новые антитела

Формула изобретения

1. Антитело против 5 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую (1) LHVR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQ-N/S-VGSDVA (SEQ ID NO: 10), (2) LHVR2, содержащую аминокислотную последовательность STSYRYS (SEQ ID NO: 11), и (3) LHVR3, содержащую аминокислотную последовательность QQY-N/S-SYPFT (SEQ ID NO: 12), и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую (1) HHVR1, содержащую аминокислотную последовательность GYTF-T/S-DYYLY (SEQ ID NO: 13), (2) HHVR2, содержащую аминокислотную последовательность GISPS-N/S-GGTTF-N/A-D-N/A-FE-N/G (SEQ ID NO: 14), и (3) HHVR3, содержащую аминокислотную последовательность DAYGDWYFDV (SEQ ID NO: 15).

2. Антитело против 5 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, или ее вариант, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 или 9, или ее вариант, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариантную последовательность, содержат вариабельный домен легкой цепи, содержащий три определяющих комплементарность области (CDR) в последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий три определяющих комплементарность области (CDR) в последовательности, представленной в любой из SEQ ID NО: 5, 6, 7, 8 или 9.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 или 9.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, и вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, и вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 7.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, и вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 9.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где последовательность в вариабельном домене тяжелой цепи представляет собой вариант SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 или 9, где вариант последовательности в вариабельном домене тяжелой цепи содержит замену аминокислоты в остатке, выбранном из группы, состоящей из 66, 67 и 69, на основе системы нумерации по Kabat.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.9, где замена аминокислоты выбрана из группы, состоящей из K66R, A67F и L69I.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую (1) LHVR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQNVGSDVA, (2) LHVR2, содержащую аминокислотную последовательность STSYRYS, и (3) LHVR3, содержащую аминокислотную последовательность QQYNSYPFT, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую (1) HHVR1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTDYYLY, (2) HHVR2, содержащую аминокислотную последовательность GISPSNGGTTFNDNFEN, и (3) HHVR3, содержащую аминокислотную последовательность DAYGDWYFDV.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую (1) LHVR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQSVGSDVA, (2) LHVR2, содержащую аминокислотную последовательность STSYRYS, и (3) LHVR3, содержащую аминокислотную последовательность QQYSSYPFT, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую (1) HHVR1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTDYYLY, (2) HHVR2, содержащую аминокислотную последовательность GISPSSGGTTFADAFEG, и (3) HHVR3, содержащую аминокислотную последовательность DAYGDWYFDV.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую (1) LHVR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQSVGSDVA, (2) LHVR2, содержащую аминокислотную последовательность STSYRYS и (3) LHVR3, содержащую аминокислотную последовательность QQYSSYPFT, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую (1) HHVR1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFSDYYLY, (2) HHVR2, содержащую аминокислотную последовательность GISPSSGGTTFADAFEG, и (3) HHVR3, содержащую аминокислотную последовательность DAYGDWYFDV.

14. Антитело против 5 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую (1) LHVR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQSVGSDVA, (2) LHVR2, содержащую аминокислотную последовательность STSYRYS и (3) LHVR3, содержащую аминокислотную последовательность QQYSSYPFT, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую (1) HHVR1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTDYYLY, (2) HHVR2, содержащую аминокислотную последовательность GISPSSGGTTFADSFEG, и (3) HHVR3, содержащую аминокислотную последовательность DAYGDWYFDV.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1, 11-13, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывают альфаVбета3, или альфаVбета5, или альфаVбета1.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1, 11-13, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность Fc из IgG человека.

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.16, где IgG человека представляет собой hIgG1 или hIgG4.

18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.16, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность Fc с отсутствием эффекторной функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 18, где последовательность Fc содержит замену D265A по системе нумерации EU.

20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-19, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)' ₂, одноцепочечного Fv (scFv), Fv-фрагмента, диатела и линейного антитела.

21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15 и 20, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное или химерное антитело.

22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-21, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются выделенными.

23. Конъюгат для лечения, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15 и 20-22 и лекарственное средство.

24. Конъюгат для лечения по п.23, где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из цитотоксического средства, радиоактивного изотопа и химиотерапевтического средства.

25. Конъюгат для лечения, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15 и 20-22 и метку.

26. Конъюгат по п.25, где метка выбрана из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, флуоресцентного красителя и фермента.

27. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15 и 20-22.

28. Экспрессирующий вектор для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и 20-22, где экспрессирующий вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.27.

29. Клетка для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и 20-22, где клетка содержит экспрессирующий вектор по п.28.

30. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки по п.29, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, продуцируемых клеткой.

31. Фармацевтическая композиция для лечения, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и 20-22 и фармацевтически приемлемый носитель.

32. Фармацевтическая композиция по п.31, дополнительно содержащая антагонист VEGF.

33. Способ детекции белка 5 1 в образце от пациента посредством приведения в контакт антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10, 12-15 и 20-22 с образцом и детекции связанного с белком 5 1 антитела против 5 1.

34. Способ по п.33, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используют в иммуногистохимическом анализе (IHC) или анализе ELISA.

35. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и 20-22 для изготовления лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза и/или проницаемости или просачивания сосудов у субъекта.

36. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и 20-22 для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания у субъекта, где при заболевании присутствует аномальный ангиогенез, или проницаемость, или просачивание сосудов.

37. Применение по п.36, где субъект имеет повышенные уровни 5 1 в пораженной заболеванием ткани по сравнению с тканью субъекта, не страдающего заболеванием.

38. Применение по п.35 или 36, где субъекту дополнительно вводят лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства и цитотоксического средства.

39. Способ ингибирования ангиогенеза и/или проницаемости или просачивания сосудов у субъекта, страдающего заболеванием, включающий введение субъекту (i) эффективного количества антитела против 5 1 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и 20-22 и (ii) эффективного количества антагониста VEGF.

40. Способ лечения рака или глазного заболевания, или аутоиммунного заболевания у субъекта, включающий введение субъекту (i) эффективного количества антитела против 5 1 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и 20-22 и (ii) эффективного количества антагониста VEGF.

41. Способ по п.40, где способ предназначен для лечения рака.

42. Способ по п.40, где способ предназначен для лечения глазного заболевания, аутоиммунного заболевания.

43. Способ по п.40, где способ предназначен для лечения аутоиммунного заболевания.

44. Способ по п.39, где субъект имеет повышенные уровни 5 1 в пораженной заболеванием ткани по сравнению с тканью субъекта, не страдающего заболеванием.

45. Способ по п.39, где субъекту дополнительно вводят лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства, ингибирующего рост средства и цитотоксического средства.

46. Способ по п.39, где связывание антагониста VEGF с VEGF человека может конкурентно ингибироваться бевацизумабом.

47. Способ по п.39, где антагонист VEGF представляет собой бевацизумаб.

48. Промышленное изделие для ингибирования ангиогенеза и/или проницаемости или просачивания сосудов, где изделие содержит композицию, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15, 20-22.

49. Изделие по п.48, дополнительно содержащее антагонист VEGF.

50. Изделие по п.48, дополнительно содержащее инструкции по применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для ингибирования ангиогенеза и/или проницаемости или просачивания сосудов у субъекта, страдающего заболеванием.

51. Изделие по п.48, дополнительно содержащее инструкции по применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в комбинации с антагонистом VEGF для ингибирования ангиогенеза и/или проницаемости или просачивания сосудов у субъекта, страдающего заболеванием.

52. Изделие по п.48, где заболевание представляет собой рак или глазное заболевание, или аутоиммунное заболевание.

Описание изобретения к патенту

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США номер 60/975471, поданной 26 сентября 2007 г., полное содержание которой приведено в настоящем документе ссылкой для всех целей.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам против 5 1, композициям и наборам, содержащим антитела, и способам с использованием антител.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Интегрин 5 1 представляет собой гликопротеин мембраны клеток, опосредующий взаимодействия клетка-клетка и клетка-ECM посредством его главного лиганда, фибронектина. Интегрин 5 1 играет роль в миграции, дифференцировке и выживаемости клеток. Уровни интегрина 5 1 повышены в эндотелии сосудов опухоли (например, при карциномах желудка, ободочной и прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциноме, карциномах шейки матки и молочной железы) и в других ангиогенных сосудах. Интегрин 5 1 модулирует связь пристеночных клеток с эндотелиальными клетками и сборку эндотелиального внеклеточного матрикса в ходе ангиогенеза. Соответственно, интегрин 5 1 является полезной мишенью для ингибирования ангиогенеза и сенсибилизации клеток к воздействию антагониста VEGF.

Таким образом, в данной области существует необходимость в композициях и способах для нацеливания на интегрин 5 1. Настоящее изобретение удовлетворяет эту и другие необходимости.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам против 5 1, полученным из антитела, продуцируемого гибридомой 7H5, наборам и композициям, содержащим новые антитела против 5 1, и способам их получения или использования. Антитела против 5 1 по этому изобретению обладают улучшенным связыванием с 5 l по сравнению с антителом, продуцируемым гибридомой 7H5. Такие антитела включают в себя гуманизированные антитела. По другому варианту осуществления новые антитела против 5 1 можно конъюгировать с другим веществом, таким как, в качестве неограничивающих примеров, лекарственное средство или флуоресцентный краситель, или другой маркер для детекции 5 1 у пациентов или в образцах от пациента. Такие новые антитела против 5 1 можно использовать во множестве терапевтических и диагностических способов. Например, такие антитела против 5 1 можно использовать для лечения аномального ангиогенеза, неоплазии, глазных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Такие антитела можно использовать для детекции белка 5 1 у пациентов или в образцах от пациента посредством приведения таких антител в контакт с белком 5 1 у пациентов или в образцах от пациента и количественного или качественного определения антитела против 5 1, связанного с белком 5 1.

В одном варианте осуществления антитела против 5 1 по этому изобретению содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую (1) LHVR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQ-N/S-VGSDVA (SEQ ID NO: 10), (2) LHVR2, содержащую аминокислотную последовательность STSYRYS (SEQ ID NO: 11) и (3) LHVR3, содержащую аминокислотную последовательность QQY-N/S-SYPFT (SEQ ID NO: 12). В другом варианте осуществления антитела против 5 1 по этому изобретению содержат последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую (1) HHVR1, содержащую аминокислотную последовательность GYTF-T/S-DYYLY (SEQ ID NO: 13), (2) HHVR2, содержащую аминокислотную последовательность GISPS-N/S-GGTTF-N/A-D-N/A-FE-N/G (SEQ ID NO: 14) и (3) HHVR3, содержащую аминокислотную последовательность DAYGDWYFDV (SEQ ID NO: 15).

В другом варианте осуществления антитела против 5 1 по этому изобретению содержат вариабельный домен легкой цепи, обладающий последовательностью SEQ ID NO:1, или его вариант, и вариабельный домен тяжелой цепи, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 6, или его вариант. В одном варианте осуществления вариант последовательности вариабельного домена тяжелой цепи содержит аминокислотную замену в остатке, выбранном из группы, состоящей из 30, 48, 49, 54, 60, 62, 65, 66, 67 и 69 (система нумерации Kabat). В другом варианте осуществления вариант последовательности вариабельного домена легкой цепи содержит аминокислотную замену в остатке, выбранном из группы, состоящей из 28, 46 и 92 (система нумерации Kabat). В одном варианте осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из T30S, I48V, G49S, N54S, N60A, N62A, N62S, N65G, K66R, A67F и L69I (система нумерации Kabat). В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из N28S, T46L и N92S (система нумерации Kabat).

Настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 1 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:2 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:6. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:2 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:3 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:8. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:4 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:9.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему в себя стадию(стадии) введения антагониста VEGF и антитела против 5 1 по этому изобретению. В одном из предпочтительных вариантов осуществления рак является способным отвечать на терапию антагонистом VEGF. В другом варианте осуществления способ лечения возрастной дегенерации желтого пятна (AMD), включая влажную связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна, у субъекта, страдающего от AMD, включает в себя стадию(стадии) введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антитела против 5 1 по этому изобретению. В другом варианте осуществления способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта включает в себя стадию (стадии) введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антитела против 5 1.

В одном варианте осуществления субъекту, подлежащему лечению, сначала можно вводить антагонист VEGF, а затем лечить его антителом против 5 1 по этому изобретению. В другом варианте осуществления субъекта лечат антагонистом VEGF и антителом против 5 1 по этому изобретению во время циклов лечения одним из двух лекарственных средств. В другом варианте осуществления субъекта подвергают лечению антагонистом VEGF, пока субъект не перестает отвечать на лечение антагонистом VEGF, и затем субъекта подвергают лечению антителом против 5 1 по этому изобретению. В одном конкретном варианте осуществления субъекта подвергают лечению антагонистом VEGF, если рак является неинвазивным или находится на ранней стадии, и подвергают лечению антителом против 5 1 по этому изобретению, если рак является инвазивным. В другом варианте осуществления субъект, подвергающийся лечению антителом против 5 1 по этому изобретению, обладает повышенными уровнями 5 1 в пораженной заболеванием ткани по сравнению с тканью субъекта, не страдающего заболеванием. В этом случае, способ может дополнительно включать в себя стадию детекции 5 1 у субъекта, например, в пораженной заболеванием ткани после лечения антагонистом VEGF. В одном варианте осуществления инвазивный рак представляет собой метастазирующий рак. В другом варианте осуществления рак на ранней стадии представляет собой рак после лечения адъювантной терапией (например, химиотерапией или хирургическим удалением).

В одном предпочтительном варианте осуществления субъект страдает заболеванием с аномальным ангиогенезом. В другом варианте осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из рака, имунного заболевания или глазного заболевания. В одном из предпочтительных вариантов осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из солидной опухоли, метастазирующей опухоли, опухоли мягких тканей, заболевания, обладающего неоваскуляризацией глаза, воспалительного заболевания с аномальным ангиогенезом, заболевания, возникающего после трансплантации у субъекта, и заболевания с аномальной пролиферацией сосудисто-волокнистой ткани. В другом предпочтительном варианте осуществления, рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы (включая метастазирующий рак молочной железы), рака шейки матки, рак ободочной и прямой кишки (включая метастазирующий рак ободочной и прямой кишки), рака легкого (включая немелкоклеточный рак легкого), неходжкинской лимфомы (NHL), хронического лимфоцитарного лейкоза, почечноклеточного рака, рака предстательной железы, включая устойчивый к гормонам рак предстательной железы, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы, рака мягких тканей, стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, мультиморфной глиобластомы и множественной миеломы. В другом предпочтительном варианте осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из ретинопатии, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (например, влажной AMD), диабетического отека желтого пятна, окклюзии ретинальных вен (RVO) и сухой AMD/географической атрофии (для предотвращения прогрессирования до влажной AMD), покраснения радужки; псориаза, воспалительной почечной недостаточности, гемолитико-уремического синдрома, диабетической нефропатии (например, пролиферативной диабетической ретинопатии), артрита (например, псориатического артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита), воспалительного заболевания кишечника, хронического воспаления, хронического отслоения сетчатки, хронического увеита, хронического витрита, отторжения трансплантата роговицы, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации трансплантата роговицы, болезни Крона, миопии, заболевания неоваскуляризации глаза, болезни Педжета, пемфигоида, полиартериита, заболевания после лазерной радиальной кератотомии, неоваскуляризации сетчатки, синдрома Шегрена, язвенного колита, отторжения трансплантата, воспаления легких, нефротического синдрома, отека, асцитов, связанных со злокачественными новообразованиями, инсульта, ангиофибромы и неоваскулярной глаукомы. В одном варианте осуществления субъекту дополнительно вводят лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства и цитотоксического средства.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления этого изобретения субъект, подлежащий лечению антителом против 5 1, страдает от обострения после лечения антагонистом VEGF или стал устойчивым к лечению антагонистом VEGF. В другом варианте осуществления субъект, подлежащий лечению антителом против 5 1 по этому изобретению и антагонистом VEGF, страдает от метастазирующего рака или его ранее подвергали лечению с помощью адъювантной терапии. В одном варианте осуществления пациент-кандидат испытывает обострение, является невосприимчивым или устойчивым к химиотерапевтическому средству, такому как иринотекан. Такие заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров метастазирующий рак ободочной и прямой кишки, рецидивирующий метастазирующий рак ободочной и прямой кишки, метастазирующий рак молочной железы, рецидивирующий метастазирующий рак молочной железы, метастазирующий HER2+ рак молочной железы, адъювант рак молочной железы, адъювант HER2+ рак молочной железы, метастазирующий рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника после адъювантной терапии, немелкоклеточный рак легкого после адъювантной терапии, рак прямой кишки после адъювантной терапии, немелкоклеточный рак легкого после адъювантной терапии, метастазирующий немелкоклеточный рак легкого, метастазирующий рак яичника, метастазирующий почечно-клеточный рак и почечно-клеточный рак после адъювантной терапии.

В одном варианте осуществления для субъекта, страдающего заболеванием, описанным в настоящем документе, проводят поддерживающую терапию после лечения заболевания антагонистом VEGF, где поддерживающая терапия представляет собой терапию антителом против 5 1 по этому изобретению отдельно или последовательно, или одновременно с антагонистом VEGF.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF может являться выбранным из группы, состоящей из антитела, иммуноадгезина, пептидного антитела, малой молекулы и нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF, в строгих условиях (например, рибозим, миРНК и аптамер). В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF представляет собой антитело. В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антитело против VEGF можно конкурентно ингибировать посредством связывания VEGF человека антителом Авастин®. В другом варианте осуществления антитело против VEGF является человеческим, гуманизированным или химерным. В одном конкретном варианте осуществления антитело против VEGF представляет собой антитело Авастин®. В другом варианте осуществления антитело против VEGF выбрано из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)'₂, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В другом варианте осуществления антагонист VEGF представляет собой биспецифическое антитело, которое связывает VEGF и содержит тяжелую цепь и легкую цепь вариабельного домена антитела против 5 1 по этому изобретению.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления антитело против 5 1 по этому изобретению представляет собой антитело, содержащее Fc-фрагмент из IgG человека. В другом варианте осуществления антитело против 5 1 по этому изобретению содержит домены CH1, CH2 и CH3 из IgG1 человека или hIgG4. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антитело против 5 1 представляет собой гуманизированное антитело. В одном конкретном варианте осуществления антитело против 5 1 представляет собой антитело 7H5 или химерное, или гуманизированное антитело из него. В другом варианте осуществления антитело против 5 1 выбрано из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab) ^' ₂, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В другом варианте осуществления антитело против 5 1 по этому изобретению представляет собой биспецифическое антитело, которое связывает VEGF и 5 1 и является антагонистом VEGF. В другом варианте осуществления антитело против 5 1 по этому изобретению обладает измененной эффекторной функцией. В одном варианте осуществления антитело против 5 1 является измененным для уменьшения или предотвращения активности антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) (например, изменением последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Fc-фрагмент антитела). В другом варианте осуществления антитело против 5 1 изменено для увеличения или уменьшения времени его полужизни у человека (например, изменением последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Fc-фрагмент антитела).

