лечение кожи

Формула изобретения

1. Способ лечения естественно стареющей и/или фотостареющей кожи у субъекта, включающий введение в кожу указанного субъекта ингенол-3-ангелата или его фармацевтически приемлемой соли.

2. Способ по п.1, в котором ингенол-3-ангелат имеет формулу



где R¹ представляет собой группу ангелоила;

R² и R³ представляют собой водород и

R⁴ представляет собой гидрокси.

3. Способ по п.1, где ингенол-3-ангелат вводят на участок кожи, по меньшей мере, 10 см².

4. Способ по п.1, где ингенол-3-ангелат вводят на лицо, и/или шею, и/или горло, и/или область вокруг глаз.

5. Способ по п.1, где ингенол-3-ангелат вводят в кожу топически.

6. Способ по п.1, где ингенол-3-ангелат вводят в виде геля на основе изопропилового спирта или крема на основе простого макроцетилового эфира.

7. Способ по п.1, где кожа субъекта не является больной.

8. Способ по п.1, где лечение проводят для улучшения внешнего вида на основе одного или нескольких показателей: тонких линий, морщин и УФ-старения.

9. Способ индуцирования эндогенного синтеза гиалуронана у субъекта, включающий введение в кожу указанного субъекта ингенол-3-ангелата или его фармацевтически приемлемой соли.

10. Способ по п.9, в котором ингенол-3-ангелат имеет формулу



где R¹ представляет собой группу ангелоила,

R² и R³ представляют собой водород и

R⁴ представляет собой гидрокси.

11. Композиция для применения при лечении естественно стареющей и/или фотостареющей кожи, содержащая ингенол-3-ангелата или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

12. Композиция для применения для индуцирования эндогенного синтеза гиалуронана в коже субъекта, содержащая ингенол-3-ангелат или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

13. Применение ингенол-3-ангелета или его фармацевтически приемлемой соли при изготовлении композиции для лечения естественно стареющей и/или фотостареющей кожи.

14. Применение ингенол-3-ангелата или его фармацевтически приемлемой соли при изготовлении композиции для индуцирования эндогенного синтеза гиалуронана в коже субъекта.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к косметическому лечению стареющей кожи. Более конкретно, изобретение относится к применению производных ингенола, в частности, ингенол ангелатов, при лечении фотостареющей и/или естественно (хроно) стареющей кожи.

Уровень техники

Приведенные в настоящем описании ссылки на публикации предшествующего уровня техники (или информация, полученная из таких публикаций), или на любые общедоступные сведения не следует рассматривать как признание или предложение в любой форме того, что публикация предшествующего уровня техники (или информация, полученная из этой публикации) или общедоступные сведения являются частью общего знания в той области деятельности, к которой относится настоящее описание.

Старение кожи является динамическим процессом, на который оказывают влияние не только естественные клеточные и внеклеточные изменения, происходящие со временем, но также и экологические, или внешние, факторы, такие как недостаточное питание, курение, чрезмерное потребление алкоголя и, в частности, хроническое воздействие УФ излучения.

Естественное, или хронологическое, старение кожи является результатом врожденной дегенерации соединительной ткани кожи. Этот вид старения кожи является неизбежным, хотя генетические особенности могут сдерживать его начало и/или клиническое прогрессирование. Естественно стареющая кожа проявляется в виде эпидермальной и дермальной атрофии, сглаживания эпидермальных выростов, а также уменьшения количества фибробластов и мастоцитов и уменьшения уровня коллагена. С косметической точки зрения такая кожа может выглядеть безупречно, но иметь тонкие линии, складки и может потерять эластичность. (Baumann, L, 2007; Helfrich, Y.R., 2008; и приведенные там ссылки).

Фотостарение, общий каузативный фактор старения, вызываемого воздействием внешних условий, является термином, используемым для описания косметического и физиологического влияния на кожу длительного воздействия естественного или искусственного УФ излучения. Хотя фотостарению может быть подвержена любая часть тела, которая находится под воздействием УФ излучения, наиболее часто этому подвержены лицо, руки, кисти рук, шея и верхняя часть груди. Фотостареющая кожа проявляется в виде увеличения толщины эпидермального слоя или атрофии эпидермального слоя и прежде всего в виде солнечного эластоза, накопления эластин-содержащего материала непосредственно под дермо-эпидермальным соединением. Коллагеновые и эластиновые волокна становятся фрагментированными и неорганизованными. На косметическом уровне это может выглядеть в виде покраснения и/или утолщения кожи (в виде задубевшей кожи), хрупкость кожи и неровной пигментации, потери тонуса и эластичности (Baumann, L, 2007; Helfrich, Y.R., 2008; и приведенные там ссылки), а также в виде появления морщин, сухости, веснушек и образования глубоких борозд.

Гиалуронан, или гиалуроновая кислота (HA), представляет собой высокомолекулярный (1×10⁴-1×10⁷ Да) несульфатированный полисахаридный компонент семейства гликозаминогликанов и является важным компонентом внеклеточного матрикса (ECM) дермы, выполняющим множество основных структурных и физиологических функций. Он состоит из повторяющихся дисахаридных звеньев сахаров N-ацетилглюкозамина и D-глюкуроновой кислоты и синтезируется ферментами HA-синтазами (HAS), из которых были выделены три гена позвоночных и охарактеризованы как HAS1, HAS2 и HAS3. Гиалуронан может связывать до 1000 раз больше воды, чем весит сам, и, вместе с другим гликозаминогликанами (GAS) способствует сохранению и поддержанию воды в коже, таким образом, поддерживая ее гладкий и округлый вид. Он был обнаружен в дерме и эпидермисе, в частности, в эпидермальном межклеточном пространстве, и синтезируется, главным образом, фибробластами и кератиноцитами.

Кожа эмбриона/внутриутробного плода на ранней стадии, архитипичная кожа без признаков естественного старения/фотостарения, отличается повышенными уровнями гиалуронана. Гиалуронан в коже плода усиливает реорганизацию коллагеновой решетки и увеличивает синтез коллагена типа III и V, в молодой коже гиалуронан обнаружен на периферии коллагена и эластиновых волокон и в местах их пересечения. Стареющая кожа, напротив, отличается сниженными уровнями гиалуронана, и фотостареющая кожа, как было отмечено, также демонстрирует уменьшенное содержание гиалуронана. (Baumann, L., 2007 и приведенные там ссылки).

Увеличенные уровни гиалуронана, ассоциированные с отсутствием признаков естественно стареющей/фотостареющей кожи, объясняются увеличенной экспрессией генов гиалуронан-синтазы (HAS). Общепринято, что три гена HAS являются ответственными за регулирование гиалуронан-синтазы; HAS1, HAS2 и HAS3. Экспрессия гена HAS1 отсутствует в фибробластах естественно стареющей/фотостареющей кожи. HAS2 считается ответственным за эмбриональное/фетальное развитие, а HAS3 связан с естественно стареющей/фотостареющей кожей.

Молекулярная масса гиалуронана (вместе с концентрацией) также имеет важное влияние на архитектуру кожи: с высокомолекулярным гиалуронаном формируется более эффективная перицеллюлярная оболочка по сравнению с низкомолекулярным гиалуронаном (Meran et al., 2007, 2008; Stern and Maibach, 2008). Действительно, молекулярная масса вновь синтезированного гиалуронана в человеческой коже имеет высокую молекулярную массу как в эпидермисе, так и в дерме. В то время как HAS1 и HAS3 связаны с синтезом более низкомолекулярного гиалуронана, и, как описано выше, ассоциированы со стареющей/фотостареющей кожей, HAS2-синтезированный гиалуронан имеет высокую молекулярную массу (обычно, по меньшей мере, 1,5×10 ⁶ Да).

Хотя общепризнано, что лучшим и наиболее эффективным способом профилактики или, по меньшей мере, минимизации процесса фотостарения является исключение воздействия УФ излучения на кожу, в частности, нахождение в тени и ношение защитной одежды и использование солнцезащитного крема, и что естественный процесс старения является неизбежным, тем не менее, в современном одержимом молодостью обществе остается устойчивый спрос на лечение, которое может "повернуть время вспять" путем возвращения или, по меньшей мере, улучшения или совершенствования одного или нескольких косметических проявлений процесса естественного старения и/или фотостарения, таких как линии, морщины, сухость, глубокие морщины, покраснение, утолщение, веснушки, потеря тонуса и эластичности, хрупкость и неравномерная пигментация. Действительно, потребительский спрос на косметические средства, которые могут восстановить моложавость естественно стареющей или фотостареющей кожи, в частности кожи лица, постоянно увеличивается, при этом ожидается, что к 2010 в одних только Соединенных Штатах рынок антивозрастных технологий превысит по сумме продаж 16,5 миллиардов долларов (Helfrich, Y.R., et al., 2008).

Учитывая такую потребность, имеется необходимость в новом лечении, которое может помочь вернуть, улучшить или каким-либо иным способом усовершенствовать одно или несколько косметических проявлений, ассоциированных с естественным старением и фотостарением кожи.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того, что ингенол-3-ангелат, производное ингенола, обнаруженное в растениях вида Euphorbia, индуцирует синтез эндогенного высокомолекулярного гиалуранона в дермальных фибробластах. Таким образом, предоставляется способ улучшения косметического вида кожи, в частности естественно или фотостареющей кожи.

Следовательно, в первом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения естественно стареющей и/или фотостареющей кожи у субъекта, содержащий введении в кожу указанного субъекта производного ингенола или его фармацевтически приемлемой соли.

В других аспектах изобретение также предоставляет производные ингенола или их фармацевтически приемлемые соли, а также композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель и указанные производные или соли для применения при лечении естественно стареющей и/или фотостареющей кожи. Также предоставляется использование производных ингенола или их фармацевтически приемлемых солей при изготовлении композиции или лекарственного средства для лечения естественно стареющей и/или фотостареющей кожи.

В другом аспекте, предоставляется способ индуцирования синтеза эндогенного гиалуронана у субъекта, содержащий введение в кожу указанного субъекта производного ингенола или его фармацевтически приемлемой соли.

Другой аспект изобретения предоставляет применение производного ингенола или его фармацевтически приемлемой соли для индуцирования синтеза эндогенного гиалуронана у субъекта.

Еще один аспект предоставляет применение производного ингенола или его фармацевтически приемлемой соли при изготовлении лекарственного средства для индуцирования синтеза эндогенного гиалуронана у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления изобретения используют топическое введение в кожу производного ингенола.

В некоторых вариантах осуществления изобретения данное соединение выбирают из следующих: ингенол-3-ангелата, 20-O-ацетил-ингенол-3-ангелата и 20-дезокси-ингенол-3-ангелата, и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств. В одном из примеров это соединение представляет собой ингенол-3-ангелат или его фармацевтически приемлемую соль.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 графически изображен средний уровень синтеза гиалуронана дермальными фибробластами, культивируемыми в 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005 без или с TGF- ₁ (нг/мл) за (A) 24 часа и (B) 72 часа, (N=3, среднее значение ± SE, *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001, по сравнению с контролями дермальных фибробластов, культивируемых без PEP005).

На Фиг.2 приведены характерные цифровые изображения, полученные для процесса формирования перицеллюлярной гиалуроновой оболочки дермальными фибробластами, культивируемыми в (A) 0, (B) 0,01 мкг/мл, (C) 0,1 мкг/мл, (D) 1 мкг/мл, (E) 10 мкг/мл и (F) 100 мкг/мл PEP005 без TGF- ₁ (10 нг/мл) за 24 часа (×200).

На Фиг.3 приведены характерные цифровые изображения, полученные для процесса формирования перицеллюлярной гиалуроновой оболочки дермальными фибробластами, культивируемыми в (A) 0, (B) 0,01 мкг/мл, (C) 0,1 мкг/мл, (D) 1 мкг/мл, (E) 10 мкг/мл и (F) 100 мкг/мл PEP005 без TGF- ₁ (10 нг/мл) за 72 часа (×200).

