применение гликозаминогликанов для снижения неспецифического связывания в иммунологических анализах

Формула изобретения

1. Реагент иммунологического анализа, включающий

связывающийся с тропонином I агент в разбавителе и хондроитинсульфат в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на тропонин I.

2. Реагент иммунологического анализа по п.1, отличающийся тем, что хондроитинсульфат присутствует в количестве от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл.

3. Реагент иммунологического анализа по п.1, отличающийся тем, что хондроитинсульфат присутствует в количестве приблизительно 1 мг/мл.

4. Реагент иммунологического анализа по п.1, отличающийся тем, что связывающийся с тропонином I агент представляет собой антитело.

5. Композиция пробы для иммунологического анализа, включающая

пробу, анализируемую на присутствие тропонина I; связывающийся с тропонином I агент; хондроитинсульфат в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на тропонин I.

6. Композиция пробы по п.5, отличающаяся тем, что проба представляет собой пробу сыворотки.

7. Композиция пробы по п.5, отличающаяся тем, что проба представляет собой пробу плазмы, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту.

8. Композиция пробы по п.5, отличающаяся тем, что связывающийся с тропонином I агент представляет собой антитело.

9. Способ обнаружения тропонина I в пробе, включающий объединение анализируемой на присутствие тропонина I пробы с хондроитинсульфатом и связывающимся с тропонином I агентом для образования комплекса между тропонином I, присутствующим в пробе, и связывающимся с тропонином I агентом, причем хондроитинсульфат снижает неспецифическое связывание в способе; и обнаружение полученного комплекса для определения тропонина I.

10. Способ п.9, отличающийся тем, что пробу объединяют с хондроитинсульфатом и полученную пробу затем объединяют со связывающимся с тропонином I агентом.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что пробу объединяют со связывающимся с тропонином I агентом и полученную пробу затем объединяют с хондроитинсульфатом.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что связывающийся с тропонином I агент получен как реагент иммунологического анализа, включающий связывающийся с тропонином I агент в разбавителе и хондроитинсульфат, и тем, что реагент иммунологического анализа объединяют с пробой.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к иммунологическим анализам, и, в частности, к использованию гликозаминогликанов с целью уменьшения неспецифического связывания в иммунологических анализах.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биохимические анализы связывания широко используются для определения присутствия и концентрации анализируемых веществ в биологических образцах. Такие анализы основаны на концепции партнеров связывания. Интересующее анализируемое вещество связывается со связывающимся с анализируемым веществом агентом (таким как, например, антитело к анализируемому веществу или рецептор для анализируемого вещества). Таким образом, анализируемое вещество и связывающийся с анализируемым веществом агент называют "партнерами связывания". Когда один из партнеров связывания связан с твердой фазой, анализ называют гетерогенным. Такие гетерогенные анализы включают, например, сэндвич-метод, косвенный метод и конкурентный метод. Все эти термины используются в данной области техники.

Чувствительность анализа обычно означает наименьшую массу анализируемого вещества, которая обеспечивает статистически значительное изменение в сигнале, генерируемом анализом, по сравнению с сигналом, полученным при отсутствии анализируемого вещества. Увеличение чувствительности является желательным, поскольку это позволяет обнаружить меньшие количества анализируемого вещества, а также обеспечивает более высокую общую точность измерения анализируемого вещества.

Неспецифическое связывание означает неспецифическое взаимодействие партнеров связывания в гетерогенной системе анализа с твердой фазой. Неспецифическое связывание часто снижает чувствительность гетерогенных анализов, и поэтому желательно уменьшить такое неспецифическое связывание.

Известно много способов, используемых для этой цели. Например, белки, такие как бычий сывороточный альбумин (BSA), желатин и казеин, добавляют к реагентам анализа или предварительно адсорбируют на твердой фазе, чтобы заблокировать неспецифические участки адсорбции. Кроме того, в литературе описано применение различных поверхностно-активных веществ, часто - в высоких концентрациях.

