магнитная наночастица для лечения и/или профилактики рака, на ее основе инфузионный раствор и фармацевтическая композиция

Формула изобретения

1. Магнитная наночастица для лечения и/или профилактики рака, выполненная из оксидов железа или чистого железа, содержащего оксидный слой, включающая на поверхности функциональные группы, выбранные из группы, включающей аминогруппу, гидроксигруппу, карбонильную группу и карбоксильную группу, и по меньшей мере один линкер, выбранный из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, полипептид, пептидную нуклеиновую кислоту, аптамер, ДНК, РНК, лейциновый зиппер, олигонуклеотид, олигопептид, биотин, авидин, стрептавидин, связь гаптен-антитело и связь биотин-авидин, посредством которого она связана с по меньшей мере одним терапевтически активным веществом, пригодным для лечения и/или профилактики рака, и который содержит группу, которая является термолабильной, электромагнитно лабильной или может интеркалироваться или расщепляться энзиматически, и связан с по меньшей мере частью названных функциональных групп посредством связи, выбранной из группы, включающей иминную связь, аминную связь, сложноэфирную связь, амидную связь и кетальную связь, при этом при нормальных физиологических условиях линкер не претерпевает никакого расщепления или претерпевает только расщепление с малой скоростью, а высвобождение терапевтически активного вещества от наночастицы вызывается, или инициируется, или существенно ускоряется переменным магнитным полем.

2. Наночастица по п.1, которая связана с терапевтически активным веществом ковалентной связью.

3. Наночастица по п.1, в которой линкер выбран из группы, включающей конструкцию двуцепочечной нуклеиновой кислоты, двойную спираль, гомогибрид или гетерогибрид типа ДНК-ДНК, ДНК-РНК, ДНК-ПНК, РНК-РНК, РНК-ПНК или ПНК-ПНК.

4. Наночастица по любому из пп.1-3, которая имеет защитную оболочку или покрытие.

5. Наночастица по п.4, в которой защитная оболочка или покрытие имеет аминогруппы или карбоксильные группы.

6. Наночастица по п.1 или 2, которая связана с терапевтически активным веществом, выбранным из группы, включающей антипролиферативные, антимиграционные, антиангиогенные, противовоспалительные, цитостатики и цитотоксические препараты.

7. Наночастица по п.6, которая связана с терапевтически активным веществом, выбранным из группы, включающей актиномицин D, аметантрон, 9-аминокамфотецин, аминоглутетимид, амсакрин, анастрозол, антагонисты пуриновых и пиримидиновых оснований, антрациклины, ингибиторы ароматазы, аспарагиназу, антиэстрогены, бендамустин, бексаротен, биолимус А9, блеомицин, бузерелин, бусульфан, калихеамицины, камптотецин, производные камптотецина, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитарабин, цитозинарабинозид, алкилирующие цитостатики, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, 5'-деокси-5-фторуридин, доцетаксел, доксорубицин (адриамицин), доксорубицин липо, эпирубицин, эстрамустин, этопозид, эксеместан, флударабин, фтороурацил, антагонисты фолиевой кислоты, форместан, гемцитабин, глюкокортикоиды, гозерелин, гормоны и гормональные антагонисты, гикамтин, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, иринотекан, детрозол, левпрорелин, ломустин, майтанзиноиды, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, милтефозин, митомицины, митоподозид, антимитотические агенты, митоксантрон, нимустин, оксалиплатин, оксазафосфорины, паклитаксел, пентостатин, производные подофиллотоксина, прокарбазин, рапамицин, родомицин D, тамоксифен, темозоломид, тенипозид, тестолактон, тиотепа, тиогуанин, ингибиторы топоизомеразы, топотекан, треосульфан, третиноин, трипторелин, трофосфамиды, алкалоиды барвинка, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, цитостатически активные антибиотики.

8. Наночастица по п.6, которая связана с терапевтически активным веществом, выбранным из группы, включающей нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, протеины, углеводы, липиды, гликопротеины, гликаны или липопротеины, причем вышеуказанные вещества имеют антипролиферативные, антимиграционные, антиангиогенные, противовоспалительные, цитостатические, цитотоксические свойства.

9. Наночастица по п.1 или 2, в которой оксиды железа являются суперпарамагнитными.

10. Наночастица по п.1 или 2, которая связана с сенсибилизатором, радиосенсибилизатором и/или усилителем в качестве дополнительного лекарственного средства от рака.

11. Наночастица по п.1 или 2, которая связана своей поверхностью с моноклональными антителами или соответственно фрагментами антител и/или аптамеров.

12. Инфузионный раствор, содержащий наночастицы по любому из пп.1-11.

13. Применение наночастиц по любому из пп.1-11 в качестве компонента для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к наночастицам, к которым присоединены терапевтически активные вещества, при этом высвобождение терапевтически активных веществ вызывается, инициируется или существенно усиливается при воздействии переменного магнитного поля.

Уровень техники

Известно, что суперпарамагнитные наночастицы могут использоваться в качестве наполнителей при лечении заболеваний. В данном контексте применяются различные подходы. Одна из известных стратегий, например, основана на так называемой "магнитной доставке лекарств", при которой предпринимаются попытки получить локальное повышение концентрации активного ингредиента посредством магнитного поля (DE 10059151 А, Alexiou). Сходным образом, предпринимаются попытки химически придать частицам свойства нахождения мишени для получения эффекта аккумулирования упомянутых частиц в определенных частях тела (DE 4428851 А1, ЕР 0516252 А2). В патенте WO 98/58673 (INM) описаны многооболочечные частицы для проникновения в опухолевые клетки, где конъюгаты состоят из частицы и активного ингредиента.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является присоединение к наночастицам терапевтически активных веществ таким образом, что в здоровых тканях не наблюдается заметного высвобождения терапевтически активных соединений, а при проникновении наночастиц в опухолевую ткань или опухолевые клетки может происходить контролируемое высвобождение терапевтически активных соединений.

Указанная цель достигается с помощью наночастиц по пункту 1 формулы изобретения, а также с помощью фармацевтической композиции по пункту 11 и с помощью упомянутых наночастиц по пункту 12.

Другие предпочтительные варианты следуют из зависимых пунктов формулы изобретения, примеров и описания.

Настоящее изобретение относится к наночастицам, в которых терапевтически активные вещества присоединены к упомянутым наночастицам и в которых отделение терапевтически активных веществ от упомянутых наночастиц вызывается, инициируется или существенно усиливается под воздействием переменного магнитного поля. В этом контексте, по меньшей мере одно терапевтически активное вещество высвобождается посредством прямого воздействия переменного магнитного поля или вследствие локального нагрева, вызываемого переменным магнитным полем. Предпочтительно, высвобождение вызывается тем фактом, что термически лабильный линкер между активным ингредиентом, например терапевтически активным веществом и наночастицей расщепляется термически и/или тем, что используемый линкер лабилен по отношению к переменному магнитному полю. Поэтому, настоящее изобретение заключается в связывании терапевтически активного вещества, в частности цитостатика, с наночастицей посредством линкера, который может расщепляться термически и/или посредством магнитного поля.

Наночастицы в соответствии с настоящим изобретением характеризуются тем, что по меньшей мере одно терапевтически активное вещество связано с наночастицей, при этом отделение по меньшей мере одного терапевтически активного вещества от наночастицы вызывается или инициируется или существенно усиливается переменным магнитным полем.