В одном варианте осуществления антитело против 5 1 конъюгируют с цитотоксическим средством или химиотерапевтическим средством. В другом варианте осуществления цитотоксическое средство представляет собой радиоактивный изотоп или токсин.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим антагонист VEGF, антитело против 5 1 по этому изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к изделиям, содержащим инструкции для детекции 5 1 у субъекта, подвергавшегося лечению с помощью антагониста VEGF.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 изображено выравнивание последовательностей вариабельного домена легкой цепи по отношению к клону 7H5 против интегрина 5 1 для следующего: гуманизированное антитело 7H5, основанное на прививке CDR из мышиного 7H5 (h7H5.v1) (SEQ ID NO: 1), гуманизированное антитело 7H5, основанное на замене остатков в CDR-L1, -L3 и -H2 из h7H5.v1 (h7H5.v2, SEQ ID NO:2) и гуманизированные антитела 7H5, основанные на модификации каркаса в h7H5.v2 (h7H5.v4 (SEQ ID NO:3) и h7H5.v5 (SEQ ID NO:4)). Вариабельный домен легкой цепи h7H5.v3 является идентичным последовательности SEQ ID NO:2.

На фигуре 2 изображено выравнивание последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи по отношению к клону 7H5 против интегрина 5 1 для следующего: гуманизированное 7H5 антитело, основанное на прививке CDR из мышиного 7H5 (h7H5.v1) (SEQ ID NO:5), гуманизированное антитело 7H5, основанное на замене остатков в CDR-L1, -L3 и -H2 из h7H5.v1 (h7H5.v2) (SEQ ID NO:6) и гуманизированные антитела 7H5, основанные на модификации каркаса в h7H5.v2 (h7H5.v4 (SEQ ID NO:8) и h7H5.v5 (SEQ ID NO:9)). Вариабельный домен тяжелой цепи The h7H5.v3 является идентичным последовательности h7H5.v2, за исключением того, что он обладает мутацией аминокислоты N62S (последовательность VH h7H5.v3 обозначена SEQ ID NO:7).

На фигуре 3 изображены результаты анализа BIACORE^® химерного 7H5-IgG и гуманизированного 7H5.v1-IgG против интегрина 5 1 человека. (A) Химерное 7H5-IgG и гуманизированное 7H5.v1-IgG иммобилизовали в двух различных проточных ячейках сенсорного чипа CM5 по 450RU (единиц ответа), и 2-кратные серийные разведения интегрина 5 1 человека от 300 нМ до 0,29 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. (B) Интегрин 5 1 человека иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 при 800RU, и 2-кратные серийные разведения 7H5-IgG и гуманизированного 7H5.v1-IgG от 200 нМ до 0,2 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C.

На фигуре 4 изображен фаговый конкурентный ELISA для определения IC50 фага против интегрина 5 1 человека для клона гуманизированного 7H5.v1 с единичной точечной мутацией, представленного на фаге в формате моновалентного Fab.

На фигуре 5 изображено обобщение относительной кратности изменений аффинности связывания (IC50) для каждой единичной точечной мутации по отношению к исходному клону h7H5.v1.

На фигуре 6 изображен фаговый конкурентный ELISA для определения IC50 фага против интегрина 5 1 человека для клонов гуманизированного 7H5.v1 с множественными заменами, представленных на фаге в формате моновалентного Fab. Два первых варианта получены на основании отбора из фигуры 5, как отмечено. В общем, все шесть вариантов обладали сохраненной и немного улучшенной аффинностью связывания; таким образом, два варианта, h7H5.v2 и h7H5.v3, как указано, выбрали для включения замены глицина в положении 65 CDR-H2.

На фигуре 7 изображены результаты анализа BIACORE^® гуманизированных 7H5.v1, v2 и v3-IgG против интегрина 5 1 человека. Гуманизированные 7H5.v1, v2 и v3-IgG иммобилизовали в трех различных проточных ячейках сенсорного чипа CM5 по 450RU (единиц ответа), и 2-кратные серийные разведения интегрина 5 1 человека от 300 нМ до 0,29 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. Для гуманизированного 7H5.v2 показали наибольшее улучшение аффинности связывания для скорости диссоциации.

На фигуре 8 изображен фаговый конкурентный ELISA для определения IC50 фага против интегрина 5 1 человека для клонов гуманизированного 7H5.v2 с модификацией каркаса, представленных на фаге в формате моновалентного Fab. Для большинства замен в каркасе показали сравнимую аффинность связывания по сравнению с h7H5.v2, за исключением положений 49 и 78 тяжелой цепи с заменами глицина на серин и аланина на лейцин, соответственно.

На фигуре 9 изображены результаты анализа BIACORE^® гуманизированных 7H5.v2, v4 и v5-IgG против интегрина 5 1 человека. (A) Гуманизированные 7H5.v2, v4 и v5-IgG иммобилизовали в трех различных проточных ячейках сенсорного чипа CM5 по 450RU (единиц ответа), и 2-кратные серийные разведения интегрина 5 1 человека от 300 нМ до 0,29 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. (B) Интегрин 5 1 человека иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 при 800RU, и 2-кратные серийные разведения гуманизированного 7H5.v2, v4 и v5-IgG от 200 нМ до 0,2 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. В обоих форматах для гуманизированного 7H5.v4 показали сравнимую аффинность связывания по сравнению с гуманизированным 7H5.v2.

На фигуре 10 изображены результаты экспериментов по заживлению ранений кожи, показывающие, что введение комбинации h7H5.v2 и анти-VEGF усиливает антиангиогенные эффекты одного анти-VEGF.

На фигуре 11 изображены результаты экспериментов по заживлению ранений кожи, показывающие, что введение комбинации h7H5.v4 и анти-VEGF усиливает антиангиогенные эффекты одного анти-VEGF.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Введение

Настоящее изобретение основано на идентификации новых антител, которые связывают интегрин 5 1. Антитела против 5 1 получены из моноклонального антитела 7H5, и их можно использовать во множестве терапевтических и диагностических способов. Например, антитела против _{5 1} можно использовать отдельно или в сочетании с другими средствами для лечения аномального ангиогенеза, неоплазии, глазных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Антитела можно использовать также для детекции белка 5 1 у пациентов или в образцах от пациента посредством введения антител против белка _{5 1} пациентам и детекции антитела против _{5 1}, связанного с белком _{5 1} в образце от пациента (например, in vivo или ex vivo) или посредством приведения антител в контакт с образцами от пациента и количественного или качественного определения антитела против _{5 1}, связанного с белком _{5 1}.

II. Определения

«Альфа5бета1» или « 5 1» или «a5b1» или « _{5 1}» представляет собой интегрин, содержащий два различных белка (т.е., субъединицы Альфа5 и бета1). Показано, что 5 1 связывается с фибронектином, L1-CAM и фибриногеном. Интегрин 5 1 известен также как белок очень поздней активации 5, VLA-5, альфа5бета1, CD49e/CD29, рецептор фибронектина, FNR и GPIc-IIa. В предпочтительном варианте осуществления 5 1 представляет собой 5 1 человека.

«Альфа5», применяемая в настоящем документе взаимозаменяемо с CD49e, 5, субъединицей интегрина альфа5, альфа-субъединицей VLA-5, субъединицей IC GPIc-IIa и альфа-цепью FNR, относится к одной субъединице интегрина _{5 1}. Альфа5 имеет четыре изоформы, получаемые альтернативным сплайсингом (A-D), которые отличаются внутри их цитоплазматических доменов. Аминокислотные последовательности изоформ альфа5 человека можно найти, например, под инвентарными номерами в Genbank: X07979, U33879, U33882 и U33880, соответственно.

«Бета1» называют также CD29, бета1, GPIIa тромбоцитов; цепь VLA-бета; цепь бета-1 интегрина, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 и VLA5B. Аминокислотные последовательности для Бета1 человека можно найти, например, под инвентарным номером в Genbank No. X06256.

Термин «VEGF», как применяют в настоящем документе, относится к фактору роста эндотелиальных клеток сосудов человека из 165 аминокислот и родственным факторам роста эндотелиальных клеток сосудов человека из 121, 189 и 206 аминокислот, как описано в Leung et al. Science, 246: 1306 (1989), и Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), вместе с их природными аллельными и процессированными формами. Термин «VEGF» относится также к VEGF из не относящихся к человеку видов, таких как мышь, крыса или примат. Иногда VEGF из конкретных видов указывают такими терминами, как hVEGF для VEGF человека, mVEGF для VEGF мыши и т.д. Термин «VEGF» используют также для обозначения усеченных форм полипептида, содержащих аминокислоты 8-109 или 1-109 из фактора роста эндотелиальных клеток сосудов человека из 165 аминокислот. Ссылку на любую из таких форм VEGF можно идентифицировать в настоящей заявке, например, посредством «VEGF(8-109)», «VEGF(1-109)» или «VEGF₁₆₅». Положения аминокислот для «усеченного» природного VEGF пронумерованы, как указано в природной последовательности VEGF. Например, положение аминокислоты 17 (метионин) в усеченном природном VEGF представляет собой также положение 17 (метионин) в природном VEGF. Усеченный природный VEGF обладает аффинностью связывания для рецепторов KDR и Flt-1, сравнимой с аффинностью природного VEGF. В предпочтительном варианте осуществления VEGF представляет собой VEGF человека.

«Антагонист VEGF» относится к молекуле, способной осуществлять нейтрализацию, блокирование, ингибирование, устранение, снижение или препятствование активности VEGF, включая его связывание с VEGF или с одним или несколькими рецепторами для VEGF, или с кодирующей их нуклеиновой кислотой. Предпочтительно, антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF. Антагонисты VEGF включают в себя антитела против VEGF и их антигенсвязывающие фрагменты, полипептиды, которые связывают VEGF и рецепторы VEGF и блокируют взаимодействие лиганд-рецептора (например, иммуноадгезины, пептидные антитела), антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецептора VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR, аптамеры, которые связывают VEGF, и нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в строгих условиях с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими VEGF или рецептор VEGF (например, РНКи). В предпочтительном варианте осуществления, антагонист VEG связывает VEGF или рецептор VEGF с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В другом предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF между 500 нМ и 1 пМ.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF связывает VEGF и ингибирует индуцированную VEGF пролиферацию эндотелиальных клеток in vitro. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF с большей аффинностью, чем не относящуюся к VEGF молекулу или рецептор не относящейся к VEGF молекулы. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEG связывает VEGF или рецептор VEGF с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В другом предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF между 500 нМ и 1 пМ.

В предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF выбран из группы, состоящей из полипептида, такого как антитело, пептидное антитело, иммуноадгезин, малая молекула или аптамер. В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой антитело против VEGF, такое как антитело АВАСТИН® или антитело против рецептора VEGF, такое как антитело против VEGFR2 или против VEGFR3. Другие примеры антагонистов VEGF включают в себя: VEGF-ловушку, мукаген, PTK787, SUl 1248, AG-013736, Bay 439006 (сорафениб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 и KRN-633.

«Антитело против VEGF» представляет собой антитело, связывающее VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. Предпочтительно, антитело против VEGF по изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства для нацеливания на заболевания или состояния, в которые вовлечена активность VEGF, и создания помех для них. Антитело против VEGF обычно не связывается ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как PlGF, PDGF или bFGF. Предпочтительное антитело против VEGF представляет собой моноклональное антитело, связывающее тот же самый эпитоп, что и моноклональное антитело против VEGF A4.6.1, продуцируемое гибридомой ATCC HB 10709. Более предпочтительно, антитело против VEGF представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, полученное согласно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включая, в качестве неограничивающих примеров, антитело, известное как бевацизумаб (BV; Авастин®). В другом варианте осуществления, антитела против VEGF, которые можно использовать, включают в себя в качестве неограничивающих примеров антитела, описанные в WO 2005/012359. В одном из вариантов осуществления антитело против VEGF содержит вариабельную тяжелую и вариабельную легкую область из любого из антител, описанных на фигурах 24, 25, 26, 27 и 29 из WO 2005/012359 (например, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 и B20.4.1). В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против VEGF, известное как ранибизумаб, представляет собой антагонист VEGF, вводимый при глазном заболевании, таком как диабетическая ретинопатия и влажная AMD.

Антитело против VEGF «Бевацизумаб (BV)», известное также как «rhuMAb VEGF» или «Авастин®», представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, полученное согласно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Оно содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антигенсвязывающие определяющие комплементарность области из мышиного моноклонального антитела против hVEGF A.4.6.1, блокирующие связывание VEGF с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, получено из IgG1, и приблизительно 7% последовательности получено из мышиного антитела A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 149000 дальтон и является гликозилированным. Другие антитела против VEGF включают в себя антитела, описанные в патенте США No. 6884879 и WO 2005/044853.

Антитело против VEGF Ранибизумаб или антитело ЛУЦЕНТИС® или rhuFab V2 представляет собой гуманизированный, подвергнутый аффинному созреванию Fab-фрагмент против VEGF человека. Ранибизумаб получают общепринятыми способами посредством рекомбинантной технологии в экспрессирующем векторе E. coli и бактериальной ферментации. Ранибизумаб не является гликозилированным и обладает молекулярной массой ~48000 дальтон. Смотри WO98/45331 и U.S. 2003/0190317.

Моноклональное антитело против альфа5/бета1, известное как 7H5, депонировано в ATCC как 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421) 7 марта 2006 г.

Молекулы, такие как антитела, характеризующиеся связыванием с перекрывающимися или сходными областями на мишени, можно идентифицировать анализами конкурентного ингибирования/связывания.

В одном варианте осуществления HUVEC или другие клетки, экспрессирующие 5 1, используют в конкурентном анализе ингибирования, и FACS используют для оценки местоположений связывания двух антител против 5 1 друг относительно друга. Например, клетки HUVEC можно промывать в конической пробирке и центрифугировать 5 мин при 1000 об/мин. Осадок, как правило, промывают два раза. Затем клетки можно ресуспендировать, подсчитать и сохранять на льду до использования. 100 мкл первого антитела против _{5 1} (например, начиная с концентрации 1 мкг/мл или более низкой концентрации) можно добавлять в лунку. Затем 100 мкл (например, 20×10⁵ клеток) клеток можно добавлять в лунку и инкубировать на льду в течение 30 мин. Затем 100 мкл биотинилированного антитела против 5 1 (исходный раствор 5 мкг/мл) можно добавлять в каждую лунку и инкубировать на льду в течение 30 мин. Затем клетки промывают и осаждают в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант отсасывают. Второй реагент, конъюгированный с R-фикоэритрином стрептавидин (Jackson 016-110-084), добавляют в лунку (100 мкл, 1:1000). Затем планшет можно завернуть в фольгу и инкубировать на льду 30 мин. После инкубации осадок можно промывать и осаждать 5 мин при 1000 об/мин. Осадок можно ресуспендировать и переносить в пробирки для микротитрования для анализа FACS.

«Ангиогенный фактор или средство» представляет собой фактор роста, стимулирующий развитие кровеносных сосудов, например стимулирующий ангиогенез, рост эндотелиальных клеток, стабильность кровеносных сосудов и/или васкулогенез и т.д. Ангиогенные факторы включают в себя в качестве неограничивающих примеров, например, VEGF и члены семейства VEGF, PlGF, семейство PDGF, семейство фактора роста фибробластов (FGFs), лиганды TIE (ангиопоэтины), эфрины, Del-1, факторы роста фибробластов: кислый (aFGF) и основной (bFGF), фоллистатин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), фактор роста гепатоцитов (HGF) /рассеивающий фактор (SF), интерлейкин-8 (IL-8), лептин, мидкин, фактор роста плаценты, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарный фактор роста, особенно PDGF-BB или PDGFR-бета, плейотропин (PTN), програнулин, пролиферин, трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-альфа), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-альфа), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)/фактор проницаемости сосудов (VPF) и т.д. Ангиогенные факторы включают в себя также факторы, ускоряющие заживление ран, такие как гормон роста, инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), CTGF и члены его семейства, и TGF-альфа и TGF-бета. Смотри, например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, Таблица 1 с перечислением известных ангиогенных факторов); и Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003).

По этому изобретению в одном предпочтительном варианте осуществления «Kd» или «значение Kd» для антитела против VEGF измеряют посредством анализа связывания радиоактивно меченного VEGF (RIA), проведенного с вариантом Fab антитела и молекулой VEGF, как описано в следующем анализе, где аффинность связывания Fab с VEGF в растворе измеряют посредством уравновешивания Fab минимальной концентрацией (¹²⁵ I)-меченного VEGF(109) в присутствии серий для титрования немеченного VEGF с удерживанием затем связанного VEGF на планшете, покрытом антителом против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Чтобы подготовить условия для этого анализа, микропланшеты для титрования (Dynex) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл антитела для захвата против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (pH 9,6) и затем блокируют 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I] VEGF(109) смешивают с серийными разведениями интересующего Fab, например Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем интересующий Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно продолжать в течение 65 часов, чтобы убедиться, что равновесие достигнуто. Затем смеси переносят в планшет для захвата для инкубации при комнатной температуре в течение одного часа. Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% Tween-20 в PBS. Когда планшеты высыхают, добавляют 150 мкл/лунку сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard), и планшеты просчитывают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, обеспечивающие связывание, меньшее или равное 20% от максимального, выбирают для использования в конкурентных анализах связывания. Согласно другому варианту осуществления Kd или значение Kd измеряют с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore -2000 или BIAcore -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным hVEGF при ~10 единицах ответа (RU). Коротко, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям производителя. VEGF человека разводят в 10 мМ ацетате натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/минуту для достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции VEGF инъецируют 1 M этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики инъецируют двукратные серийные разведения Fab (0,78 нМ - 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости связывания (k_on) и скорости диссоциации (k_off) вычисляют с использованием простой модели связывания один-к-одному Лэнгмюра (программное обеспечение BIAcore Evaluation версии 3.2) посредством одновременного подбора для сенсограмм связывания и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) вычисляют как соотношение k_off/k_on. Смотри, например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Если скорость связывания превышает 10⁶ M^-1 сек ^-1 по вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса, тогда скорость связывания можно определить с использованием способа тушения флуоресценции, которым измеряют увеличение или уменьшение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C для 20 нМ антитела против VEGF (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций короткой формы VEGF человека (8-109) или VEGF мыши, как измеряют в спектрофотометре, таком как спектрофотометр, оборудованный для остановки потока (Aviv Instruments), или спектрофотометр серий 8000 SLM-Aminco (ThermoSpectronic) с перемешивающей кюветой. Сходные анализы связывания можно проводить для определения Kd Fab или антитела против 5 1 с использованием 5 1 в качестве мишени.

