средство и способы культивирования, хранения и криоконсервации стволовых и дифференцированных клеток человека и животных

Формула изобретения

1. Средство для сохранения культуры стволовых и дифференцированных клеток человека и животных при культивировании, хранении и криоконсервации, характеризующееся тем, что оно представляет собой гель, содержащий эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС) при стабилизации их в эмульгированном состоянии водным раствором неионогенных поверхностно-активных соединений (ПАВ) на основе блок-сополимера полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ППО) при соотношении ПЭО/ППО от 9:1 до 7:3, с концентрацией ПАВ от 20 до 90% и средней молекулярной массе ПАВ от 5000 Да до 21000 Да, при этом содержание ПФОС в эмульсии составляет от 5 до 70 об.%, размер частиц эмульсии ПФОС находится в интервале от 15 нм до 2000 нм, при этом водная фаза геля содержит осмолиты органической и/или неорганической природы для поддержания в ней осмотического давления в диапазоне от 250 до 350 мОсм.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что ПФОС представляет собой моносоединение или смесь двух и более ПФОС.

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что водная фаза геля дополнительно содержит культуральную среду.

4. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве эмульсии ПФОС использована эмульсия смесей перфтордекалина (ПФД) с перфторметилциклогексилпиперидином (ПМЦП).

5. Средство по п.4, отличающееся тем, что эмульсия смесей дополнительно содержит перфтортрибутиламин (ПФТБА).

6. Средство по п.1, отличающееся тем, что водный ПАВ на основе блок-сополимера ПЭО и ППО дополнительно содержит полиэтиленоксидное производное токоферола.

7. Способ получения средства по п.1, характеризующийся тем, что осуществляют экструзию под давлением 400-700 атм грубой смеси водного раствора неионогенных поверхностно-активных соединений (ПАВ) на основе блок-сополимера ПЭО и ППО, и жидких ПФОС или смеси ПФОС до получения эмульсии, которую затем смешивают в горячем виде с концентрированным водным раствором неорганических солей или добавляют в него осмолиты до достижения полученной смесью осмотического давления в диапазоне от 250 до 350 мОсм, после чего полученный состав охлаждают.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что после охлаждения дополнительно производят частичную лиофильную сушку или центрифугирование геля при соблюдении температурного градиента и осаждающем ускорении от 15000g до 35000g, после чего надосадочную жидкость удаляют.

9. Способ по любому из пп.7 и 8, отличающийся тем, что полученное средство перед использованием смешивают с культуральной средой.

10. Способ сохранения культуры стволовых и дифференцированных клеток человека и животных при хранении, характеризующийся тем, что к культуральной среде добавляют средство по п.1 с содержанием ПФОС от 15 до 59 об.% при контролируемой величине рН 7,0-7,4, температуре 37°С в атмосфере инкубатора CO₂ или при низком рН<6,0, температуре 20°C, в воздушной атмосфере.

11. Способ по п.11, отличающийся тем, что используют комбинации средства по п.1 с различным содержанием ПФОС.

12. Способ сохранения культуры стволовых и дифференцированных клеток человека и животных при криоконсервации, характеризующийся тем, что производят отмывание клеток от старой культуральной среды, ресуспендирование клеток в свежей культуральной среде, ресуспендированные клетки помещают в среду, содержащую средство по п.1 с содержанием ПФОС 59-70 об.%, после чего производят охлаждение в два этапа: сначала со скоростью 1 градус в мин до -80°C, а затем с максимально возможной скоростью до температуры -196°C.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что используют комбинации средства по п.1 с различным содержанием ПФОС.

14. Способ сохранения культуры стволовых и дифференцированных клеток человека и животных при культивировании, характеризующийся тем, что в качестве компонента среды используют средство по п.1 с содержанием ПФОС от 15 до 70 об.%.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что при культивировании суспензионных и распластывающихся на подложке клеток дополнительно к стандартным культуральным средам добавляют гели по п.1 с содержанием ПФОС не менее 61 об.%.

16. Способ по любому из пп.14 и 15, отличающийся тем, что используют комбинации средства по п.1 с различным содержанием ПФОС.

Описание изобретения к патенту

Группа изобретений относится к области биотехнологии, медицины, фармакологии, клеточной биологии, инженерии и другим отраслям биологии и медицины, в которых используются изолированные из тканей клетки человека и животных, в том числе стволовые и прогениторные клетки разного уровня дифференцировки, зрелые дифференцированные клетки различных тканей, в частности для создания банка клеток путем криоконсервации и для транспланталогии.