Другими словами, настоящее изобретение относится к наночастицам, в которых по меньшей мере одно терапевтически активное вещество связано ковалентно или ионно, или связано посредством водородных связей, или посредством комплексообразования (комплексная связь), или посредством внедрения, или посредством липофильных взаимодействий через линкер, и этот линкер может расщепляться вследствие термической инициации или инициации электромагнитным или соответственно магнитным полем.

Термически инициируемое расщепление означает, что локальный нагрев в физиологических условиях до температуры более 45°С, предпочтительно более 50°С, достаточен для расщепления линкера. Инициируемое электромагнитным или соответственно магнитным полем расщепление означает, что применение электромагнитного или соответственно магнитного поля при физиологических условиях вызывает расщепление линкера, или только посредством электромагнитного или соответственно магнитного поля, или/и посредством локального уменьшения рН, индуцированного электромагнитным или соответственно магнитным полем.

По меньшей мере одно терапевтически активное вещество, то есть молекулы по меньшей мере одного класса терапевтически активных веществ или один определенный активный ингредиент, предпочтительно связывается посредством ковалентной или преимущественно ковалентной связи и/или достаточно прочной ионной связи, клатратных соединений или комплексообразования (комплексные связи) или соответственно посредством установления достаточного количества водородных связей или гидрофобных взаимодействий таким образом, чтобы с достаточной степенью надежности избежать неконтролируемого высвобождения терапевтически активного вещества. Неконтролируемое выделение означает высвобождение терапевтически активных веществ в здоровых тканях, особенно, высвобождение без активного воздействия переменного магнитного поля.

Такое неконтролируемое высвобождение приводит к высвобождению терапевтически активных веществ в местах, где они могут скорее вызвать нежелательные побочные эффекты нежели терапевтические эффекты, а именно вне раковых тканей или соответственно вне раковых клеток.

Таким образом, терапевтически активные вещества остаются крепко связанными с наночастицами и транспортируются к раковым клеткам вместе с наночастицей. Во время транспортировки наночастиц к раковым тканям высвобождаются количества терапевтически активных веществ от небольших до незначительных. После доставки в раковые клетки терапевтически активные вещества высвобождаются посредством переменного магнитного поля, в частности посредством внешнего переменного магнитного поля или, соответственно, посредством переменного магнитного поля, применяемого извне (импульс).

В данном контексте, "вызванный или инициированный переменным магнитным полем" означает, что высвобождение или соответственно отделение либо непосредственно вызывается переменным магнитным полем либо соответственно импульсами, либо непрямым образом, например активацией или соответственно индуцированием генной экспрессии энзимов или генерацией тепла.

Наночастицы состоят из магнитного материала, предпочтительно ферромагнитного, антиферромагнитного, ферримагнитного, антиферримагнитного или суперпарамагнитного материала, более предпочтительно из оксидов железа, особенно суперпарамагнитных оксидов железа или из чистого железа с оксидным слоем. Такие наночастицы могут нагреваться переменным магнитным полем. Ткань, содержащую такие наночастицы, можно нагреть до температур выше 50°С. Такие высокие температуры могут достигаться благодаря тому, что до 800 пг железа и более может адсорбироваться в форме наночастиц одной раковой клеткой.

Наночастицы предпочтительно состоят из оксидов железа и в частности из магнетита (Fе₃О₄), магхемита ( -Fе₂О₃) или смесей двух указанных оксидов. В целом, предпочтительные наночастицы представлены формулой FeO_x, где Х означает число от 1 до 2. Наночастицы предпочтительно имеют диаметр менее 500 нм. Наночастицы предпочтительно имеют средний диаметр 15 нм и лежат в пределах от 1 до 100 нм, особенно предпочтительно, в диапазоне от 10 до 20 нм.

В дополнение к магнитным материалам формулы FeO_x, где Х означает число от 1 до 2, в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться материалы общей формулы МFе₂О ₄, где М=Со, Ni, Mn, Zn, Cd, Ba или другие ферриты. Более того, могут применяться также кремниевые или полимерные частицы, в которые включены и/или с которыми связаны магнитные материалы, такие как упомянутые в тексте магнитные материалы.

Терапевтически активные вещества присоединяются к описанным наночастицам, в частности, к суперпарамагнитным наночастицам, при этом предпочтительной является ковалентная связь. Выбираемые терапевтически активные вещества включают антипролиферативные, антимиграционные, антиангиогенные,противотромбозные, противовоспалительные,цитостатики, цитотоксические, антикоагуляционные, антибактериальные, антивирусные и/или противогрибковые препараты, где предпочтительными являются антипролиферативные, антимиграционные, антиангиогенные, цитостатические и/или цитотоксические вещества, а также нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, белки, углеводы, жиры, гликопротеины, гликаны или липопротеины имеющие антипролиферативные, антимиграционные, анти-ангиогенные, противотромбозные, противовоспалительные, цитостатические, цитотоксические, антикоагуляционные, антибактериальные, антивирусные и/или противогрибковые свойства. Более того, такие вещества могут также представлять собой радиосенсибилизаторы или сенсибилизаторы или усилители других комбинированных общепринятых способов лечения рака, либо могут содержать такие сенсибилизаторы.

В качестве цитотоксических и/или цитостатических соединений, то есть химических соединений имеющих цитотоксические и/или цитостатические свойства, могут использоваться следующие: алкилирующие агенты, антибиотики с цитостатическими свойствами, антиметаболиты, ингибиторы микроканальцев и ингибиторы топоизомеразы, соединения содержащие платину и другие цитостатики, такие как например аспарагиназа, третиноин, алкалоиды, подофиллотоксины, таксаны и милтефозин^®, гормоны, иммуномодуляторы, моноклональные антитела, сигнальные трансдукторы (молекулы для трансдукции сигнала) и цитокины.

Примеры алкилирующих агентов включают, помимо прочих, хлорэтамин, циклофосфамид, трофосфамид, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, тиотепа, кармустин, ломустин, дакарбазин, прокарбазин, темозолумид, треосульфан, эстрамустин и нимустин.

Примеры антибиотиков с цитостатическими свойствами включают даунорубицин, доксорубицин (адриамицин), дактиномицин, митомицин С, блеомицин, эпирубицин (4-эпиадриамицин), идарубицин, митоксантрон, амсакрин и актиномицин D.

Метотрексат, 5-фторурацил, 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин, флударубин, кладрибин, пентостатин, гемцитабин, цитарабин, азатиоприн, ралтитрексед, капецитабин, цитозин арабинозид, тиогуанин и меркаптопурин можно привести в качестве примеров антиметаболитов (антиметаболических агентов).

Винкристин, винбластин, виндезин, этопозид, а также тенипозид принадлежат, в числе прочих, к классу алкалоидов и подофиллотоксинов. Платиносодержащие соединения также могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин являются примерами платиносодержащих соединений. К ингибиторам микроканальцев относятся, например, такие алкалоиды как алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин) и паклитаксел (Тахоl^®), а также производные паклитаксела. Примеры ингибиторов топоизомеразы включают этопозид, тенипозид, камптотецин, топотекан и иринотекан.

Паклитаксел и доцетаксел являются примерами соединений класса таксанов, а в числе других цитостатических соединений (другие цитостатики) находятся, например, гидроксикарбамид (гидроксимочевина), иматиниб, Miltefosin^®, амсакрин, топотекан (ингибитор изомеразы-1), пентостатин, бексаротен, биолимусА9, рапамицин (сиролимус), родомицин D, аметантрон, бендамустин, оксазафосфорин, 5'-деокси-5-фторуридин, 9-аминокамптотецин, производные подофиллотоксина, митоподозид, алкалоиды барвинка, калихеамицины, майтанзиноиды, третиноин и аспарагиназа. Представителями соединений класса моноклональных антител являются, в числе прочих, трастузумаб (также известный как Herceptin^®), алемтузумаб (также известный как MabCampath^®) и ритуксимаб (также известный как MabThera^®).

