способ получения конъюгата (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида с 20-гидроксиэкдизоном и его применение в качестве антиоксидантного средства, ингибирующего процесс перекисного окисления липидов

Формула изобретения

1. Способ получения конъюгата (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида с 20-гидроксиэкдизоном, отличающийся тем, что 20-гидроксиэкдизон взаимодействует со стехиометрическим количеством 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегидом в этилацетате в присутствии кислотного катализатора при температуре ~20°C в течение 24 ч, с последующим дебензилированием полученного промежуточного конъюгата в растворе этанола в присутствии катализатора Pd-C.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве кислотного катализатора использовали пара-толуолсульфокислоту (TsOH) или фосфорномолибденовую кислоту (ФМК) в количестве 10% от веса экдистероида.

3. Применение конъюгата (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида с 20-гидроксиэкдизоном в качестве антиоксидантного средства, ингибирующего процесс перекисного окисления липидов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к органической химии и химии природных соединений, конкретно, способу получения нового соединения, производного 20-гидроксиэкдизона, конъюгированного с короткоцепочечным аналогом витамина Е, перспективного для медицины и фармакологии.

Экдистероиды - гормоны линьки и метаморфоза насекомых - составляют распространенный и разнообразный класс стероидных соединений в природе. Обнаружение гормонов насекомых во многих растениях, а в некоторых видах до 2-3% от сухой массы, позволило выделять эти соединения для изучения их свойств и проведения химических трансформаций [Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды: химия и биологическая активность II Минск: Наука и техника, 1989, 327 с.].

Установлено, что экдистероиды обладают широким спектром биологических свойств, представляющим практический интерес для медицины, и относятся к малотоксичным соединениям [Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Фармакотерапевтический эффект фитоэкдистероидов и неробола при токсическом поражении почек в эксперименте // Эксперим. и клин. фармакол., 2001, № 4, с.56-58; Сыров В.Н., Шахмурова Г.А., Хушбактова З.А. Влияние фитоэкдистероидов и бемитила на функциональные, метаболические и иммунобиологические показатели работоспособности в эксперименте. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, № 5, с.40-43; Шахмурова Г.А., Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Иммуномодулирующая и стресс-протективная активность фитоэкдистероидов экдистерона и туркестерона при иммобилизационном стрессе у мышей. // Химико-фармацевтический журнал, 2010, т.44, № 1, с.9-11]. В ряде модельных экспериментов показано, что 20-гидроксиэкдизон (наиболее распространенный и доступный экдистероид) и его производные проявляет выраженные антиоксидантные свойства, сопоставимые с гидрохиноном и бутилгидрокситолуолом [Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Военно-медиц. журнал., 1999, № 3, с.35; Володин В.В., Ширшова Т.И., Бурцева С.А., Мельник М.В. // Раст. Ресурсы., 1999, т. 35, № 2, с.76; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Укр. биохим. журнал., 1999, т.71, № 2, с.69; Коновалова Н.П., Митрохин Ю.И., Волкова Л.М., Сидоренко Л.И., Тодоров И.Н. // Изв. АН. Сер. биол., 2002, № 6, с.650; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Корнилец Г.В., Холодова Ю.Д. // Биохимия, 1997, т.62, № 6, с.712]. Описано использование в практической медицине лекарственного средства, разработанного на основе 20-гидроксиэкдизона («экдистен») в качестве препарата коррекции нарушенных метаболических процессов в организме человека при лечении различных заболеваний [Сыров В.Н., Хушбактова ЗА., Комарин А.С. и др. Экспериментально-клиническая оценка эффективности применения экдистена при лечении гепатита // Эксперим. и клин. фармакол., 2004, № 5, с.56-59; Сыров В.Н. Фитоэкдистероиды: биологические эффекты в организме высших животных и перспективы использования в медицине. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, № 5, с.40-43].