Хотя эти способы могут помочь в некотором снижении неспецифической адсорбции, многие из них связаны с влиянием на желаемое специфическое взаимодействие партнеров связывания. Эти методы могут также привести к замещению комплекса, образующегося между партнерами связывания. Кроме того, несмотря на использование высоких концентраций белка и поверхностно-активного вещества, во многих гетерогенных анализах наблюдается значительное количество неспецифического связывания. Таким образом, существует потребность в альтернативных методах снижения неспецифического связывания в гетерогенных анализах.

Это особенно верно в случае анализов для определения сердечного тропонина I, где обнаруживаемые уровни анализируемого вещества являются очень малыми, и увеличенная чувствительность необходима для получения точных и полезных результатов анализа. Определение сердечного тропонина I помогает в точном диагностировании острого инфаркта миокарда и стратификации риска пациентов с острыми коронарными синдромами без повышения в сегменте ST в плане относительного риска смертности, инфаркта миокарда или увеличенной вероятности ишемических событий, требующих проведения срочных процедур реваскуляризации.

Тропонин I (TnI) является белком, обычно содержащимся в мышечной ткани, и вместе с Тропонином Т и Тропонином С регулирует кальций-зависимое взаимодействие актина и миозина (Tobacman, Annu Rev Physiol 58:447-481, 1996). Были идентифицированы три изотипа TnI: один - связанный с быстрым подергиванием скелетной мускулатуры, другой - с медленным подергиванием скелетной мускулатуры, и третий - с сердечной мышцей (Wilkinson and Grand, Nature 271:31-35, 1978; Bodor, J Clin Immunoassay 17(l):40-44, 1994). Сердечная форма имеет 31 дополнительный аминокислотный остаток на N-конце и является единственной изоформой тропонина, присутствующей в миокарде (Vallins et al., FEBS Letts 270(1,2):57-61, 1990).

Клинические исследования продемонстрировали, что сердечный тропонин I (cTnI) обнаруживается в кровотоке спустя 4-6 часов после острого инфаркта миокарда (AMI) и остается повышенным в течение нескольких дней после того (Mair et al., Clin Chem 41(9):1266-1272, 1995; Lame et al., Clin Chem 39(6):972-979, 1993). Таким образом, повышение уровня cTnI охватывает диагностические окна креатинкиназы-МВ (СК-МВ) и лактатдегидрогеназы (Bodor, J Clin Immunoassay 17(l):40-44, 1994). Дальнейшие исследования указали, что cTnI обладает более высокой клинической специфичностью к повреждению миокарда, чем СК-МВ (Adams et al., Circulation 88(1): 101-106, 1993; Apple et al., Clin Chim Acta 237:59-66, 1995).

Ввиду его сердечной специфичности и чувствительности TnI используется как надежный маркер при оценке пациентов с нестабильной стенокардией и острым коронарным синдромом без повышения сегмента ST (ACS). Предыдущие клинические исследования пациентов с ACS (Lindahl et al., J Am Coll Cardiol 38:1497-1498, 2001; Venge et al., Am J Cardiol 89:1035-1041, 2002) показали, что незначительное повышение значений cTnI предоставляет важную прогностическую информацию о близком и долгосрочном риске смерти (Galvani et al., Circulation 95:2053-2059, 1997; Antman et al., N Eng J Med 335:1342-1349, 1996; Ottani et al., Am Heart J 40:917-927, 2000; Heidenreich et al., J Am Coll Cardiol 38:478-485, 2001). В конечном счете, оценка прогноза может быть полезной для идентификации пациентов, для которых, наиболее вероятно, будут полезны те или иные терапевтические вмешательства.

Таким образом, желательно получить реагенты и способы для уменьшения неспецифического связывания в гетерогенных анализах на cTnI, a значит и повышения чувствительности анализов на cTnI.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для указанной цели изобретение предлагает реагент иммунологического анализа, включающий связывающийся с анализируемым веществом агент в разбавителе и гликозаминогликан в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы анализируемого вещества.

В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления анализируемым веществом является тропонин, связывающимся с анализируемым веществом агентом - антитропонин I моноклональное антитело, а гликозаминогликаном - хондроитинсульфат.

Также предоставляется композиция пробы, которая включает пробу для анализа на присутствие анализируемого вещества, связывающийся с анализируемым веществом агент и гликозаминогликан, отличный от гепарина, в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество.