Как применяют в настоящем документе, субъект, подлежащий лечению, представляет собой млекопитающее (например, человека, не относящегося к человеку примата, крысу, мышь, корову, лошадь, свинью, овцу, козу, собаку, кошку и т.д.). Субъект может представлять собой пациента клиники, добровольца клинического исследования, экспериментального животного и т.д. У субъекта могут подозревать наличие или риск наличия рака, иммунного заболевания или любого другого заболевания с аномальным ангиогенезом, субъекту могут ставить диагноз рак, иммунное заболевание или любое другое заболевание с аномальным ангиогенезом. Многие диагностические способы для рака, иммунного заболевания или любого другого заболевания с аномальным ангиогенезом и клиническое выделение этих заболеваний известны в данной области. В одном из предпочтительных вариантов осуществления субъект, подлежащий лечению по этому изобретению, представляет собой человека.

Термин «аномальный ангиогенез» присутствует, когда новые кровеносные сосуды растут либо избыточно, либо иным образом неадекватно (например, когда локализация, сроки, степень или начало ангиогенеза являются нежелательными с медицинской точки зрения) в состоянии заболевания, или когда он вызывает состояние заболевания. В некоторых случаях, избыточный, неконтролируемый, или иным образом неадекватный ангиогенез присутствует, когда присутствует рост новых кровеносных сосудов, вносящий вклад в ухудшение состояния заболевания или вызывающий состояние заболевания, такое как рак, особенно васкуляризованные солидные опухоли и метастазирующие опухоли (включая рак ободочной кишки, рак легкого (особенно мелкоклеточный рак легкого) или рак предстательной железы), заболевания, вызванные неоваскуляризацией глаза, особенно диабетическая слепота, ретинопатии, первичная диабетическая ретинопатия или связанная с возрастом дегенерация желтого пятна, хориоидальная неоваскуляризация (CNV), диабетический отек желтого пятна, патологическая миопия, болезнь Гиппель-Линдау, гистоплазмоз глаза, окклюзия центральной вены сетчатки (CRVO), неоваскуляризация роговицы, неоваскуляризация сетчатки и покраснение радужки; псориаз, псориатический артрит, гемангиобластома, такая как гемангиома; воспалительные заболевания почек, такие как гломерулонефрит, особенно мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром, диабетическая нефропатия или гипертензивный нефросклероз; различные воспалительные заболевания, такие как артрит, особенно ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, саркоидоз, артериосклероз артерий и заболевания, возникающие после трансплантаций, эндометриоз или хроническая астма и более 70 других состояний. Новые кровеносные сосуды могут подпитывать пораженные заболеванием ткани, разрушать нормальные ткани, и, в случае рака, новые сосуды могут позволять опухолевым клеткам уходить в кровоток и расселяться в других органах (метастазы опухоли). Настоящее изобретение относится к лечению тех пациентов, которые подвержены риску развития вышеупомянутых заболеваний.

«Аномальная проницаемость сосудов» присутствует, когда поток жидкостей, молекул (например, ионов и питательных веществ) и клеток (например, лимфоцитов) между сосудистым и внесосудистым пространством является избыточным или иным образом неадекватным (например, когда локализация, сроки, степень или начало проницаемости сосудов являются нежелательными с медицинской точки зрения) в состоянии заболевания, или когда она вызывает состояние заболевания. Аномальная проницаемость сосудов может приводить к избыточному или иным образом неадекватному «просачиванию» ионов, воды, питательных веществ или клеток через сосудистую систему. В некоторых случаях, избыточная, неконтролируемая или иным образом неадекватная проницаемость сосудов или просачивание сосудов усиливает или индуцирует состояния заболевания, включая, например, отек, связанный с опухолями, включая, например, опухоли мозга; асциты, связанные со злокачественными новообразованиями; синдром Мейгса; воспаление легких; нефротический синдром; перикардиальный выпот; плевральный выпот; проницаемость, связанную с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как состояния после инфарктов миокарда и инсультов, и т.п. Настоящее изобретение относится к лечению пациентов с развитием или с риском развития заболеваний и нарушений, связанных с аномальной проницаемостью сосудов или просачиванием.

Другие пациенты, которые являются кандидатами для введения антител или полипептидов по этому изобретению, страдают от или подвержены риску развития аномальной пролиферации сосудисто-волокнистой ткани, красных угрей, синдрома приобретенного иммунодефицита, окклюзии артерий, атопического кератита, бактериальных язв, болезни Бехчета, распространяемыми с кровотоком опухолями, каротидного обструктивного заболевания сонной артерии, хориоидальной неоваскуляризации, хронического воспаления, хронического отслоения сетчатки, хронического увеита, хронического витрита, слишком длительного ношения контактных линз, отторжения трансплантата роговицы, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации трансплантата роговицы, болезни Крона, болезни Илза, эпидемического кератоконъюнктивита, грибковых язв, инфекции простым герпесом, инфекции опоясывающим герпесом, синдромов повышенной вязкости крови, саркомы Капоши, лейкоза, липидной дегенерации, болезни Лайма, маргинального кератолиза, язвы роговицы Морена, инфекций микобактериями, отличными от лепры, миопии, заболевания неоваскуляризации глаза, ямок диска зрительного нерва, синдрома Ослера-Вебера (Ослера-Вебера-Рандю), остеоартрита, болезни Педжета, заднего циклита, пемфигоида, фликтенулеза, полиартериита, осложнений после лазерного лечения, инфекций простейшими, эластической псевдоксантомы, сухого кератита птеригия, осложнений после радиальной кератотомии, неоваскуляризации сетчатки, ретинопатии недоношенных, ретролентальных фиброплазий, саркоида, склерита, серповидноклеточной анемии, синдрома Шегрена, солидных опухолей, болезни Штаргардта, болезни Стивенса-Джонсона, верхнего лимбального кератита, сифилиса, системной волчанки, краевой дегенерации Террьена, токсоплазмоза, травмы, опухолей из саркомы Юинга, опухолей из нейробластомы, опухолей из остеосаркомы, опухолей из ретинобластомы, опухолей из рабдомиосаркомы, язвенного колита, окклюзии вен, недостаточности витамина A и саркоидоза Вегенера, нежелательного ангиогенеза, связанного с диабетом, паразитарных заболеваний, аномального заживления ран, гипертрофии после хирургического вмешательства, ранения или травмы, замедления роста волос, замедления овуляции и формирования желтого тела, замедления имплантации и замедления развития эмбриона в матке.

Виды терапии против ангиогенеза являются применимыми при общем лечении отторжения трансплантата, воспаления легких, нефротического синдрома, преэклампсии, перикардиального выпота, такого как связанный с перикардитом, и плеврального выпота, заболеваний и нарушений, характеризующихся нежелательной проницаемостью сосудов или просачиванием сосудов, например отека, связанного с опухолями мозга, асцитов, связанных со злокачественными новообразованиями, синдрома Мейгса, воспаление легких, нефротического синдрома, перикардиального выпота, плеврального выпота, проницаемость, связанную с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как состояние после инфарктов миокарда и инсультов, и т.п.

Другие зависимые от ангиогенеза заболевания по этому изобретению включают в себя ангиофиброму (аномальные кровеносные сосуды, подверженные кровотечению), неоваскулярную глаукому (рост кровеносных сосудов в глазу), артериовенозные мальформации (аномальные связи между артериями и венами), несрастающиеся переломы (переломы, которые не заживают), атеросклеротические бляшки (отверждение артерий), пиогенную гранулему (общераспространенное поражение кожи, состоящее из кровеносных сосудов), склеродермию (форму заболевания соединительной ткани), гемангиому (опухоль, состоящую из кровеносных сосудов), трахому (главную причину слепоты в странах третьего мира), гемофилическую артропатию, слипания сосудов и гипертрофические рубцы (аномальное формирование рубца).

«Лечение» относится и к лечебным, и к профилактическим или предупредительным мерам для заболевания. Нуждающиеся в лечении включают в себя тех, кто уже обладает нарушением, так же как тех, для кого нарушение необходимо предупредить.

Термины «повторение», «рецидив» или «рецидивирующий» относится к возвращению рака или заболевания после клинической оценки исчезновения заболевания. Диагноз отдаленного метастазирования или местного рецидива можно считать повторением.

Термин «невосприимчивый» или «устойчивый» относится к раку или заболеванию, не отвечающему на лечение.

Термин «адъювантная терапия» относится к лечению, проводимому после первичной терапии, обычно хирургической операции. Адъювантная терапия для рака или заболевания может включать в себя иммунную терапию, химиотерапию, радиотерапию или гормональную терапию.

Термин «поддерживающая терапия» относится к плановой повторной терапии, которую проводят, чтобы помочь поддерживать эффекты предшествующего лечения. Поддерживающую терапию часто проводят, чтобы помочь сохранять рак в состоянии ремиссии или продлить ответ на конкретную терапию независимо от прогрессирования заболевания.

Термин «инвазивный рак» относится к раку, распространяющемуся за пределы слоя ткани, в котором он начался, в нормальные окружающие ткани. Инвазивные виды рака могут являться или не являться метастазирующими.

Термин «неинвазивный рак» относится к раку на очень ранней стадии или к раку, не распространяющемуся за пределы ткани возникновения.

Термин «выживаемость без прогрессирования» в онкологии относится к длительности времени во время и после лечения, когда рак не растет. Выживаемость без прогрессирования включает в себя количество времени, когда пациенты испытывают полный ответ или частичный ответ, так же как количество времени, когда пациенты испытывают стабильное заболевание.

Термин «прогрессирующее заболевание» в онкологии может относиться к росту опухоли более чем на 20 процентов со времени начала терапии - либо из-за увеличения по массе, либо из-за распространения опухоли.

«Нарушение» представляет собой любое состояние, при котором является благоприятным лечение антителом. Например, для млекопитающих, страдающих от аномального ангиогенеза (избыточного, неадекватного или неконтролируемого ангиогенеза) или аномальной проницаемости сосудов или просачивания, или нуждающихся в профилактике против них. Это включает в себя хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающего к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры нарушений, подлежащих лечению, в настоящем документе включают в себя злокачественные и доброкачественные опухоли; нелейкозные и лимфоидные злокачественные новообразования; нейрональные, глиальные, астроцитарные, гипоталамические и другие гландулярные, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцелиальные нарушения; и воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения.

Термины «рак» и «раковый» обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Рак включает в себя в качестве неограничивающих примеров карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают в себя плоскоклеточный рак, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак ободочной и прямой кишки, карциному эндометрия, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени, рак головы и шеи, рак прямой кишки, рак ободочной и прямой кишки, рак легкого, рак прямой кишки, рак ободочной и прямой кишки, рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, плоскоклеточный рак (например, плоскоклеточный рак эпителия), рак предстательной железы, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, желудочный рак или рак желудка, включая желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, ретинобластому, астроцитому, текомы, арренобластомы, гепатому, гематологические злокачественные новообразования, включая неходжкинскую лимфому (NHL), множественную миелому и острые гематологические злокачественные новообразования, карциному эндометрия или тела матки, эндометриоз, фибросаркомы, хориокарциному, карциному слюнной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, карциномы пищевода, гепатокарциному, анальную карциному, карциному полового члена, носоглоточную карциному, карциномы гортани, саркому Капоши, меланому, карциномы кожи, шванному, олигодендроглиому, нейробластомы, рабдомиосаркомы, остеогенную саркому, лейомиосаркомы, карциномы мочевыводящих путей, карциномы щитовидной железы, опухоль Вильмса, также как B-клеточную лимфому (включая неходжкинскую лимфому низкой степени злокачественности/фолликулярную (NHL); мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL; NHL промежуточной степени злокачественности/фолликулярную; диффузную NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; NHL высокой степени злокачественности из мелких клеток с нерасщепленными ядрами; генерализованную NHL; лимфому из клеток мантийной зоны; связанную со СПИД лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и лимфопролиферативное нарушение после трансплантации (PTLD), a также как аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, и синдром Мейгса.

«Опухоль», как применяют в настоящем документе, относится к любым росту и пролиферации неопластических клеток, злокачественным или доброкачественным, и ко всем предраковым и злокачественным клеткам и тканям.

Термин «антинеопластическая композиция» или «антинеопластическое средство» относится к композиции, применимой для лечения рака, содержащей по меньшей мере одно активное лекарственное средство, например «противораковое средство». Лекарственные средства (противораковые средства) включают в себя в качестве неограничивающих примеров химиотерапевтические средства, ингибирующие рост средства, цитотоксические средства, средства, применяемые для радиотерапии, средства против ангиогенеза, вызывающие апоптоз средства, антитубулиновые средства и другие средства для лечения рака, такие как антитела против HER-2, антитела против CD20, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva ), ингибиторы тромбоцитарного фактора роста (например, Gleevec (мезилат иматиниба)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), связывающиеся с одной или несколькими из следующих мишеней: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BAFF, BR3, APRIL, рецептор(ы) BCMA или VEGF, TRAIL/Apo2, и другие биологически активные и органические химические средства и т.д. Их сочетания также предусматривают по этому изобретению.

«Ингибирующее рост средство» при применении в настоящем документе относится к соединению или композиции, ингибирующим рост или пролиферацию клеток in vitro и/или in vivo. Таким образом, ингибирующее рост средство может представлять собой средство, значительно уменьшающее процент клеток в S-фазе. Примеры ингибирующих рост средств включают в себя средства, блокирующие прогрессирование клеточного цикла (в точке, отличной от S-фазы), такие как средства, индуцирующие арест в G1 и M-фазе. Классические блокаторы M-фазы включают в себя алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), ТАКСОЛ®, и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Средства, вызывающие арест в G1, распространяются также на арест в S-фазе, например алкилирующие ДНК средства, такие как тамоксифен, преднизон, декарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил, и ара-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, озаглавленная «Cell cycle regulation, oncogenes, и antineoplastic drugs», Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно p. 13.

Термин «цитотоксическое средство», как применяют в настоящем документе, относится к веществу, ингибирующему или предотвращающему функционирование клеток и/или вызывающему разрушение клеток. Термин предназначен, чтобы включать в себя радиоактивные изотопы (например, I¹³¹, 1¹²⁵ , Y⁹⁰ и Re¹⁸⁶), химиотерапевтические средства и токсины, такие как ферментативно активные токсины, происходящие из бактерий, грибов, растений или животных, или их фрагменты.

«Химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, применимое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают в себя алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид ЦИТОКСАН®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогинины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкриастатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднемустин, трофосфамид, иприт урацила; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как эндииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма1I и калихеамицин омегаI1 (смотри, например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин A; бисфосфонаты, такие так клодронат; эсперамицин; так же как хромофор неокарциностатин и сходные хромофоры хромопротеиновых эндииновых антибиотиков, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин Adriamycin® (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; средство, восполняющее недостаток фолиевой кислоты, такое как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2'-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангвидин); уретан; виндезин; декарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ара-C»); циклофосфамид, тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел Taxjl® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофора, сконструированный на основе альбумина препарат из наночастиц паклитаксела Abraxane (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), и доксетаксел Taxofere® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин Gemsar®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платинум; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин Navelbine®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Камптосар, CPT-11) (включая режимы лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая режимы лечения оксалиплатином (FOLFOX); ингибиторы PKC-альфа, Raf, H-Ras и EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva )), уменьшающие пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного.

Химиотерапевтические средства включают в себя также антигормональные средства, которые действуют для регуляции или ингибирования воздействия гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен Nolvadex®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен Fareston; ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, который регулирует продукцию эстрогена в надпочечниках, например, такие как 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, ацетат магестрола Megase®, экземестан Aromasin®, форместан, фадрозол, ворозол Rivizor®, Femara® лектрозол и анастрозол Arimidex®; и антиандрогенные средства, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; также как троксацитабин (аналог нуклеозида цитозина 1,3-диоксолан); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, те, которые ингибируют экспрессию генов в сигнальных путях, вовлеченных в аберрантную пролиферацию клеток, например, таких как PKC-альфа, Raf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим Angiozyme®) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как вакцины для генотерапии, например вакцина Allovectin®, вакцина Luvectin® и вакцина Vaxid®; rIL-2 Proleukin®; ингибитор топоизомеразы 1 Lurtotecan®; Abarelix® rmRH; винорелбин и эсперамицины (смотри Патент США No. 4675187), и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного.

Термин «пролекарство», как применяют в этой заявке, относится к форме предшественника или производного фармацевтически активного вещества (например, малой молекулы), которая является менее цитотоксической для пораженных заболеванием клеток по сравнению с исходным лекарственным средством и которую можно ферментативно активировать или превращать в более активную исходную форму. Смотри, например, Wilman, «Prodrugs in Cancer Chemotherapy» Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., «Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery», Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по этому изобретению включают в себя в качестве неограничивающих примеров, содержащие фосфат пролекарства, содержащие тиофосфат пролекарства, содержащие сульфат пролекарства, содержащие пептид пролекарства, модифицированные D-аминокислотами пролекарства, гликозилированные пролекарства, содержащие -лактам пролекарства, содержащие, необязательно, замещенный феноксиацетамид пролекарства или содержащие, необязательно, замещенный фенилацетамид пролекарства, 5-фторцитозиновые и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые можно превращать в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство. Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые можно дериватизировать в форму пролекарства для применения по этому изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров, те химиотерапевтические средства, которые описаны выше.

«Выделенный», при использовании для описания различных полипептидов, указанных в настоящем документе, обозначает полипептид, идентифицированный и отделенный и/или выделенный из клетки или культуры клеток, из которых он экспрессирован. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой материалы, которые, как правило, препятствуют диагностическим или терапевтическим применениям полипептида и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления полипептид очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (2) до гомогенности при SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенный полипептид включает в себя полипептид в рекомбинантных клетках in situ, поскольку в этом случае отсутствует по меньшей мере один компонент естественного окружения полипептида. Однако, как правило, выделенный полипептид получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

«Выделенная» кодирующая полипептид нуклеиновая кислота или кодирующая другой полипептид нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которую идентифицируют и отделяют по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты находится в другой форме или окружающих условиях, чем обнаруженные в природе. Выделенные молекулы кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты, таким образом, отличаются от конкретной молекулы кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты, как она существует в природных клетках. Однако выделенная молекула кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты включает в себя кодирующие полипептид молекулы нуклеиновой кислоты, находящиеся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, где, например, расположение молекулы нуклеиновой кислоты на хромосоме отличается от расположения в природных клетках.

Термин «контрольные последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контрольные последовательности, которые являются пригодными для прокариот, например, включают в себя промотор, необязательно, последовательность оператора и участок связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируются в качестве пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосом является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связанный» означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры не должны являться смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в соответствующих участках рестрикции. Если таких участков нет, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

«Строгие условия» или «условия высокой строгости», как определяют в настоящем документе, можно идентифицировать как те, в которых: (1) применяют низкую ионную силу и высокую температуру для отмывки, например 0,015 M хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) применяют во время гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамида с 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/буфером 50 мМ фосфатом натрия при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42ºC; или (3) гибридизация в течение ночи в растворе, где применяют 50% формамид, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 x раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS, и 10% декстран сульфат при 42°C, с отмывкой 10 минут при 42°C в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) с последующими 10 минутами промывки высокой строгости, состоящей из 0,1 x SSC, содержащего ЭДТА, при 55°C.