На Фиг.4 приведены характерные цифровые изображения, полученные для процесса формирования перицеллюлярной гиалуроновой оболочки дермальными фибробластами, культивируемыми в (A) 0, (B) 0,01 мкг/мл, (C) 0,1 мкг/мл, (D) 1 мкг/мл, (E) 10 мкг/мл и (F) 100 мкг/мл PEP005 в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл) за 24 часа (×200).

На Фиг.5 приведены характерные цифровые изображения, полученные для процесса формирования перицеллюлярной гиалуроновой оболочки дермальными фибробластами, культивируемыми в (A) 0, (B) 0,01 мкг/мл, (C) 0,1 мкг/мл, (D) 1 мкг/мл, (E) 10 мкг/мл и (F) 100 мкг/мл PEP005 в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл) за 72 часа (×200).

На Фиг.6 показан средний уровень экспрессии гена HAS1 дермальными фибробластами, культивируемыми в 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005 без или с TGF- ₁ (10 нг/мл) за (A) 24 часа и (B) 72 часа (N=2, среднее значение ± SE, *p<0,05, **p<0,01, по сравнению с контролями дермальных фибробластов, культивируемых без PEP005).

На Фиг.7 показан средний уровень экспрессии гена HAS2 дермальными фибробластами, культивируемыми в 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005 без или с TGF- ₁ (10 нг/мл) за (A) 24 часа и (B) 72 часа (N=3, среднее значение ± SE).

На Фиг.8 показан средний уровень экспрессии гена HAS3 дермальными фибробластами, культивируемыми в 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005 без или с TGF- ₁ (10 нг/мл) за (A) 24 часа и (B) 72 часа (N=3, среднее значение ± SE).

На Фиг.9 показано включение [3H]-глюкозамина (за День 1) в дермальные фибробласты, обработанные 0, 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мкг/мл PEP005 без TGF- ₁.

На Фиг.10 показано включение [3H]-глюкозамина (за День 3) в дермальные фибробласты, обработанные 0, 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мкг/мл PEP005 без TGF- ₁.

На Фиг.11 показано включение [3H]-глюкозамина (за День 1) в дермальные фибробласты, обработанные 0, 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мкг/мл PEP005 в присутствии TGF- ₁.

На Фиг.12 показано включение [3H]-глюкозамина (за День 3) в дермальные фибробласты, обработанные 0, 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мкг/мл PEP005 в присутствии TGF- ₁.

Подробное описание изобретения

Формы единственного числа включают аспекты множественного числа, если из контекста в явном виде не следует иное. Таким образом, например, ссылка на "ангелоил-замещенный ингенан", или "ингенол ангелат" включает одно соединение, а также, соответственно, два или несколько соединений.

Во всем описании и следующей за ним формуле изобретения, если из контекста не следует иное, слово "содержать" и его варианты, такие как "содержит" и "содержащий", следует понимать, как подразумевающие включение указанного объекта или стадии или группы объектов, а не исключение любого другого объекта или стадии или группы объектов.

Используемый здесь термин "лечение" означает улучшение, полное или частичное восстановление, или, по меньшей мере, некоторое изменение эстетических или косметических характеристик и/или физиологических свойств (таких как увеличение уровня гиалуранона) кожи. С косметической точки зрения, это может включать сокращение, устранение, ослабление или какое-либо улучшение проявления одного или нескольких из следующих показателей: сухости, тонких линий, морщин, борозд, красноты, веснушек и неравномерной пигментации.

Это можно оценить или определить каким-либо способом, обычно используемым в данной области техники. В одном из способов, приведенных в качестве примера, используется описанная здесь фотография TruVu®. Другие способы могут включать измерение или оценку морщин согласно способам, известным в данной области.

Ссылка на "высокомолекулярный гиалуронан" означает молекулярную массу, по меньшей мере, примерно 1,5×10⁶ Да. Величина молекулярной массы может быть определена согласно способам, известным в данной области техники, таким как гель-фильтрационная хроматография относительно известных стандартов, см., например, Simpson, R.M., et al., 2009.

Ссылка на "ингенол" относится к соединениям, имеющим скелет С₃-, С ₄-, C₅-триокси транс-бицикло[4.4.1]-ундекан ингенана. О таких соединениях имеется множество сообщений, и они известны в литературе и могут быть выделены из растений, таких как виды семейства Euphorbiaceae или могут быть полностью или частично синтезированы химическим способом (см., например, Winkler et al., 2002, and Tanino et al., 2003). Искусственно полученные производные ингенола могут включать стереоизомеры встречающихся в природе ингенолов. Таким образом, в настоящем описании также рассматриваются смеси рацематов и стереоизомеров. Рассмотренные здесь соединения вообще были обнаружены в экстрактах растений Euphorbiaceae. Следовательно, экстракт может содержать сок или жидкий или полужидкий материал, выделяемый или находящийся в листьях, стебле, цветах, семенах, коре или между корой и стеблем. Наиболее предпочтительным является экстракт сока. Кроме того, экстракт может содержать жидкий или полужидкий материал, находящийся во фракциях, экстрагированных из сока, листьев, стеблей, цветов, коры или другого растительного материала растения семейства Euphoriaceae. Например, растительный материал может быть подвергнут физической обработке для разрушения растительных волокон и материала межклеточного и внеклеточного матрикса и внутренней и внешней тканей, экстрагированных в растворителе, включая водную среду. Настоящее изобретение охватывает все такие источники соединений, включая соединения, полученные с помощью химического синтеза. В некоторых вариантах осуществления изобретения производное ингенола используется в выделенной или очищенной форме, что означает, что оно является или было получено из естественного источника или способом выделения или синтеза по существу свободным или не содержащим другие соединения или загрязняющие агенты. Однако следует учитывать, что очищенная форма может быть затем смешана или включена в фармацевтическую композицию с другими соединениями, включая, при необходимости, соединения из природного источника. В некоторых вариантах осуществления по существу очищенное производное ингенола является чистым, по меньшей мере, на 95%. В других вариантах осуществления по существу очищенное соединение является чистым, по меньшей мере, на 97 или 98%. В других вариантах осуществления по существу очищенное соединение является чистым, по меньшей мере, на 99 или 99,5%.

Приведенная здесь ссылка на члены семейства Euphorbiaceae включает ссылку на виды следующих родов: Acalypha, Acidoton, Actinostemon, Adelia, Adenocline, Adenocrepis, Adenophaedra, Adisca, Agrostistachys, Alchornea, Alchorneopsis, Alcinaeanthus, Alcoceria, Aleurites, Amanoa, Andrachne, Angostyles, Anisophyllum, Antidesma, Aphora, Aporosa, Aporosella, Argythamnia, Astrococcus, Astrogyne, Baccanrea, Baliospermum, Bernardia, Beyeriopsis, Bischofia, Blachia, Blumeodondron, Bonania, Bradleia, Breynia, Breyniopsis, Briedelia, Buraeavia, Caperonia, Caryodendron, Celianella, Cephalocroton, Chaenotheca, Chaetocarpus, Chamaesyce, Cheilosa, Chiropetalum, Choriophyllum, Cicca, Chaoxylon, Cleidon, Cleistanthus, Cluytia, Cnesmone, Cnidoscolus, Coccoceras, Codiaeum, Coelodiscus, Conami, Conceveiba, Conceveibastrum, Conceveibum, Corythea, Croizatia, Croton, Crotonopsis, Crozophora, Cubanthus, Cunuria, Dactylostemon, Dalechampia, Dendrocousinsia, Diaspersus, Didymocistus, Dimorphocalyx, Discocarpus, Ditaxis, Dodecastingma, Drypetes, Dysopsis, Elateriospermum, Endadenium, Endospermum, Erismanthus, Erythrocarpus, Erythrochilus, Eumecanthus, Euphorbia, Euphorbiodendron, Excoecaria, Flueggea, Calearia, Garcia, Gavarretia, Gelonium, Giara, Givotia, Glochidion, Clochidionopsis, Glycydendron, Gymnanthes, Gymnosparia, Haematospermum, Hendecandra, Hevea, Hieronima, Hieronyma, Hippocrepandra, Homalanthus, Hymenocardia, Janipha, Jatropha, Julocroton, Lasiocroton, Leiocarpus, Leonardia, Lepidanthus, Leucocroton, Mabea, Macaranga, Mallotus, Manihot, Mappa, Maprounea, Melanthesa, Mercurialis, Mettenia, Micrandra, Microdesmis, Microelus, Microstachy, Maocroton, Monadenium, Mozinna, Neoscortechinia, Omalanthus, Omphalea, Ophellantha, Orbicularia, Ostodes, Oxydectes, Palenga, Pantadenia, Paradrypeptes, Pausandra, Pedilanthus, Pera, Peridium, Petalostigma, Phyllanthus, Picrodendro, Pierardia, Pilinophytum, Pimeleodendron, Piranhea, Platygyna, Plukenetia, Podocalyx, Poinsettia, Poraresia, Prosartema, Pseudanthus, Pycnocoma, Quadrasia, Reverchonia, Richeria, Richeriella, Ricinella, Ricinocarpus, Rottlera, Sagotia, Sanwithia, Sapium, Savia, Sclerocroton, Sebastiana, Securinega, Senefeldera, Senefilderopsis, Serophyton, Siphonia, Spathiostemon, Spixia, Stillingia, Strophioblachia, Synadenium, Tetracoccus, Tetraplandra, Tetrorchidium, Thyrsanthera, Tithymalus, Trageia, Trewia, Trigonostemon, Tyria и Xylophylla.