В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления пробой является сыворотка или плазма EDTA, анализируемым веществом - тропонин, связывающимся с анализируемым веществом агентом - антитропонин I моноклональное антитело, а гликозаминогликаном - хондроитинсульфат.

Также предлагаются способы обнаружения анализируемого вещества в пробе с использованием гликозаминогликана для снижения неспецифического связывания в способе. Способ включает объединение пробы, анализируемой на присутствие анализируемого вещества, с гликозаминогликаном и связывающимся с анализируемым веществом агентом для образования комплекса между анализируемым веществом в образце и связывающимся с анализируемым веществом агентом, причем гликозаминогликан снижает неспецифическое связывание в способе и обнаружение получающегося комплекса для определения анализируемого вещества. В данном способе предпочтительным анализируемым веществом является тропонин, более предпочтительно - тропонин I, a предпочтительным гликозаминогликаном является хондроитинсульфат.

Дополнительные особенности и преимущества данного изобретения станут понятны из последующего описания, которое следует рассматривать в связи с прилагаемыми чертежами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показаны результаты анализа TropI, когда различные сахара вводили в пробы TropI с неправильными результатами;

На Фиг. 2 показаны результаты анализа TropI, когда реагент BJ был подготовлен с хондроитинсульфатом в количестве 0, 1,2 и 4 мг/мл в присутствии или отсутствии EDTA;

На Фиг. 3 показаны результаты анализа TropI с добавлением 0,5 мг/мл CSC в реагент BJ и без такого добавления;

На Фиг. 4 показаны результаты анализа TropI, когда реактив BJ был приготовлен с различными изомерами хондроитинсульфата по сравнению с Kit Lot (без хондроитинсульфата); и

На Фиг. 5 показаны принципы анализа на сердечный тропонин I.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение предлагает реагент иммунологического анализа, который включает связывающийся с анализируемым веществом агент в разбавителе и гликозаминогликан в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество.

Как обсуждено выше, часто желательно определить присутствие и концентрацию анализируемых веществ в биологических образцах. Анализируемое вещество представляет собой вещество или химический компонент, который определяют в ходе аналитической процедуры (такой как иммунологический анализ). Иммунологические анализы основаны на концепции партнеров связывания. Представляющее интерес анализируемое вещество связывается со связывающимся с анализируемым веществом агентом (таким как, например, антитело к анализируемому веществу или рецептор для анализируемого вещества). Таким образом, анализируемое вещество и связывающийся с анализируемым веществом агент называют "партнерами связывания".

Во многих иммунологических анализах связывающимся с анализируемым веществом агентом является антитело. Такие антитела часто предоставляются в разбавителе, таком как калийфосфатный буфер. Антитело может быть из любого класса иммуноглобулинов, включая, например, IgG или IgM. Антитело может быть моноклональным антителом или поликлональным антителом. В сэндчич-иммуноанализе анализируемое вещество может быть захвачено антителом или антителами, иммобилизованными на твердой фазе. Такая иммобилизация может быть обеспечена с применением способов, известных из уровня техники, включая использование покрытой стрептавидином (SAC) твердой фазы, с которой связаны биотин-меченое антитело или антитела. Представляющее интерес анализируемое вещество, присутствующее в пробе, связывается с иммобилизованным антителом захвата или антителами, а затем меченное антитело или антитела, в свою очередь, связываются с захваченным анализируемым веществом. Метка может быть любой, известной из уровня техники, включая, например, пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу. Детектируемый сигнал свидетельствует о количестве анализируемого вещества, присутствующего в образце. Метод обнаружения будет зависеть от типа выбранной метки, как известно из уровня техники, и может включать колориметрический, флуорометрический или хемилюминесцентный методы.

Предпочтительным в настоящее время гликозаминогликаном (GAG) является хондроитинсульфат, хотя также могут использоваться другие GAG. Другие GAG включают гиалуронат (также называемый гиалуроновой кислотой), гепарансульфат, гепарин, дерматансульфат и кератансульфат. Хондроитинсульфатом может быть хондроитинсульфат А, хондроитинсульфат В (также называемый дерматансульфат), хондроитинсульфат С или их смесь.