Аминокислотные последовательности, описанные в настоящем документе, представляют собой непрерывные аминокислотные последовательности, если не указано иначе.

Как применяют в настоящем документе, термин «иммуноадгезин» обозначает антителоподобные молекулы, сочетающие специфичность связывания гетерологичного белка («адгезин») с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. Структурно, иммуноадгезины содержат слитые аминокислотную последовательность с желаемой специфичностью связывания, отличную от участка узнавания и связывания антигена из антитела (т.е. являются «гетерологичными»), и последовательность константного домена иммуноглобулина. Часть адгезина молекулы иммуноадгезина, как правило, представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере участок связывания рецептора или лиганда - такого как VEGFR или лиганд фибронектин. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине можно получить из любого иммуноглобулина, такого как иммуноглобулин подтипов IgG-1, IgG-2, IgG-3, или IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM. Пептидные антитела, которые часто содержат последовательность, полученную при отборе с помощью фагового дисплея последовательностей, которые специфически связывают Fc-фрагмент иммуноглобулина, можно рассматривать как иммуноадгезины в настоящем документе.

Термин «антитело» применяют в самом широком смысле, и он конкретно охватывает, например, отдельные моноклональные антитела (включая антитела - агонисты, антагонисты и нейтрализующие антитела), композиции антитела с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные анти-антитела, и фрагменты антител (смотри ниже), пока они специфически связывают природный полипептид и/или обладают биологической активностью или иммунологической активностью по этому изобретению. В одном варианте осуществления антитело связывает олигомерную форму белка-мишени, например тримерную форму. В другом варианте осуществления антитело специфически связывает белок, и это связывание можно ингибировать посредством моноклонального антитела по этому изобретению (например, депонированного антитела по этому изобретению и т.д.). Фраза «функциональный фрагмент или аналог» антитела представляет собой соединение, обладающее качественной биологической активностью, общую с антителом, к которому оно относится. Например, функциональный фрагмент или аналог антитела по этому изобретению может представлять собой тот, который может специфически связывать VEGF или 5 1. В одном варианте осуществления антитело может предотвращать или по существу уменьшать способность VEGF индуцировать пролиферацию клеток.

«Выделенное антитело» представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой материалы, которые препятствуют диагностическим или терапевтическим применениям антитела, и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело очищают (1) до более чем до 95% масс. антитела, как определяют способом Лоури, и наиболее предпочтительно, более чем до 99% масс., (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности при SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает в себя антитело в рекомбинантных клетках in situ, поскольку в этом случае отсутствует по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

Основная 4-цепочечная единица антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепь, и, таким образом, содержит 10 антигенсвязывающих участков, в то время как секретируемые антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных комплексов, содержащих 2-5 основных 4-цепочечных единиц вместе с J-цепью). В случае IgG, 4-цепочечная единица, как правило, составляет приблизительно 150000 дальтон. Каждая L цепь связана с H цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две H цепи связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями в зависимости от изотипа H цепи. Каждая H и L цепь также обладает расположенными с равными интервалами дисульфидными мостиками внутри цепи. Каждая H цепь имеет на N-конце вариабельный домен (V_H), за которым следуют три константных домена (C_H) для каждой из и цепей, и четыре C_H домена для и изотипов. Каждая L имеет на N-конце вариабельный домен (V_L), за которым следует константный домен (C _L) на другом его конце. V_L расположен параллельно V_H, а C_L расположен параллельно первому константному домену тяжелой цепи (C_H1). Полагают, что конкретные аминокислотные остатки формируют поверхность контакта между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Объединение V_H и V_L вместе формирует один антигенсвязывающий участок. Структуру и свойства различных классов антител, смотри, например, в BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 8^th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, страница 71 и раздел 6.

L цепь из любых видов позвоночных можно отнести к одному из двух четко различимых типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константных доменов их тяжелых цепей (C_H), иммуноглобулины можно отнести к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, обладающие тяжелыми цепями, обозначенными , , , и соответственно. Классы и далее разделяют на подклассы на основании относительно незначительных различий в последовательности и функции C _H, например у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что конкретные части вариабельных доменов сильно отличаются по последовательности среди антител. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность не является равномерно распределенной на протяжении участка вариабельных доменов из 110 аминокислот. Вместо этого V-участки состоят из относительно инвариантных участков, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками высокой вариабельности, называемыми «гипервариабельными участками», длина которых составляет 9-12 аминокислот. Каждый из вариабельных доменов природных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, главным образом, приминающих конфигурацию -слоев, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые формируют петли, объединяющие структуру -слоев, и, в некоторых случаях, формирующие ее часть. Гипервариабельные области в каждой цепи расположены вместе в непосредственной близости от FR и, вместе с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEIN OF IMMUNOLOGICAL INTEREST , 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но они проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

Термин «гипервариабельная область» при применении в настоящем документе относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Как правило, гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки в районе приблизительно 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в V_L, и в районе приблизительно 31-35B (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в V _H (в одном варианте осуществления, H1 находится в районе приблизительно 31-35); Kabat et al., выше и/или такие остатки из «гиперварибельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в V_L, и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в V_H; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Области HVR по этому изобретению включают положения: 24-36 (LHVR1), 46-56 (LHVR2) и 89-97 (LHVR3) вариабельного домена легкой цепи, и 26-35 (HHVR1), 47-65 (HHVR2) и 93-102 (HHVR3) вариабельного домена тяжелой цепи (система нумерации Kabat, Kabat et al., выше 1991).

На протяжении настоящего описания и формулы изобретения, как правило, используют систему нумерации Kabat, когда имеют в виду остаток в вариабельном домене (приблизительно, остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al, выше (1991)). «Систему нумерации EU» или «индекс EU», как правило, используют, когда имеют в виду остаток в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, опубликованный в Kabat et al., выше (1991), в явной форме включенной в настоящий документ в качестве ссылки). Если в настоящем документе не указано иначе, ссылки на номера остатков в вариабельном домене антител означают нумерацию остатков в соответствии с системой нумерации Kabat. Если в настоящем документе не указано иначе, ссылки на номера остатков в константном домене антител означают нумерацию остатков в соответствии с системой нумерации EU.

Термин «моноклональное антитело», как применяют в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции в основном гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфическими, являясь направленными против одного антигенного участка. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело из препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты антигена. В дополнение к их специфичности, препараты моноклональные антитела являются преимущественными, поскольку их можно синтезировать без загрязнения другими антителами. Определение «моноклональное» не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, применимые по настоящему изобретению, можно получить способом гибридомы, впервые описанном в Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или можно получить с использованием способов рекомбинантной ДНК в клетках бактерий, эукариотических клетках животных или растений (смотри, например, Патент США No. 4816567). «Моноклональные антитела» можно также выделять из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol Biol., 222:581-597 (1991) или с использованием способов, указанных в примерах ниже.

Моноклональные антитела в настоящем документе включают в себя «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи(цепей) является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, также как фрагменты таких антител, пока они обладают биологической активностью по этому изобретению (патент США No. 4816567; и Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющие интерес химерные антитела в настоящем документе включают в себя «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные из не относящегося к человеку примата (например, низших узконосых обезьян, человекообразных обезьян и т.д.), и человеческие последовательности константной области.

«Интактное» антитело представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающий участок, так же как C_L и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи, C_H1, C_H 2 и C_H3. Константные домены могут представлять собой константные домены с природной последовательностью (например, константные домены с человеческой природной последовательностью) или вариант их аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями.

«Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab') ₂ и Fv; диатела; линейные антитела (смотри Патент США No. 5641870, Пример 2; Zapata et al, Protein Eng, 8(10): 1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечного антитела; и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител.

Выражение «линейные антитела», в общем, относится к антителам, описанным в Zapata et al, Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Кратко, эти антитела содержат пару тандемных Fd-фрагментов (VH-CH1-VH-CH1), которые, вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи, формируют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут являться биспецифическими или моноспецифическими.

Расщеплением антител папаином получают два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, и оставшийся «Fc»-фрагмент, обозначение которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из целой L цепи вместе с доменом вариабельной области H цепи (V_H) и первым константным доменом одной тяжелой цепи (C_H1). Каждый Fab-фрагмент является моновалентным по отношению к связыванию антигена, т.е., обладает одним антигенсвязывающим участком. Обработкой антитела пепсином получают один большой F(ab')₂-фрагмент, который приблизительно соответствует двум связанным дисульфидными мостиками Fab фрагментам, обладающим активностью двухвалентного связывания антигена и еще способным к перекрестному связыванию антигена. Fab' фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что имеют несколько дополнительных остатков на C-конце домена C_H1, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем документе представляет собой обозначение для Fab', в котором остаток(остатки) цистеина константных доменов несет свободную тиоловую группу. F(ab')₂-фрагменты антитела первоначально получили как пары Fab'-фрагментов с наличием шарнирных цистеинов между ними. Известны также другие химические соединения фрагментов антитела.

Fc-фрагмент содержит C-концевые части обеих H цепей, удерживаемые вместе дисульфидными мостиками. Эффекторные функции антител определяются последовательностями Fc-области, и эта область также является частью, узнаваемой Fc-рецепторами (FcR), обнаруженными на конкретных типах клеток.

«Вариант Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от природной последовательности Fc-области вследствие по меньшей мере одной «модификации аминокислоты», как определено в настоящем документе. Предпочтительно, вариант Fc-области обладает по меньшей мере одной заменой аминокислоты по сравнению с природной последовательностью Fc-области или с Fc-областью исходного полипептида, например от приблизительно одной до приблизительно десяти замен аминокислот, и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти замен аминокислот в природной последовательности Fc-области или в Fc-области исходного полипептида. В одном варианте осуществления вариант Fc-области в настоящем документе обладает по меньшей мере приблизительно 80% гомологией, по меньшей мере приблизительно 85% гомологией, по меньшей мере приблизительно 90% гомологией, по меньшей мере приблизительно 95% гомологией или по меньшей мере приблизительно 99% гомологией с природной последовательностью Fc-области. В другом варианте осуществления вариант Fc-области в настоящем документе обладает по меньшей мере приблизительно 80% гомологией, по меньшей мере приблизительно 85% гомологией, по меньшей мере приблизительно 90% гомологией, по меньшей мере приблизительно 95% гомологией или по меньшей мере приблизительно 99% гомологией с Fc-областью исходного полипептида.

Термин «содержащий Fc-область полипептид» относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин (смотри определения ниже), который содержит Fc-область. C-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) Fc-области можно удалять, например, во время очистки полипептида или посредством рекомбинантной модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Соответственно, композиция, содержащая полипептиды, включая антитела, обладающие Fc-областью по этому изобретению, может содержать популяции полипептидов со всеми удаленными остатками K447, популяции полипептидов без удаленных остатков K447 или популяции полипептидов, содержащие смесь полипептидов с остатком K447 и без него.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный участок, узнающий и связывающий антиген. Этот фрагмент состоит из димера вариабельной области одной тяжелой и одной легкой цепи в жесткой, нековалентной связи. Из укладки двух этих доменов происходят шесть гипервариабельных петель (по 3 петли из каждой из цепей H и L), которые предоставляют аминокислотные остатки для связывания антигена и сообщают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако даже отдельный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных для антигена) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем целый связывающий участок.

«Одноцепочечные Fv», обозначаемые также сокращением «sFv», или «scFv», представляют собой фрагменты антитела, содержащие V_H и V_L домены антитела, соединенные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет scFv формировать желательную структуру для связывания антигена. Обзор scFv смотри в Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, ниже.

Термин «диатела» обозначает малые фрагменты антител, полученные конструированием фрагментов sFv (смотри предыдущий абзац) с короткими линкерами (приблизительно 5-10 остатков) между доменами V_H и V_L, так что достигают спаривания V доменов между цепями, но не одной и той же цепи, что приводит к образованию двухвалентного фрагмента, т.е., фрагмента, обладающего двумя антигенсвязывающими участками. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры двух «кроссоверных» фрагментов sFv, в которых домены V_H и V_L двух антител присутствуют на различных полипептидных цепях. Диатела более полно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., PNAS USA, 90:6444-6448 (1993).

«Гуманизированные» формы не относящихся к человеку антител (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку антитела. В основном, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменяют остатками из гипервариабельной области не относящихся к человеку видов, (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или не относящийся к человеку примат, которые обладают желательной специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не относящимися к человеку остатками. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в донорном антителе. Эти модификации выполняют для дополнительного улучшения параметров антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, и, как правило, из двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям из не относящегося к человеку иммуноглобулина, а все или по существу все FR представляют собой FR из последовательности иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело, необязательно, содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константного домена иммуноглобулина человека. Более подробно смотри в Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

«Видоспецифическое антитело» представляет собой антитело, обладающее более сильной аффинностью связывания для антигена из первого вида млекопитающих, чем для гомолога этого антигена из второго вида млекопитающих. В норме видоспецифическое антитело «специфически связывает» антиген человека (т.е., обладает значением аффинности связывания (Kd) не более чем приблизительно 1×10^-7 M, не более чем приблизительно 1×10 ^-8 M или не более чем приблизительно 1×10^-9 M), но обладает аффинностью связывания для гомолога антигена из второго, не относящегося к человеку, вида млекопитающих, по меньшей мере, приблизительно в 50 раз, или, по меньшей мере, приблизительно в 500 раз, или по меньшей мере, приблизительно в 1000 раз более слабой, чем его аффинность связывания для антигена человека. Видоспецифическое антитело может принадлежать к любому из различных типов антител, как определено выше, но предпочтительно представляет собой гуманизированное или человеческое антитело.

В таких вариантах осуществления степень связывания полипептида, антитела, антагониста или композиции с «не являющимся мишенью» белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания полипептида, антитела, антагониста или композиции с их конкретным белком-мишенью, как определяют анализом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS) или радиоиммунопреципитации (RIA). По отношению к связыванию полипептида, антитела, антагониста или композиции с молекулой-мишенью, термин «специфическое связывание» или «специфически связывает» или является «специфическим для» конкретного полипептида или эпитопа конкретного полипептида-мишени обозначает связывание, которое измеримо отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание можно измерять, например, определением связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая, как правило, представляет собой молекулу сходной структуры, не обладающей активностью связывания. Например, специфическое связывание можно определить посредством конкуренции с контрольной молекулой, которая является сходной с мишенью, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание отмечают, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Термин «специфическое связывание» или «специфически связывает» или является «специфическим для» конкретного полипептида или эпитопа конкретного полипептида-мишени, как применяют в настоящем документе, можно проиллюстрировать, например, молекулой, обладающей Kd для мишени по меньшей мере приблизительно 10^-4 M, по меньшей мере приблизительно 10^-5 M, по меньшей мере приблизительно 10^-6 M, по меньшей мере приблизительно 10^-7 M, по меньшей мере приблизительно 10^-8 M, по меньшей мере приблизительно 10^-9 M, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 10^-10 M, по меньшей мере приблизительно 10^-11 M, по меньшей мере приблизительно 10^-12 M, или более. В одном варианте осуществления термин «специфическое связывание» относится к связыванию, где молекула связывает конкретный полипептид или эпитоп конкретного полипептида без существенного связывания с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.

«Эффекторные функции» антитела относятся к тем видам биологической активности, которые можно приписать Fc-области (природной последовательности Fc-области или варианту аминокислотной последовательности Fc-области) антитела, и которые меняются с изотипом антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают в себя: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов поверхности клеток; и активацию B-клеток. «Природная последовательность Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, обнаруженной в природе. Примеры последовательностей Fc описаны, в качестве неограничивающих примеров, в Kabat et al., выше (1991)).

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» или «гомологию» по отношению к последовательностям полипептида и антитела, идентифицированным в настоящем документе, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных с аминокислотными остатками в сравниваемом полипептиде после выравнивания последовательностей, рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно выполнять различными способами, известными в данной области, например, с применением свободно доступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по полной длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей по настоящему документу величины % идентичности аминокислотных последовательностей получали с применением компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Авторство компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2 принадлежит Genentech, Inc., и исходный код подан с пользовательской документацией в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где зарегистрирован под U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной из Genentech, Inc., South San Francisco, California. Программу ALIGN-2 следует компилировать для применения в операционной системе UNIX, предпочтительно digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены в программе ALIGN-2 и не меняются.

Термины «Fc-рецептор» или «FcR» используют для обозначения рецептора, связывающегося с Fc-областью антитела. В одном варианте осуществления FcR по этому изобретению представляет собой тот, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов Fc RI, Fc RII и Fc RIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы Fc RII включают в себя Fc RIIA («активирующий рецептор») и Fc RIIB («ингибирующий рецептор»), обладающие сходными аминокислотными последовательностями, различающимися в первую очередь своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор Fc RIIA в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный содержащий тирозин активирующий мотив (ITAM). Ингибирующий рецептор Fc RIIB в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный содержащий тирозин ингибирующий мотив (ITIM) (смотри обзор M. в Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор FcR приведен в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). К термину «FcR» в настоящем документе относятся другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем. Термин включает в себя также неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

Термин «FcRn» относится к неонатальному Fc-рецептору (FcRn). FcRn является структурно сходным с главным комплексом гистосовместимости (MHC) и состоит из -цепи, нековалентно связанной с 2-микроглобулином. Обзор множества функций неонатального Fc-рецептора FcRn приведен в Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn играет роль в пассивной доставке иммуноглобулинов IgG от матери к потомству и в регуляции уровней IgG в сыворотке. FcRn может действовать как рецептор спасения, связывая и транспортируя IgG после пиноцитоза в интактной форме, как внутри клетки, так и между клетками, и спасая их от действующего по умолчанию пути деградации.

В WO 00/42072 (Presta) и в Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описаны варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. Содержание этих публикаций конкретно приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

«CH1 домен» Fc-области IgG человека (обозначаемый также как домен «C1» из «H1») обычно простирается от приблизительно аминокислоты 118 до приблизительно аминокислоты 215 (система нумерации EU).

«Шарнирную область», как правило, определяют как простирающуюся от Glu216 до Pro230 IgG1 человека (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Шарнирные области других изотипов IgG можно выравнивать с последовательностью IgG1 посредством помещения первого и последнего остатков цистеина, формирующих S-S связи между тяжелыми цепями, в одинаковые положения.

«Нижнюю шарнирную область» из Fc-области обычно определяют как участок остатков непосредственно на C-конце от шарнирной области, т.е. остатки 233-239 из Fc-области. В предыдущих сообщениях связывание FcR, как правило, приписывали аминокислотным остаткам в нижней шарнирной области из Fc-области IgG.

«CH2 домен» Fc-области IgG человека (обозначаемый также «C2» из «H2» домена) обычно простирается от приблизительно аминокислоты 231 до приблизительно аминокислоты 340. CH2 домен является уникальным в том, что он не является близко спаренным с другим доменом. Скорее, две N-связанных разветвленных углеводных цепи расположены между двумя CH2 доменами интактной нативной молекулы IgG. Выдвинуто предположение, что углевод может обеспечивать замену спаривания домен-домен и помогает стабилизировать CH2 домен. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).