В соответствии с настоящим изобретением могут также использоваться гормоны, такие как, например, глюкокортикоиды (преднизон), эстрогены (фосфестрол, эстрамустин), LHRH (бусерелин, госерелин, лейпрорелин, трипторелин), флутамид, ципротерона ацетат, тамоксифен, торемифен, аминоглутетимид, форместан, экземестан, летрозол и анастрозол. Среди классов иммуномодуляторов, цитокинов, антител и трансдукторов сигнала присутствуют интерлейкин-2, интерферон-(, эритропоетин, G-CSF, трастузумаб (Herceptin ^®), ритуксимаб (MabThera^®), гефитиниб (Iressa^®), ибритумомаб (Zevalin^® ), левамизол, а также ретиноиды.

Вышеупомянутые соединения предпочтительно связаны с наночастицами ковалентно. Например, вещества могут связываться через гидроксильные группы, аминогруппы, карбонильные группы, тиольные группы или карбоксильные группы, в зависимости от того, какие функциональные группы несет соответствующее вещество. Так, например, доксорубицин может связываться через свои первичные гидроксильные группы в форме сложного эфира; платиновые производные (цисплатин, карбоплатин, оксаплатин, и т.д.) могут присоединяться к аминогруппе посредством нуклеофильного замещения у платины; или паклитаксел может связываться через иминную связь.

Гидроксильные группы предпочтительно связываются в виде сложных эфиров, ацеталей или кеталей; тиогруппы предпочтительно связываются как тиоэфиры, тиоацетали или тиокетали; аминогруппы предпочтительно связываются как амиды и частично в виде иминов (оснований Шиффа) или в качестве уретанов в ходе реакции с изоцианатной группой; карбоксильные группы предпочтительно связываются в качестве сложных эфиров или амидов и карбонильные группы предпочтительно связываются в виде ацеталей или соответственно кеталей.

Приготовление наночастиц без активного ингредиента и без оболочки детально описано в DE 4428851 А. Более того, известна функционализация поверхности наночастиц, так что аминогруппы, гидроксильные группы, карбоксильные группы или карбонильные группы могут образовываться на поверхности наночастиц по известным методикам.

Поэтому настоящее изобретение относится к наночастицам, имеющим множество аминогрупп, гидроксильных групп, карбоксильных групп или карбонильных групп на их поверхностях, и где линкеры связаны с по меньшей мере одной частью из упомянутых функциональных групп посредством иминной связи, аминной связи, сложноэфирной связи, амидной связи или кетальной связи. Кроме того, перечисленные линкеры связывают терапевтически активное вещество ковалентным, ионным, комплексным, липофильным путем или посредством водородных связей.

Отличительной особенностью предпочтительного варианта наночастиц настоящего изобретения является связывание активных компонентов с магнитными наночастицами посредством связей специального типа. Упомянутые связи построены таким образом, что высвобождение активных ингредиентов может стимулироваться внешним магнитным полем (импульсом).

Переменное магнитное поле действует как внешний стимул, который в случае суперпарамагнитных частиц запускает различные процессы релаксации в молекуле. Среди прочих, эти процессы приводят к нагреванию частиц и их окружения. В соответствии с настоящим изобретением, упомянутые процессы, запускаемые переменным магнитным полем, используются для расщепления связи между наночастицей и терапевтически активным веществом или для значительного ускорения процесса расщепления. В данном контексте, скорость расщепления посредством биологических процессов (например энзиматическое расщепление) может сильно ускоряться импульсом, поэтому увеличение концентрации активного ингредиента в месте назначения может достигаться только посредством использования импульса. Сходным образом, связь может быть построена таким образом, что запускается или значительно ускоряется расщепление посредством химических реакций (например гидролиз). Более того, индуцированное магнитным полем нагревание может вызывать расплавление молекулы нуклеиновой кислоты или полипетидной молекулы, используемых в качестве линкера.

Терапевтически активные соединения связываются непосредственно или через линкерные молекулы. Линкерные молекулы предпочтительно связываются с наночастицами или соответствующей наночастицей посредством амидной связи или эфирной связи.

В соответствии с настоящим изобретением возможно также использование в качестве линкеров нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), рибонуклеиновая кислота (РНК)) или полипетидов различной длины. Необходимые молекулы могут производиться либо генетически, либо синтетически. Линкеры могут расщепляться термически индуцируемым, магнитно индуцируемым или кислотно индуцируемым образом при физиологических условиях.

Расщепление линкера означает, что линкер содержит в своем составе по меньшей мере одну связь, которая может расщепляться в физиологических условиях вследствие воздействия тепла, влияния магнитного поля, то есть магнитного импульса или вследствие воздействия кислоты. Вследствие воздействия тепла (предпочтительно по меньшей мере 45°С) и/или влияния магнитного поля и/или вследствие воздействия кислоты вышеуказанная связь должна расщепляться в физиологических условиях по меньшей мере в два раза быстрее, чем в случае отсутствия воздействия. Образование кислоты и локальное понижение рН может, например, вызываться уже мертвыми клетками. Выражение "связь в составе линкера" также включает связь между линкером и наночастицей, а также связь между линкером и терапевтически активным веществом. Кроме того, линкер может состоять из двух или трех линкерных молекул.

Для обеспечения необходимой способности к расщеплению, линкеры имеют по меньшей мере одну из следующих функциональных групп: -S-S-, -O-Р(=O)(O-)-O-, -СО-СО-, -NH-CO-CO-NH-, -С=N-С, кетали, -CO-NH-N=C-, триоксисиланы (-O-)(-O-)(-O-)Si-C или ацетали.

Например, подходящие линкеры могут иметь следующую форму:

Зигзагообразная линия означает связь между активным ингредиентом и линкером или соответственно, между линкером и наночастицей.

Предпочтительные нуклеиновые кислоты представляют собой конструкции, предпочтительно дважды скрученные конструкции, имеющие температуру плавления в диапазоне от 40 до 60°С. Когда используются дважды скрученные ДНК, РНК или ПНК, одна цепочка содержит группу, способную к связыванию с частицей (например, амино- или карбоксиотная группа, связанная с фосфорамидатной группой). Комплементарная цепочка может, например, содержать активный компонент, который также связан посредством ковалентной связи. Вследствие основного попарногосвязывания между цепочками, активный компонент также связывается с частицей. Высвобождение активного компонента возможно только в случае расплавления двойной спирали вследствие генерации тепла в переменном магнитном поле. В этом процессе отдельные цепочки разделяются, и активный компонент отщепляется от частицы. И температура плавления, и разрушение линкера могут контролироваться выбором соответствующих гомо-гибридов или гетеро-гибридов из ДНК-ДНК, ДНК-РНК, ДНК-ПНК, РНК-РНК, РНК-ПНКили ПНК-ПНК.

Предпочтительными полипептидами являются такие молекулы, которые имеют тенденцию к формированию определенных гомо-димеров или гетеро-димеров, особенно посредством водородных связей (такие как, например, между иммуноглобулиновыми доменами) или посредством гидрофобных взаимодействий (как например, в так называемых лейциновых зипперах). В оговоренных случаях тоже используются такие пары с температурой плавления в диапазоне от 40 до 60°С, которые поэтому в физиологических условиях присутствуют преимущественно в спаренном состоянии, но которые не распадаются на свои мономеры при терапевтически достижимых температурах. Для указанных целей один связующий член ковалентно связан с наночастицей, а второй ковалентно связан с терапевтически активным веществом. Когда связь между двумя пептидными цепочками ослабляется, наночастицы отделяются и терапевтически активные вещества, которые впоследствии, возможно только вследствие расщепления такого как энзиматическое расщепление, присутствуют в свободно диффундирующей форме.