Гликозаминогликаны (GAG) или мукополисахариды являются длинными неразветвленными полисахаридами, содержащими повторившийся дисахаридный мотив. Дисахаридные мотивы содержат один или два модифицированных сахара, N-ацетилгалактозамин (GalNAc) или N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и уроновую кислоту, такую как глюкуронат или идуронат. Гиалуронаты состоят из D-глюкуроната и GlcNAc. Дерматансульфаты состоят из D-глюкуроновой кислоты (GlcA) или L-идуроната (IdoA) и GalNAc-сульфата. Гетерогенность в дерматансульфате является результатом различных степеней О-сульфатации и присутствия двух уроновых кислот. Хондроитинсульфаты состоят из D-глюкуроната и GalNAc-6 (или 4)-сульфата. Гепарин и гепарансульфаты состоят из D-глюкуронат-2-сульфата и N-сульфо-В-глюкозамин-6-сульфата (гепараны содержат меньше сульфата, чем гепарины). Кератансульфаты состоят из галактозы и галактоза-6-сульфата и GlcNAc-6-сульфата.

Хондроитинсульфат (CS) является сульфатированным гликозаминогликаном (GAG). В цепи хондроитина может быть более чем 100 отдельных сахаров, каждый из которых может быть сульфатирован в различных положениях и количествах. Хондроитинсульфат А означает CS преимущественно сульфатированный поуглероду 4 сахара GalNAc (хондроитин-4-сульфат). Хондроитинсульфат В называют дерматансульфатом. Хондроитинсульфат С означает CS, преимущественно сульфатированный по углероду 6 сахара GalNAc (хондроитин-6-сульфат). Хондроитинсульфат D означает CS, преимущественно сульфатированный по углероду 2 GlcA и 6 сахара GalNAc (хондроитин-4,6-сульфат).

Гликозаминогликан обеспечивается в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество. Если GAG является хондроитинсульфатом, это количество предпочтительно составляет от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл (эквивалентно от приблизительно 0,025% до приблизительно 0,4%). В одном конкретном варианте осуществления хондроитинсульфат присутствует в количестве 1 мг/мл (эквивалентно 0,1%). Следующие примеры подробно иллюстрируют выбор подходящего количества GAG для использования в соответствии с данным изобретением.

Анализируемая на присутствие анализируемого вещества проба может быть любой подходящей пробой, предпочтительно пробой крови, такой как проба сыворотки или плазмы. Плазма крови - жидкий компонент крови, в которой суспендированы клетки крови. Центрифугирование представляет собой простой способ отделения плазмы от клеток крови в пробе крови. Сыворотка представляет собой плазму крови, из которой факторы свертывающей системы крови были удалены естественным путем, позволяя крови свернуться до выделения жидкого компонента. Пробы плазмы получают из пробирок с кровью, которые содержат антикоагулянты, такие как гепарин натрия, цитрат натрия, фторид натрия и оксалат калия или калий EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). В случае пробы плазмы согласно данному изобретению плазму предпочтительно получают, используя антикоагулянт, отличный от гепарина.

В одном варианте осуществления реагент иммунологического анализа согласно данному изобретению содержит моноклональное антитело, специфическое к сердечному тропонину I в разбавителе и 0,1% хондроитинсульфата. Подходящие антитела к сердечному тропонину I известны из уровня техники, и конкретные пары или сочетания антител часто рекомендуют как партнеры для анализа. В частности, могут использоваться моноклональные антитела, обозначаемые 19С7 и 24-40 как двойные антитела захвата, меченые биотином, для присоединения к покрытой стрептавидином лунке, и антитело 16А11, в качестве антитела обнаружения, меченное пероксидазой хрена. Эти антитела коммерчески доступны (см. упомянутые ниже источники) и обсуждаются в литературе в связи с анализами на сердечный тропонин I, а процедуры биотинилирования и мечения также известны из уровня техники.

Приведенное выше описание относится к реагенту иммунологического анализа, который включает гликозаминогликан в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания. GAG может присутствовать в разбавителе, содержащем антитело. Альтернативно, GAG может быть добавлен к композиции пробы, в которую затем добавляют связывающийся с анализируемым веществом агент. Порядок составления может меняться, но GAG должен добавляться до наступления неспецифического связывания любого анализируемого вещества, присутствующего в пробе, со связывающимся с анализируемым веществом агентом.