В последнее время в медицинской химии передовым направлением в создании лекарственных средств является синтез конъюгатов путем химических комбинаций разных молекул с определенными свойствами. Полученные конъюгаты (гибридные молекулы) проявляют либо синергетический эффект, либо обладают эффектом пролонгированного действия в организме, либо строго воздействуют на орган-мишень.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод молекулярной конъюгации витаминов C и аналога витамина E, признанных природных антиоксидантов, взаимодействием вицинальной диольной группы аскорбиновой кислоты с альдегидной функцией хроманильного компонента (аналога витамина E) при катализе n-TsOH. Реакция проводилась в бензоле при нагревании в течение 8 часов, при этом выход образующегося коньюгата составил 55%. Полученный таким образом синтетический конъюгат показал интересные свойства. Обладая антиоксидантной активностью, соизмеримой с природными а-токоферолом или L-аскорбиновой кислотой, он способен улавливать свободные радикалы как в гидрофильной, так и в липофильной тканях организма, повышая иммунный статус [Manfredini S., Vertuani S., Manfredi B., Rossoni G., Calviello G., Palozza P Novel antioxidant agents deriving from molecular combinations of vitamins C and E analogues.// Biorganic and Medicinal Chem., 2000, 8, p.2791-2801].

Конъюгаты экдистероидов с аналогами витамина E или другими фармакофорами неизвестны. Задачей изобретения явился способ получения нового гибридного антиоксиданта на основе синтетической комбинации природного экдистероида - 20-гидроксиэкдизона и C ₂-аналога -токоферола.

Решение поставленной задачи было достигнуто взаимодействием 20-гидроксиэкдизона (1) со стехиометрическим количеством (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида (2) в этилацетате в присутствии каталитического количества пара-толулсульфокислоты TsOH (10% от веса экдистероида) при комнатной температуре (~20°C) течение 24 часов. При этом с выходом 62% образуется бис-конъюгированный аддукт (3). Если n-TsOH заменить на другой катализатор, например, фосфорномолибденовую кислоту (ФМК), то время реакции увеличивается.

6-Дебензилирование конъюгата (3) гладко протекает при гидрировании в растворе этанола в присутствии катализатора Pd-C и приводит к соответствующему соединению (4) со свободными фенольными группами.

Соединения 3, 4 являются новыми. Их структура доказана методами ЯМР ¹H и ¹³ C. Для соединения 4 был снят масс-спектр MALDI TOF и зарегистрирован ион [M+H]⁺. В спектрах ЯМР ¹H и ¹³ C полученных гибридных соединений 3, 4 зарегистрированы сигналы всех атомов углерода и водорода экдистероидного и хроманильного фрагментов молекул.

Полученный экдистероидсодержащий конъюгат с C₂-аналогом витамина E 4 перспективен для использования в качестве адаптогенного и геропротекторного препарата при заболеваниях, связанных с активацией процессов перекисного окисления в организме.

Сущность метода продемонстрирована на следующих примерах.