Сходным образом, в соответствующем линкере могут использоваться взаимодействия между полипептидом и нуклеиновой кислотой. Для достижения указанной цели, с наночастицами связываются полипептиды, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами нековалентным образом и способные к связыванию с нуклеиновыми кислотами. Указанные взаимодействия также могут ослабляться под воздействием тепла, так что связывающая нуклеиновая кислота высвобождается вдополнение ксвязанной эффекторной молекуле. Иногда даже выделяющаяся нуклеиновая кислота сама может играть роль эффекторной молекулы (например, siRNA, антисмысловая ДНК, и т.д.). Подходящими нуклеиновыми кислотами, связывающими полипептиды, могут быть в частности цинковые пальцы, имеющие длину от 20 до 50 аминокислот, но также могут использоваться часто повторяющиеся элементы типа "спираль-поворот-спираль" ДНК-связывающих доменов или SSB-белки для связывания ДНК (маленький протеин, имеющий ДНК-связывающий домен размером около 100 аминокислот), или соответственно "РНК-распознающий элемент" (RRM или соответственно RNP-1) одноцепочечных РНК-связывающих протеинов (насчитывает около 90 аминокислот), или "связующий элемент двухцепочечных РНК" (DRBM) двухцепочечных РНК-связывающих протеинов (насчитывает около 65 аминокислот).

Другой вариант осуществления изобретения заключается в использовании в линкерной системе связи низкомолекулярных лигандов нуклеиновых кислот (аптамеров) или соответственно протеинов. В общем, могут использоваться все молекулы, например путем продуцирования антител против так называемого "гаптена" (например, часто используются антитела против динитрофенола, тринитрофенола, дигоксигенина, дигоксина, биотина). В частности, могут применяться связующие участки биомолекул, таких как коэнзимы (например коэнзим А, АТР, GTP, FAD, NADH, NADPH, биотин, фолиевая кислота, пиридоксал фосфат, и т.д.), субстраты (например, связывающий сайт глутатиона глутатион-3-трансферазы GST, состоящий из 73 аминокислот) или гормоны (например, гормон-связывающий домен ядерного гормонального рецептора андрогенов, эстрогенов, ретиноевая кислота, тироксина, витамина D3, насчитывающий от 218 до 252 аминокислот). Одно из наиболее часто использующихся взаимодействий и одновременно самое сильное из известных нековалентное связывание - это связывание биотина с авидином или соответственно стрептавидином. Вследствие высокой связующей способности, возможно предпочтительно использовать модифицированные аналоги авидина или соответственно биотина (например, дестиобиотин или иминобиотин) с менее сильными связями, для обеспечения плавления в технически достижимом интервале температур. Во всех случаях имеет смысл связывать микромолекулярный лиганд с эффекторной молекулой и связывать макромолекулярный лиганд с наночастицей; однако, обратный порядок также может быть более выгодным, в зависимости от выбора лиганда.

В этом предпочтительном варианте рассматриваются только связывающие способы, посредством которых образуется связь между наночастицей и активным компонентом, где указанная связь достаточно устойчива при "нормальных" физиологических условиях, но значительно менее устойчива, когда используются условия импульса в соответствии с настоящим изобретением. Механизм высвобождения сам по себе и также тип связи зависят от мишени (например, опухоль в случае раковых заболеваний) и должны быть вариабельны посредством обычных способов химического связывания. Сходным образом, выделение может происходить внутриклеточно (например, в клетках опухоли) или внеклеточно. Произведенные в соответствии с настоящим изобретением наночастицы отличаются от известных носителей активных компонентов тем, что эффективность может быть достигнута только посредством активации в переменном магнитном поле, в то время как без указанного импульса активный компонент остается по большей части в неактивном состоянии.

В соответствии с настоящим изобретением, конъюгаты наночастицы и активного компонента предпочтительно основаны на железосодержащих магнитных ядрах; упомянутые ядра окружены одним или более коллоидными оболочками или покрытиями, которые позволяют активным ингредиентам связываться с ними через функциональные группы. Ядро предпочтительно состоит из магнетита или магемита. Главная функция таких оболочек состоит в обеспечении коллоидного распределения в водной среде и в защите наночастиц от агломерации. В принципе, частицы с несколькими оболочками, как описано в WO 98/58673, представляют собой подходящую основу для конъюгатов наночастицы с активным компонентом, которые могут быть активированы, поскольку биологическое поведение таких частиц можно адаптировать посредством покрытия полимерами и поскольку активные компоненты можно связать с функциональными группами первичной оболочки.

Активные компоненты можно связывать с первичными оболочками с использованием различных методов. В случае если ядро частицы стабилизировано аминосиланами или оболочкой или соответственно несущим аминогруппы покрытием, активные компоненты можно, например, связать с аминогруппой, расположенной близко к поверхности. В этом контексте, связывание можно провести через, например, сукцинимидиловые эфиры, сульфосукцинимидиловые эфиры, изотиоцианаты, триазинилхлориды, сульфонилхлориды, тетрафторфениловые эфиры или через альдегидные группы. Для этой цели, активный компонент должен быть способен к связыванию с такими группами химическим способом. Если активный компонент не может быть непосредственно связан с использованием упомянутых способов, можно использовать линкерную молекулу. Указанный "линкер" соединяет активный компонент с функциональными группами защитной оболочки и таким образом увеличивает вариабельность в плане различных возможностей соединения. Поэтому предпочтительным является использование линкера, содержащего группу, которая является термолабильной, электромагнитно-лабильной, фотолабильной, кислотно-лабильной, интеркалирована или может интеркалироваться или расщепляться посредством энзиматического расщепления. Более того, механизм высвобождения может также контролироваться посредством линкера. Так, линкер также может вводить группы, позволяющие отсоединить активный компонент.Подходящие группы включают, например, расщепляемые ацетали, сложные эфиры, гидразоннные или иминные группы. Сходным образом, пептидные последовательности могут использоваться как линкеры, в которых активный компонент выделяется только после энзиматического расщепления или вследствие расплавления нековалентной связи. Более того, ДНК, РНК и ПНК молекулы могут использоваться предпочтительно в качестве двухцепочечных линкеров, где высвобождение происходит вследствие термически индуцируемого разрушения двойной цепочки.

В соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться только такие линкеры, которые не претерпевают никакого расщепления при нормальных физиологических условиях или скорость такого расщепления очень мала. Например, линкерные молекулы могут быть построены таким образом, что даже если высвобождение в целевой зоне возможно (например, энзиматическое расщепление в клетках опухоли), то указанное высвобождение настолько медленно при нормальных условиях, что достижение терапевтической концентрации активного компонента невозможно. Расщепление линкерной молекулы или соответственно расщепление линкерной молекулы с достаточно большой скоростью является исключительно следствием импульса переменного магнитного поля извне, приводящее к активации активного компонента. Предпочтительно эта цель достигается вследствие того факта, что конформация, допускающая энзиматическое расщепление линкера, возникает только когда происходит термически индуцируемое разрушение двойной цепочки нуклеиновых кислот или соответственно множественных цепочек, или альтернативно расщепление пептидных димеров или соответственно пептидных олигомеров.