Таким образом, также предоставляется композиция пробы, которая включает пробу для анализа на присутствие анализируемого вещества, связывающийся с анализируемым веществом агент и гликозаминогликан, отличный от гепарина, в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество.

В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления пробой является сыворотка или плазма EDTA, анализируемым веществом - тропонин, связывающимся с анализируемым веществом агентом - антитропонин I моноклональное антитело, а гликозаминогликаном - хондроитинсульфат.

Также предлагается способ обнаружения анализируемого вещества в пробе, включающий: объединение анализируемой на присутствие анализируемого вещества пробы с гликозаминогликаном и связывающимся с анализируемым веществом агентом для образования комплекса между анализируемым веществом, присутствующим в пробе, и связывающимся с анализируемым веществом агентом, причем гликозаминогликан снижает неспецифическое связывание в способе; и обнаружение получающегося комплекса для определения анализируемого вещества. В одном варианте осуществления пробу объединяют с гликозаминогликаном и полученную пробу затем объединяют со связывающимся с анализируемым веществом агентом. В другом варианте осуществления пробу объединяют со связывающимся с анализируемым веществом агентом, и полученную пробу затем объединяют с гликозаминогликаном. В еще одном варианте осуществления связывающийся с анализируемым веществом агент получен как реагент иммунологического анализа, включающий связывающийся с анализируемым веществом агент в разбавителе и гликозаминогликан, и реагент иммунологического анализа объединяют с образцом. В каждом из этих способов предпочтительное анализируемое вещество - тропонин, более предпочтительно - тропонин I, а предпочтительным гликозаминогликаном является хондроитинсульфат.

В композиции пробы и способах согласно данному изобретению различные подходящие связывающиеся с анализируемым веществом агенты, разбавитель, гликозаминогликаны, пробы и анализируемые вещества являются такими, как описано выше в связи с реагентами для иммунологических анализов.

Реагенты, композиции и способы данного изобретения особенно полезны в иммунологическом анализе на сердечный тропонин I. Подробности данного варианта осуществления приведены в следующих примерах.

Пример I. Влияние добавления гепарина к реагентам захвата (BJ) и обнаружения (CJ) сердечного тропонина I (cTnI или TropI) в анализе

Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы определить, обеспечивает ли добавление гепарина к реагентам TropI BJ и/или CJ уменьшение ложных положительных результатов TropI. Были получены многочисленные отчеты о воспроизводимых ложных результатах повышенного Тропонина I в пробах сыворотки. Также было получено несколько отчетов о ложно повышенном уровне TropI в плазме EDTA. В некоторых случаях соответствующие пробы плазмы с гепарином, взятые у тех же пациентов, не давали ложных результатов повышенного уровня TropI.

Эксперимент включал введение гепарина в реагенты BJ и CJ и анализ с применением этих реагентов проб TropI, которые ранее давали ложные положительные результаты TropI.

Результаты показывают, что при введении гепарина в TropI CJ и немедленном проведении анализа наблюдается сильное ослабление полученного сигнала. При всего лишь 10 единицах на мл CJ полученный сигнал Cal 2 (калибрация 2) оказался менее 50% от номинального. Уровни гепарина в плазме, напротив, составляют обычно 25-50 единиц/мл. Для обеспечения эквивалентной концентрации гепарина, обеспечиваемой реагентом CJ, потребовалось бы присутствие гепарина на уровне 50-100 единиц/мл. На основании этих откликов не представляется возможным добавление гепарина к CJ при уровнях, которые были бы эквивалентными гепаринизированной плазме.

Группу проб сыворотки, которые ранее давали ложноположительные результаты на TropI, проверили с использованием раствора CJ, содержащего 10 единиц гепарина на мл. Эти дававшие ложные результаты пробы продемонстрировали значительное снижение в определяемой концентрации cTnI (сердечного тропонина I). Результаты были в диапазоне 8-35% для проб, которые без обработки показывали концентрации cTnI 0,7-7,0 нг/мл. Однако ни один из этих образцов не удалось полностью скорректировать до уровня ниже Верхнего справочного предела (URL) для сыворотки.