«CH3 домен» (обозначаемый также как «C2» или «H3» домен) содержит участок остатков на C-конце от CH2 домена в Fc-области (т.е. от приблизительно аминокислотного остатка 341 до C-конца последовательности антитела, как правило, на аминокислотном остатке 446 или 447 IgG).

«Функциональная Fc-область» обладает «эффекторными функциями» природной последовательности Fc-области. Иллюстративные «эффекторные функции» включают в себя связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов поверхности клеток (например, B-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Для таких эффекторных функций, как правило, необходимо объединение Fc-области со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценивать с использованием различных анализов, например, как описано в настоящем документе.

«C1q» представляет собой полипептид, содержащий участок связывания для Fc-области иммуноглобулина. C1q вместе с двумя сериновыми протеазами, C1r и C1s, формирует комплекс C1, первый компонент пути комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Коммерческий C1q можно закупать, например, из Quidel, San Diego, CA.

Термин «связывающий домен» относится к области полипептида, связывающейся с другой молекулой. В случае FcR, связывающий домен может содержать часть его полипептидной цепи (например, его альфа-цепь), ответственную за связывание с Fc-областью. Одним из применимых связывающих доменов является внеклеточный домен альфа-цепи FcR.

Антитело или пептидное антитело с вариантом Fc IgG с «измененной» аффинностью связывания FcR или активностью ADCC представляет собой антитело, обладающее либо усиленной, либо уменьшенной активностью связывания FcR (например, Fc R или FcRn) и/или активностью ADCC по сравнению с исходным полипептидом или с полипептидом, содержащим природную последовательность Fc-области. Вариант Fc, который «обладает увеличенным связыванием» с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более высокой аффинностью (например, с более низкой кажущейся Kd или значением IC50), чем исходный полипептид или природная последовательность Fc IgG. В некоторых вариантах осуществления улучшение связывания по сравнению с исходным полипептидом составляет улучшение связывания приблизительно в 3 раза, предпочтительно, приблизительно в 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 раз, или приблизительно на 25%-1000%. Вариант полипептида, который «обладает уменьшенным связыванием» с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более низкой аффинностью (например, с более высокой кажущейся Kd или с более высоким значением IC50), чем исходный полипептид. Уменьшение связывания по сравнению с исходным полипептидом может составлять приблизительно уменьшение связывания на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или более.

«Антителозависимая опосредуемая клетками цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемые Ig, связанные с Fc-рецепторами (FcR), находящимися на конкретных цитотоксических клетках (например, на естественных киллерных (NK) клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяют этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью, а затем уничтожать клетку-мишень посредством цитотоксинов. Антитела являются «оружием» цитотоксических клеток и являются абсолютно необходимыми для такого уничтожения. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только Fc RIII, в то время как моноциты экспрессируют Fc RI, Fc RII и Fc RIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в таблице 3 на странице 464 из Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки активности представляющей интерес молекулы в отношении ADCC, можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патенте США No. 5500362, или 5821337, или в примерах ниже. Применимые для таких анализов эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, активность представляющей интерес молекулы в отношении ADCC можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, такой как описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

Полипептид, содержащий вариант Fc-области, который «обладает увеличенной ADCC» или опосредует антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно, чем полипептид, обладающий Fc IgG дикого типа, или исходный полипептид, представляет собой полипептид, который in vitro или in vivo является по существу более эффективным для опосредования ADCC, когда количества полипептида с вариантом Fc-области и полипептида с Fc-областью дикого типа (или исходного полипептида) в анализе являются по существу одинаковыми. Как правило, такие варианты идентифицируют с использованием анализа ADCC in vitro, как описано в настоящем документе, однако предусматривают также другие анализы или способы для определения активности ADCC, например, в модели на животных и т.д. В одном варианте осуществления предпочтительный вариант является в от приблизительно 5 раз до приблизительно 100 раз, например, в от приблизительно 25 до приблизительно 50 раз более эффективным для опосредования ADCC, чем Fc дикого типа (или исходный полипептид).

«Комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Классический путь активации комплемента начинается со связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), связанными с распознанным антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и увеличенной или уменьшенной способностью связывания C1q, описаны в патенте США No. 6194551 и WO 99/51642. Содержание этих патентных публикаций конкретно приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Смотри также Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).

«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. В одном варианте осуществления клетки экспрессируют по меньшей мере Fc RIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительными являются PBMC и NK-клетки. Эффекторные клетки можно выделять из их природных источников, например из крови или PBMC, как описано в настоящем документе.

Способы определения связывания с FcRn известны (смотри, например, Ghetie 1997, Hinton 2004), а также описаны в примерах ниже. Связывание с FcRn человека in vivo и время полужизни полипептидов, связывающих с высокой аффинностью FcRn человека, можно оценивать, например, у трансгенных мышей или в трансфицированных линиях клеток человека, экспрессирующих FcRn человека, или у приматов после введения полипептидов - вариантов Fc. В одном варианте осуществления конкретно антитела против 5 1 по изобретению с вариантом Fc IgG обладают увеличенной аффинностью связывания для FcRn человека, превышающей аффинность связывания полипептида с Fc IgG дикого типа, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 125 раз, по меньшей мере в 150 раз. В конкретном варианте осуществления аффинность связывания для FcRn человека увеличена приблизительно в 170 раз.

В отношении аффинности связывания с FcRn, в одном варианте осуществления EC50 или кажущаяся K_D (при pH 6,0) полипептида составляет менее 1 мкМ, более предпочтительно, меньше или равна 100 нМ, более предпочтительно, меньше или равна 10 нМ. В одном варианте осуществления для увеличенной аффинности связывания с Fc RIII (F158; т.е. изотип с низкой аффинностью), EC50 или кажущаяся K_D меньше или равна 10 нМ, и для Fc RIII (V158; изотип с высокой аффинностью) EC50 или кажущаяся K_D меньше или равна 3 нМ. В другом варианте осуществления уменьшение связывания антитела с Fc-рецептором по сравнению с контрольным антителом (например, антителом Herceptin®) можно считать значимым по сравнению с контрольным антителом, если соотношение значений поглощения в средних точках кривых связывания тестируемого антитела и контрольного антитела (например, A_{450нм(антитела)} /A_{450нм(контрольного антитела)}) меньше или равно 40%. В другом варианте осуществления увеличение связывания антитела с Fc-рецептором по сравнению с контрольным антителом (например, антителом Herceptin®), можно считать значимым по сравнению с контрольным антителом, если соотношение значений поглощения в средних точках кривых связывания тестируемого антитела и контрольного антитела (например, A_{450нм(антитела)} /A_{450нм(контрольного антитела)}) больше или равно 125%.

«Исходный полипептид» или «исходное антитело» представляет собой полипептид или антитело, содержащее аминокислотную последовательность, из которой происходит вариант полипептида или антитела, и с которым сравнивают вариант полипептида или антитела. Как правило, в исходном полипептиде или исходном антителе отсутствует одна или несколько модификаций Fc-области, описанных в настоящем документе, и они отличаются по эффекторной функции по сравнению с вариантом полипептида, как описано в настоящем документе. Исходный полипептид может содержать природную последовательность Fc-области или Fc-область с предсуществующими модификациями аминокислотной последовательности (такими как вставки, делеции и/или замены).

Антитела по этому изобретению можно получить посредством фагового дисплея. Как применяют в настоящем документе, «библиотека» относится к множеству последовательностей антитела или фрагментов антитела, или нуклеиновых кислот, кодирующих эти последовательности, где последовательности отличаются комбинациями вариантов аминокислот, введенных в эти последовательности способами по изобретению.

«Фаговый дисплей» представляет собой способ, посредством которого варианты полипептидов экспонируют в виде слитых белков по меньшей мере с частью белка оболочки на поверхности частиц фага, например нитевидного фага. Применимость фагового дисплея основана на факте, что большие библиотеки рандомизированных вариантов белка можно быстро и эффективно отсортировать по тем последовательностям, которые связывают антиген-мишень с высокой аффинностью. Экспонирование пептидных и белковых библиотек на фаге используют для скрининга миллионов полипептидов для отбора одного со специфическими свойствами связывания. Способы поливалентного фагового дисплея использовали для экспонирования малых случайных пептидов и малых белков посредством слияния их генов с геном III или геном VIII нитевидного фага. Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992), и процитированные в этом документе ссылки. В моновалентном фаговом дисплее, гены белковой или пептидной библиотеки сливают с геном III или его частью и экспрессируют на низких уровнях в присутствии гена белка III дикого типа, так что на фаговых частицах экспонировано по одной копии слитых белков или не экспонировано слитых белков. Эффекты авидности снижены по сравнению с поливалентным фагом, так что отбор проходит на основе собственной аффинности лиганда, и используют фагмидные векторы, упрощающие манипуляции с ДНК. Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991).

«Фагмида» представляет собой плазмидный вектор, обладающий бактериальной точкой начала репликации, например, ColE1, и копией межгенной области бактериофага. Фагмиду можно использовать для любого известного бактериофага, включая нитевидный бактериофаг и лямбдоидный бактериофаг. Плазмида также, как правило, содержит селективный маркер для устойчивости к антибиотику. Фрагменты ДНК, клонированной в эти векторы, можно размножать в форме плазмид. Когда клетки, несущие эти векторы, обеспечивают всеми генами, необходимыми для продукции фаговых частиц, тип репликации плазмиды меняется на репликацию по типу катящегося кольца для получения копий одной цепи плазмидной ДНК и упаковки фаговых частиц. Фагмиды могут формировать инфекционные или неинфекционные фаговые частицы. Этот термин включает в себя фагмиды, содержащие ген белка оболочки фага или его фрагмент, связанный с геном гетерологичного полипептида, так что гетерологичный полипептид экспонирован на поверхности фаговых частиц.

Термин «фаговый вектор» обозначает двухцепочечную репликативную форму бактериофага, содержащую гетерологичный ген и способную к репликации. Фаговый вектор обладает фаговой точкой начала репликации, позволяющей репликацию фага и формирование фаговых частиц. Фаг предпочтительно представляет собой нитевидный бактериофаг, такой как фаг M13, f1, fd, Pf3 или его производное, или лямбдоидный фаг, такой как лямбда, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 и т.д., или его производное.

Ковалентные модификации полипептидов, такие как пептидные антитела, иммуноадгезины, антитела и короткие пептиды, включены в объем этого изобретения. Один тип ковалентной модифкации включает в себя проведение реакции намеченных аминокислотных остатков полипептида с органическим дериватизирующим средством, способным реагировать с выбранными боковыми цепями или с N- или C-концевыми остатками полипептида. Дериватизация бифункциональными средствами является применимой, например, для сшивания полипептида с не растворимой в воде поддерживающей матрицей или поверхностью для применения в способе очистки антител, и наоборот. Общепринятые сшивающие средства включают в себя, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, например, сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные сложные имидные эфиры, включая сложные эфиры дисукцинилимидила, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), бифункциональные малеинимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан и такие средства, как метил-3-[(p-азидофенил)дитио]пропиоимидат.

Другие модификации включают в себя дезамидирование остатков глутаминила и аспарагинила до соответствующих остатков глутамила и аспартила, соответственно, гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование -аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties , W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], ацетилирование N-концевого амина и амидирование любой C-концевой карбоксильной группы.

Другие модификации включают в себя конъюгацию с антагонистами токсинов, таких как майтанзин и майтанзиноиды, калихеамицин и другие цитотоксические средства.

Другой тип ковалентной модификации полипептида включает в себя связывание полипептида с одним из множества небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем (PEG), полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, способом, описанным в патентах США No. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.

Полипептид по настоящему изобретению можно модифицировать также, если это является преимущественным, таким способом, чтобы получить химерную молекулу, содержащую полипептид, слитый с другим, гетерологичным, полипептидом или аминокислотной последовательностью (например, иммуноадгезины или пептидные антитела).

В одном варианте осуществления такая химерная молекула содержит полипептид, слитый с доменом трансдукции белка, который нацеливает полипептид для доставки к различным тканям и, более конкретно, через гематоэнцефалический барьер, с использованием, например, домена трансдукции белка из белка TAT вируса иммунодефицита человека (Schwarze et al., 1999, Science 285:1569-72).

В другом варианте осуществления такая химерная молекула содержит полипептид, слитый с полипептидом-меткой, предоставляющей эпитоп, с которым может избирательно связываться антитело против метки. Эпитоп-метку, как правило, можно помещать на N- или C-конце полипептида. Присутствие меченных эпитопом форм полипептида можно детектировать с использованием антитела против полипептида-метки. Предоставление эпитопа-метки позволяет легкую очистку полипептида аффинной очистки с использованием антитела против метки или другого типа аффинной матрицы, связывающейся с эпитопом-меткой. Различные полипептиды-метки и соответствующие антитела известны в данной области. Примеры включают в себя метки из полигистидина (поли-His) или поли-гистидина-глицина (поли-His-gly); полипептид-метку HA вируса гриппа и антитело против нее 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol, 8:2159-2165 (1988)]; метку c-myc и антитела против нее 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; и метку из гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса и антитело против нее [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Другие полипептиды-метки включают в себя Flag-пептид [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; пептид эпитопа KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид эпитопа -тубулина [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; и пептидную метку из белка гена 10 T7 [Lutz-Freyermuth et al., PNAS USA, 87:6393-6397 (1990)].

В альтернативном варианте осуществления химерная молекула может содержать полипептид, слитый с иммуноглобулином или конкретной областью иммуноглобулина. Для бивалентной формы химерной молекулы (например, «иммуноадгезина»), можно получать такой слитный белок с Fc-областью молекулы IgG. Слитные белки с Ig по этому изобретению включают в себя полипептиды, содержащие приблизительно или только человеческие остатки 94-243, остатки 33-53 или остатки 33-52 вместо по меньшей мере одной вариабельной области в молекуле Ig. В особенно предпочтительном варианте осуществления слитый с иммуноглобулином белок включает в себя шарнирную, CH2 и CH3, или шарнирную, CH1, CH2 и CH3 области молекулы IgG1. Получение слитых с иммуноглобулинами белков смотри также в патенте США No. 5428130.

Изобретение относится к способам и композициям для ингибирования или предотвращения рецидива роста опухоли или рецидива роста раковых клеток. В различных вариантах осуществления рак представляет собой рецидив роста опухоли или рецидив роста раковой клетки, где число раковых клеток значительно не уменьшилось, или увеличилось, или размер опухоли значительно не уменьшился, или увеличился, или не удается далее уменьшать размер или число раковых клеток. Определение того, представляют ли собой раковые клетки рецидив роста опухоли или рецидив роста раковых клеток можно проводить in vivo или in vitro любым способом, известным в данной области для анализа эффективности лечения раковых клеток. Опухоль, устойчивая к лечению против VEGF, является примером рецидива роста опухоли.

«Эффективное количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции, как описано в настоящем документе, представляет собой количество, достаточное для осуществления конкретно указанной цели. «Эффективное количество» можно определять эмпирически и посредством известных способов, в зависимости от поставленной цели.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела, полипептида или антагониста по этому изобретению, эффективное для «лечения» заболевания или нарушения у млекопитающего (называемого также пациентом). В случае рака, терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снижать количество раковых клеток; уменьшать размер или массу опухоли; ингибировать (т.е., замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать, т.е., замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или смягчать до некоторой степени один или несколько симптомов, связанных с раком. До той степени, до которой лекарственное средство может предотвращать рост раковых клеток и/или убивать существующие раковые клетки, оно может являться цитостатическим и/или цитотоксическим. В одном варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой ингибирующее рост количество. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, продлевающее выживаемость пациента. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, улучшающее выживаемость без прогрессирования пациента.

В случае заживления ран, термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для ускорения или улучшения заживления ран у субъекта. Терапевтическая доза представляет собой дозу, которая оказывает терапевтический эффект на пациента, а субтерапевтическая доза представляют собой дозу, которая не оказывает терапевтический эффект на подвергавшегося лечению пациента.

«Хроническая рана» относится к ране, которая не заживает. Смотри, например, Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994). Хронические раны включают в себя в качестве неограничивающих примеров, например, артериальные язвы, диабетические язвы, пролежни, венозные язвы и т.д. Острая рана может развиваться в хроническую рану. Острые раны включают в себя в качестве неограничивающих примеров раны, вызванные, например, термическим повреждением, травмой, хирургической операцией, удалением обширного рака кожи, глубокими грибковыми и бактериальными инфекциями, васкулитом, склеродермией, пемфигусом, токсическим эпидермальным некролизом и т.д. Смотри, например, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, опубликовано 24 октября 2001 г. «Нормальная рана» относится к ране, подвергающейся восстановлению нормальным заживлением раны.

«Ингибирующее рост количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции по этому изобретению представляет собой количество, способное ингибировать рост клеток, особенно опухолевых, например, раковых клеток, либо in vitro, либо in vivo. «Ингибирующее рост количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции по этому изобретению для целей ингибирования роста неопластических клеток можно определять эмпирически и посредством известных способов или посредством представленных в настоящем документе примеров.

«Цитотоксическое количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции по этому изобретению представляет собой количество, способное вызывать разрушение клеток, особенно опухолевых, например, раковых клеток, либо in vitro, либо in vivo. «Цитотоксическое количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции по этому изобретению для целей ингибирования роста неопластических клеток можно определять эмпирически и посредством способов, известных в данной области.