Частицы, стабилизированные различными функциональными группами (например, карбокси, эпокси, альдегидными), могут обрабатываться теми же способами, что и частицы, стабилизированные аминосиланами. Определяющим при выборе способа связывания является то, что высвобождение должно происходить только при указанных выше условиях. Сходным об разом, активный компонент может связываться с ал коксисиланом, который был функционализирован посредством вышеупомянутых групп (смотри пример 1), где на следующей стадии упомянутый конъюгат связывается с защитной оболочкой частиц, которые уже были стабилизированы силанами. Связывание не ограничивается только ковалентными связями. Всоответствии с настоящим изобретением, возможно также создавать ионные взаимодействия с достаточной устойчивостью.

Дополнительное покрытие (например, полимерами) конъюгатов наночастиц с активным компонентом, который может быть активирован как описано в патенте WO 98/58673, также возможно и может использоваться для улучшения биологических свойств конъюгатов наночастиц с активным компонентом. Сходным образом, могут связываться другие молекулы, придающие всей конструкции способность находить мишень (например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, химерные антитела, рекомбинантные антитела, биспецифичные антитела, фрагменты антител, аптамеры, фрагменты Fab, фрагменты Fc, пептиды, пептидомиметики, гап-меры, рибозимы, CpG олигомеры, ДНК-зимы, рибо-переключатели или липиды). Для достижения этой цели, дополнительные модификации не должны оказывать влияние на процесс высвобождения (который может активироваться) активного компонента в целевой зоне.

Таким образом, различные молекулы, имеющие до 500 углеродных атомов или от 10 до 30 пар оснований, предпочтительно 15-25 пар оснований или 10-30 аминокислот, предпочтительно от 15 до 25 аминокислот, могут выполнять роль линкеров, при условии что линкер содержит группу, которая может расщепляться термически, фотохимически или энзиматически, кислотно-лабильную группу или любую другую группу, которую можно легко отщепить. Поэтому связь в составе линкерной молекулы и/или связь между линкером и активным компонентом и/или связь между линкером и поверхностью наночастицы должна быть легко расщепляема непосредственно под воздействием переменного магнитного поля или расщепляема опосредованно. Опосоредованное расщепление означает, что энзимы, такие как пептидазы, эстеразы или гидролазы, переходят в возбужденное состояние в районе мишени, например в раковых клетках, например посредством переменного магнитного поля или что их активность или действие увеличивается и упомянутые энзимы получают способность к вышеупомянутому расщеплению. Кроме того, опосредованное расщепление может происходить когда используются магнитные наночастицы, если эти частицы нагреваются переменным магнитным полем, что приводит к расщеплению термически лабильных связей. Также стоит рассмотреть увеличение рН в целевой зоне под воздействием переменного магнитного поля и последующее расщепление кислотно-лабильных связей в составе линкерной молекулы.

Сложноэфирная группа и амидная или соответственно пептидная группа входят в число энзиматически расщепляемых групп в составе линкерной молекулы или непосредственно около нее. Группы, которые могут расщепляться термически или посредством кислоты, включают например фосфатные группы, тиофосфатные группы, сульфатные группы, фосфамидные группы, карбаматные группы или иминные группы.

Активный компонент необязательно должен быть ковалентно связан с линкером; вместо этого он также может быть связан ионно или через водородные связи, или может присутствовать в интеркалированной или комплексной форме.

Более того, можно также связать активные компоненты с поверхностью наночастиц адсорбционно и покрыть их барьерным слоем, так чтобы с большой степенью вероятности предотвратить высвобождение активного компонента до тех пор пока барьерный слой модифицируется, в частности разрушается, под воздействием переменного магнитного поля таким образом, что становится возможным выделение активного компонента.

В другом предпочтительном варианте, наночастицы, соответствующие настоящему изобретению окружены или соответственно покрыты одной или более оболочками или покрытиями. Упомянутые оболочки или покрытия могут иметь одну или более функций и могут выступать в роли защитной оболочки, барьерного слоя или клеточно-селективного покрытия.

В случае если связь терапевтически активного вещества с наночастицей слабая, например в случае нековалентной, ионной, адсорбционной, липофильной и/или ван-дер-Ваальсовой связи и/или присоединения посредством водородных связей, защитная оболочка или барьерное покрытие могут предотвращать выделение терапевтически активных веществ до тех пор, пока наночастицы не достигнут своего места назначения. Внешний слой, несущий клеточно-специфичные функциональности, может наноситься на защитную оболочку или барьерное покрытие вместо указанных защитных оболочек или барьерных покрытий или как дополнительный слой к этим защитным оболочкам или барьерному покрытию.

Указанное клеточно-специфическое покрытие увеличивает сродство наночастиц к определенным клеткам, например к определенным бактериальным клеткам или к определенным раковым клеткам; вследствие этого, оно служит целям клеточной дискриминации. Такие клеточно-специфичные наночастицы предпочтительно аккумулируются в клетках, к которым у них имеется повышенное сродство благодаря функционализированной поверхности; вследствие этого, такие наночастицы становятся опухоле-специфичными. Благодаря такой технологии, можно разработать специфичные к опухолям наночастицы, например для определенных видов рака.

Кроме того, наночастицы также можно стабилизировать коллоидной защитной оболочкой, защищающей наночастицы от агломерации. Предпочтительно, такие защитные оболочки или покрытия обеспечиваются аминогруппами или карбоксильными группами. Для таких защитных оболочек или соответственно покрытий могут использоваться биологические, синтетические или полусинтетические полимеры. Для получения барьерного слоя обычно используются полимеры, предпочтительно биостабильные полимеры, например полимеры которые весьма устойчивы к биологической деградации. Для образования клеточно-специфических оболочек или соответственнопокрытийпредпочтительноиспользованиебиодеградируемых полимеров.

В качестве биологически стабильных полимеров могут использоваться следующие полимеры: полиакриловая кислота и полиакрилаты такие как полиметилметакрилат, полибутилметакрилат, полиакриламид, полиакрилонитрилы, полиамиды, полиэфирамиды, полиэтиленамин, полиимиды, поликарбонаты, поликарбоуретаны, поливинилкетоны, поливинилгалогениды, поливинилиденгалогениды, поливиниловые эфиры, полиизобутилены, ароматические поливинилы, поливиниловые эфиры, поливинил пирролидоны, полиоксиметилены, политетраметилен оксид, полиэтилен, полипропилен, политетрафторэтилен, полиуретаны, полиэфирные уретаны, силиконовые полиэфирные уретаны, силиконовые полиуретаны, силиконовые поликарбонатные уретаны, полиолефиновые эластомеры, EPDM резины, фторсиликоны, карбоксиметилхитозаны, полиарилэфирные эфиркетоны, полиэфирные эфиркетоны, полиэтилен терефталат, поливалераты, карбоксиметилцеллюлоза, целлюлоза, вискоза, триацетат вискозы, нитраты целлюлозы, ацетаты целлюлозы, гидроксиэтил целлюлоза, бутираты целлюлозы, ацетат-бутираты целлюлозы, этилвиниловые ацетатные сополимеры, полисульфоны, эпоксидные смолы, ABS смолы, силиконы такие как полисилоксаны, полидиметилсилоксаны, полидиметилсилоксаны, поливинилгалогениды и сополимеры, эфиры целлюлозы, триацетаты целлюлозы, хитозаны и сополимеры и/или смеси указанных соединений.