Результаты этого эксперимента приводят к выводу о том, что добавление гепарина к композиции CJ приводит к значительному снижению общей способности реагентов генерировать сигнал. При концентрациях гепарина 10 единиц на мл сигнал составлял всего лишь 50% от номинального. Однако дававшие ложные результаты пробы пациентов были частично скорректированы путем добавления указанного количества гепарина к CJ. Тем не менее, более полное исправление указанного влияния потребовало бы более высоких уровней гепарина, которые, вероятно, снизили бы сигнал анализа до уровней, несовместимых с принципами анализа.

Пример II. Влияние сахаров как факторов корректировки пробы в реагенте BJ

Цель данного эксперимента состояла в том, чтобы оценить способность сахаров, таких как сахаров, присутствующих в гликозаминогликанах и обычно связанных с боковыми цепочками углевода пероксидазы хрена (HRP), снижать влияние в ложноположительных пробах TropI при добавлении к реагентам BJ.

Как описано в Примере I, добавление гепарина к ложноположительным пробам уменьшило ложные положительные результаты. Гепарин входит в гетерогенную группу анионных мукополисахаридов с неразветвленной цепочкой, называемых гликозаминогликанами (GAG), которые обладают антикоагулянтными свойствами. Хотя могут присутствовать и другие сахара, основными сахарами в гепарине являются: -L-идуроновой кислоты 2-сульфат; 2-деокси-2-сульфамино- -D-глюкозы 6-сульфат; -D-глюкуроновая кислота; 2-ацетамидо-2-деокси- -D-глюкоза; и -L-идуроновая кислота.

В качестве первоначального изучения возможных факторов корректировки пробы в ложноположительные пробы на TropI вводили указанные ниже сахара (для достижения конечной концентрации 2 мг/мл тестируемого вещества), чтобы оценить эффективность блокирования ложных положительных реакций: N-ацетил-глюкозамин (Sigma A8625); N-ацетил-галактозамин (Sigma A2795); глюкозамин (Sigma G4875); N-ацетилнейраминовая кислота (NANA, сиаловая кислота)(Sigma A0812); хондроитинсульфат С (Sigma C4384); хитин (гомополимер N-ацетил-глюкозамина) (Sigma C9752); муцин (полимер NANA)(Sigma M3895); и манноза (Sigma M8296). В этом первоначальном исследовании было обнаружено, что хондроитинсульфат С (CSC) значительно уменьшает ложные положительные результаты (см. Фиг. 1). Полученные результаты TropI были в целом подавлены до уровня ниже URL в ложноположительных пробах, кроме одной. Мы считаем, что эта последняя проба положительна на гетерофильные антитела.

На основании этих первоначальных отборочных исследований были проведены дополнительные эксперименты, в которых хондроитинсульфат С (CSC) добавляли непосредственно к реагенту BJ в серии увеличивающихся уровней (0,25, 0,5, 1, 2, 3 и 4 мг/мл), с и без EDTA (5,58 мг/мл) в реагенте BJ (см. Фиг. 2 и 3). Эффективность композиций была основана на блокировании ложноположительных проб TropI в сочетании с оценкой изменения в откликах справочного калибратора. Самая низкая концентрация CSC, которая эффективно подавляла ложноположительные пробы TropI, составляла 0,25 мг/мл; при немного более высоких уровнях CSC (0,5 мг/мл) наблюдалось некоторое возрастающее улучшение блокирования. Эффект, связанный с присутствием или отсутствием EDTA с дополнительными добавками реагентов, не был значительным.

Добавление CSC в количестве 0,25-0,5 мг/мл к композиции BJ оказывало небольшое, но заметное влияние на отрицательные или положительные контрольные пробы сыворотки. Кроме того, отклики справочного калибратора демонстрировали небольшое изменение при низких уровнях CSC. При уровнях CSC свыше 1 мг/мл обычно наблюдали 10-30% уменьшение откликов.