Предпочтительным родом и, в частности, подходящим для практической реализации настоящего изобретения является род Euphorbia. Особенно полезные виды этого рода включают следующие: Euphorbia aaron-rossii, Euphorbia abbreviata, Euphorbia acuta, Euphorbia alatocaulis, Euphorbia albicaulis, Euphorbia algomarginata, Euphorbia aliceae, Euphorbia alta, Euphorbia anacampseros, Euphorbia andromedae, Euphorbia angusta, Euphorbia anthonyi, Euphorbia antiguensis, Euphorbia apocynifolia, Euphorbia arabica, Euphorbia ariensis, Euphorbia arizonica, Euphorbia arkansana, Euphorbia arteagae, Euphorbia arundelana, Euphorbia astroites, Euphorbia atrococca, Euphorbia baselicis, Euphorbia batabanensis, Euphorbia bergeri, Euphorbia bermudiana, Euphorbia bicolor, Euphorbia biformis, Euphorbia bifurcata, Euphorbia bilobata, Euphorbia biramensis, Euphorbia biuncialis, Euphorbia blepharostipula, Euphorbia blodgetti, Euphorbia boerhaavioides, Euphorbia boliviana, Euphorbia bracei, Euphorbia brachiata, Euphorbia brachycera, Euphorbia brandegee, Euphorbia brittonii, Euphorbia caesia, Euphorbia calcicola, Euphorbia campestris, Euphorbia candelabrum, Euphorbia capitellata, Euphorbia carmenensis, Euphorbia carunculata, Euphorbia cayensis, Euphorbia celastroides, Euphorbia chalicophila, Euphorbia chamaerrhodos, Euphorbia chamaesula, Euphorbia chiapensis, Euphorbia chiogenoides, Euphorbia cinerascens, Euphorbia clarionensis, Euphorbia colimae, Euphorbia colorata, Euphorbia commutata, Euphorbia consoquitlae, Euphorbia convolvuloides, Euphorbia corallifera, Euphorbia creberrima, Euphorbia crenulata, Euphorbia cubensis, Euphorbia cuspidata, Euphorbia cymbiformis, Euphorbia darlingtonii, Euphorbia defoliata, Euphorbia degeneri, Euphorbia deltoidea, Euphorbia dentata, Euphorbia depressa, Euphorbia dictyosperma, Euphorbia dioeca, Euphorbia discoidalis, Euphorbia dorsiventralis, Euphorbia drumondii, Euphorbia duclouxii, Euphorbia dussii, Euphorbia eanophylla, Euphorbia eggersii, Euphorbia eglandulosa, Euphorbia elata, Euphorbia enalla, Euphorbia eriogonoides, Euphorbia eriophylla, Euphorbia esculaeformis, Euphorbia espirituensis, Euphorbia esula, Euphorbia excisa, Euphorbia exclusa, Euphorbia exstipitata, Euphorbia exstipulata, Euphorbia fendleri, Euphorbia filicaulis, Euphorbia flliformis, Euphorbia florida, Euphorbia fruticulosa, Euphorbia garber, Euphorbia gaumerii, Euphorbia gerardiana, Euphorbia geyeri, Euphorbia glyptosperma, Euphorbia gorgonis, Euphorbia gracilior, Euphorbia gracillima, Euphorbia gradyi, Euphorbia graminea, Euphorbia graminiea, Euphorbia grisea, Euphorbia guadalajarana, Euphorbia guanarensis, Euphorbia gymnadenia, Euphorbia haematantha, Euphorbia hedyotoides, Euphorbia heldrichii, Euphorbia helenae, Euphorbia helleri, Euphorbia helwigii, Euphorbia henricksonii, Euphorbia heterophylla, Euphorbia hexagona, Euphorbia hexagonoides, Euphorbia hinkleyorum, Euphorbia hintonii, Euphorbia hirtula, Euphorbia hirta, Euphorbia hooveri, Euphorbia humistrata, Euphorbia hypericifolia, Euphorbia inundata, Euphorbia involuta, Euphorbia jaliscensis, Euphorbia jejuna, Euphorbia johnston, Euphorbia juttae, Euphorbia knuthii, Euphorbia lasiocarpa, Euphorbia lata, Euphorbia latazi, Euphorbia latericolor, Euphorbia laxiflora Euphorbia lecheoides, Euphorbia ledienii, Euphorbia leucophylla, Euphorbia lineata, Euphorbia linguiformis, Euphorbia longecornuta, Euphorbia longepetiolata, Euphorbia longeramosa, Euphorbia longinsulicola, Euphorbia longipila, Euphorbia lupulina, Euphorbia lurida, Euphorbia lycioides, Euphorbia macropodoides, Euphorbia macvaughiana, Euphorbia manca, Euphorbia mandoniana, Euphorbia mangleti, Euphorbia mango, Euphorbia marylandica, Euphorbia mayana, Euphorbia melanadenia, Euphorbia melanocarpa, Euphorbia meridensis, Euphorbia mertonii, Euphorbia mexiae, Euphorbia microcephala, Euphorbia microclada, Euphorbia micromera, Euphorbia misella, Euphorbia missurica, Euphorbia montana, Euphorbia montereyana, Euphorbia multicaulis, Euphorbia multiformis, Euphorbia multinodis, Euphorbia multiseta, Euphorbia muscicola, Euphorbia neomexicana, Euphorbia nephradenia, Euphorbia niqueroana, Euphorbia oaxacana, Euphorbia occidentalism, Euphorbia odontodenia, Euphorbia olivacea, Euphorbia olowaluana, Euphorbia opthalmica, Euphorbia ovata, Euphorbia pachypoda, Euphorbia pachyrhiza, Euphorbia padifolia, Euphorbia palmeri, Euphorbia paludicola, Euphorbia parciflora, Euphorbia parishii, Euphorbia parryi, Euphorbia paxiana, Euphorbia pediculifera, Euphorbia peplidion, Euphorbia peploides, Euphorbia peplus, Euphorbia pergamena, Euphorbia perlignea, Euphorbia petaloidea, Euphorbia petrina, Euphorbia picachensis, Euphorbia pilosula, Euphorbia pilulifera, Euphorbia pinariona, Euphorbia pinetorum, Euphorbia pionosperma, Euphorbia platysperma, Euphorbia plicata, Euphorbia poeppigii, Euphorbia poliosperma, Euphorbia polycarpa, Euphorbia polycnemoides, Euphorbia polyphylla, Euphorbia portoricensis, Euphorbia portulacoides Euphorbia portulana, Euphorbia preslii, Euphorbia prostrata, Euphorbia pteroneura, Euphorbia pycnanthema, Euphorbia ramosa, Euphorbia rapulum, Euphorbia remyi, Euphorbia retroscabra, Euphorbia revoluta, Euphorbia rivularis, Euphorbia robusta, Euphorbia romosa, Euphorbia rubida, Euphorbia rubrosperma, Euphorbia rupicola, Euphorbia sanmartensis, Euphorbia saxatilis М. Bieb, Euphorbia schizoloba, Euphorbia sclerocyathium, Euphorbia scopulorum, Euphorbia senilis, Euphorbia serpyllifolia, Euphorbia serrula, Euphorbia setiloba Engelm, Euphorbia sonorae, Euphorbia soobyi, Euphorbia sparsiflora, Euphorbia sphaerosperma, Euphorbia syphilitica, Euphorbia spruceana, Euphorbia subcoerulea, Euphorbia stellata, Euphorbia submammilaris, Euphorbia subpeltata, Euphorbia subpubens, Euphorbia subreniforme, Euphorbia subtrifoliata, Euphorbia succedanea, Euphorbia tamaulipasana, Euphorbia telephioides, Euphorbia tenuissima, Euphorbia tetrapora, Euphorbia tirucalli, Euphorbia tomentella, Euphorbia tomentosa, Euphorbia torralbasii, Euphorbia tovariensis, Euphorbia trachysperma, Euphorbia tricolor, Euphorbia troyana, Euphorbia tuerckheimii, Euphorbia turczaninowii, Euphorbia umbellulata, Euphorbia undulata, Euphorbia vermiformis, Euphorbia versicolor, Euphorbia villifera, Euphorbia violacea, Euphorbia whitei, Euphorbia xanti Engelm, Euphorbia xylopoda Greenm., Euphorbia yayalesia Urb., Euphorbia yungasensis, Euphorbia zeravschanica и Euphorbia zinniiflora.

В некоторых вариантах осуществления виды рода Synadenium включают Synadenium grantii и Synadenium compactum.

В некоторых вариантах осуществления виды рода Monadenium включают Monadenium lugardae и Monadenium guentheri.

В одном из вариантов осуществления вид рода Endadenium представляет собой Endadenium gossweileni.

В другом варианте осуществления при реализации настоящего изобретения используется Euphorbia peplus в части обеспечения источника производных ингенола, таких как ангелаты ингенола. Используемая здесь ссылка на "Euphorbia peplus" или его сокращение "E. peplus" включает различные разновидности, сорта, линии, гибриды или производные этого растения, а также его ботанических или садоводческих родственников. Кроме того, настоящее изобретение может быть реализовано с использованием целого растения Euphorbiaceae или его части, включая сок или семена, или может быть использован другой репродуктивный материал. Обычно для использования семян или репродуктивного материала, сначала необходимо размножить растение или саженец.

Используемая здесь ссылка на растение Euphorbiaceae, вид Euphorbia или E. peplus также охватывает генетически модифицированные растения. Генетически модифицированные растения включают трансгенные растения или растения, у которых удален какой-либо характерный признак, или у которых последовательность эндогенного гена подавлена, мутирована или изменена иным образом, включая изменение или введение генетического материала, который оказывает регуляторное воздействие на конкретный ген. Следовательно, растение, которое выглядит не естественным для растения Euphorbiaceae или вида Euphorbia, или E. peplus, образом, тем не менее рассматривается в настоящем изобретении и включено в объем указанных выше терминов.

В одном из вариантов осуществления изобретения производное ингенола имеет формулу:

где

R¹-R ³ независимо выбирают из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкинила, необязательно замещенного ацила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного арилалкила, S(О)₂ R', S(О)₂OR', P(О)(OR')₂ (где R' представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, ацил, арил, или арилалкил) и гликозила, или R¹ и R² или R² и R³ могут образовать метиленовую или этиленовую цепь; и

R⁴ выбирают из водорода, гидрокси, необязательно замещенного алкокси, необязательно замещенного алкенокси, необязательно замещенного алкинокси, необязательно замещенного ацилокси, необязательно замещенного арилалкокси, OS(О)₂R', OS(О)₂OR', OP(О)(OR') ₂ (где R' представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, ацил, арил или арилалкил) и гликокси.

В некоторых примерах, по меньшей мере, один из R¹-R ⁴ не является водородом. В другом примере, R¹ не является водородом.

В некоторых примерах изобретения R¹ представляет собой необязательно замещенную ацильную группу C(О)-R. В других примерах R представляет собой необязательно замещенный алкил, алкенил или алкинил. В других примерах R может быть прямой или разветвленной цепью и может иметь до 6 или до 10 атомов углерода. В других примерах, R является разветвленным.

В некоторых примерах изобретения один из R¹ -R³ представляет собой группу ангелоила, изображенную ниже в виде формулы (i), или R⁴ представляет собой группу O-ангелоила. В настоящем описании такие соединения называются ангелатами ингенола. В одном из таких примеров изобретения R ¹ представляет собой группу ангелоила формулы (i).

(i)

В некоторых примерах изобретения один или оба, R² и R³, представляют собой водород. R² и R³ вместе также могут образовать метиленовую или этиленовую диоксигруппу.

В некоторых примерах изобретения R⁴ представляет собой водород, гидрокси или ацилокси, такой как группа формулы -OC(О)C_1-6 алкил, например ацетокси.

В некоторых примерах изобретения соединения для применения в описанных способах, применениях и композициях представляют собой ингенол-3-ангелат, 20-O-ацетил-ингенол-3-ангелат и 20-дезокси-ингенол-3-ангелат (изображенный ниже), и его фармацевтически приемлемые соли и пролекарства.

R⁴=ОН, ингенол-3-ангелат

R⁴=OAc, 20-O-ацетил-ингенол-3-ангелат

R⁴=H, 20-дезокси-ингенол-3-ангелат

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение представляет собой ингенол-3-ангелат. Используемое в настоящем описании название "ингенол-3-ангелат" включает встречающиеся в природе, а также химически синтезированные формы.

Несмотря на признание того, что эти соединения можно использовать в виде сока или экстракта Euphorbiacae, рассматриваемые в настоящем описании производные ингенола преимущественно используются, по меньшей мере, в частично очищенной или изолированной форме, такой как, по меньшей мере, 95% очищенная форма, обычно чистая, по меньшей мере, на 97, 98 или 99%.

Производные ингенола можно подвергать алкилированию, алкенилированию, алкинилированию, арилированию, арилалкилированию или ацилированию с помощью способов, известных в области химии синтеза для алкилирования, алкенилирования, алкинилирования, арилирования, арилалкилирования или ацилирования свободных гидрокси групп (см. например, Greene и Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis, 1999; March, Advanced Organic Chemistry, 5th Edition; Larock, Comprehensive Organic Transformations, 1999; содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки). Например, гидрокси группы могут быть алкилированы (или арилалкилированы) с помощью алкил (или арилалкил) галогенидов, таких как метилйодид (или бензилбромид), или диалкилсульфатов, таких как диметил- или диэтилсульфат. Ацилирование можно осуществлять путем обработки соответствующими карбоновыми кислотами, галогенангидридами и кислотными ангидридами в присутствии основания или связывающего агента. Гликозид может быть получен химическим способом, например, с помощью реакции между производным ингенола и защищенным соединением сахара, в котором C-1 был активирован галогенированием для присоединения к гидроксильным или карбоксильным группам, а гидроксильные группы сахара были заблокированы защитными группами. В качестве альтернативы, гликозид может быть образован с участием соответствующих ферментов, например, гликозилтрансферазы, такой как UDP-галактозо-зависимая галактоцилтрансфераза и UDP-глюкозо-зависимая гликотрансфераза. Предпочтительные C-1 связанные сахариды представляют собой сахаридный (сахара) заместитель фуранозной или пиранозной формы, который связан со структурой ингенол ангелата через C-1 сахарид (согласно традиционной нумерации) путем формирования ацетильной связи. Иллюстративные сахаридные группы включают редуцирующие сахара, такие как глюкоза, рибоза, арабиноза, ксилоза, манноза и галактоза, каждый из которых связан с атомом кислорода производного ингенола.