В качестве биодеградируемых полимеров могут использоваться следующие полимеры: поливалеролактоны, поли- -деколактоны, полилактоновая кислота, полигликолевая кислота, полилактиды, полигликолиды, сополимеры полилактидов и полигликолидов, поли- -капролактон, полигидроксимасляная кислота, полигидроксибутираты, полигидроксивалераты, полигидроксибутират-совалераты, поли(1,4-диоксан-2,3-дионы), поли(1,3-диоксан-2-оны), поли-пара-диоксаноны, полиангидриды такие, как ангидриды полималеиновой кислоты, полигидроксиметакрилаты, фибрин, полицианоакрилаты, поликапролактон диметилакрилаты, поли- -малеиновая кислота, поликапролактон бутилакрилаты, мультиблочные полимеры такие как например олигокапролактондиолы и олигодиоксанондиолы, полиэфир сложноэфирные мультиблочные полимеры такие как, например, ПЭГ и поли(бутилентерефталат), полипивотолактоны, триметилкарбонаты полигликолевой кислоты, поликапролактон гликолиды, поли( -этилглютамат), поли(ДТН-иминокарбонат), поли(ДТЕ-со-ДТ-карбонат), поли(бисфенол А иминокарбонат), полиортоэфир, политриметил карбонаты, полииминокарбонаты, поли(N-винил)-пирролидон, поливиниловые спирты, полиэфирные амиды, гликолизованные полиэфиры, полифосфоэфиры, полифосфазены, поли[(р-карбоксифенокси)пропан], полигидроксипентановая кислота, полиангидриды, полиэтиленоксидпропиленоксид, мягкие полиуретаны, полиуретаны с аминокислотными остатками в боковых цепях, полиэфирные эфиры такие как полиэтиленоксид, полиалкиленоксалаты, полиортоэфиры, а также их сополимеры, липиды, карагенаны, фибриногены, крахмал, коллаген, полимеры на протеиновой основе, полиаминокислоты, синтетические аминокислоты, зеин, модифицированный зеин, полигидроксиалканоаты, пектиновая кислота, актиновая кислота, модифицированный и немодифицированный фибрин и казеин, карбоксиметилсульфат, альбумин, гиалуроновая кислота, хитозан и его производные, гепарансульфаты и их производные, гепарины, хондроитин-сульфат, декстран, -циклодекстрины, альгинаты, гликозаминогликаны, сахариды, полисахариды, протеогликаны, гликопротеины, сополимеры с ПЭГ и полипропиленгликолем, гуммиарабик, гуаровая смола, желатин, коллаген N-гидроксисукцинимид, фосфолипиды, модификации и сополимеры и/или смеси вышеупомянутых веществ.

Для дальнейшего увеличения сродства к определенным типам клеток можно присоединять моноклональные антитела и/или аптамеры к поверхности наночастиц или соответственно к наружному слою или оболочке наночастиц. Моноклональные антитела и аптамеры сконструированы таким образом, что они способны распознавать определенные клетки, такие как опухолевые клетки, и еще более увеличивать клеточную дискриминацию наночастиц.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения ядро магнитных наночастиц состит из магнетита (Fе ₃O₄), магхемита ( -Fe₂O₃) или смесей двух упомянутых оксидов и они предпочтительно обладают суперпарамагнитными свойствами. Кроме того, ядра стабилизированы коллоидной защитной оболочкой, обеспечивающей присоединение терапевтически активных веществ. Благодаря типу связи, конъюгаты магнитных наночастиц и терапевтически активных соединений построены таким образом, что посредством переменного магнитного поля в человеческом теле может происходить высвобождение терапевтически активного вещества.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные выше наночастицы, а также к использованию таких наночастиц для приготовления фармацевтических композиций.

В частности, упомянутые фармацевтические композиции представляют собой инфузионные или инъекционные растворы. Такие растворы наночастиц, например в физиологическом растворе, пригодны для внутритканевого или соответственно, внутриопухолевого введения. Внутриартериальное или внутривенное введение дополнительно позволяет проводить системную терапию по отношению ко всему телу, в случае нетвердых опухолей и/или видов опухолей, которые дают метастазы.

Наночастицы и фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением используются как для лечения, так и для профилактики заболеваний, характеризующихся дегенерацией клеток или чужеродными клетками, и при которых могут эффективно использоваться характеристики наночастиц настоящего изобретения, состоящие в том, что частицы способны отличать чужеродные или соответственно дегенеративные клетки от здоровых аутологических клеток. Среди дегенеративных клеток особо следует выделить раковые клетки или соответственно клетки с нарушенной пролиферацией, а также стенозные и рестенозные ткани. Чужеродные клетки включают, в частности, бактериальные клетки.

Соответственно, наночастицы настоящего изобретения и содержащие такие наночастицы фармацевтические композиции используются для профилактики и лечения опухолей, карцином и рака.

Примерами видов рака и опухолей, при которых могут применяться наночастицы настоящего изобретения, включают следующие: аденокарциномы, хлороидальная меланома, острый лейкоз, акустическая нейринома, ампуллярная карцинома, анальная карцинома, астроцитомы, базально-клеточная карцинома, рак поджелудочной железы, соединительнотканевая опухоль, рак мочевого пузыря, бронхиальная карцинома, немелкоклеточная бронхиальная карцинома, рак молочной железы, лимфома Буркетта, карцинома туловища, CUP синдром, рак толстого кишечника, рак тонкого кишечника, опухоли тонкого кишечника, рак яичника, карцинома эндометрия, эпендимома, рак эпителия, опухоли Юинга, рак желудочно-кишечного тракта, рак желчного пузыря, желчная карцинома, рак матки, рак шейки матки, глиобластомы, гинекологический рак, опухоли уха, носа и горла, гематологические неоплазии, лейкоз ворсистых клеток, рак уретры, рак кожи, опухоли мозга (глиомы), мозговые метастазы, рак яичек, опухоль гипофиза, карциноиды, саркома Капози, рак гортани, опухоль эмбриональных клеток, рак костей, рак прямой кишки, опухоли головы и шеи (опухоли, расположенные в обрасти шеи, носа и ушей), карцинома толстой кишки, краниофарингиомы, рак в области рта и губ, рак печени, метастазы печени, лейкоз, опухоль века, рак легких, лимфобластома (Ходжкина и не-Ходжкина), лимфомы, рак желудка, злокачественная меланома, злокачественная неоплазма, малигнома желудочно-кишечного тракта, карцинома груди, рак прямой кишки, медуллобластома, меланома, менингиомы, болезнь Ходжкина, грибовидный микоз, рак носа, невринома, нейробластома, почечный рак, карцинома почечных клеток, не-Ходжкина лимфомы, олигодендроглиома, карцинома пищевода, остеолитические опухоли и остеобластические опухоли, остеосаркома, яичниковая карцинома, панкреатическая карцинома, карцинома полового члена, плазмоцитома, карцинома чешуйчатых клеток головы и шеи, карциномы простаты, рак горла, ректальная карцинома, ретинобластома, вагинальный рак, карцинома щитовидной железы, рак легкого по Шнеебергу, рак пищевода, спиноклеточная карцинома, лимфомаТ-клеток (грибовидный микоз), тимома, карцинома маточных труб, опухоли глаза, урологические опухоли, уротелиальная карцинома, карцинома вульвы, появление бородавок, опухоли мягких тканей, саркома мягких тканей, опухоль Вилма и рак языка.

Особенно предпочтительны твердые опухоли. Кроме того, карциномы простаты, опухоли мозга, саркомы, цервикальные карциномы, карциномы яичника, карциномы молочной железы, бронхиальные карциномы, меланомы, опухоли головы и шеи, карциномы пищевода, ректальные карциномы, карциномы поджелудочной железы, карциномы мочевого пузыря и карциномы почек, метастазы в печени, в мозге и в лимфоузлах являются предпочтительными.