Результаты данного эксперимента приводят к выводу о том, что хондроитинсульфат С является эффективным блокирующим агентом, снижающим неспецифические фоновые реакции (неспецифическое связывание), которые демонстрируют некоторые образцы сыворотки и плазмы EDTA. В то время как самый низкий протестированный уровень (0,25 мг/мл) продемонстрировал значительные снижения наблюдаемых ложноположительных реакций, несколько более высокие уровни (0,5 мг/мл) могут обеспечить дополнительные защитные меры для образцов, которые могут содержать более высокие уровни влияющих веществ. Уровень EDTA в присутствии CSC не оказывал значительного влияния на ложноположительные пробы.

Добавление CSC к реагенту BJ оказывало минимальное вредное влияние на общую зависимость между дозой и откликом при использовании справочных калибраторов Tropl. По данным всех восьми калибраторов изменения, вызванные концентрациями CSC до 1 мг/мл, были в целом меньше 10%. Поэтому добавление CSC к композиции BJ в концентрациях 0,25-0,50 мг/мл, как можно ожидать, будет иметь малое влияние на справочную калибровку или вообще не будет оказывать такого влияния.

Пример III. Ложноположительные образцы с 0,05% CSC в BJ

Цель данного эксперимента состояла в том, чтобы проверить ложноположительные пробы, используя 0,5 мг/мл (0,05%) CSC в BJ. Ложноположительные образцы давали положительные результаты без добавления CSC и отрицательные при добавлении 0,05% CSC к биотиновому разбавителю. Добавление 0,05% CSC не оказывало влияния на предсказание положительного или отрицательного результата пробы. Эти результаты показаны на Фиг. 3.

Пример IV. Сравнительные показатели хондроитина А, В и С

Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы определить, может ли какой-либо изомер хондроитинсульфата обеспечить защиту от получения ложных результатов пробы. Хондроитинсульфат С, который использовался в вышеупомянутых экспериментах, представлял собой смесь хондроитинсульфата С и некоторого количества хондроитинсульфата А. Наименьшее количество хондроитинсульфата С в смеси составляло 85%. Поскольку может присутствовать до 15% изомера А, на эффективность были протестированы изомеры А, В и С.

Полученные результаты показали, что все изомеры хондроитинсульфата успешно снижали наблюдаемые концентрации в ложноположительных пробах, и не наблюдалось значительного различия между изомерами в отношении подавления ложноположительных реакций (см. Фиг. 4). Это приводит к выводу о том, что процентная чистота хондроитинсульфата в связи с концентрациями изомеров А и В не влияет на подавление ложноположительных откликов.

Пример V. Проба на сердечный тропонин I

Использовали метод иммунометрического иммунологического анализа (см. Фиг. 5), включающий одновременную реакцию сердечного тропонина I, присутствующего в пробе, с биотинилированными антителами (мышиное моноклональное анти-cTnI: клон 19С7, узнающий аминокислоты 41-49 Тропонина I, и второй клон, специфичный к участку Тропонина I, включающему аминокислоты 24-40) и конъюгатом антитела, меченным пероксидазой хрена (HRP) (мышиное моноклональное анти-cTnI: клон 16А11, узнающий аминокислоты 87-91 Тропонина I). Биотинилированные тропониновые Mab специфично реагируют с тропонином I в пробе с образованием комплекса, связывающимся со стрептавидином лунки SAC. Несвязанные материалы удаляют путем промывания, и комплекс тропонина обнаруживают, используя HRP меченый Mab (который специфично связывается с эпитопом тропонина I, отличающимся от эпитопа, с которым связываются биотинилированные Mab). Связанный конъюгат HRP измеряется люминесцентной реакцией. Реагент, содержащий люминогенные субстраты (производную люминола и соль перкислоты) и агент переноса электронов, добавляют в лунки. HRP в связанных конъюгатах катализирует окисление производной люминола, производя свет. Агент переноса электронов (замещенный ацетанилид) увеличивает уровень произведенного света и продлевает его излучение. Световые сигналы считываются иммунодиагностической системой VITROS (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Раритан, Нью-Джерси). Количество связанного HRP конъюгата прямопропорционально концентрации присутствующего cTnI.