Пример 1. 2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (3). К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г TsOH, реакционную смесь перемешивали 24 ч при комнатной температуре и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (20 г SiO₂, элюент - CHCl₃). Получили 0.29 г (62%) соединения 3, R_f 0.56 (CHCl₃ -MeOH, 20:1), т.пл. 128-130°C, [ ]_D ²⁰+20.7° (с 2.03, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), , м.д., J, Гц: 0.90 с (3Н, H₃C¹⁸), 1.00 с (3Н, Н₃С¹⁹), 1.17 с (3Н, Н₃ С²¹), 1.27 с (3Н, H₃C²⁶), 1.28 с (3Н, H₃C²⁷), 1.37 с (6Н, СН₃ -С^2' и CH₃-C^2''), 2.11 с, 2.18 с и 2.24 с (18Н, 6 СН₃-Ar), 2.63 м (4Н, H₂C^4' и H₂C^4'' ), 3.62 м (1Н, HC²²), 4.10 м (1Н, HC²), 4.14 м (1Н, НС³), 4.71 с (4Н, OCH₂Ph), 5.18 уш.с. (1Н, НС^2'''', w_1/2 =13.0 Гц), 5.24 уш.с. (1Н, НС^2''', w _1/2=13.0 Гц), 5.85 с (1Н, НС⁷), 7.35-7.50 м (10Н, Н-Ar). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), , м.д.: 11.92, 12.01 и 12.89 (6 Ме-Ar), 17.00 (С¹⁸ ), 20.56 (С¹⁹), 20.56 (С^4' и С ^4''), 21.50 (C¹¹), 23.04 (C¹⁶ ), 23.61 (C²¹), 24.80 (MeC^2'), 24.97 (MeC^2''), 26.68 (С²³), 29.47 (С ²⁶ и С²⁷), 30.86 (С¹⁵), 30.94 (C ⁴), 31.74 (С^3'), 31.85 (С^3'' ) 34.00 (С¹²), 34.71 (С⁹), 37.82 (С ¹), 38.40 (С¹⁰), 41.41 (С²⁴), 45.53 (С¹³), 47.36 (С⁵), 49.74 (С^1''' , С¹⁷), 50.83 (С^1''''), 70.48 (С²⁵), 73.36 (С^2' и С^2'' ), 74.75 (OCH₂Ph), 76.75 (С³), 77.07 (C ²), 83.55 (С²⁰), 83.85 (С²²), 84.86 (С¹⁴), 101.41 и 101.63 (С^2'''' ), 102.00 (С^2'''), 117.41 (C^8a' ), 117.49 (C^8a''), 121.43 (С⁷), 123.04 (С^8' и С^8''), 126.06 (С^7', С^7''), 127.74, 127.76 и 128.47 (Ph), 128.055 (С^5', С^5'' ), 137.97 (ОСН₂-С), 147.48 (C^4a'), 147.60 (C^4a''), 148.39 (С^6' и С^6''), 163,23 (С⁸), 202.62 (С ⁶).

Пример 2. К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г ФМК, реакционную смесь перемешивали 54 ч при комнатной температуре и упарили. Далее обрабатывали как описано в примере 1. Получили 0.29 г (61%) соединения 3, идентичного полученному в примере 1.

2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (4). Через суспензию 0.28 г (0.25 ммоль) соединения 3 и 0.07 г катализатора (10% Pd-C) в 5 мл абс. метанола пропускали водород (контроль ТСХ, ~3 ч). Катализатор отфильтровали, фильтрат упарили. Остаток хроматографировали на колонке (15 г SiO₂, элюент - CHCl₃). Получили 0.23 г (96%) соединения 4, т.пл. 130-134°С, [ ]_D ²⁰+24.5° (с 1.82, CH₂Cl ₂). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), , м.д., J, Гц: 0.81 с (3Н, H₃C¹⁸), 0.97 с (3Н, H₃C¹⁹), 1.15 с (3Н, Н₃ С²¹), 1.26 с (6Н, Н₃С²⁶, Н ₃С²⁷), 1.33 с (3Н, СН₃С^2' ), 1.34 с (3Н, СН₃С^2''), 2.11 с, 2.16 с и 2.18 с (18Н, 6 СН₃-Ar), 2.62 с (4Н, CH ₂ ^4' и CH₂ ^4''), 3.59 м (1Н, С²²), 4.12 м (1Н, HC²), 4.46 м (1Н, HC³), 5.14 уш.с. (1Н, HC^2''''), 5.21 уш.с. (1Н, HC ^2'''), 5.82 с (1Н, HC⁷). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), , м.д.: 11.32, 11.85 и 12.26 (Me-Ar), 16.97 (С¹⁸ ), 20.63 (С¹⁹), 20.63 (С^4' и С ^4''), 21.46 (С¹¹), 23.00 (С¹⁶ ), 23.53 (С²¹), 24.37 (МеС^2'), 24.64 (МеС^2''), 26.65 (С²³), 29.43 (С ²⁶ и С²⁷), 30.82 (С¹⁵), 30.92 (С ⁴), 31.65 (С^3'), 31.95 (С^3'' ) 33.16 (С¹²), 34.69 (С⁹), 37.80 (С ¹), 38.37 (С¹⁰.), 41.38 (С²⁴), 45.42 (С¹³), 47.33 (С⁵), 49.71 (С¹⁷ ), 50.90 (С^1''' и С^1'''' ), 70.51 (С²⁵), 73.05 (С^2'), 73.32 (С^2''), 76.73 (С³), 77.05 (С ²), 83.59 (С²⁰), 83.83 (С²²), 84.80 (С¹⁴), 101.44 и 101.66 (1Н, С^2'''' ) 102.01 (1Н, С^2'''), 117.10 (C^8a' и C^8a''), 118.71(C^5' и C ^5''), 121.38 (С^8', С^8'' , С⁷), 122.64 (С^7'и С^7'' ), 144.81 (C^4a' и C^4a''), 145.11 (С^6'), 163.21 (С⁸), 203.01 (С⁶ ). MALDI-TOF MS: m/z 942.360 [М+Н]⁺. Вычислено для (C₅₇H₈₀O₁₁+H) 942.248.