Сульфатные, сульфонатные и фосфатные группы могут быть получены способами, известными в данной области. Примеры R' включают водород, C_1-6алкил, фенил и бензил.

Используемый в настоящем описании термин "алкил" означает алкил с прямой или разветвленной цепью, предпочтительно С_1-20 алкил, например, С_1-10 или C _1-6. Примеры алкила с прямой и разветвленной цепью включают: метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, 1,2-диметилпропил, 1,1-диметилпропил, гексил, 4-метилпентил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 1,2,2,-триметилпропил, 1,1,2-триметилпропил, гептил, 5-метилгексил, 1-метилгексил, 2,2-диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 4,4-диметилпентил, 1,2-диметилпентил, 1,3-диметилпентил, 1,4-диметилпентил, 1,2,3-триметилбутил, 1,1,2-триметилбутил, 1,1,3-триметилбутил, октил, 6-метилгептил, 1-метилгептил, 1,1,3,3-тетраметилбутил, нонил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- или 7-метилоктил, 1-, 2-, 3-, 4- или 5-этилгептил, 1-, 2- или 3-пропилгексил, децил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- и 8-метилнонил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- или 6-этилоктил, 1-, 2-, 3- или 4-пропилгептил, ундецил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- или 9-метилдецил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- или 7-этилнонил, 1-, 2-, 3-, 4- или 5-пропилоктил, 1-, 2- или 3-бутилгептил, 1-пентилгексил, додецил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10-метилундецил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-этилдецил, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- или 6-пропилнонил, 1-, 2-, 3- или 4-бутилоктил, 1-2-пентилгептил и т.п. Там, где алкильная группа указана в общем виде как "пропил", "бутил" и т.д., следует иметь в виду, что это может относиться к любому из соответствующих прямых, разветвленных или циклических изомеров. Алкильная группа может быть необязательно замещенной одним или несколькими определенными здесь необязательными заместителями. "Циклоалкильная" группа представляет собой циклическую алкильную группу, по меньшей мере, из трех атомов углерода, например, С₃-C₈, такую как C₃-, С₄-, С₅- или С ₆-циклоалкил. Примеры "циклоалкила" включают моно- или полициклические алкильные группы, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил и т.п. Циклоалкильная группа может быть необязательно замещенной одним или несколькими определенными здесь необязательными заместителями.

Используемый в настоящем описании термин "алкенил" означает, что группы, образованные из углеводородных остатков с прямой или разветвленной цепью или циклических остатков, содержат, по меньшей мере, одну двойную связь углерод-углерод, включая этилен моно- ди- или полиненасыщенные алкильные или циклоалкильные группы, определенные выше, предпочтительно C_2-20 алкенил (например, C_2-10 или С_2-6). Примеры алкенила включают винил, аллил, 1-метилвинил, бутенил, изобутенил, 3-метил-2-бутенил, 1-пентенил, циклопентенил, 1-метил-циклопентенил, 1-гексенил, 3-гексенил, циклогексенил, 1-гептенил, 3-гептенил, 1-октенил, циклооктенил, 1-ноненил, 2-ноненил, 3-ноненил, 1-деценил, 3-деценил, 1,3-бутадиенил, 1,4-пентадиенил, 1,3-циклопентадиенил, 1,3-гексадиенил, 1,4-гексадиенил, 1,3-циклогексадиенил, 1,4-циклогексадиенил, 1,3-циклогептадиенил, 1,3,5-циклогептатриенил и 1,3,5,7-циклооктатетраенил. Алкенильная группа может быть необязательно замещенной одним или несколькими определенными здесь необязательными заместителями.

Используемый в настоящем описании термин "алкинил" означает группы, образованные из углеводородных остатков с прямой или разветвленной цепью, или циклических остатков, содержащих, по меньшей мере, одну тройную связь углерод-углерод, включая этинил моно- ди- или полиненасыщенные алкильные или циклоалкильные группы, определенные выше. Если количество атомов углерода не определено, этот термин предпочтительно относится к C_2-20 алкинилу (например, C_2-10 или C_2-6). Примеры включают изомеры этинила, 1-пропинила, 2-пропинила и бутинила, и изомеры пентинила. Алкильная группа может быть необязательно замещенной одним или несколькими определенными здесь необязательными заместителями.

Термин "арил" означает любой из одиночных, многоядерных, сопряженных и конденсированных остатков ароматических углеводородных кольцевых систем. Примеры арила включают фенил, бифенил, терфенил, кватерфенил, нафтил, тетрагидронафтил, антраценил, дигидроантраценил, бензантраценил, дибензантраценил, фенантренил, флуоренил, пиренил, иденил, азуленил, хризенил. Предпочтительный арил включает фенил и нафтил. Арильная группа может быть необязательно замещенной одним или несколькими определенными здесь необязательными заместителями.

Термин "ацил" означает группу C(О)-R, где R может представлять собой водород, алкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, арилалкил или арильный остаток. Примеры ацила включают формил, алканоил с прямой или разветвленной цепью (например, C_1-20), такой как ацетил, пропаноил, бутаноил, 2-метилпропаноил, пентаноил, 2,2-диметилпропаноил, гексаноил, гептаноил, октаноил, нонаноил, деканоил, ундеканоил, додеканоил, тридеканоил, тетрадеканоил, пентадеканоил, гексадеканоил, гептадеканоил, октадеканоил, нонадеканоил и икозаноил; циклоалкилкарбонил, такой как циклопропилкарбонил циклобутилкарбонил, циклопентилкарбонил и циклогексилкарбонил; алкеноил с прямой или разветвленной цепью (например, C_2-20 ), такой как ангелоил; и ароил, такой как бензоил, толуоил и нафтоил. Остаток R может быть необязательно замещенным, как описано здесь.

Арилалкильная группа представляет собой определенную здесь алкильную группу, замещенную определенной здесь арильной группой. В одном из вариантов осуществления алкильная группа является терминально замещенной арильной группой. Примеры арилалкила включают фенил-C₁-C₂₀алкил, такой как бензил, фенилэтил, фенилпропил, фенилбутил, фенилпентил и фенилгексил. Одна или обе из алкильной и арильной групп могут быть независимо необязательно замещенными одним или несколькими определенными здесь необязательными заместителями.

Термин "необязательно замещенный" означает, что группа может быть незамещенной или замещенной одним или несколькими одинаковыми или различными заместителями. Необязательные заместители для алкила, алкенила, алкинила, арила, арилалкила, арила, и таким образом ацила, включают: галоген (хлор, бром, йод и фтор), гидрокси, C_1-6алкокси, C_1-6алкил, C_3-6 циклоалкил, фенил, нитро, галогенметил (например, трибромметил, трихлорметил, трифторметил), галогенметокси (например, трифторметокси, трибромметокси), C(О)C_1-6алкил, амино (NH₂ ), C_1-6алкиламино, (например, метиламино, этиламино и пропиламино) диC_1-6алкиламино (например, диметиламино, диэтиламино и дипропиламино), CO₂H, CO₂ C_1-6алкил, тио (SH) и C_1-6алкилтио. Необязательный заместитель также включает замену CH₂ группы карбонильной (C=О) группой или может быть метилен- или этилендиокси группой.

Следует иметь в виду, что во время синтетического или полусинтетического способа получения производных ингенола по настоящему изобретению может возникнуть необходимость или может быть желательным защитить другие функциональные группы, которые могут быть реакционными или чувствительными к проводимым реакциям или условиям трансформации. Подходящие защитные группы для таких функциональных групп известны в данной области техники и могут использоваться согласно стандартной практике. Используемый здесь термин "защитная группы" означает вводимую функциональную группу, которая временно дезактивирует определенную функциональную группу в условиях, которым подвергнуто соединение. Такие защитные группы и способы их введения и последующего удаления на соответствующей стадии синтеза хорошо известны (Greene и Wutz, 1999, см. выше).

Настоящее изобретение также относится к пролекарствам, содержащим производные ингенола, для описанного здесь применения. Любое соединение, которое является пролекарством, содержащим производное ингенола, входит в объем и сущность изобретения. Термин "пролекарство" использован в его самом широком смысле и охватывает те производные, которые преобразованы in vivo, либо с помощью ферментов либо гидролитически, в соединения по изобретению. Специалисты в данной области могут легко получить производные, включающие, например, соединения, в которых свободная тиольная или гидрокси группа преобразована в сложный эфир, такой как ацетат или тиоэфир, или, где свободная амино группа преобразована в амид. Процедуры ацилирования соединений по изобретению, например, для получения пролекарства в виде сложного эфира и амида, известны в данной области техники и могут включать обработку соединения соответствующей карбоновой кислотой, ангидридом или хлоридом в присутствии подходящего катализатора или основания. Также рассматриваются сложные эфиры групп карбоновой кислоты (карбокси). Подходящие сложные эфиры представляют собой сложные эфиры C_1-6 алкила; сложные эфиры C_1-6алкоксиметила, например, метоксиметила или этоксиметила; сложные эфиры C_1-6 алконоилоксиметила, например, пивалоилоксиметила; сложные эфиры фталидила; сложные эфиры C_3-8циклоалкоксикарбонилC _1-6алкила, например, 1-циклогексилкарбонилоксиэтила; сложные эфиры 1,3-диоксолен-2-онилметила, например, 5-метил-1,3-диоксолен-2-онилметила; и сложные эфиры C_1-6алкоксикарбонилоксиэтила, например, 1-метоксикарбонилоксиэтила. Пролекарства с амино- функциональными группами включают амиды (см., например, Adv. BioSci., 1979, 20, 369, Kyncl, J. et al.), енамины (см., например, J. Pharm.Sci., 1971, 60, 1810, Caldwell, H. et al.), основания Шиффа (см., например, патент США 2923661 и Antimicrob. Agents Chemother., 1981, 19, 1004, Smyth, R. et al.), оксазолидины (см., например, J, Pharm. Sci., 1983, 72, 1294, Johansen, М. et al.), основания Манниха (см., например, J. Pharm.Sci., 1980, 69, 44, Bundgaard, H. et al. и J. Am. Chem. Soc, 1959, 81, 1198, Gottstein, W. et al.), производные гидроксиметила (см., например, J. Pharm. Sci., 1981, 70, 855, Bansal, P. et al.) и производные N-(ацилокси)алкила и карбаматы (см., например, J. Med. Chem., 1980, 23, 469, Bodor, N. et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1037, Firestone, R. et al., J. Med. Chem., 1967, 10, 960, Kreiger, M. et al., патент США 5684018 и J. Med. Chem., 1988, 31, 318-322, Alexander, J. et al.). Другие обычные процедуры выбора и получения подходящих пролекарств известны в данной области техники и описаны, например, в WO 00/23419; Design of prodrugs, H. Bundgaard, Ed., Elsevier Science Publishers, 1985; Methods in Enzymology, 42: 309-396, K. Widder, Ed, Academic Press, 1985; A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, Eds, Chapter 5, pp.13-191 (1991); Advanced Drug Delivery Reviews, 8; 1-38 (1992); Journal of Pharmaceutical Sciences, 77; 285 (1988), H. Bundgaard, et al.; Chem Pharm Bull, 32692 (1984), N. Kakeya et al и The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Chapter 8, pp.352-401, Academic press, Inc, 1992.