«Аутоиммунное заболевание» в настоящем документе представляет собой заболевание или нарушение, стимулируемое собственными тканями индивидуума и направленное против них или их косегрегацию или проявление, или возникающее в результате них состояние. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают в себя в качестве неограничивающих примеров артрит (ревматоидный артрит, такой как острый артрит, хронический ревматоидный артрит, подагрический артрит, острый подагрический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, спинной артрит и юношеский ревматоидный артрит, остеоартрит, хронический прогредиентный артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит, реактивный артрит и анкилозирующий спондилит), воспалительные гиперпролиферативные заболевания кожи, псориаз, такой как бляшковидный псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, дерматит, включая контактный дерматит, хронический контактный дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, герпетиформный дерматит и атопический дерматит, Х-сцепленный гипер-IgM синдром, крапивницу, такую как хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, полимиозит/дерматомиозит, юношеский дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, склеродермию (включая системную склеродермию), склероз, такой как системная склеродермия, рассеянный склероз (MS), такой как спино-оптический MS, первичный прогрессирующий MS и ремиттирующий MS, прогрессирующую системную склеродермию, атеросклероз, артериосклероз, множественный склероз и атаксический склероз, воспалительное заболевание кишечника (IBD) (например, болезнь Крона, колит, такой как язвенный колит, язвенное воспаление толстой кишки, микроскопический колит, коллагенозный колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит, и аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника), гангренозную пиодермию, узловатую эритему, первичный склерозирующий холангит, эписклерит), респираторный дистресс-синдром, включая взрослый или острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), менингит, воспаление всей или части сосудистой оболочки глаза, воспаление радужной оболочки, хориоидит, аутоиммунное гематологическое нарушение, ревматоидный спондилит, внезапную потерю слуха, IgE-опосредуемые заболевания, такие как анафилаксия и аллергический и атопический риниты, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена и лимбический энцефалит и/или энцефалит ствола головного мозга, увеит, такой как передний увеит, острый передний увеит, гранулематозный увеит, негранулематозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит или аутоиммунный увеит, гломерулонефрит (GN) с и в отсутствие нефротического синдрома, такой как хронический или острый гломерулонефрит, например, первичный GN, иммуноопосредуемый GN, мембранозный GN (мембранозная нефропатия), идиопатический мембранозный GN, мембранозный пролиферативный GN (MPGN), включая тип I и тип II, а также быстро прогрессирующий GN, аллергические состояния, аллергическую реакцию, экзему, включая аллергическую или атопическую экзему, астму, такую как бронхиальная астма, астма бронхов и аутоиммунная астма, состояния, включающие в себя инфильтрацию T-клетками, и хронический воспалительный ответ, хроническое воспалительное заболевание легких, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (SLE) или системную эритематозную волчанку, такую как кожная SLE, подострую красную волчанку, синдром неонатальной волчанки (NLE), диссеминированную красную волчанку, волчанку (включая нефрит, энцефалит, волчанку у детей, непочечную волчанку, дискоидную волчанку, алопецию), юношеский (типа I) сахарный диабет, включая детский инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM), сахарный диабет взрослых (диабет типа II), аутоиммунный диабет, идиопатический несахарный диабет, иммунный ответ, ассоциированный с острой и замедленной гиперчувствительностью, опосредуемой цитокинами и T-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, в том числе лимфоматоидный гранулематоз, гранулематоз Вегенера, агранулематоз, васкулит (в том числе васкулит крупных сосудов (в том числе ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (Такаясу)), васкулит сосудов среднего калибра (в том числе болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), микроскопический полиартериит, васкулит в ЦНС, некротизирующий, кожный или васкулит гиперчувствительности, системный некротизирующий васкулит и ассоциированный с ANCA васкулит, такой как васкулит или синдром Черджа-Стросс (CSS)), височный артериит, апластическую анемию, Кумбс-положительную анемию, анемию Диамонда-Блэкфана, гемолитическую анемию или иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию (anemia perniciosa), болезнь Аддисона, истинную эритроцитарную анемию или аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию A, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, в которые вовлечен диапедез лейкоцитов, воспалительные нарушения в ЦНС, синдром множественного поражения органов, например, вторичного по отношению к септицемии, травму или кровоизлияние, заболевания, опосредуемые комплексами антиген-антитело, заболевание, связанное с антителами против клубочковой базальной мембраны, синдром, связанный с антителами против фосфолипида, аллергический неврит, болезнь Бечета или Бехчета, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, пемфигоид, такой как буллезный пемфигоид и кожный пемфигоид, пемфигус (в том числе обыкновенную пузырчатку, эксфолиативную пузырчатку, пемфигоид слизистой оболочки и эритематозную пузырчатку), аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь или синдром Рейтера, иммунокомплексный нефрит, опосредуемый антителами нефрит, хроническую невропатию, такую как IgM-полиневропатии или опосредуемая IgM невропатия, тромбоцитопению (например, такая как развивается у пациентов с инфарктом миокарда), в том числе тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP) и аутоиммунную или иммуноопосредуемую или тромбоцитопению, такую как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP), в том числе хроническая или острая ITP, аутоиммунное заболевание яичек и яичников, в том числе аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз, гипопаратиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, в том числе тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), или подострый тиреоидит, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, идиопатический гипотиреоз, болезнь Грэйва, полигландулярные синдромы, такие как аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), паранеопластические синдромы, в том числе неврологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Итона-Ламберта, синдром «негнущегося человека» или «негнущегося субъекта», энцефаломиелит, такой как аллергический энцефаломиелит или энцефаломиелит allergica и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE), миастению, мозжечковую дегенерацию, нейромиотонию, опсоклонус или опсоклонус-миоклонус синдром (OMS), а также сенсорную невропатию, синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит, волчаночный гепатит, гигантоклеточный гепатит, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит, облитерирующий бронхиолит (не зависимый от трансплантата) в противоположность NSIP, синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (IgA-нефропатию), идиопатическую IgA-нефропатию, IgA-зависимый линейный дерматоз, первичный биллиарный цирроз, пневмоцирроз, синдром аутоиммунной энтеропатии, глютеновое заболевание, целиакию, брюшные афты (глютеновую энтеропатию), рефрактерные афты, идиопатические афты, криоглобулинемию, боковой амиотрофический склероз (ALS; болезнь Лу Геринга), болезнь коронарных артерий, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED) или аутоиммунную потерю слуха, опсоклонус-миоклонус синдром (OMS), полихондрит, такой как рефрактерный или рецидивирующий полихондрит, легочно-альвеолярный протеиноз, амилоидоз, склерит, незлокачественный лимфоцитоз, первичный лимфоцитоз, который включает в себя моноклональный B-клеточный лимфоцитоз (например, доброкачественную моноклональную гаммопатию и моноклональную гаммопатию неясного значения, MGUS), периферическую невропатию, паранеопластический синдром, каналопатии, такие как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные нарушения, глухота, слепота, пароксизмальный паралич, и каналопатии ЦНС, аутизм, воспалительную миопатию, фокальный сегментный гломерулосклероз (FSGS), эндокринную офтальмопатию, увеоретинит, хориоретинит, аутоиммунное гепатологическое нарушение, фибромиалгию, множественную эндокринную недостаточность, синдром Шмидта, адреналит, атрофию желудка, пресенильную деменцию, демиелинизирующие заболевания, такие как аутоиммунные демиелинизирующие заболевания, синдром Дресслера, очаговую алопецию, синдром CREST (кальциноз, синдром Рейно, нарушение моторики пищевода, склеродактилия и телеангиэктозия), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, смешанное заболевание соединительной ткани, болезнь Чагаса, ревматическую атаку, привычный выкидыш, альвеолит у сельскохозяйственных рабочих, полиформную эритему, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, легочную аллергию птицеловов, аллергический гранулематозный ангиит, доброкачественный лимфоцитарный ангиит, синдром Альпорта, альвеолит, такой как аллергический и фиброзный альвеолит, интерстициальное заболевание легких, трансфузионную реакцию, лепру, малярию, лейшманиоз, кипаносомиоз, шистосомоз, аскариоз, аспергиллез, синдром Самптера, синдром Каплана, денге, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, диффузный интерстициальный легочный фиброз, интерстициальный легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, кистозный фиброз, эндофтальмит, возвышенную стойкую эритему, гемолитическую болезнь новорожденных, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелти, филариоз, циклит, такой как хронический циклит, гетерохронический циклит или циклит Фукса, пурпуру Геноха-Шенлейна, инфекцию вирусом иммунодефицита человека (HIV), инфекцию эховирусом, кардиомиопатию, болезнь Альцгеймера, инфекцию парвовирусом, инфекцию вирусом краснухи, поствакцинальный синдром, врожденную инфекцию вирусом краснухи, инфекцию вирусом Эпштейна-Барра, паротит, синдром Эванса, аутоиммунную гонадную недостаточность, хорею Сиденгама, постстрептококковый нефрит, облитерирующий тромбоангиит, тиреотоксикоз, сухотку спинного мозга, хориоидит, гигантоклеточную полимиалгию, эндокринную офтальмопатию, хронический пневмонит гиперчувствительности, сухой кератоконъюнктивит, эпидемический кератоконъюнктивит, идиопатический нефритический синдром, нефропатию минимальных изменений, доброкачественное семейное и ишемически-реперфузионное повреждение, ретинальную аутоиммунную реакцию, воспаление суставов, бронхит, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей, силикоз, афты, афтозный стоматит, артериосклеротические нарушения, аспермиогенез, аутоиммунный гемолиз, болезнь Бека, криоглобулинемию, контрактуру Дюпюитрена, факоанафилактическую эндофтальмию, аллергический энтерит, узловатую эритему при лепре, идиопатический паралич лицевого нерва, синдром хронической усталости, ревматическую лихорадку, болезнь Хаммана-Рича, нейросенсорную потерю слуха, пароксизмальная гемоглобинурия, гипогонадизм, регионарный илеит, лейкопению, инфекционный мононуклеоз, поперечный миелит, первичную идиопатическую микседему, нефроз, симпатическую офтальмию, гранулематозный орхит, панкреатит, острый полирадикулит, гангренозную пиодермию, тиреоидит де Кервена, приобретенную атрофию селезенки, бесплодие вследствие антител к сперматозоидам, незлокачественную тимому, витилиго, заболевания, связанные с SCID и вирусом Эпштейна-Барра, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), паразитарные заболевания, такие как лейшманиоз, синдром токсического шока, пищевое отравление, состояния, включающие инфильтрацию T-клетками, нарушение адгезии лейкоцитов, иммунный ответ, ассоциированный с острой и замедленной гиперчувствительностью, опосредуемой цитокинами и T-лимфоцитами, заболевания, в которые вовлечен диапедез лейкоцитов, синдром множественного поражения органов, заболевания, опосредуемые комплексами антиген-антитело, заболевание, связанное с антителами против клубочковой базальной мембраны, аллергический неврит, аутоиммунные полиэндокринопатии, оофорит, первичную микседему, аутоиммунный атрофический гастрит, симпатическую офтальмию, ревматические заболевания, смешанное заболевание соединительной ткани, нефротический синдром, инсулит, полиэндокринную недостаточность, периферическую невропатию, аутоиммунный полигландулярный синдром типа I, взрослый идиопатический гипопаратиреоз (AOIH), тотальную алопецию, дилатационную кардиомиопатию, приобретенный буллезный эпидермолиз (EBA), гемохроматоз, миокардит, нефротический синдром, первичный склерозирующий холангит, гнойный или негнойный синусит, острый или хронический синусит, этмоидит, фронтит, верхнечелюстной или сфеноидальный синусит, нарушение, связанное с эозинофилами, такое как эозинофилия, эозинофильная инфильтрация легких, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Леффлера, хроническое эозинофильное воспаление легких, тропическое эозинофильное воспаление легких, бронхопневмонический аспергиллез, аспергиллома или содержащая эозинофилы гранулема, анафилаксию, серонегативный спондилоартрит, полиэндокринное аутоиммунное заболевание, склерозирующий холангит, поражение склеры, эписклеры, хронический кожно-слизистый кандидоз, синдром Брутона, транзиторную гипогаммаглобулинемию новорожденных, синдром Вискотта-Олдрича, атаксию-телеангиэктазию, аутоиммунные нарушения, связанные с коллагеновой болезнью, ревматизм, неврологическое заболевание, ишемически-реперфузионное нарушение, ослабление реакции кровяного давления, сосудистую дисфункцию, ангиэктазию, повреждение ткани, сердечно-сосудистую ишемию, гипералгезию, ишемию головного мозга, заболевание, сопутствующее васкуляризации, нарушения, связанные с аллергической гиперчувствительностью, гломерулонефрит, реперфузионное повреждение, реперфузионное повреждение миокарда или других тканей, дерматозы с острым воспалительным компонентом, острый гнойный менингит или другие воспалительные нарушения центральной нервной системы, синдромы, связанные с трансфузией гранулоцитов, индуцируемую цитокинами токсичность, острое тяжелое воспаление, хроническое стойкое воспаление, пиелит, пневмоцирроз, диабетическую ретинопатию, диабетическое нарушение крупных артерий, внутриартериальную гиперплазию, пептическую язву, вальвулит и эндометриоз.

Термин «детекция» предназначен, чтобы включать в себя определение присутствия или отсутствия вещества или определение количества вещества. Термин, таким образом, относится к применению материалов, композиций и способов по настоящему изобретению для количественных и качественных определений. Как правило, конкретный способ, применяемый для детекции, не является критическим для практического осуществления изобретения.

Например, «детекция» по изобретению может включать в себя: наблюдение присутствия или отсутствия продукта гена 5, продукта гена l (например, молекул мРНК), или полипептида 5 или 5 1; изменения уровня полипептида 5 или 5 1 или количества, связанного с мишенью; изменения биологической функции/активности полипептида 5 или 5 1. В некоторых вариантах осуществления «детекция» может включать в себя детекцию уровней 5 или 5 1 дикого типа (например, уровней мРНК или полипептида). Детекция может включать в себя количественное определение изменения (увеличения или уменьшения) любого значения на 10%-90%, или на любое значение между 30% и 60% или более 100%, при сравнении с контролем. Детекция может включать в себя количественное определение изменения любого значения в 2 раза - 10 раз, включительно, или более, например в 100 раз.

«Метка» при применении в настоящем документе относится к поддающемуся детекции соединению или композиции, которые конъюгируют напрямую или опосредованно с антителом. Метка может являться поддающейся детекции сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которое поддается детекции.

III. Антитела против 5 1

Антитела, которые могут связывать 5 1 человека и конкурентно ингибировать связывание антитела против 5 1 с 5 1 человека, представлены в настоящем документе. Соответственно, один вариант осуществления изобретения относится к антителам, содержащим последовательность вариабельного легкого (VL) домена, указанную в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, и последовательность вариабельного тяжелого (VH) домена, указанную в любой из SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 или 9. Предусмотрены также человеческие или химерные формы антител из депонированных гибридом.

В одном варианте осуществления антитело связывает 5 1 человека с Kd между 500 нМ и 1 пМ. В другом варианте осуществления антитело не связывает альфаVбета3 или альфа Vбета5, или альфаVбета1. В другом варианте осуществления антитело содержит последовательность Fc из IgG человека, например, IgG1 человека или IgG4 человека. В другом варианте осуществления последовательность Fc переделывают или иным образом изменяют так, что в ней отсутствует эффекторная функция антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), часто связанная с ее связыванием с рецепторами Fc (FcR). Существует множество примеров изменений или мутаций последовательностей Fc, которые могут изменять эффекторные функции. Например, в WO 00/42072 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описаны варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. Содержание этих публикаций конкретно приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Антитело может присутствовать в форме Fab, Fab', F(ab)'₂, одноцепочечного Fv (scFv), Fv-фрагмента; диатела и линейного антитела. Антитело может представлять собой также мультиспецифическое антитело, которое связывается с 5 1 и представляет собой антагонист 5 1, но связывает также одну или несколько других мишеней и ингибирует их функцию (например, VEGF). Антитело можно конъюгировать с лекарственным средством (например, цитотоксическим средством, радиоактивным изотопом и химиотерапевтическим средством) или меткой для детекции 5 1 в образцах от пациента или in vivo посредством визуализации (например, радиоактивного изотопа, флуоресцентного красителя и фермента).

Предусмотрены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против 5 1, экспрессирующие векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие один или оба вариабельных домена, и клетки, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты. Эти антитела можно использовать для видов терапии, описанных в настоящем документе, и для детекции белка 5 1 в образцах от пациента (например, анализами FACS, иммуногистохимии (IHC), ELISA) или у пациентов.

A. Моноклональные антитела

Моноклональные антитела можно получать, например, способом с использованием гибридомы, таких как описанные в Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975), или их можно получать способами рекомбинантной ДНК (Патент США No. 4816567), или их можно получать способами, описанными в настоящем документе в примерах ниже. В способе с применением гибридомы мыши, хомяка или другого подходящего животного-хозяина, как правило, иммунизируют иммунизирующим средством для активации лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые могут специфически связываться с иммунизирующим средством. Альтернативно, можно иммунизировать лимфоциты in vitro.

Иммунизирующее средство, как правило, может включать в себя полипептид представляющего интерес белка или слитый с ним белок, или композицию, содержащую белок. Как правило, используют либо лимфоциты периферической крови («PBL»), если желательны клетки человеческого происхождения, либо клетки селезенки или клетки лимфоузлов, если желательны источники из не относящихся к человеку млекопитающих. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной линией клеток с использованием подходящего вызывающего слияние клеток средства, такого как полиэтиленгликоль, для получения клеток гибридомы. Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Иммортализованные линии клеток обычно представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности клетки миеломы, происходящие из грызунов, быка и человека. Обычно применяют линии клеток миеломы крысы или мыши. Клетки гибридомы можно культивировать в подходящей культуральной среде, предпочтительно содержащей одно или несколько веществ, подавляющих рост или выживание не слитых иммортализованных клеток. Например, если в родительских клетках отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридомы, как правило, содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин («среда HAT») - вещества, предотвращающие рост HGPRT-дефицитных клеток.

Предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают высокий уровень экспрессии антитела выбранными продуцирующими антитело клетками и являются чувствительными к среде, такой как среда HAT. Более предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются линии миеломы мышей, которые можно получить, например, из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California и American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Описана также продукция моноклональных антител в линиях клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека. Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987), pp. 51-63.

Затем в культуральной среде, в которой культивировали клетки гибридомы, можно анализировать присутствие моноклональных антител, направленных против полипептида. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, можно определять иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммунный анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Такие способы и анализы известны в данной области. Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определять анализом Скэтчарда по Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

После идентификации желательных клеток гибридомы клоны можно субклонировать способами лимитирующих разведений и выращивать общепринятыми способами. Goding, выше. Подходящая для данной цели культуральная среда включает в себя, например, среду Игла, модифицированную по Дульбекко, и среду RPMI-1640. Альтернативно, клетки гибридомы можно выращивать in vivo в форме асцитов у млекопитающего.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно выделять или очищать из культуральной среды или асцитной жидкости общепринятыми способами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, очистка на сефарозе с белком A, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Моноклональные антитела можно получить также способами рекомбинантной ДНК, такими, как описаны в патенте США No. 4816567. ДНК, кодирующие моноклональные антитела по изобретению, можно легко выделить и секвенировать с применением общепринятых способов (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы по изобретению служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как обезьяньи клетки COS, клетки яичников китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулин, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК можно также модифицировать, например, заменой кодирующими последовательностями человеческих константных доменов тяжелых и легких цепей гомологичных мышиных последовательностей (патент США No. 4816567; Morrison et al., выше) или ковалентным присоединением к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности, не относящегося к иммуноглобулинам полипептида. Таким не относящимся к иммуноглобулинам полипептидом можно заменить константные домены антитела по изобретению, или заменить вариабельные домены совмещающегося с антигеном участка антитела по изобретению для получения химерного бивалентного антитела.

Антитела могут представлять собой моновалентные антитела. Способы получения моновалентных антител известны в данной области. Например, один из способов включает в себя рекомбинантную экспрессию легкой цепи иммуноглобулина и модифицированной тяжелой цепи. Как правило, тяжелую цепь укорачивают в какой-либо точке Fc-области, чтобы предотвратить сшивание тяжелых цепей. Альтернативно, существенные остатки цистеина заменяют другим аминокислотным остатком или делетируют для предотвращения сшивания.