Для бисаддукта (4) было изучено влияние на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в экспериментах in vitro на гомогенате печени. В опытах т vivo на интактных животных определяли степень накопления малонового диальдегида (МДА) в печени и активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы и супероксиддисмутазы. У животных с острым экспериментальным гепатитом в гомогенате печени определяли содержание диеновых коньюгатов (ДН), малонового диальдегида и восстановленного глютатиона.

Биологическая активность препарата (4) продемонстрирована следующими примерами.

Пример 1. Опыты проводили в системе in vitro на гомогенатах печени нормальных животных (крысы-самцы - 160-180 г). Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) активировали путем добавления сульфата железа (II) (1·10^-4 М) и аскорбиновой кислоты (2·10^-4 М). Один из конечных продуктов ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА) определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Проведенные эксперименты показали выраженное ингибирующее влияние соединения 4 на процессы ПОЛ, что проявляется подавлением реакции образования МДА на 94.2%. Соответствующий эффект витамина Е (использовали аптечный препарат токоферола в конечной концентрации 1·10^-4 г/мл) и экдистерона составлял 83.3 и 27.8% соответственно (табл.1).

Таблица 1
Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на содержание МДА в гомогенате печени крыс в опытах in vitro (M±m, n=6).
Испытуемое вещество	МДА в пробе, нмоль/мг белка	Эффект, в %
Соединение 4	0.107±0.0171,2,3	-94.2
Экдистерон	1.320±0.0421	-27.8
Витамин Е	0.306±0,0241	-83.3
Контроль	1.826±0.079
Примечание. Концентрация всех образцов составляла 1·10-4 г/мг (именно в этой концентрации в условиях нашего опыта проявлялась их максимально выраженное антиоксидантное действие). 1 - достоверно по отношению к контролю, 2 - по отношению к результатам пробы с экдистероном, 3 - по отношению к результатам пробы с витамином Е.

Пример 2. Крысам самцам (160-180 г) орально в течение 7 дней вводили соединение 4 (5 мг/кг), экдистерон (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг). (Дозы предварительно определили как наиболее оптимальные). После окончания эксперимента животных забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). В печени животных определяли содержания МДА [Стальная И.Д., Гариашвили Т.Г. Методы определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.66-68] и активность ферментов антиоксидантной системы: каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) по методам [Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Т. и др. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело, 1988, № 1, с.16-19] и [Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А., Ефимова Л.Ф. Активность и изоферментный спектр супероксиддисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека // Лаб. дело, 1983, № 10, с.30-33].

Проведенные исследования показали, что как и в опытах in vitro, введение соединения 4 в организм животных приводит к угнетению процессов ПОЛ, о чем свидетельствовало понижение содержания в печени МДА на 42% по сравнению с показателями интактной группы. При введении экдистерона и витамина Е содержание МДА в печени понижалось только на 17.9 и 30% (табл.2). При этом в случае введения соединения 4 отмечено также более выраженное повышение активности ферментов, определяющих состояние антиоксидантной защиты организма (табл.2).

Таблица 2
Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на некоторые показатели антиоксидантной системы, уровень МДА в печени крыс (М±m, n=8).
Испытуемое вещество	Каталаза, ммоль/мин/г белка	Эффект, в %	СОД, УЕ/мин/мг белка	Эффект, в %	МДА, нмоль/мг белка	Эффект, в %
Витамин Е	16.8±0.74	+6.3	1.78±0.16	+12.6	0.562±0.028 1	-30
Соединение 4	19.4±1.041	+22.07	2.10±0.20 1	+32.9	0.424±0.022 1,2,3	-42
Экдистерон	17.11±0.98	+8.3	1.91±0.18	+20.9	0.600±0.0301	-17,9
Контроль	15.8±0.98	-	1.58±0.12	-	0.731±0.04	-
Примечание. Обозначения достоверности те же, что и в таблице 1.