Некоторые примеры рассматриваемых пролекарств включают сложные эфиры, сульфонаты и фосфонаты ацила.

Подходящие фармацевтически приемлемые соли соединений включают, но не ограничиваются этим, соли фармацевтически приемлемых неорганических кислот, таких как хлористоводородная, серная, фосфорная, азотная, угольная, борная, сульфаминовая и бромистоводородная кислоты, или соли фармацевтически приемлемых органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, масляная, винная, малеиновая, гидроксималеиновая, фумаровая, малеиновая, лимонная, молочная, муциновая, глюконовая, бензойная, сукциновая, щавелевая, фенилуксусная, метансульфоновая, толуолсульфоновая, бензолсульфоновая, салициловая, сульфаниловая, аспарагиновая, глутаминовая, этилендиаминтетрауксусная, стеариновая, пальмитиновая, олеиновая, лауриновая, пантотеновая, дубильная, аскорбиновая и валериановая кислоты. Основные соли включают, но не ограничены этим, основания, образованные с фармацевтически приемлемыми катионами, такими как натрий, калий, литий, кальций, магний, аммоний и алкиламмоний. Основные азот-содержащие группы могут быть кватернизованы такими агентами как галогениды низших алкилов, таких как метил, этил, пропил и бутилхлориды, бромиды и йодиды; диалкилульфаты, например, диметил и диэтилсульфат; и другие.

Соединения по изобретению могут быть в виде кристаллов, либо свободных соединений или в виде сольватов (например, воды, т.е., гидратов, или обычных органических растворителей, таких как спирты), и обе формы включены в объем настоящего изобретения. Способы сольватации являются общеизвестными в данной области техники, например путем перекристаллизации из заданного растворителя.

Таким образом, субъекты, которых можно лечить согласно настоящему изобретению, включают млекопитающих: людей, приматов, домашний скот (включая коров, лошадей, овец, свиней и коз), домашних животных (включая собак, кошек, кроликов, морских свинок) и диких животных, живущих в неволе. Также рассматриваются лабораторные животные, такие как кролики, мыши, крысы, морские свинки и хомяки, поскольку они могут обеспечить удобную тест-систему. В некоторых вариантах осуществления изобретения также могут быть рассмотрены не относящиеся к млекопитающим виды, такие как птицы, амфибии и рыбы. В данном описании субъект также может относиться к индивидууму, пациенту, животному или реципиенту.

Субъектов для лечения по изобретению предпочтительно выбирают с учетом необходимости в указанном лечении или желании получить такое лечение субъектом.

Производные ингенола вводят субъекту в эффективном для лечения количестве. Подходящее эффективное количество для введения (дозирование) и режимы дозирования могут определяться лечащим врачом и могут зависеть от косметического вида, анатомического местоположения и площади кожи, предназначенной для лечения, а также возраста и общего здоровья субъекта.

В некоторых вариантах осуществления активный компонент, производное ингенола, предпочтительно вводят в виде фармацевтической композиции, содержащей производное ингенола с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми адъювантами. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению производного ингенола или его фармацевтически приемлемой соли, или пролекарства при изготовлении лекарственного средства для лечения стареющей или фотостареющей кожи.

Лекарственные средства или композиции, подходящие для применения в изобретении, могут содержать производное ингенола в количестве от примерно 0,0001% до 100% по массе. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит производное ингенола в количестве от примерно 0,0001% до примерно 10% по массе, например, примерно от 0,0005, 0,001, 0,0025, 0,005, 0,0075, 0,01, 0,0125, 0,015, 0,02, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,125, 0,15, 0,2 или 0,25% до примерно 0,5, 1,0, 2,5 или 5,0%. В одном из вариантов осуществления изобретения производное ингенола представляет собой ингенол-3-ангелат, который находится в количестве от примерно 0,001 до примерно 1%. В другом варианте осуществления производное ингенола, например ингенол-3-ангелат, присутствует в количестве от примерно 0,005 до примерно 0,2%. В другом варианте осуществления изобретения производное ингенола, такое как ингенол-3-ангелат, может присутствовать в количестве от 0,005 до 0,1%, например, примерно 0,01%.

Производные ингенола можно вводить любым подходящим способом, таким как локальное введение, например топическое нанесение на требующий лечение участок кожи и/или путем инъекции. В конкретных примерах изобретения производное ингенола вводят топическим нанесением на участок(участки) кожи.

Дозирование при нанесении зависит от нескольких факторов, которые могут быть легко определены специалистом в данной области техники, это может быть одна или несколько доз в сутки с курсом лечения, длящимся от нескольких дней до нескольких месяцев, или длящимся до тех пор, пока не будет получен желаемый результат. В некоторых вариантах осуществления производное ингенола вводят один или два раза в сутки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения производные ингенола вводят, т.e. наносят, топически на требующий лечения участок. Согласно настоящему изобретению можно лечить любой участок кожи на теле. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к лечению одного или нескольких из следующих частей тела: лицо, шея, горло, область, окружающая глаза (например, мешки под глазами, морщины и гусиные лапки ), верхняя часть груди, кисти рук, спина, плечи, кожа головы и руки, включая предплечья. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к лечению фотостареющей кожи. Лечение преимущественно применяется к участку естественностареющей и/или фотостареющей кожи размером, по меньшей мере, 10 см². В других вариантах осуществления кожа, которую лечат согласно настоящему изобретению, не является больной кожей, т.е., на момент лечения субъект не страдает кожными заболеваниями. В иллюстративных вариантах осуществления согласно изобретению можно лечить участки на лице и/или шее/горле. Производные ингенола можно наносить топически в любой подходящей форме, включая растворы, эмульсии (масло в воде, вода в масле, аэрозоли или пены), мази, пасты, лосьоны, порошки, краски, гели (такие как гель PEP005 (ингенола мебутат), Peplin Inc.), гидрогели, гидроколлоиды и кремы, которые могут содержать липосомы, мицеллы и/или микросферы. В качестве альтернативы, производные ингенола могут быть представлены в виде окклюзионной повязки с активным веществом, например, пропитанной производным ингенола или с нанесенным производным ингенола, такой как бандажи, марли, ленты, сетки, маски для лица, клейкий пластырь, пленки, мембраны или патчи.

Состав рассматриваемых композиций и повязок известен специалистам в данной области техники, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing, 1990. Композиции могут содержать любые подходящие носители, разбавители или наполнители. Они включают все обычные растворители, дисперсионные среды, наполнители, твердые носители, покрытия, противогрибковые и антибактериальные агенты, усилители вязкости, пленкообразователи, усилители проницаемости кожи, поверхностно-активные вещества, изотонические и абсорбирующие агенты и т.п. Носитель для композиций по настоящему изобретению должен быть фармацевтически приемлемым в смысле совместимости с другими компонентами композиции и не вредным для субъекта.

Как известно в области фармацевтических составов, мази представляют собой полутвердые препараты, которые обычно основаны на вазелине или других производных вазелина. Конкретная используемая основа мази, как хорошо известно специалистам в данной области, представляет собой основу, которая будет обеспечивать оптимальную доставку лекарственного вещества, а также предпочтительно будет обеспечивать другие желаемые характеристики, например, смягчение и т.п. В отношении других носителей или наполнителей, основа мази должна быть инертной, стабильной, не вызывающей раздражение и неаллергенной. Эмульгируемые мазевые основы, также известные как абсорбирующие мазевые основы, содержат немного воды или вообще не содержат воду и включают, например, гидроксистеарин сульфат, безводный ланолин и гидрофильный вазелин. Эмульсионными мазевыми основами являются либо эмульсии вода в масле (В/М), либо эмульсии масло в воде (М/В) и включают, например, цетиловый спирт, глицерил моностеарат, ланолин и стеариновую кислоту. Предпочтительные водорастворимые мазевые основы получают из полиэтиленгликолей путем изменения их молекулярной массы.

Крема, также известные в данной области техники, представляют собой вязкие жидкости или полутвердые эмульсии, либо масло в воде, либо вода в масле. Основы крема являются водосмываемыми и содержат масляную фазу, эмульгатор и водную фазу. Масляная фаза, также называемая "внутренней" фазой, как правило, состоит из вазелина и жирного спирта, такого как цетиловый или стеариловый спирт. Водная фаза, как правило, хотя и не обязательно, превышает масляную фазу в объеме и обычно содержит увлажнитель. Эмульгатор в составе крема обычно представляет собой неионное, анионное, катионное или амфотерное поверхностно-активное вещество.

Как очевидно специалистам, работающим в области фармацевтических составов, гели представляют собой полутвердые системы типа суспензии. Однофазные гели содержат желирующие агенты, распределенные по существу равномерно в жидком носителе, который обычно является водным, но также, предпочтительно, содержит спирт, такой как изопропиловый спирт, и, необязательно, масло.

Лосьоны для доставки косметических агентов представляют собой препараты, которые наносят на поверхность кожи без втирания, и, как правило, являются жидкими или полужидкими препаратами, в которых в водной или спиртовой основе присутствуют твердые частицы, включая активный агент. Обычно лосьоны представляют собой суспензии твердых частиц, и предпочтительно, для рассматриваемых задач, содержат жидкую масляную эмульсию типа масло в воде. Нерастворимый материал в лосьоне обычно является тонкоизмельченным. Лосьоны, как правило, содержат суспендирующие агенты для получения улучшенных дисперсий, а также соединения, применяемые для локализации и удержания активного агента в контакте с кожей.

Пасты представляют собой полутвердые дозированные формы, в которых активный агент суспендирован в подходящей основе. В зависимости от природы основы пасты подразделяются на жирные пасты и пасты, изготовленные из однофазного водного геля. Основой в жирной пасте обычно является вазелин или гидрофильный вазелин или т.п. Пасты, изготовленные из однофазного водного геля, как правило, в качестве основы включают карбоксиметилцеллюлозу или т.п.

В одном из вариантов осуществления изобретения производное ингенола может наноситься топически в виде геля на основе изопропилового спирта. Один из подходящих составов включает изопропиловый спирт, бензиловый спирт, полимер целлюлозы, такой как гидроксиэтилеллюлоза, и буфер (например, цитратный) с pH <3. В другом варианте осуществления изобретения производное ингенола может входить в состав для топического нанесения в виде крема на основе макроцетилового эфира, например содержащего цетомакрогол эмульгирующий воск, белый мягкий парафин и жидкий парафин.

Составы также могут быть изготовлены с использованием липосом, мицелл и микросфер. Липосомы представляют собой микроскопические везикулы, имеющие липидную оболочку, включающую двойной липидный слой, и в настоящей заявке также могут использоваться в качестве системы доставки лекарственного вещества. Как правило, составы с липосомами предпочтительны для труднорастворимых или нерастворимых фармацевтических агентов. Липосомальные препараты для применения по изобретению включают катионные (положительно заряженные), анионные (отрицательно заряженные) и нейтральные препараты.

Мицеллы, как известно в данной области техники, состоят из молекул поверхностно-активного вещества, расположенных таким образом, чтобы их полярные головные группы формировали внешнюю сферическую оболочку, в то время как гидрофобные углеводородные цепи были направлены к центру сферы, формируя ядро. Мицеллы формируются в водном растворе, содержащем поверхностно-активное вещество в достаточно высокой концентрации для формирования мицелл естественным образом. Составы с мицеллами могут использоваться в сочетании с настоящим изобретением или путем их введения в резервуар системы топической или трансдермальной доставки или в наносимый на поверхность тела состав.