Способы in vitro также пригодны для получения моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, особенно Fab-фрагментов, можно осуществлять с применением общепринятых способов, известных в данной области.

B. Человеческие и гуманизированные антитела

Антитела могут представлять собой гуманизированные антитела или человеческие антитела. Гуманизированные формы не относящихся к человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие последовательности антител), содержащие минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают в себя человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменяют остатками из CDR не относящихся к человеку видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях каркасные остатки Fv человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими не относящимися к человеку остатками. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, не обнаруженные ни в антителе-реципиенте, ни в импортируемых последовательностях CDR или каркаса. Как правило, гуманизированное антитело может содержать в основном все из по меньшей мере одного, а обычно, двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все области CDR соответствуют областям не относящегося к человеку иммуноглобулина, и все или в основном все области FR представляют собой области из консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Предпочтительно, гуманизированное антитело содержит также по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно из человеческого иммуноглобулина Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

Некоторые способы гуманизации не относящихся к человеку антител описаны в данной области и ниже в примерах. Как правило, гуманизированное антитело обладает одним или несколькими аминокислотными остатками, введенными в него из не относящегося к человеку источника. Эти не относящиеся к человеку аминокислотные остатки часто обозначают как «импортируемые» остатки, которые, как правило, берут из «импортируемого» вариабельного домена. В одном варианте осуществления гуманизацию можно провести по существу по способу Winter и соавторов (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), посредством замены последовательностями одной CDR или нескольких CDR грызунов соответствующих последовательностей антитела человека. Следовательно, такие «гуманизированные» антитела представляют собой антитела (патент США No 4816567), где по существу менее чем один интактный человеческий вариабельный домен заменен соответствующей последовательностью из не относящихся к человеку видов. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR, заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

В качестве альтернативы гуманизации, можно получать человеческие антитела. Например, в настоящее время является возможным получение трансгенных животных (например, мышей), способных при иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция соединительного гена тяжелой цепи антитела (JH) в химерных и мутантных по зародышевой линии мышах приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос массива зародышевых генов иммуноглобулинов человека таким мутантным по зародышевой линии мышам приводит к продукции человеческих антител при стимуляции антигеном. Смотри, например, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993); патенты США No. 5545806, 5569825, 5591669; 5545807; и WO 97/17852. Альтернативно, человеческие антитела можно получать введением локусов иммуноглобулинов человека трансгенным животным, например мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. При стимуляции наблюдают продукцию человеческих антител, сильно напоминающую продукцию, наблюдаемую у человека, во всех отношениях, включая реаранжировку генов, сборку и репертуар антител. Этот способ описан, например, в патентах США No. 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016, и в Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995).

Альтернативно, способ фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552- 553 [1990]) можно использовать для продукции человеческих антител и фрагментов антител in vitro, из репертуаров генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов от неиммунизированных доноров. В одном варианте осуществления этого способа последовательности V-домена антитела клонируют в рамке считывания в ген мажорного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и экспонируют в форме функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговых частиц. Фаговый дисплей можно осуществлять во множестве форматов, например, как описано ниже в разделе Примеры или как описано в обзоре, например, в Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Несколько источников фрагментов V-гена можно использовать для фагового дисплея. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили массив разнообразных антител против оксазолона из небольшой рандомизированной комбинаторной библиотеки V-генов, полученных из селезенки иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуар V-генов из неиммунизированных доноров-людей, и антитела против массива разнообразных антигенов (включая аутоантигены) можно выделить, в основном следуя способам, описанным в Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBOJ. 12:725-734 (1993). Смотри также патенты США No. 5565332 и 5573905.

Как обсуждают выше, человеческие антитела можно получать также посредством активированных in vitro B-клеток (смотри патенты США 5567610 и 5229275).

Человеческие антитела можно также получать с использованием различных способов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol Biol, 222: 581 (1991). Способы Cole et al. и Boerner et al. также доступны для получения человеческих моноклональных антител. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol, 147(1): 86-95 (1991).

C. Мультиспецифические антитела

Мультиспецифическиеантитела представляют собой моноклональные, предпочтительно, человеческие или гуманизированные, антитела, обладающие специфичностью связывания для двух или более различных антигенов (например, биспецифические антитела со специфичностью связывания по меньшей мере для двух антигенов). Например, одна из специфичностей связывания может быть предназначена для белка 5 1, а другая может быть предназначена для любого другого антигена. В одном из предпочтительных вариантов осуществления другой антиген представляет собой белок поверхности клеток или рецептор, или субъединицу рецептора. Например, белок поверхности клеток может представлять собой рецептор естественных киллерных (NK) клеток. Таким образом, в одном варианте осуществления биспецифическое антитело по этому изобретению может связывать как 5 1, так и VEGF.

Подходящие способы для получения биспецифических антител хорошо известны в данной области. Например, рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулинов, где две тяжелые цепи обладают различными специфичностями. Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Вследствие случайной сборки тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, такие гибридомы (квадромы) потенциально продуцируют смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одно обладает правильной биспецифической структурой. Очистку правильной молекулы обычно проводят посредством стадий аффинной хроматографии. Подобные способы описаны в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Вариабельные домены антител с желательными специфичностями связывания (участками объединения антитело-антиген) можно сливать с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Предпочтительно, проводят слияние с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной, CH2- и CH3-областей. Предпочтительно, чтобы первая константная область (CH1) тяжелой цепи, содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одном из слитых белков. ДНК, кодирующие слитые белки с тяжелыми цепями иммуноглобулинов, и, если желательно, с легкими цепями иммуноглобулинов, вставляют в отдельные экспрессирующие векторы, и совместно трансфицируют подходящий организм-хозяин. Более подробно о получении биспецифических антител смотри, например, в Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

Описаны также различные способы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, получены биспецифические антитела с использованием лейциновых молний. Kostelny et al ., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии из белков Fos и Jun соединяли с Fab'-фрагментами двух различных антител посредством слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем повторно окисляли с получением гетеродимеров антител. Этот способ также можно использовать для получения гомодимеров антител. Способ «диател», описанный Hollinger et al., PNAS USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечивает альтернативный механизм получения биспецифических фрагментов антител. Фрагменты содержат VH, соединенный с VL посредством линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. Соответственно, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, таким образом, формируя два антигенсвязывающих участка. Описан также другой способ для получения фрагментов биспецифических антител с использованием димеров одноцепочечных Fv (sFv). Смотри Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994).

Предусмотрены антитела более чем с двумя валентностями. Например, можно получать триспецифические антитела. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

D. Гетероконъюгированные антитела

Гетероконъюгированные антитела составлены из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела предложены, например, для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (Патент США No. 4676980). Предусматривают, что антитела можно получать in vitro с использованием известных способов химии синтеза белка, включая способы, включающие в себя средства для сшивания. Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием реакции дисульфидного обмена или посредством формирования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают в себя иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат, и реагенты, описанные, например, в патенте США No. 4676980.

E. Модификация эффекторной функции

Может являться желательным модифицировать антитело по изобретению по отношению к эффекторной функции, чтобы, например, улучшить эффективность антитела для лечения рака. Например, в Fc-область можно ввести остаток(остатки) цистеина, таким образом, позволяя формирование межцепьевой дисульфидной связи в данной области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или увеличенным комплемент-зависимым цитолизом и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). Смотри Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) и Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с улучшенной противоопухолевой активностью можно также получать с применением гетеробифункциональных сшивающих средств, как описано в Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Альтернативно, можно сконструировать антитело, обладающее двойными Fc-областями и, таким образом, обладающее усиленными лизисом комплементом и способностью к ADCC. Смотри Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

Мутации или изменения в последовательностях Fc-области можно осуществлять для улучшения связывания FcR (например, FcgammaR, FcRn). В одном варианте осуществления антитело по этому изобретению обладает по меньшей мере одной измененной эффекторной функцией, выбранной из группы, состоящей из ADCC, CDC и улучшенного связывания FcRn, по сравнению с природным IgG или исходным антителом. Примеры нескольких применимых конкретных мутаций описаны, например, в Shields, RL et al. (2001) JSC 276(6)6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487- 490; и WO 00/42072.

В одном варианте осуществления мутация Fc-рецептора представляет собой замену по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, состоящей из: 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439 из Fc-области, где нумерация остатков в Fc-области соответствует системе нумерации EU. В некоторых вариантах осуществления мутация Fc-рецептора представляет собой замену D265A. В некоторых вариантах осуществления мутация Fc-рецептора представляет собой замену N297A. Дополнительные подходящие мутации указаны в патенте США No. 7332581.

F. Иммуноконъюгаты

Изобретение относится также к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, токсином (например, ферментативно активным токсином, происходящим из бактерий, грибов, растений или животных, или его фрагментами) или с радиоактивным изотопом (т.е., радиоконъюгат).

Химиотерапевтические средства, применимые для получения таких иммуноконъюгатов, описаны выше. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают в себя цепь A дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь A экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки-диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Множество радиоактивных изотопов доступны для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают в себя ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re.

Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с использованием множества бифункциональных средств для сшивания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие, как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие, как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получать, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МХ-DTPA) является примером хелатирующего средства для конъюгации радиоактивного изотопа с антителом. Смотри WO 94/11026.

В другом варианте осуществления антитело можно конъюгировать с «рецептором» (таким как стрептавидин) для применения в предварительном нацеливании на опухоль, где пациенту вводят конъюгат антитело-рецептор с последующим выведением несвязавшегося конъюгата из циркуляции с применением очищающего средства и затем введением «лиганда» (например, авидина), конъюгированного с цитотоксическим средством (например, радиоактивным изотопом).

G. Иммунолипосомы

Описанные в настоящем документе антитела можно также составлять как иммунолипосомы. Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными в данной области, такими, как описанные в Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030 (1980); и в патентах США No 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции описаны в патенте США No. 5013556.

Особенно полезные липосомы можно получить способом обращеннофазового выпаривания с композицией липидов, содержащей фосфатидилхолин, холестерин, и дериватизированный PEG фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы выдавливают через фильтры с определенным размером пор для получения липосом желаемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела по настоящему изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано в Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982), посредством реакции дисульфидного обмена. Внутри липосомы, не обязательно, заключено также антинеопластическое средство, ингибирующее рост средство или химиотерапевтическое средство (такое как доксорубицин). Смотри Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).

IV. Способы лечения с использованием антител против 5 1

Антитела против 5 1 по изобретению можно вводить субъектам (например, млекопитающим, таким как человек) для лечения заболеваний и нарушений, вовлекающих аномальный ангиогенез и/или проницаемость сосудов, или просачивание, включая, например, рак, глазные заболевания и иммунные нарушения (например, аутоиммунные нарушения). Введение можно проводить любым подходящим способом, включая, например, внутривенный, внутримышечный или подкожный.

В некоторых вариантах осуществления антитела против 5 1 по изобретению вводят в сочетании со вторым, третьим или четвертым средством (включая, например, антинеопластическое средство, ингибирующее рост средство, цитотоксическое средство или химиотерапевтическое средство) для лечения заболеваний или нарушений, вовлекающих аномальный ангиогенез и/или проницаемость сосудов, или просачивание. В некоторых вариантах осуществления антитела против 5 1 конъюгируют с дополнительным средством.

В некоторых вариантах осуществления антитела против 5 1 вводят в сочетании с антагонистом VEGF. Антитело против 5 1 и дополнительное средство (например, антагонист VEGF) можно вводить одновременно или последовательно. Альтернативно, субъекта можно подвергать лечению антагонистом VEGF и затем вводить антагонист 5 1, например, подвергать лечению антагонистом VEGF, пока субъект не перестает отвечать на лечение антагонистом VEGF, и затем лечить подвергавшегося лечению субъекта антагонистом 5 1. В одном варианте осуществления субъекта подвергают лечению антагонистом VEGF, если рак является неинвазивным, и затем подвергают лечению антагонистом 5 1, если рак является инвазивным. Некоторые пациенты, обладающие повышенными уровнями 5 1 от природы или в ответ на терапию антагонистом VEGF, по сравнению с не пораженными заболеванием пациентами или с контролем, могут являться особенно сильно отвечающими на это комбинированное лечение. Предусмотрены комбинации, дополнительно содержащие лекарственное средство (например, антинеопластическое средство, химиотерапевтическое средство, ингибирующее рост средство и цитотоксическое средство). Например, для пациентов, подлежащих лечению с помощью химиотерапии (например, иринотеканом) и антагонистов 5 1 или подвергавшихся лечению с помощью химиотерапии и антагонистов 5 1, может являться благоприятной терапия антагонистами VEGF. Альтернативно, для пациентов, подвергавшихся лечению с помощью химиотерапии и антагонистов VEGF, может являться благоприятной терапия антагонистами 5 1. В одном предпочтительном варианте осуществления антитело против VEGF представляет собой антитело Авастин®. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против 5 1 представляет собой антитело против 5 1, описанное в настоящем документе. Предусмотрены наборы, содержащие антагонист VEGF, антагонист 5 1 и, необязательно, химиотерапевтическое средство.

Способы лечения рака можно оценивать посредством, в качестве неограничивающих примеров, регрессии опухоли, уменьшения массы или размера опухоли, времени без прогрессирования, продолжительности выживаемости, выживаемости без прогрессирования, общей доли ответивших, продолжительности ответа, качества жизни, экспрессии и/или активности белка. Поскольку антиангиогенные средства, описанные в настоящем документе, нацелены на сосудистую сеть опухоли, и необязательно на сами неопластические клетки, они представляют собой уникальный класс противораковых лекарственных средств, и таким образом, могут требовать уникальных измерений и определений клинических ответов на лекарственные средства. Например, уменьшение размера опухоли более чем на 50% в 2-мерном анализе является стандартным порогом для признания ответа. Однако антагонисты 5 1 и антагонисты VEGF по изобретению могут вызывать ингибирование распространения метастазов без уменьшения размеров первичной опухоли, или могут просто оказывать статический эффект на опухоль. Соответственно, можно применять способы определения эффективности лечения, включая, например, измерение уровня маркеров ангиогенеза в плазме или в моче и измерение ответа посредством радиологической визуализации.

В зависимости от показания, подлежащего лечению, и факторов, имеющих отношение к дозированию, которые известны терапевту, компетентному в данной области, антитела по изобретению можно вводить в дозе, являющейся эффективной для лечения этого показания при минимизации токсичности и побочных эффектов. Для лечения рака, аутоиммунного заболевания или связанного с иммунодефицитом заболевания, терапевтически эффективная дозировка может, например, лежать в диапазоне от 50 мг/дозу до 2,5 г/м ². В одном варианте осуществления вводимая доза составляет от 250 мг/м² до приблизительно 400 мг/м² или 500 мг/м². В другом варианте осуществления доза составляет от приблизительно 250-375 мг/м². В другом варианте осуществления диапазон дозирования составляет 275-375 мг/м².

Оценка видов лечения связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD) включает в себя, в качестве неограничивающих примеров, уменьшение скорости дальнейшей потери зрения или предотвращение дальнейшей потери зрения. Для терапии при AMD, эффективность in vivo можно, например, измерять посредством одного или нескольких из следующего: оценка среднего изменения наилучшей корригированной остроты зрения (BCVA) от исходного значения до желаемого времени, оценка доли субъектов с потерей остроты зрения менее чем на 15 букв до желаемого времени по сравнению с исходным значением, оценка доли субъектов с приобретением остроты зрения большим или равным 15 буквам до желаемого времени по сравнению с исходным значением, оценка доли субъектов с эквивалентом Снеллена для остроты зрения 20/2000 или хуже до желаемого времени, оценка функции зрения по опроснику NEI, оценка размера CNV и количества просачивания CNV до желаемого времени, как оценивают ангиографией с флуоресцеином, и т.п.

V. Фармацевтические композиции

Антитела против 5 1 можно составлять с пригодными носителями или эксципиентами, так, чтобы они являлись пригодными для введения. Подходящие композиции антител получают смешиванием антитела, обладающего желательной степенью чистоты, с необязательными физиологически пригодными носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Пригодные носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметэтония; хлорид бензалкония, хлорид бензэтония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлом (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN , PLURONICS или полиэтиленгликоль (PEG). Иллюстративные композиции антител описаны в WO98/56418, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Лиофилизированные композиции, адаптированные для подкожного введения, описаны в WO97/04801. Такие лиофилизированные композиции можно разводить в подходящем разбавителе до высокой концентрации белка, и разведенный состав можно вводить подкожно млекопитающему, подлежащему лечению по настоящему описанию.

Композиция по настоящему описанию может также содержать более одного активного соединения, как необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно, соединения с комплементарными активностями, не оказывающими вредного действия друг на друга. Например, может являться желательным дополнительно предоставить антинеопластическое средство, ингибирующее рост средство, цитотоксическое средство или химиотерапевтическое средство. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в сочетании в количествах, эффективных для предназначенных целей. Эффективное количество таких дополнительных средств зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа заболевания или нарушения, или лечения, и других факторов, обсуждаемых выше. Их, как правило, используют в тех же самых дозах и при таких же способах введения, как описано в настоящем документе, или приблизительно 1-99% от ранее применяемых доз.

Активные ингредиенты можно также заключать в микрокапсулы, полученные, например, посредством способов коацервации или посредством межповерхностной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и поли-(метилметацилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают в себя полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы находятся в форме сформованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц для замедленного высвобождения включают в себя полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт), полилактиды (патент США No. 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты - гликолевой кислоты, такие как ЛЮПРОН ДЕПОТ (пригодные для инъекции микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата леупролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Липофектины или липосомы также можно использовать для доставки полипептидов и антител или композиций по этому изобретению в клетки. При использовании фрагментов антител, наименьший ингибирующий фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом белка-мишени, является предпочтительным. Например, на основании последовательностей вариабельной области антитела можно сконструировать пептидные молекулы, сохраняющие способность связывать белковую последовательность-мишень. Такие пептиды можно синтезировать химически и/или получать способом рекомбинантной ДНК. Смотри, например, Marasco et al., PNAS USA. 90: 7889-7893 (1993).

Активные ингредиенты можно также заключать в микрокапсулы, полученные, например, посредством способов коацервации или посредством межповерхностной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и поли-(метилметацилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980), выше.

Можно получать также препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают в себя полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы находятся в форме сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц для замедленного высвобождения включают в себя полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт), полилактиды (патент США No. 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и -этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты - гликолевой кислоты, такие как ЛЮПРОН ДЕПОТ (пригодные для инъекции микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата леупролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, позволяют высвобождение молекул в течение более 100 суток, конкретные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влажности при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Можно разрабатывать разумные стратегии стабилизации в зависимости от вовлеченного механизма. Например, если обнаружено, что механизмом агрегации является образование междумолекулярной S-S связи посредством тиол-дисульфидного обмена, можно достигать стабилизации модификацией сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, контролированием содержания влаги, применением соответствующих добавок и разработкой специальных композиций полимерной матрицы.

Композиции для применения для введения in vivo должны являться стерильными. Этого легко достигают фильтрацией через стерильные мембраны для фильтрации.