Пример 3. Опыты проводили на крысах-самцах массой 180-200 г. Поражение печени у них вызывали путем введения ССЦ (по 0.4 мл 50% масляного раствора на 100 г массы ежедневно в течение 4-х дней) [Левшин Б.И, Экспериментальная фармакотерапия препаратами селена и тиазолидина токсического повреждения печени: Автореф. дис. д-ра мед. наук., Харьков, 1973]. Известно, что CCl₄ является сильным прооксидантом. Начиная со 2-го дня введения CCl₄, крысам орально при помощи специального зонда вводили внутрь экдистерон (5 мг/кг), соединение 4 (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг) (дозы подобрали как наиболее эффективные в предварительных экспериментах).

По истечении 3-х дней после повторного введения препаратов животным (через 2 часа после последнего введения) крыс забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). О выраженности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и восстановленного глютатиона в гомогенате печени. Содержание диеновых коньюгатов и восстановленного глютатиона определяли по методу [Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.63-64] и [Смирнов В.В. Глютатион - зависимая антиоксидантная система головного мозга при черепно-мозговой травме // Дис. канд. мед. наук., СПб, 1995, 153 с.]. Проведенные эксперименты показали, что введение крысам CCl₄ приводило к резкой активации ПОЛ, о чем свидетельствовало увеличение количества ДК, МДА (на 164.8-69.7%) и снижение восстановленного глютатиона (на 51.4%) в гомогенатах печени. Соединение 4 и в этих опытах проявило выраженное антиоксидантное действие, заметно более превосходящее действие экдистерона и витамина Е. Под действием соединения 4 содержание ДК и МДА в печени крыс с CCl₄ - гепатитом было ниже на 53.5 и 36.9% и всего на 23.1 и 7.1% (p>0.05) выше, чем у интактных животных. Экдистерон понижал содержание ДК и МДА только на 29.5 и 20.9%. Витамин Е оказывал тоже выраженный эффект, но и в этом случае содержание ДК и МДА снизилось только на 41.5 и 26.8%. Соединение 4 проявило также выраженный глютатионстабилизирующий эффект. И в этом случае соединение 4 действовало более выражено, чем собственно экдистерон и витамин Е (табл.3).

Таким образом, соединение 4 обладает выраженным антиоксидантным действием, что открывает перспективу его использования при целом ряде заболеваний, в основе которых лежит активация процессов перекисного окисления липидов.

Таблица 3
Антиоксидантная активность соединения 4 в сравнении с экдистероном и витамином Е при поражении печени крыс CCl4 (М±m, n=8).
Условия эксперимента	ДК, мкмоль/г	Эффект, в %	МДА, нмоль/мг белка	Эффект, в %	Глютатион-SH, мкмоль/мг	Эффект, в %
Интактные животные	0.182±0.012		0.700±0.032		8.76±0.32
Контроль (CCl4 - гепатит)	0.482±0.0361		1.188±0.0941		4.26±0.221
CCl4 + препарат (4)	0.224±0.0141,2	-53.5	0.750±0.034 2	-36.9	8.24±0.30 2	+93.4
CCl4 + экдистерон	0.340±0.020 1,2,3	-29.5	0.940±0.0521,2,3	-20.9	6,94±0.32 1,2,3	+62-9
CCl4 + витамин Е	0.282±0.0181,2,3	-41.5	0.870±0.038 1,2,3	-26.8	6.30±0.241,2,3	+47.8
Примечание. 1 - достоверно по отношению к интактным животным, 2 - по отношению к контролю, 3 - по отношению к группе животных получавших на фоне CCl4 соединение 4 (p>0.05).

В результате проведенного тестирования соединение 4 показало более высокую антиоксидантную активность в сравнении с витамином Е и 20-гидроксиэкдизоном (экдистерон).