Микросферы, аналогично, могут быть включены в составы и системы доставки лекарственного вещества по настоящему изобретению. Подобно липосомам и мицеллам, микросферы по существу инкапсулируют лекарственное вещество или состав, содержащий лекарственное вещество. Микросферы, как правило, хотя и не обязательно, составлены из биологически совместимых синтетических полимеров или полимеров естественного происхождения, но также могут состоять из заряженных липидов, таких как фосфолипиды. Препарат с микросферами известен в данной области и описан в соответствующих текстах и литературе.

Очевидно, что изобретение также может применяться в сочетании с использованием других форм антивозрастной терапии или методами лечения "фотостарения кожи", включая, но не ограничиваясь этим, лазерную шлифовку, химический пилинг, топические ретиноиды, механическую шлифовку (например, дермабразию) и фотодинамическую терапию (ФДТ), используемые для лечения естественно стареющей или фотостареющей кожи.

Дополнительные вещества, используемые в сочетании с изобретением, могут входить в состав композиции или наноситься на повязку вместе с производным или производными ингенола или могут вводиться отдельно или последовательно, или вместе.

Следует иметь в виду тот факт, что, хотя термины "естественное старение" и "фотостарение" используются для указания на косметические и/или физиологические эффекты, появляющиеся со временем, и влияния УФ излучения, соответственно, и что в некоторых вариантах осуществления субъект может быть в возрасте, по меньшей мере, 20, 30, 40, 50 или 60 лет, настоящее изобретение не должно ограничиваться возрастом пациента, и производное ингенола или композиция, содержащая указанное производное, может соответствующим образом применяться к младенцам, детям или подросткам.

Несмотря на то, что описанные здесь производные ингенола преимущественно рассматриваются для применения при лечении стареющей кожи человека, они также могут применяться в ветеринарных композициях, которые могут быть приготовлены с помощью любых подходящих средств, известных в данной области техники. Примеры таких композиций включают композиции, адаптированные для топического нанесения, например, описанные выше кремы, мази, гели, лосьоны и т.д.

Производные ингенола, например ингенол-3-ангелат или его фармацевтически приемлемая соль могут индуцировать синтез эндогенного гиалуронана в коже субъекта. Преимущественно, индуцируется синтез высокомолекулярного гиалуронана. Оценку индуцированного эндогенного гиалуронана преимущественно можно осуществлять с помощью теста или средства для оценки эффективности производных ингенола.

В обычном примере биопсию кожи (4-6 мм пункционная биопсия) фиксируют в 10% забуференном формалине и заливают парафином. С препаратов, полученных из парафиновых блоков, удаляют воск, затем их повторно гидратируют последовательно ксилолом и набором спиртов с повышающейся концентрацией. Эндогенную пероксидазу блокируют путем погружения препаратов в перекись водорода в метаноле на 30 мин. Для гистохимического детектирования НА используется биотинилированный гиалуронан-связывающий белок (bHABP), полученный из бычьего хряща (Seikagaku Ltd, Tokyo, Japan). Препараты инкубируют всю ночь при 4°C в присутствии bHABP в забуферинном фосфатом физрастворе (PBS) и бычьего сывороточного альбумина. После промывки PBS все образцы инкубируют с сывороткой козы, чтобы заблокировать неспецифические участки связывания. После промывки с помощью PBS препараты инкубируют при комнатной температуре с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (набор реагентов для окраски с пероксидазой Immunopure ABC, Pierce, Rockford, IL, USA). Реакцию визуализируют, используя 3,3'-диаминобинзидин (DAB, Sigma-Aldrich) и перекись водорода в PBS, при комнатной температуре. Препараты подвергают в течение 30 сек контрастному окрашиванию с помощью гематоксилина Майера, промывают, обезвоживают и готовят для исследования. Протоколы также описаны в уровне техники (см., например, Bertheim, U. and Hellström, S., 1994; Bertheim, U., et al., 2004; Asari, A., et al., 1992 and Zanna G., et al., 2008).

Внеклеточный матрикс (ECM) дермы может быть экстрагирован из биопсии кожи с помощью хаотропного буфера (такого как гуанидиния хлорид). Затем гиалуронан может быть очищен от ECM анионно-обменной хроматографией, и молекулярная масса может быть определена гель-фильтрационной хроматографией с использованием известных стандартов (см., например, Simpson et al., 2009).

Далее изобретение описано со ссылками на приведенные ниже примеры, которые включены с целью иллюстрации некоторых вариантов осуществления изобретения и которые не следует рассматривать в качестве ограничения приведенных выше утверждений общего характера.

ПРИМЕРЫ

Используемый здесь термин "PEP005" относится к ингенол-3-ангелату, причем эти термины являются взаимозаменяемыми.

1. Материалы и способы

1.1 Неклинические примеры

1.1.1 Клеточная культура дермальных фибробластов

Была получена биопсия нормальной взрослой кожи (6 мм) (n=1), с согласием на основе полной информации, от индивидуума, посетившего клинику хирургии полости рта школы лечения зубов уэльского медицинского колледжа в Кардиффе. После введения местного обезболивающего брали биопсию кожи и получали культуру дермальных фибробластов взрослого индивида способом одноклеточной суспензии после ферментативного расщепления образца. Этот способ ранее надежно использовался для получения жизнеспособных первичных культур как фибробластов слизистой оболочки полости рта, так и дермальных фибробластов in vitro (Cook et al., 2000; Stephens et al., 2001; 2003). Дермальные фибробласты культивировали в содержащей сыворотку для фибробластов среде, которая содержала модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), дополненную L-глутамином (2 мм), антибиотиками (1000 Ед./мл пенициллина G натрия, 100 мг/мл стрептомицин сульфата и 0,25 мкг/мл амфотерицина B) и 10% эмбриональной сывороткой теленка (приобретенные у компании Invitrogen Ltd., Paisley, U.K.). Культуры дермальных фибробластов поддерживали при 37°C в 5% СО₂/95% воздуха, культуральную среду меняли каждые 2-3 дня. Дермальные фибробласты использовали для всех экспериментов между 7-17 пассажами.

1.1.2. Препарат PEP005

PEP005, полученный от компании Peplin партиями по 20 мг, хранили при 4°C. По мере необходимости PEP005 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, >99,9%, Sigma Chemical Company, Dorset, U.K.) до концентрации 10 мг/мл. Раствор перемешивали в течение 5 минут или до тех пор, пока раствор не становился прозрачным, и маточный раствор PEP005/ДМСО хранили при 4°C, причем он сохранял стабильность в течение нескольких месяцев. Перед использованием маточный раствор PEP005/DMSO вынимали из места хранения при 4°C и нагревали до комнатной температуры. Необходимые объемы аликвот PEP005/ДМСО помещали в полипропиленовый сосуд, и PEP005/ДМСО разбавляли до необходимой концентрации (обычно до 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 100 мкг/мл) в содержащей сыворотку для фибробластов среде (для культур дермальных фибробластов, Секция 3.1) свежеприготовленными растворами PEP005/культуральная среда, которые готовили ежедневно в различных указанных выше концентрациях, для стабилизации раствора. Перед тем, как сливали раствор PEP005/культуральная среда, для дезактивации в каждый раствор добавляли, по меньшей мере, два объема 0,1% гидроксида натрия (Sigma Chemical Company) в смеси 95% этанол/5% метанол (оба от Thermo Fisher Scientific, Leicestershire, U.K.).

1.1.3 Оценка синтеза гиалуронана дермальными фибробластами

После трипсинизации дермальные фибробласты засевали в 24-х луночные планшеты для культуры тканей в содержащей сыворотку для фибробластов среде без PEP005 (1 мл) с плотностью клеток 2,5×10⁴ клеток/лунка. Дермальные фибробласты поддерживали при 37°C в атмосфере 5% СО2/95% воздух в течение 48 часов перед помещением их в содержащую сыворотку для фибробластов среду (1 мл) без сыворотки на следующие 48 часов. На этой стадии культуральную среду без сыворотки заменяли содержащей сыворотку для фибробластов средой (600 мкл), которая содержала 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005, +/-TGF- ₁ (10 нг/мл) (по три лунки с культурой на одну концентрацию PEP005). Также готовили контроль, состоящий из клеток в содержащей сыворотку для фибробластов среде без сыворотки, которая содержала 1% ДМСО. Дермальные фибробласты поддерживали при 37°C в атмосфере 5% СО₂/95% воздух в течение 24 ч или 72 ч до удаления культуральной среды. Синтез гиалуронана в собранных культуральных средах определяли количественно, используя тестовый набор для количественного определения гиалуроновой кислоты (Corgenix U.K. Ltd., Cambridgeshire, U.K.), в котором используется бычий белок, связывающийся с гиалуронаном, естественного происхождения. Супернатанты анализировали согласно инструкции изготовителя, и оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра при 450 нм. Концентрацию гиалуронана определяли путем сравнения показаний оптической плотности образца со стандартной кривой, полученной с помощью холостого контрольного реагента и стандартов. Каждый эксперимент имел три независимых повтора.

1.1.4 Оценка формирования дермальными фибробластами гиалуронановой перицеллюлярной оболочки

После трипсинизации дермальные фибробласты засевали в 53 мм чашках для бактериологических культур (VWR International Ltd., Leicestershire, U.K.) в содержащей сыворотку для фибробластов среде без PEP005 (2 мл) с плотностью 7×10⁴ клеток/чашка. Дермальные фибробласты культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% воздух в течение ночи до промывки PBS (2×2 мл) и культивирования в содержащей сыворотку для фибробластов среде без сыворотки (2 мл), содержащей 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005, +/-TGF- ₁ (10 нг/мл) (по три чашки с культурой на одну концентрацию PEP005). Также готовили контроль, состоящий из клеток в содержащей сыворотку для фибробластов среде без сыворотки, содержащей 1% ДМСО. Дермальные фибробласты поддерживали при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% воздух в течение 24 ч или 72 ч. Через 24 ч и 72 ч культуральные чашки обрабатывали формализованными эритроцитами крови лошади (TCS Biosciences Ltd., Buckinghamshire, U.K.). Формализованные эритроциты крови лошади промывали PBS, удаляли азид натрия (3×20 мл) и центрифугировали при 100 об/мин в течение 7 мин при 4°C. Полученный клеточный пеллет эритоцитов ресуспендировали в содержащей сыворотку для фибробластов среде без сыворотки с плотностью 1×10⁸ клеток/мл. Аликвоты клеточной суспензии эритоцитов (500 мкл) добавляли в каждую культуральную чашку, и чашки взбалтывали перед культивированием при 37°C в атмосфере 5% СО₂/95% воздух в течение 15 мин. Зоны, в которых отсутствовали эритроциты, визуализировали с помощью световой микроскопии, используя инверсионный микроскоп Zeiss Axiovery 135 (Carl Zeiss Ltd., Hertfordshire, U.K.) с охлажденной CCD камерой Hamamatsun C5985 (Hamamatsu Photonics U.K. Ltd., Hertfordshire, U.K.) и программным обеспечением Openlab 3.0.8 (Improvision Ltd., Warwickshire, U.K.). Каждый эксперимент имел три независимых повтора.