VI. Способы диагностики и визуализации с использованием антител против 5 1

Меченые антитела против 5 1, и их производные и аналоги, которые специфически связывают полипептид 5 1, можно использовать для диагностических целей для детекции, диагностики или мониторирования заболеваний и/или нарушений, связанных с экспрессией, аберрантной экспрессией и/или активностью 5 1. Например, антитела против 5 1 по изобретению можно использовать в диагностических анализах или анализах для визуализации in situ, in vivo, ex vivo и in vitro.

Способы для детекции экспрессии полипептида 5 1 включают в себя (a) анализ экспрессии полипептида в клетках (например, ткани) или жидкости организма индивидуума с использованием одного или нескольких антител по этому изобретению и (b) сравнение уровня экспрессии гена со стандартным уровнем экспрессии гена, на основании чего увеличение или уменьшение уровня экспрессии анализируемого гена по сравнению со стандартным уровнем экспрессии является показателем аберрантной экспрессии.

Дополнительные варианты осуществления изобретения включают в себя способы диагностики заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или аберрантной экспрессией 5 1 у животного (например, млекопитающего, такого как человек). Способы включают в себя детекцию молекул 5 1 у млекопитающего. В одном варианте осуществления, после введения антагониста VEGF, диагностика включает в себя: (a) введение эффективного количества меченого антитела против 5 1 млекопитающему; (b) ожидание в течение интервала времени после введения, чтобы позволить меченому антителу против 5 1 предпочтительно концентрироваться в участках организма субъекта, где экспрессируется молекула 5 1 (и чтобы позволить клиренс несвязавшейся меченой молекулы до уровня фона); (c) определение уровня фона; и (d) детекцию меченой молекулы у субъекта, так что детекция меченой молекулы выше уровня фона указывает на то, что субъект обладает конкретным заболеванием или нарушением, связанным с экспрессией или аберрантной экспрессией 5 1. Уровень фона можно определить различными способами, включая сравнение количества детектированной меченой молекулы со стандартным значением, предварительно определенным для конкретной системы.

Антитела против 5 1 по изобретению можно применять для анализа уровней белка в биологическом образце с использованием классических иммунологических способов, известных специалистам в данной области (например, смотри Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Другие способы на основе антител, применимые для детекции экспрессии гена белка, включают в себя иммунологические анализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммунный анализ (RIA). Подходящие метки для анализа с помощью антител известны в данной области и включают в себя ферментные метки, такие как оксидаза глюкозы; радиоактивные изотопы, такие как иод (¹³¹ I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I), углерод (¹⁴C), сера (³⁵S), тритий (³ H), индий (^115mIn, ^113mIn, ¹¹² In, ¹¹¹In) и технеций (⁹⁹Tc, ^99m Tc), таллий (²⁰¹Ti), галлий (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), палладий (¹⁰³Pd), молибден (⁹⁹ Mo), ксенон (¹³³Xe), фтор (¹⁸F), ¹⁵³ Sm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰ Y, ⁴⁷Sc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁴²Pr, ¹⁰⁵Rh, ⁹⁷Ru; люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин, и биотин.

Способы, известные в данной области, можно применять для мечения антител по изобретению. Такие способы включают в себя в качестве неограничивающих примеров использование бифункциональных конъюгирующих средств (смотри, например, патенты США No. 5756065; 5714631; 5696239; 5652361; 5505931; 5489425; 5435990; 5428139; 5342604; 5274119; 4994560; и 5808003).

В одном конкретном варианте осуществления, экспрессию или сверхэкспрессию полипептида 5 1 определяют в диагностическом или прогностическом анализе после введения лекарственного средства - антагониста VEGF по увеличенным уровням 5 1, присутствующим на поверхности клетки (например, посредством иммуногистохимического анализа с использованием антитела против 5 1). Альтернативно или дополнительно можно измерять уровни кодирующей полипептид 5 1 нуклеиновой кислоты или мРНК в клетке, например, посредством флуоресцентной гибридизации in situ с использованием зонда на основе нуклеиновой кислоты, соответствующего кодирующей 5 1 нуклеиновой кислоте или комплементарной ей нуклеиновой кислоте; (FISH; смотри WO98/45479, опубликованную в октябре 1998 г.), блоттинга по Саузерну, Нозерн-блоттинга или способов полимеразной цепной реакции (ПЦР), таких как количественная ПЦР с детекцией в реальном времени (RT-ПЦР). Можно исследовать также сверхэкспрессию 5 1 измерением уровня отделившегося антигена в биологической жидкости, такой как сыворотка, например, с использованием анализов на основе антител (смотри, например, патент США No. 4933294, выданный 12 июня 1990 г.; WO91/05264 опубликованную 18 апреля 1991 г.; патент США 5401638, выданный 28 марта 1995 г.; и Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Помимо вышеуказанных анализов, различные анализы in vivo и ex vivo доступны специалисту в данной области. Например, можно подвергать клетки внутри организма млекопитающего воздействию антитела, которое, необязательно, является меченным поддающейся детекции меткой, например, радиоактивным изотопом, и связывание антитела можно оценивать, например, наружным сканированием по радиоактивности или анализом образца (например, биоптата или другого биологического образца), взятого у млекопитающего, предварительно подвергнутого воздействию антитела.

VII. Изделия и наборы

Другой вариант осуществления изобретения относится к изделию, содержащему материалы, применимые для лечения рака (например, опухолей), глазного заболевания (например, влажной AMD) или аутоиммунных заболеваний и родственных состояний. Изделие может содержать контейнер и этикетку или листовку-вкладыш на контейнере или приложенные к контейнеру. Подходящие контейнеры включают в себя, например, флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры можно изготавливать из множества материалов, таких как стекло или пластик. Как правило, контейнер содержит композицию, являющуюся эффективной для лечения состояния, и может обладать стерильным отверстием для доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой стерильной иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой антагонист VEGF или антагонист 5 1, или агонист VEGF, или агонист 5 1 по изобретению. На этикетке или в листовке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка или листовка-вкладыш может дополнительно содержать инструкции для введения композиции антитела пациенту. Предусматривают также изделия и наборы, содержащие виды комбинированной терапии, описанные в настоящем документе.

Листовка-вкладыш относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, содержащим информацию относительно показаний, применения, дозировки, введения, противопоказаний и/или предупреждений, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном варианте осуществления в листовке-вкладыше указано, что композицию используют для лечения неходжкинской лимфомы.

Кроме того, изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически пригодный буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой или пользовательской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.

Представлены также наборы, применимые для различных целей, например, для выделения или детекции 5 1 и/или VEGF у пациентов, необязательно, в сочетании с изделиями. Для выделения и очистки 5 1 набор может содержать антитело против 5 1, присоединенное к бусинам (например, к бусинам сефарозы). Могут быть предоставлены наборы, содержащие антитела для детекции и количественного определения 5 1 и/или VEGF in vitro, например, в ELISA или на вестерн-блоте. Как и в случае изделия, набор содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш на контейнере или приложенные к контейнеру. Например, контейнер содержит композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело против 5 1 по изобретению. Также можно включать дополнительные контейнеры, содержащие, например, разбавители и буферы, контрольные антитела. На этикетке или в листовке-вкладыше можно предоставлять описание композиции, так же как инструкции для предполагаемого применения in vitro или диагностического применения.

Коммерчески доступные реагенты, упомянутые в примерах, использовали согласно инструкциям производителя, если не указано иначе. Источники клеток идентифицированы в следующих ниже примерах, и на протяжении описания, посредством инвентарных номеров ATCC в Американской коллекции типовых культур, Manassas, VA. Если не указано иначе, по настоящему изобретению используют общепринятые способы технологии рекомбинантной ДНК, такие как описаны выше и в следующих руководствах: Sambrook et al., выше; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates и Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, ANIMAL CELL CULTURE, 1987; Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 1991.

Полное содержание всех публикаций (включая патенты и патентные заявки), процитированных в настоящем документе, таким образом, приведено в качестве ссылки, включая конкретно, предварительную патентную заявку США No. 60/784704, поданную 21 марта 2006 г., предварительную патентную заявку США No. 60/785330, поданную 22 марта 2006 г.; и предварительную патентную заявку США No. 60/871743, поданную 22 декабря 2006 г.

Следующие последовательности ДНК депонированы по условиям Будапештского Соглашения в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, как описано ниже :

Материал	No. депозита	Дата депонирования
Альфа5/бета1 7H5.4.2.8	PTA-7421	7 марта 2006 г.

Депонирование по настоящей заявке выполнено согласно положениям Будапештского Соглашения о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и инструкциям в силу данного соглашения (Будапештское Соглашение). Это гарантирует поддержание жизнеспособной культуры в течение 30 лет от даты депонирования. Депозит может быть сделан доступным в ATCC по условиям Будапештского Соглашения, и подчиняется соглашению между Genentech, Inc и ATCC, которое гарантирует постоянную и неограниченную публичную доступность потомства культуры из депозита после выдачи соответствующего патента США или после опубликования любой патентной заявки США или иностранной патентной заявки, какая бы не была опубликована первой, и гарантирует доступность потомства для кого-либо, определенного членом комиссии по патентам и товарным знакам США, как указанного для данной цели согласно 35 U.S.C. 122 и правилам для члена комиссии в соответствии с этим (включая 37 C.F.R. 1.14 с конкретной ссылкой на 886 OG 638).

Патентообладатель настоящей заявки согласен с тем, что если культура в депозите погибнет или будет потеряна или уничтожена при культивировании при соответствующих условиях, материалы незамедлительно заменят по уведомлении другими такими же. Доступность депонированного материала не следует рассматривать как лицензию для осуществления изобретения на практике в нарушение прав, предоставленных под властью любого правительства в соответствии с его патентным законодательством.

Коммерчески доступные реагенты, упомянутые в примерах, использовали согласно инструкциям производителя, если не указано иначе. Источники клеток идентифицированы в следующих ниже примерах, и на протяжении описания, посредством инвентарных номеров ATCC в Американской коллекции типовых культур, Manassas, VA. Если не указано иначе, по настоящему изобретению используют общепринятые способы технологии рекомбинантной ДНК, такие как описаны выше и в следующих руководствах: Sambrook et al., выше; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture , 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology , 1991.

Вышеизложенное письменное описание считают достаточным, чтобы позволить специалисту в данной области осуществление изобретения на практике. Следующие ниже примеры предложены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Действительно, различные модификации по изобретению в дополнение к показанным и описанным в настоящем документе, являются очевидными для специалистов в данной области из вышеизложенного описания и попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

(1) Прямые прививки CDR в акцепторный консенсусный человеческий каркас

Фагмида, используемая для этой работы, представляет собой вектор, экспонирующий моновалентный Fab-g3, в основном как описано в Lee et al., J. Mol. Biol. 340: 1073-93 (2004). Гипервариабельные последовательности из последовательностей from мышиного моноклонального антитела 7H5 прививали в домены человеческого консенсусного каппа I (huKI) и человеческого консенсусного VH подгруппы III (huIII). Для получения привитого CDR использовали акцепторный каркас VH, который отличается от человеческого консенсусного домена VH подгруппы III в 3 положениях: R71A, N73T и L78A (Carter et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:4285 (1992)).

(2) Модификация аспарагинов CDR гуманизированного 7H5.v1

Замены другими остатками в различных положениях достигали посредством мутагенеза по Кункелю с использованием отдельного олигонуклеотида для каждого положения. Фаговый конкурентный ELISA использовали для оценки для всех вариантов, моновалентно экспонированных в виде Fab на фаге, аффинностей связывания (IC50) против интегрина 5 1 человека, фигура 4. Относительную кратность потери или улучшения аффинности связывания по сравнению с исходным гуманизированным 7H5.v1, обобщали на фигуре 5. Значения IC50 для аффинности связывания определяли фаговым конкурентным ELISA, фигура 6. Два варианта, h7H5.v2 и h7H5.v3, как указано, выбрали для включения замены глицина в положении 65 CDR-H2, клонировали в вектор hlgGl и оценивали аффинности связывания с использованием аппарата BIAcore. На фигуре 7 анализом связывания BIAcore показано, что гуманизированный 7H5.v2 действительно немного улучшал аффинность связывания до уровня субнаномолярного.

(3) Модификации каркаса гуманизированного 7H5.v2

В следующих положениях вводили мутации: положение легкой цепи 46 (T46L), положения тяжелой цепи 48 (I48V), 49 (G49S), 66 (K66R), 67 (A67F), 69 (L69I) и 78 (A78L) в h7H5.v2. Кроме того, мутацию вводили также в положение тяжелой цепи 30 (T30S).

Мутацию в каждом положении получали мутагенезом по Кункелю с использованием отдельного олигонуклеотида. Фаговый конкурентный ELISA использовали для оценки всех вариантов. Моновалентный Fab экспонировали на фаге. Определяли аффинности связывания (IC50) против интегрина 5 1 человека. На фигуре 8 показано, что для большинства мутаций еще сохраняется такой же уровень аффинностей связывания по сравнению с исходным клоном, за исключением двух вариантов с изменениями в положениях тяжелой цепи 49 (G49S) и 78 (A78L).

Таким образом, гуманизированные 7H5.v4 и v5 получены включением всех из следующих мутаций, в положении легкой цепи 46 (T46L), положениях тяжелой цепи 30 (T30S), 48 (I48V), 66 (K66R), 67 (A67F) и 69 (L69I), и отличаются только в положении тяжелой цепи 49. Аффинность связывания для обоих вариантов определяли с использованием аппарата BIAcore. На фигуре 9 показано, что h7H5.v4 сохраняет такой же уровень аффинности связывания, как его исходный клон гуманизированный 7H5.v2.

(4) Фаговый конкурентный ELISA

Микропланшеты для титрования MAXISORP покрывали рекомбинантным интегрином 5 1 человека (R&D) при 5 мкг/мл в PBS в течение ночи и затем блокировали буфером PBST (0,5% BSA и 0,05% Tween 20 в PBS) в течение часа при комнатной температуре. Фаг из культуральных супернатантов инкубировали с серийными разведениями интегрина 5 1 человека в буфере PBST в культуральном микропланшете для титрования в течение часа, после чего 80 мкл смеси переносили в покрытые мишенью лунки на 15 минут для захвата несвязавшегося фага. Планшет промывали буфером PBT (0,05% Tween 20 в PBS) и добавляли конъюгированное с HRP-анти-M13 (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 в буфере PBST) в течение 40 минут. Планшет промывали буфером PBT и проявляли добавлением субстрата тетраметилбензидина (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Поглощение при 450 нм наносили на график как функцию концентрации мишени в растворе для определения IC₅₀ фага. Это использовали как оценку аффинности для клона Fab, экспонированного на поверхности фага.

(5) Продукция IgG и определение аффинности антитела посредством эксперимента BIAcore

Интересующие клоны (химерный 7H5, гуманизированные 7H5.v1, v2, v3, v4, и v5) переводили в формат вектора pRK с IgG1 человека (Carter et al., PNAS USA, 89: 4285-4289 (1992)), временно экспрессировали в клетках CHO и очищали аффинной хроматографией с белком A.

Определения аффинности проводили посредством анализа поверхностного плазмонного резонанса с использованием аппарата BIACORE -3000. Иммобилизацию осуществляли случайным связыванием через аминогруппы с использованием протокола, предоставленного производителем. Для изучения кинетики связывания антитела против интегрина 5 1 человека операции проводили в двух различных форматах. На фигурах 3A, 7 и 9A, антитела иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 приблизительно по 450 единиц ответа (RU), и 2-кратные серийные разведения концентраций интегрина 5 1 человека (300 нМ - 0,29 нМ) в буфере PBT (0,05% Tween 20 в PBS) инъецировали при скорости потока 30 мкл/мин при 25°C. На фигурах 3B и 9B, интегрин 5 1 человека иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 приблизительно по 800 RU, и 2-кратные серийные разведения концентраций антител (200 нМ - 0,2 нМ) в буфере PBT (0,05% Tween 20 в PBS) инъецировали при скорости потока 30 мкл/мин при 25°C. После каждой инъекции проводили регенерацию чипа с использованием 10 мМ буфера глицин-HCl при pH 1,7. Проводили коррекцию ответа связывания вычитанием RU из нулевой проточной ячейки. Скорости связывания (k _on) и скорости диссоциации (k_Off ) вычисляли с использованием простой модели связывания один-к-одному Лэнгмюра (программное обеспечение BIAcore Evaluation Software версии 3,2). Равновесную константу диссоциации (K _d) вычисляли как соотношение k_off/ k_on.

(6) Анализы заживления ранений кожи

Новозеландских белых кроликов использовали в исследованиях, чтобы показать эффективность гуманизированных антител 7H5. С использованием асептического способа, круглый 8 мм перфоратор для биопсии использовали для получения ран глубиной до хряща, подлежащий перихондрий удаляли распатором и тонкими ножницами. Макроскопическую картину каждого ранения мониторировали ежесуточно до окончания исследования. Измерения просвета раны получали на сутки 0, 7, 14, 21 и 28. Всех животных подвергали эвтаназии на сутки 28. Проводили две серии экспериментов по заживлению ран.

В первой использовали следующие группы для исследования, с 5 животными на группу и двумя ранами на животное: (1) отрицательный контроль - IgG (200 мкг/30 мкл/рану в сутки); (2) h7H5.v2 (100 мкг/30 мкл/рану в сутки); (3) антитело против VEGF (100 мкг/30 мкл/рану в сутки); и (4) h7H5.v2 (100 мкг/15 мкл/рану в сутки) в сочетании с антителом против VEGF (100 мкг/15 мкл/рану в сутки). Антитела вводили местно. На фигуре 10 изображены результаты, показывающие, что введение (1) h7H5.v2 отдельно или анти-VEGF отдельно ингибирует заживление ран; и (2) комбинированное введение h7H5.v2 и антитела против VEGF усиливает эффекты одного антитела против VEGF на заживление ран.

Во второй серии экспериментов использовали следующие группы для исследования, с 5 животными на группу и двумя ранами на животное: (1) отрицательный контроль - IgG (200 мкг/30 мкл/рану в сутки); (2) h7H5.v4 (100 мкг/30 мкл/рану в сутки); (3) антитело против VEGF (100 мкг/30 мкл/рану в сутки); и (4) h7H5.v4 (100 мкг/15 мкл/рану в сутки) в сочетании с антителом против VEGF (100 мкг/15 мкл/рану в сутки). Антитела вводили местно. На фигуре 11 изображены результаты, показывающие, что введение (1) h7H5.v4 или анти-VEGF отдельно ингибирует заживление ран; и (2) комбинированное введение h7H5.v4 и антитела против VEGF усиливает эффекты одного антитела против VEGF на заживление ран.

Полное содержание всех публикаций (включая, например, патенты, опубликованные патентные заявки, и инвентарные No. в Genbank), процитированных в настоящем документе, таким образом, приведено в качестве ссылки для всех целей, как если бы содержание каждой ссылки было конкретно и отдельно приведено в качестве ссылки.