Протокол анализа был таким: 1) в лунку SAC добавляли 80 мкл пробы, 35 мкл биотинового реагента (BJ) и 35 мкл реагента конъюгата (CJ); 2) Инкубирование в течение 10 минут 40 секунд; 3) Промывка ячейки SAC; 4) Добавление 200 мкл реагента сигнала и измерение излучаемого света.

Лунки SAC готовили путем покрытия полистироловых лунок стрептавидином. Вкратце, полистироловые лунки вначале облучали 3,5 Мрад для оптимизации адсорбции белков. Биотинилированный бычий сывороточный альбумин (B-BSA), полученный путем химического соединения биотина с BSA, используя коммерчески доступный активизированный сложный эфир (биотин-ХХ-NHS, Calbiochem, Ноттингем, Великобритания), наносили на полистироловые лунки. Покрытие наносили путем инкубирования лунок с раствором B-BSA в течение 10 минут. B-BSA физически адсорбировался и не связывался ковалентно с поверхностью полистирола. Лунки промывали перед нанесением покрытия из стрептавидина. Стрептавидин наносили на лунки путем инкубирования стрептавидинового раствора с покрытой биотином поверхностью в течение 50 минут. Взаимодействие между стрептавидином и биотином является нековалентным, но очень прочным (10¹⁵ л/моль). Лунки промывали еще раз, а затем сушили и хранили.

Стрептавидин имеет четыре участка связывания с биотином, поэтому после иммобилизации стрептавидина на поверхности имеются свободные участки связывания с биотином. Эти участки связывания могут реагировать с биотинилированными компонентами анализа.

Реагент конъюгата (CJ) включает следующие компоненты:

Компонент Количество г/л

Компонент	Количество г/л
Вода	849,3
К2НРО4	13
КН 2РО4	17
Kathon	20
BSA 30%	100
HRP-меченый mab 16A11 клон	4 мг/л
рН	6,6

Реагент анализа или захвата (BJ) включает следующие компоненты:

Компонент	Количество г/л
Вода
К2НРО4	13
КН 2РО4	17
Kathon	20
Бычий сывороточный альбумин 30%	100
EDTA (эквимолекулярный двунатриевый и тринатриевый)	15 мМ
Хондроитинсульфат С	1
Биотинилированный mab 24-40aa специфический клон	5,5 мг/л
Биотинилированный mab 19C7 клон	3 мг/л
рН	6,6

Моноклопальные антитела доступны коммерчески. HyTest, Ltd (Itainen Pitkakatu 4C, Pharma City, Торку, Финляндия 20520) является поставщиком клона 19С7 мышиного моноклонального антитела, специфического к области тропонина I, включающей аминокислоты 41-49. Это Mab биотинилировано, как описано ниже. HyTest также поставляет клон 16А11 мышиного моноклонального антитела, специфического к области тропонина I, включающей аминокислоты 87-91. Это Mab метят HRP, как описано ниже. Strategic BioSolutions (111 Pencader Dr., Newark, Делавэр, США 19702) поставляет клон мышиного моноклонального антитела, специфического к области тропонина I, включающей аминокислоты 24-40. Это Маb биотинилировано, как описано ниже.

Процедура биотинилирования включает следующее. Клон 19С7 и направленный клон Strategic BioSolutions 24-40 конъюгируют с биотином по отдельности посредством хорошо известной область-специфической химии.

Процедура мечения HRP включает следующее. Клон 16А11 от HyTest конъюгируют с HRP с использованием следующей методики: 1) Mab активируют малеимидными группами путем проведения реакции с сульфо-SMCC [сульфосукцинимидил 4-(М-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат]; 2) HRP активируют тиольными группами путем проведения реакции с NHS-SATA [N-гидроксисукцинимида s-ацетилтиоуксусной кислоты]; З) Оба активированных реагента очищают, а затем проводят их реакцию с образованием 16А11-HRP, который затем очищают.

Хотя здесь описаны конкретные варианты осуществления изобретения, следует понимать, что изобретение не ограничено ими, и специалист в данной области техники может внести различные изменения, в частности, в свете приведенного описания. В приведенное описание можно внести разумные изменения и модификации, не выходя за рамки изобретения.