1.1.5 Оценка генной экспрессии гиалуронан-синтазы (HAS) дермальными фибробластами

После трипсинизации дермальные фибробласты засевали в 24 луночные планшеты для культуры тканей в содержащей сыворотку для фибробластов среде без PEP005 (1 мл) с плотностью клеток 2,5×10⁴ клеток/лунка. Дермальные фибробласты поддерживали при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% воздух в течение ночи. На этой стадии культуральную среду заменяли содержащей сыворотку для фибробластов средой (600 мкл), которая также содержала 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005, +/-TGF- ₁ (10 нг/мл) (по три лунки с культурой на одну концентрацию PEP005). Также готовили контроль, состоящий из клеток в содержащей сыворотку для фибробластов среде, которая также содержала 1% ДМСО. Дермальные фибробласты поддерживали при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% воздух в течение 24 ч или 72 ч до промывки PBS (3×1 мл) и добавления к клеткам реагента Тризол® (250 мкл) на 5 минут при комнатной температуре с целью индуцирования лизиса клеток. РНК экстрагировали описанным выше методом смесью фенол-хлороформ, генерируя при этом кДНК библиотеку посредством случайных RT гексамеров, как описано выше. РНК (1 мкг) добавляли к 100 М случайному гексамеру (1 мкл), в реакционную смесь также добавляли 5× RT буфер (4 мкл), 2,5 мМ дезоксинуклеотид трифосфаты (dNTP, 5 мкл), 2 мкл DTT и воду без нуклеаз (до полного объема 20 мкл). Для денатурации РНК реакционные пробирки помещали в систему ПЦР GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Cheshire, U.K.) и нагревали в течение 5 мин при 95°C перед охлаждением до 4°C. В каждую пробирку добавляли суперскрипт (Superscript) (1 мкл) и ингибитор рибонуклеазы RNAsin® (1 мкл, Promega, Hampshire, U.K.), и пробирки подвергали 30 циклам при 20°C в течение 10 минут, 42°C в течение 1 ч и 95°C в течение 5 минут, затем хранили при 4°C до момента использования. В качестве отрицательного контроля RT также выполняли с водой без нуклеаз, заменяющей образец РНК.

Количественную ПЦР выполняли, как описано выше, используя образцы и зонды для HAS1, HAS2 и HAS3 (целевые гены) и 18s рибосомную РНК (ген контроля), разработанную и поставляемую компанией Applied Biosystems. ПЦР выполняли с конечным объемом 20 мкл на образец для каждой реакционной смеси, состоящей из кДНК (1 мкл), праймеров целевого гена и зонда (1 мкл), Taqman® FAST мастер-микс для обычной ПЦР (10 мкл, Applied Biosystems), и воды без нуклеаз (8 мкл). ПЦР амплификацию выполняли с начальным циклом при 95°C в течение 1 сек с последующими 40 циклами при 60°C в течение 20 сек. Также использовали контроль без кДНК. Снова для относительного определения количественной генной экспрессии использовали сравнительный способ СТ. Каждый эксперимент имел три независимых повтора.

1.1.6 Оценка молекулярной массы de novo гиалуронана

Определение молекулярной массы гиалуронана после синтеза дермальными фибробластами выполняли согласно описанному ранее способу (Meran et al., 2008; Simpson et al., 2009). Дермальные фибробласты засевали в 6-ти луночные планшеты для тканевых культур в содержащей сыворотку для фибробластов среде без PEP005 (2 мл) с плотностью 1,5×10 ⁵ клеток/лунка. Дермальные фибробласты поддерживали при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% воздух в течение 48 ч до промывки физраствором, забуференным фосфатом (PBS, 2×2 мл), и помещали в содержащую сыворотку для фибробластов среду без сыворотки (2 мл) на следующие 48 ч. Через 48 ч в содержащую сыворотку для фибробластов среду без сыворотки добавляли содержащую сыворотку для фибробластов среду без сыворотки (2 мл), которая содержала 0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл PEP005, +/-TGF- ₁ (10 нг/мл) (по три лунки с культурой на одну концентрацию PEP005) дополнительно к [³H]-глюкозамину (20 мкКюри/мл, G.E. Healthcare). Дермальные фибробласты поддерживали при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% воздух в течение 24 ч или 72 ч.

Через 24 ч и 72 ч культуральную среду удаляли, и каждую лунку промывали PBS (1×2 мл). Культуральную среду и PBS после промывок объединяли (экстракты кондиционированных сред, 8 мл) и хранили при -20°C до использования. По мере необходимости экстракты кондиционированных сред оттаивали при 4°C перед добавлением равного объема проназы, солюбилизированной в 100 мМ трис-HCl буфера, pH 8,0, содержащего 0,05% азида натрия (все, приобретенные у компании Sigma). Экстракты кондиционированных сред, содержащие проназу, инкубировали при 37°C в течение 24 ч перед проведением ионно-обменной хроматографии на колонках DEAE Sephacel® (G.E. Healthcare), уравновешенных 8 M мочевиной, в 20 мМ Бис-Трис буфере, pH 6,0, содержащем 0,2% Тритон Х-100 (все от компании Sigma), для удаления низкомолекулярных пептидов и невключенных радиометок. Радиомеченный гиалуронан в каждом экстракте элюировали через ионно-обменные колонки DEAE Sephacel®, используя 8 M мочевину в 20 мМ Бис-Трис буфере, pH 6,0, содержащем 0,2% Тритон X-100 и 0,3 M хлорида натрия (Sigma). Каждый выделенный экстракт делили на два одинаковых количества, и радиомеченный гиалуронан преципитировали тремя объемами ацетата калия (1% в 95% этаноле, оба от компании Sigma) в присутствии хондроитин 4-сульфата, гепарина и галуронана без радиоактивной метки (все от компании Sigma), в качестве соосадителей, при 4°C в течение 18 ч.

При преципитации первую половину каждого экстракта ресуспендировали в 4 M буфере гуанидиния хлорида, pH 6,0, содержащем 50 мМ ацетата натрия, 0,5% Тритон X-100 и 0,05% азида натрия (все от компании Sigma), перед оценкой молекулярной массы гиалуронана с помощью указанной выше калибровочной колонки Sephacryl® S-500 (G.E. Healthcare). Колонку калибровали, используя [3H]-глюкозамина гидрохлорид, мол. м. 215; гликозаминогликаны в виде [35S]-хондроитин сульфата, мол. м. 25000; декорин, мол. м. 100000, и [35S] версикан, мол. м. 1300000. Элюирование выполняли, используя 4 M буфер гуанидиния хлорида, pH 6,0, содержащий 50 мМ ацетата натрия, 0,5% Тритон X-100 и 0,05% азида натрия. Для подтверждения того, что полученные хроматографические профили отражают только наличие радиомеченного гиалуронана, вторую половину каждого экстракта расщепляли гиалуронидазой (200 мкл, Streptomyces hyalurolyticus, ICN Pharmaceuticals) в 20 мМ буфере ацетата натрия, pH 6,0, содержащем 0,15 M хлорида натрия и 0,05% азида натрия, при 37°C в течение 18 ч. Расщепленные образцы смешивали с равным объемом (200 мкл) 4 M буфера гуанидиния хлорида, pH 6,0, содержащем 50 мМ ацетат натрия, 0,5% Тритон X-100 и 0,05%, азид натрия, с последующей элюцией на колонке Sephacel® S-500.

Аликвоты (20 мкл × 3) каждой фракции экстракта переносили в сцинтилляционные пробирки, затем добавляли 70% этанол (600 мкл) и сцинтилляционную жидкость (4 мл). Сцинтилляционные пробирки встряхивали на вортексе и определяли количество включенного [3H], используя жидкостной сцинтилляционный анализатор Packard Tri-Carb 1900CA (Perkin Elmer), используя значения, полученные во время экспрессии в виде распада в мин (dpm). Для получения каждого хроматографического профиля [³H]-активность обеих половин каждого экстракта нормализовали и корректировали для разбавления перед вычитанием гиалуронидазо-резистентных показателей. По существу, хроматографические профили представляли только гиалуронидазо-чувствительную активность в каждом PEP005-обработанном (0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл), +/-TGF- ₁ (10 нг/мл), с данными, представленными в виде [³H]-активности на фракцию в зависимости от номера фракции. Каждый эксперимент выполняли два раза.

1.2 Клинические примеры

1.2.1 Изучение случая косметической эффективности геля PEP005 на коже человека

В 1 день (исходное состояние) и после согласия на основе полной информации был сделан краткий анамнез и выполнен физический осмотр для подтверждения пригодности субъекта для данного исследования. Анамнез был зарегистрирован и проведен краткий медицинский осмотр. На одной стороне лица отметили участок кожи площадью 50 см ² и определили как участок лечения. Были сделаны фотографии исходного состояния с помощью TruVu® и проведены измерения исходного состояния. Затем на предназначенный для лечения участок на лице размером 50 см² наносили гель PEP005 (ингенол мебутат), 0,005% (Peplin Inc).

На следующий день (день 2) субъект вновь посетил клинику. Были сделаны фотографии (включая TruVu®) и проведены измерения в области нанесения геля. Данные о реакции кожи собирали на основе сообщений субъекта и наблюдений исследователей. Гель PEP005, 0,005%, был повторно нанесен на предназначенный для лечения участок.

Субъект посещал клинику на 8, 15 и 30 дни для получения фотографий (включая TruVu®), проведения измерений и оценки кожной реакции. Общую оценку врача проводили при посещении клиники на 15 и 30 дни. Для общей оценки врача использовали 7-ми бальную шкалу от -3 до +3; где -3 означало заметно хуже , -2 - умеренно хуже , -1 - немного хуже , 0 - никаких изменений , +1 - немного лучше , +2 - умеренно лучше и +3 - заметно лучше . Наблюдение субъекта было прекращено на 30 день посещения.

1.2.2 Фотографии TruVu®

С помощью системы получения фотографий TruVu® (Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc.) были получены изображения кожи в нескольких различных световых режимах. Для этого исследования были использованы следующие различные световые режимы: видимый свет, параллельно-поляризованный свет, кросс-поляризованный свет и УФ свет. Было показано, что с помощью этих четырех различных световых режимов можно получить естественный вид кожи, тонкие линии и морщины, красноту и УФ старение. Результаты представляют собой случайные блоки, сгенерированные с помощью компьютера, ранжированные на классы 'нет/низкий' - 'средний' - 'улучшенный/высокий', и наконец представленные в виде гистограмм для тонких линий, морщин, красноты и УФ старения. Эти данные переводили вручную, с участием врача, в целые числа от '0' (нет/низкий) до '5' (умеренный) и до '10' (улучшенный/высокий).

2. Результаты

2.1 Оценка синтеза гиалуронана дермальными фибробластами

Средние значения, полученные для количественного определения синтеза гиалуронана дермальными фибробластами в присутствии PEP005 (0,01-100 нг/мл) и в отсутствие и присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл) в течение 24 ч и 72 ч с помощью набора для количественного определения гиалуроновой кислоты, показаны на Фиг.1A и 1B, соответственно.

Средние уровни гиалуронана (нг/мл), синтезированного дермальными фибробластами в течение 24 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл), показали, что PEP005 имеет значимый стимулирующий эффект на синтез гиалуронана при концентрациях 0,01-10 мкг/мл по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов (Фиг.1A). Введение TGF- ₁ (10 нг/мл) при отсутствии PEP005 слабо стимулировало синтез гиалуронана в течение 24 ч, в то время как присутствие как PEP005, так и TGF- ₁ (10 нг/мл), по-видимому, оказывает значимый синергетический эффект на синтез гиалуронана, отмеченный повышением синтеза гиалуронана по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов и дермальными фибробластами в присутствии PEP005 (0,01-100 мкг/мил), но без TGF- ₁ (10 нг/мл, Фиг.1A).

Также как через 24 ч, средние уровни гиалуронана (нг/мл), синтезированного дермальными фибробластами через 72 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл), показали, что PEP005 продолжает демонстрировать значимый стимулирующий эффект на синтез гиалуронана при концентрациях 0,01-10 мкг/мл по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов (Фиг.1B).

Также было продемонстрировано, что влияние PEP005 на синтез гиалуронана при всех концентрациях (0,01-100 мкг/мл) происходит исключительно благодаря только PEP005, а не ДМСО, используемому для солюбилизации PEP005, поскольку культуры дермальных фибробластов в присутствии 1% ДМСО не показали существенных отличий в синтезе гиалуронана по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов (p>0,05, данные не показаны).