Кроме того, применение и использование изобретенных наночастиц вместе с обычными гипертермией, радиотерапией и/или вместе с обычной химиотерапией являются особо предпочтительными.

Осуществление изобретения

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Приготовление наночастиц со связанным митомицином. предназаначенным для высвобождения:

Для связывания цитостатика митомицина с наночастицами оксида железа, покрытыми аминосиланом, синтезируют конъюгат митомицина и триэтоксисилилбутиральдегида. Для этой цели митомицин и триэтоксисилилбутиральдегид растворяют в молярном соотношении 1:1 и перемешивают 2 часа. Во время этой операции активный компонент связывается с силаном посредством иминной связи. В последующем указанный конъюгат используют для покрытия наночастиц оксида железа по следующей методике: Суспензию непокрытых частиц оксида железа (приготовлены из хлорида железа (II) и хлорида железа (III) осаждением гидроксидом натрия) доводят до рН 5 с использованием уксусной кислоты. Далее при постоянном перемешивании добавляют смесь митомицин/силанового конъюгата и аминопропилтриэтоксисилан. Предварительно устанавливают молярное соотношение митомицина к аминопропилтриэтоксисилану, равное 1:50. Через 24 часа добавляют этиленгликоль в таком количестве, чтобы объем смеси удвоился. Воду затем удаляют дистилляцией. Таким образом, силаны прочно связываются с частицами оксида железа. Эту суспензию очищают диализом против ультрачистой воды и концентрируют до концентрации железа 1 моль/л (путем дистилляции).

Пример 2

Связывание амино-модифицированного олигонуклеотида с наночастицами оксида железа с использованием глутарового альдегида в качестве линкера.

Стабилизированные аминосиланом наночастицы получают из хлорида железа (II) и хлорида железа (III) осаждением гидроксидом натрия и покрывают путем добавления аминопропилтриэтоксисилана (в соответствии с WO 97/38058). Полученную суспензию концентрируют до концентрации железа 2 моль/л.

500 мкл полученной суспензии промывают 10 мл PIPES буфера (пиперазин-N,N'-бис-2-этансульфоновая кислота; рН=7,4). Далее добавляют 5% раствор глутарового альдегида (6 мл) и перемешивают смесь 2 часа. Активированные таким образом частицы промывают и ресуспендируют в 800 мкл PIPES буфера. 0,3 мкмоль амино-модифицированного олигонуклеотида (амино-терминальная модификация) растворяют в воде и добавляют туда же. Суспензию перемешивают в течение 12 часов. Затем частицы промывают ультрачистой водой и ресуспендируют в 500 мкл ультрачистой воды.

Пример 3

Нанесение биодеградируемого слоя

Наночастицы с глутаровым диальдегидным линкером и иммобилизованнными на них олигонуклеотидами, приготовленные в соответствии с примером 2, подвергают лиофильной сушке и методом опрыскивания обрабатывают этанольным раствором, содержащим полигликоль. После удаления растворителя получают наночастицы с биоразлагаемым полигликольным покрытием. Такие покрытия служат, например, для присоединения аптамеров и специфичных к опухолевым клеткам антител.

Пример 4

Связывание активных веществ посредством олигонуклеотидов

В настоящее время синтез олигонуклеотидов по большей части автоматизирован и проводится с использованием известной химии защитных групп. К наночастицам ковалентно пришивают короткий олигонуклеотид, состоящий из 15 нуклеотидов (смотри пример 2). Второй олигонуклеотид, комплементарный первому, присоединяют к активному компоненту доксорубину путем терминальной модификации. Оба компонента соединяют и нагревают при температуре 95°С для денатурации олигонуклеотидов. Две цепочки спариваются одна с другой, формируя двойную цепочку благодаря последующей инкубации при температуре немного ниже температуры плавления олигонуклеотида. Последовательность олигонуклеотида выбирается таким образом, чтобы его температура плавления при физиологических условиях была около 48°С, и таким образом плавление двойной цепочки невозможно. Вследствие нагревания до температуры выше 50°С приготовленная двойная цепочка ДНК количественно расплавляется и активный компонент высвобождается вместе с присоединенным олигонуклеотидом. Одноцепочечная ДНК быстро разрушается при проникновении в клетку, и таким образом активный компонент полностью высвобождается.

Пример 5

Связывание активного вещества посредством тройной спирали нуклеиновых кислот

Двухцепочечная РНК может использоваться в терапии в качестве так называемой siRNA (короткая интерферирующая РНК) для деактивации специфических генов. Если такая РНК должна под внешним контролем отщепляться от наночастиц, использующихся в виде переносчика, способ выбора состоит в связывании через специфическую тройную спираль.

Связующие олигонуклеотидные двойные цепочки и соответствующая используемая siRNA ковалентно связываются с наночастицами посредством терминальной модификации (в соответствии с примером 2). (Это позволяет в последующем формировать так называемый "триплет-образующий олигонуклеотид" (TFO)). Для достижения большей устойчивости по отношению к гидролитическим энзимам используют такие олигонуклеотиды, которые имеют сахар-фосфатный остаток нуклеиновых кислот, замещенный синтетическим пептидоподобным остатком, который имеет структуру аналогичную таковой в нуклеиновых кислотах, так называемые пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК). Ковалентносвязанный олигонуклеотид связывает двуцепочечную РНК в широкой выемке во время гибридизации при температуре, немного ниже температуры плавления целевой тройной спирали (которая одновременно ниже температуры плавления двуцепочечной РНК).

При физиологических условиях не наблюдается заметного высвобождения, поскольку температура плавления 45°С в этом случае не достигается. Только при терапевтическом превышении указанной температуры плавления тройной спирали указанная тройная спираль плавится, высвобождая двухцепочечную siRNA.

Пример 6

Связывание активного вещества посредством олигопептидной молекулы

Чувствительное к температуре связывание через температурно-сензитивный олигопептидный домен особенно подходит для нацеливания генетически продуцируемых полипептидных эффекторов, таких как фактор некроза опухоли (TNFalpha). В этом контексте используется гетеродимеризация, так называемый лейциновый зиппер. Связь стабилизируется и одновременно специфицируется ионными взаимодействиями заряженных групп (аргинин/лизин против глутамат/аспартат).

В наночастицах синтетический олигопептид, состоящий из 22 аминокислот max лейцинового зиппера, связывается посредством терминальной модификации олигопептида. Когда добавляется препарат генетически продуцированного TNF, терминально несущий 22 аминокислоты туе лейцинового зиппера, фактор некроза опухоли количественно связывается с наночастицами. Во время термотерапии превышается температура плавления лейцинового зиппера, и вследствие этого локально высвобождается фактор некроза опухоли (функция которого не подвергается воздействию).