2.2 Оценка формирования гиалуронановой перицеллюлярной оболочки дермальными фибробластами

Характерные цифровые изображения, полученные для формирования гиалуронановой перицеллюлярной оболочки дермальными фибробластами в присутствии PEP005 (0,01-100 мкг/мл), но без TGF- ₁ в течение 24 ч и 72 ч, определенные с помощью метода исключения частиц, показаны на Фиг.2 и 3, соответственно. Характерные цифровые изображения, полученные для формирования гиалуронановой перицеллюлярной оболочки дермальными фибробластами в присутствии PEP005 (0,01-100 мкг/мл) и TGF- ₁ (10 нг/мл) в течение 24 ч и 72 ч, показаны на Фиг.4 и 5, соответственно.

В целом, анализ формирования гиалуронановой перицеллюлярной оболочки за 24 ч без TGF- ₁ (10 нг/мл) показал слабое формирование гиалуронановой перицеллюлярной оболочки за 24 ч как в контроле без PEP005, так и в культурах, обработанных PEP005 (отмечено стрелками, Фиг.2). Оказалось, что через 72 ч PEP005, напротив, способствует увеличению размера перицеллюлярной оболочки в образцах, обработанных PEP005 в концентрациях 0,01-10 мкг/мл, по сравнению с контролями без PEP005 (отмечено стрелками, Фиг.3). Кроме того, морфологические изменения в PEP005-обработанных (0,01-10 мкг/мл) фибробластах были совместимы с наличием миофибробластов благодаря дифференцировке фибробластов.

Введение TGF- ₁ (10 нг/мл) в отсутствие PEP005 индуцировало слабое усиление формирования гиалуронановой перицеллюлярной оболочки через 24 ч, в то время как наличие как PEP005, так и TGF- ₁ (10 нг/мл), по-видимому, имеет сильный синергетический эффект на формирование гиалуронановой перицеллюлярной оболочки, наблюдаемый в виде резкого увеличения формирования перицеллюлярной оболочки (за счет накопления гиалуронана) за 24 ч по сравнению контролями необработанных дермальных фибробластов и дермальными фибробластами в присутствии PEP005 (0,01-10 мкг/мл), но без TGF- ₁ (10 нг/мл, отмечено стрелками, Фиг.4).

Усиленное формирование гиалуронановой перицеллюлярной оболочки через 24 ч как в присутствии PEP005, так и в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл), показало еще большее усиление через 72 ч при концентрациях PEP005 0,01-10 мкг/мл по сравнению с контролями без PEP005 (отмечено стрелками, Фиг.5). Основные изменения, наблюдаемые в клеточной морфологии, были совместимы с наличием миофибробластов.

Также было показано, что влияние PEP005 на формирование гиалуронановой перицеллюлярной оболочки при всех концентрациях (0,01-100 мкг/мл) происходит исключительно только благодаря PEP005, а не ДМСО, используемого для солюбилизации PEP005, поскольку культуры дермальных фибробластов в присутствии 1% ДМСО не показали явных отличий в формировании гиалуронановой перицеллюлярной оболочки по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов (данные не показаны).

2.3 Оценка генной экспрессии гиалуронан-синтазы (HAS) дермальными фибробластами

Средние значения, полученные для экспрессии HAS1, HAS2 и HAS3 дермальными фибробластами в присутствии PEP005 (0,01-100 мкг/мл) в отсутствие и присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл) за 24 ч и 72 ч, определенные количественной ПЦР, показаны на Фиг.6, 7 и 8, соответственно.

Средние значения СТ, полученные для HAS1, показали, что экспрессия HAS1 дермальными фибробластами за 24 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) была чрезвычайно низкой ( СТ<0,5, Фиг.6). Следовательно, поскольку экспрессия HAS1 по существу отсутствовала, PEP005 не обладает явным влиянием на экспрессию HAS1 в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл). Напротив, введение TGF- ₁ (10 нг/мл) в отсутствие PEP005 индуцировало основное усиление экспрессии HAS1 по сравнению с контрольными дермальными фибробластами (p<0,001, Фиг.6). Как в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл), так и в присутствии PEP005 (0,01-100 мкг/мл) наблюдалось общее снижение экспрессии HAS1 (p<0,05 при 0,01 мкг/мл, p<0,01 при 100 (мкг/мл).

Средние значения СТ, полученные для HAS1, показали, что экспрессия HAS1 дермальными фибробластами за 72 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) снова была относительно низкой ( СТ<1,0, Фиг.6), таким образом PEP005 не имеет явного эффекта на экспрессию HAS2 в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл). Напротив, введение TGF- ₁ (10 нг/мл) в отсутствие PEP005 снова привело к усилению экспрессии HAS1 по сравнению с контрольными дермальными фибробластами (Фиг.6). В присутствии как TGF- ₁ (10 нг/мл), так и PEP005 (0,01-100 нг/мл), PEP005 приводит к общему подавлению экспрессии HAS1 при всех концентрациях PEP005 (0,01-100 мкг/мл, Фиг.6). Однако подавление генной экспрессии HAS1, наблюдаемое в присутствии PEP005 и TGF- ₁ (10 нг/мл) за 72 ч было признано незначимым (p>0,05).

Средние значения СТ, полученные для HAS2, продемонстрировали, что экспрессия HAS2 дермальными фибробластами за 24 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) также была относительно низкой ( СТ<1,0, Фиг.7). Также было показано, что PEP005 имеет стимулирующее влияние на экспрессию HAS2 в дермальных фибробластах при концентрациях 0,1-10 мкг/мл в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов, хотя усиление генной экспрессии HAS2, наблюдаемое с PEP005 через 24 ч было признано незначимым (p>0,05). Введение TGF- ₁ (10 нг/мл) в отсутствие PEP005 имело слабое влияние на экспрессию HAS2 в дермальных фибробластах за 24 ч, как было установлено ранее (Meran et al., 2006, 2007). PEP005 также индуцировал усиление экспрессии HAS2 дермальными фибробластами при концентрациях 0,1-10 мкг/мл в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл) по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов. Однако усиление генной экспрессии HAS2 также было признано незначимым (p>0,05).

Средние значения СТ, полученные для HAS2, показали, что экспрессия HAS2 дермальными фибробластами за 72 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) снова была относительно низкой ( СТ<1,0, Фиг.8). Однако было показано, что PEP005 стимулирует основное усиление генной экспрессии HAS2 при концентрациях 0,1-10 мкг/мл (Фиг.8). Однако усиление генной экспрессии HAS2, наблюдаемое при концентрациях 0,1-10 мкг/мл, было признано незначимым (p>0,05). Введение TGF- ₁ (10 нг/мл) в отсутствие PEP005 неожиданно индуцировало минимальный эффект на экспрессию HAS2 по сравнению с контрольными дермальными фибробластами (p>0,05, Фиг.8). Однако как в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл), так и в присутствии PEP005 (0,01-100 нг/мл), PEP005 индуцировал общее подавление генной экспрессии HAS2 при всех концентрациях PEP005 (0,01-100 мкг/мл, Фиг.8). Однако подавление генной экспрессии HAS2, наблюдаемое с PEP005 и TGF- ₁ (10 нг/мл) через 72 ч, было признано незначимым (p>0,05) по сравнению с контролями дермальных фибробластов без PEP005.

Средние значения СТ, полученные для HAS3, показали, что экспрессия HAS3 дермальными фибробластами за 24 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) также была относительно низкой ( СТ<1,0, Фиг.8). Также было показано, что PEP005 полностью подавил экспрессию HAS3 дермальными фибробластами при всех концентрациях PEP005 (0,01-100 мкг/мл) по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов (Фиг.8), хотя из-за, как правило, относительно низких уровней экспрессии HAS3, наблюдаемое подавление генной экспрессии HAS3 было признано незначимым (p>0,05). Введение TGF- ₁ (10 нг/мл) в отсутствие PEP005 также имело ингибирующий эффект на экспрессию HAS3 дермальными фибробластами за 24 ч по сравнению с дермальными фибробластами как в отсутствие PEP005 (0,01-100 нг/мл), так и в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) (p<0,01, Фиг.8). PEP005 также индуцировал подавление экспрессии HAS3 дермальными фибробластами до едва наблюдаемых уровней при концентрациях 0,1-10 мкг/мл в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл) по сравнению с контролями необработанных дермальных фибробластов. Однако подавление генной экспрессии HAS3 снова было признано назначимым при всех концентрациях PEP005 (0,01-100 мкг/мл, p>0,05).

Средние значения СТ, полученные для HAS3, показали, что экспрессия HAS3 дермальными фибробластами за 72 ч в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) снова была относительно низкой ( СТ<1,0, Фиг.8). Однако было продемонстрировано, что PEP005 стимулирует усиление генной экспрессии HAS3 в отсутствие TGF- ₁ (10 нг/мл) при концентрациях 1-10 мкг/мл (Фиг.8) до уровней, превышающих генную экспрессию HAS3, наблюдаемую через 24 ч (Фиг.8). Однако усиление генной экспрессии HAS3 при этих концентрациях PEP005 было признано незначимым (p>0,05). Введение TGF- ₁ (10 нг/мл) в отсутствие PEP005 снова имело ингибирующее влияние на экспрессию HAS3 дермальными фибробластами за 72 ч по сравнению с контрольными дермальными фибробластами. Учитывая фактически незначимые уровни экспрессии HAS3 через 72 ч в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл), было продемонстрировано, что PEP005 не оказывает значимого влияния на экспрессию HAS3 дермальными фибробластами (p>0,05) в присутствии TGF- ₁ (10 нг/мл) за 72 ч при всех изученных концентрациях PEP005 (0,01-100 мкг/мл, Фиг.8).

2.5 Оценка влияние 0,005% геля PEP005 на тонкие линии, морщины, красноту и УФ старение кожи человека с помощью TruVu®

После двух ежедневных нанесений на 1 и 2 дни геля PEP005, 0,005%, на 50 см² участок на коже лица, на 30 день оценивали уровень тонких линий, морщин, красноты и УФ старения по сравнению с уровнями, оцененными до (исходное состояние) нанесения у одного субъекта. Было показано, что у данного субъекта уровень тонких линий уменьшился с 10 до 4, морщин уменьшился с 8 до 5, на красноту не было оказано никакого влияния, а УФ старение снизилось с 2 до 1. Согласно общей оценке врача у указанного субъекта показатель был равен +2 или умеренно лучше , указывая на то, что в общем два нанесения геля PEP005, 0,005%, дало общую косметическую оценку данного субъекта, как 'умеренно лучше' (в области обработанной кожи) на 30 день по сравнению с исходным состоянием (таблица 2.5-1).

Таблица 2.5-1
	Исходное состояние	На 30 день
Состояние кожи	показатель
Тонкие линии	10	4
Морщины	8	5
Краснота	2	2
УФ старение	2	1
Общая оценка врача	NA	+2

2.6 Оценка молекулярной массы de novo гиалуронана

Средние значения для введения [3H]-глюкозамина в присутствии 0, 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мкг/мл PEP005 в присутствии или отсутствие TGF- ₁ представлены на Фиг.9-12.

Гиалуронан, синтезированный в присутствии PEP005, имел преимущественно высокую (>1,5×10⁶ Да) и среднюю (<1,5×10 ⁶-4×10⁵ Да) молекулярную массу согласно данным, полученным на 3 день, демонстрирующим дальнейший синтез гиалуронана. Наличие гиалуронана, имеющего среднюю и низкую молекулярную массу, обусловлено деградацией гиалуронана. Общий уровень деградации гиалуронана снижается при инкубировании фибробластов в присутствии TGF- ₁.

ССЫЛКИ