Пример 7

Связывание активных веществ через олигонуклеотидные пептидные связи

В дополнение к специфическим термолабильным взаимодействиям нуклеиновых кислот с нуклеиновыми кислотами и протеинов с протеинами (или соответственно полипептидов с полипептидами) существуют также специфичные (также как и неспецифичные) биологические взаимодействия между протеинами или соответственно полипептидами и нуклеиновыми кислотами. Поскольку такие взаимодействия основаны на тех же самых нековалентных связях, они в целом настолько же термолабильны как и упомянутые ранее, и таким образом, они с тем же успехом могут использоваться в качестве термолабильных линкерных систем для термического выделения активных компонентов. Используются или протеины, которые взаимодействуют неспецифично (например, гистоны или моноцепочечный SSB протеин репликационной вилки ДНК), либо высокоспецифичные к нуклеиновым кислотам (например, репрессоры, факторы трансмиссии). В качестве ДНК-связывающих полипептидов используются так называемые "спираль-поворот-спираль" элементы репрессорных протеинов, так же как и так называемые мотивы "цинковых пальцев" ядерных рецепторных протеинов. Они оба обычно включают около 60 аминокислот. (Элементы цинковых пальцев состоят из двух петель одинакового размера, соответственно имеющих две пары цистеинов, или соответственно одну пару цистеинов и одну пару гистидинов, удерживаемых вместе комплексообразующим атомом цинка). Таким образом образуются две пальцеподобных структуры, достающие до главных бороздок спирали ДНК. Линкер, содержащий последовательность аминокислот, которая специфически распознает палиндромную последовательность ДНК в случае рецепторов стероидных гормонов и включает от 15 до 20 аминокислот, располагается между двумя структурами.

Синтетический олигопептид, состоящий из 60 аминокислот и включающий полный мотив цинковых пальцев глюкокортикоидного рецептора, ковалентно связывается с поверхностью наночастиц. Молекула активного компонента доксорубицина ковалентно пришивается к двуцепочечному олигонуклеотиду, насчитывающему 15 пар оснований включая распознающую последовательность глюкокортикоидного рецептора (так называемый глюкокортикоид-отвечающий элемент GRE). Оба компонента соединяются с образованием комплекса, стабильного при физиологических условиях. При нагревании наночастиц посредством переменного магнитного поля превышается температура плавления комплекса. Вследствие разрушения комплекса высвобождается конъюгат олигонуклеотида и активного компонента.

Пример 8:

Связывание активного компонента посредством связи гаптен-антитело

Спонтанное связывание гаптена как терапевтического средства к аутологическим протеинам может приводить к иммунным реакциям. Присоединение антител также может приводить к нейтрализации эффекта. Указанный эффект используется для обеспечения локальной активации посредством термического разрушения комплексов гаптен/антитело.

Так называемые Fv фрагменты (наименьшие из возможных антиген-связывающих фрагментов антител) антитела, направленного против доксорубицина, произведенные биохимически (или необязательно генетически), ковалентно связываются с поверхностью наночастиц. Антиген-связывающие сайты насыщают добавлением избытка доксорубицина. Насыщенные доксорубицином наночастицы отделяют от неспецифически связанного активного компонента посредством магнитной сепарации или центрифугирования и, если необходимо, дополнительно промываются.

После внутривенного введения насыщенных доксорубицином наночастиц указанные наночастицы циркулируют и большей частью свободны от обычныъх побочных эффектов цитостатика. Неспецифическое аккумулирование наночастиц в наборе опухолей достигается вследствие способности наночастиц покидать сосуды через постоянно регенерирующиеся проницаемые стенки сосудов. В дополнение, специальным покрытием поверхности можно достичь внутриклеточной интеграции в клетки опухолей (вследствие частоты митоза), но не в доброкачественные клетки. После достаточного периода внутриопухолевой аккумуляции наночастицы можно нагреть внешними магнитными полями; это приводит как к повреждению ткани вследствие гипертермии, так и к разрушению комплекса (фрагмента) гаптен/антитело вследствие выделения тепла. Эффект поражения ткани гипертермией усиливается автономным цитотоксическим эффектом, а также сенсибилизирующим эффектом по отношению к излучению, провоцируемому доксорубицином. Таким образом, достигается настоящая синергия в лечении опухоли.

Пример 9:

Связывание активного компонента посредством биотин/авидиновых связей

Нековалентная связь между витамином биотином и связующим протеином авидином из альбумина куриных яиц (или соответственно его бактериальным аналогом стрептавидином) является самым сильным известным нековалентным взаимодействием. Однако, вследствие высокой энергии связывания эта связь не разрушается в пределах достижимого интервала применимых температур. Для того чтобы все же воспользоваться преимуществами указанной высокоспецифичной связи, необходимо использовать производные биотина с уменьшенной силой связывания, такие как дестиобиотин (с константой диссоциации 5х10¹³ по сравнению с 1×10¹⁵ в случае биотина) или иминобиотин (константа диссоциации 3,5×10 ¹¹), связывание которых с (стрепт)авидином физиологически разрушается при терапевтически достижимых температурах.

Иминобиотин связывают через его -аминогруппу с аминогруппой доксорубицина; связь формируется через глутаровый диальдегид. Наночастицы также связываются с коммерчески доступным стрептавидином через аминную функцию покрытия поверхности посредством глутарового диальдегида. Путем добавления избытка иминобиотинил доксорубицина наночастицы насыщаются доксорубицином. Пассивное обогащение указанными заряженными доксорубицином наночастицами часто наблюдается in vivo вследствие проницаемости клеток эндотелия в области опухоли и дополнительно активное обогащение происходит путем эндоцитоза в опухолевые клетки. В этом случае также магнитно индуцированная гипертермия синергетически усиливается термическим выделением сенсибилизатора докорубицина.

Пример 10

Получение наночастиц со связанным цисплатином. предназначенным для последующего высвобождения:

Для связывания цитостатика цисплатина с наночастицами оксида железа, стабилизированными аминосиланом, сначала модифицируют охарактеризованные в примере 1 наночастицы аминопропил-триэтоксисиланом. Для этой цели суспензию непокрытых частиц оксида железа (получена из хлорида железа (II) и хлорида железа (III) осаждением гидроксидом натрия) доводят до рН 5 с помощью уксусной кислоты. Аминопропилтриэтоксисилан добавляют по каплям в молярном отношении по отношению к максимальному теоретическому числу гидрокси-групп, перемешивают 1 час при комнатной температуре и далее смешивают с эквимолярным количеством цисплатина, который реагирует по реакции нуклеофильного замещения с аминогруппой силана.

Полученные модифицированные наночастицы имеют следующую структуру:

Пример 11:

Влияние цисплатиновых наночастиц (в соответствии с примером 10) на клетки глиобластомы

На клетках глиобластомы был испытан водный раствор указанных цисплатиновых наночастиц по сравнению с немодифицированными наночастицами.

Тесты in vitro проводились на клеточной линии глиобластомы человека RUSIRS1 (опухоль мозга). Клетки глиобластомы были взяты из опухолевых тканей пациента и культивировались, как описано в DE 19912798 С1. Для исследования эффективности цисплатиновых наночастиц соответственно 2×10 ⁶ RUSIRS1 клеток готовили в 75 см³ пробирке для клеточных культур с 25 мл среды для культур клеток (D-MEM +20% FBS+1,2 мл пирувата). Суспензию клеток равномерно распределяли в 4 сосуда для культур. Соответственно 153 мкл водного раствора указанных цисплатиновых наночастиц (c_Fe=2 моль/л) добавляли к двум суспензиям клеток. Оставшиеся два сосуда служили стандартом, и в них добавляли 153 мкл водного раствора немодифицированных наночастиц (c_Fe=2 моль/л). Перед добавлением клеток образцы наночастиц нагревали до температуры 37°С в течение 15 минут и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. После добавления наночастиц образцы оставляли на 1 час и затем подвергали воздействию переменного магнитного поля в течение 30 минут. Указанное воздействие повторяли через 24 часа. Уже после 48-часового инкубационного периода при 37°С более выраженные поражения наблюдались в двух образцах с цисплатиновыми наночастицами, по сравнению с двумя образцами, содержащими немодифицированные наночастицы.