Предлагаемое средство и способ предназначены для культивирования и хранения, в том числе путем криоконсервации, суспензионных и прикрепляемых на подложку изолированных клеток человека и животных. Изолированные клетки при культивировании и хранении неизбежно контактируют со стеклом или пластиком, с различными видами водно-солевых и белковых растворов, содержащих химически активные природные и чужеродные элементы и соединения, в результате чего изменяются и повреждаются структура и функциональные свойства биологического материала.

Известно [1], что при сохранении клеток, особенно в условиях криоконсервации, в водную фазу среды, как правило, вносят дополнительно криоконсервирующий агент (криопротектор), который должен предохранять клетки в условиях замораживания от повреждающего действия кристаллов воды и неизбежного повышения осмотического давления вследствие концентрирования солей и биологических соединений при вымораживании воды как во внеклеточной, так во внутриклеточной водной фазе, в результате чего повреждается целостность мембран и структура биополимеров. В качестве криопротекторов для криоконсервации животных клеток, включая стволовые, прогениторные и тканевые дифференцированные, используют, как правило, либо диметилсульфоксид (ДМСО [2] в концентрации от 5% до 15% с последующим отмыванием клеточной массы для уменьшения повреждающего и токсического эффекта ДМСО, либо глицерина [3], либо ДМСО в сочетании с криоконсервирущими белками ([4] см. также Lonza BioWhittaker Cryoprotective Medium:среда для криоконсервации, содержащая 15% ДМСО).

Однако, ДМСО повреждает внешнюю мембрану и мембраны внутриклеточных органелл, происходит нарушение практически всех функций клетки от рецепторных (нарушение контакта с окружающей средой) до дезорганизации внутриклеточной системы сигнализации, дифференцировки и координации обменных процессов, завершающихся развитием апоптоза и некроза. В результате после криоконсервации клеток в присутствии ДМСО наблюдается не менее 25% мертвых клеток и не менее 30% клеток, находящихся на разных стадиях апоптоза. Поэтому любое последующее использование криоконсервированных клеток требует их полного отмывания от ДМСО с неоднократными пересевами [5]. При этом рекультивация клеток для восстановления поверхностных антигенных детерминант требует не менее 2-х месяцев [6].

Для криоконсервации дифференцированных клеток в качестве криопротекторов широко используют также глицерин [7] низкомолекулярный поливинилпирролидон [8],, низкомолекулярный оксиэтилкрахмал [9] и специальные липидные экстракты из морских животных [10].

Значительные усилия потрачены на уменьшение поражающего действия криопротекторов гликопротеидной природы путем использования природных и искусственных сред и добавок метаболитов таких, как цитохром С, холинхлорид или сложных рецептур, содержащих и другие биологически активные субстанции [11]. Эти попытки остались на лабораторном уровне и пока не нашли практического применения [10].

Известен [12] не вошедший пока в практику биомедицины способ предотвращения повреждения клеток при их высокоскоростном замораживании путем использования витрификации, в результате которой происходит резкое уменьшение кристаллообразования и осмотического удара.

Известно [13] использование для культивирования суспензионных и прикрепляемых к подложке клеток химически и метаболически инертных жидких перфторорганических соединений (ПФОС). При этом весьма удобным оказался съем клеток с подложки путем охлаждения, при котором клеточный слой собирается в виде шара с поверхности ПФОС.ПФОС представляют собой несмешивающиеся с водной фазой тяжелые жидкости, плотностью около 2 единиц. При этом считалось, что основным фактором, действующим на сохранность клеток в культуре, является способность ПФОС улучшать кислородный режим клеток за счет того, что кислородная емкость ПФОС на порядок и более превышает кислородную емкость водных сред. Благодаря этому, подложка может выполнять роль дополнительного газового депо. Эта идея продуктивна, так как без увеличения парциального давления кислорода, благодаря только лишь наличию слоя высоко газоемкого ПФОС со стороны подложки, удается обеспечить дополнительный газообмен не только через верхнюю границу раздела фаз газ/вода, но и через нижнюю границу раздела фаз ПФОС/вода. Это важно как для суспензионных культур, так и для распластывающегося клеточного моно- или полислоя, располагающегося на более тяжелом слое ПФОС.

Однако, использование жидких ПФОС в качестве подложки клеток имеет следующий недостаток: задержка (залипание), то есть не полное освобождение липидных мембран клеток от ПФОС, и влияние оставшегося ПФОС, залипшего на липидах мембран, на последующие выживание и функции клеток, что приводит к трудностям с пересевом клеток, особенно при необходимости их адгезии и распластывании на иной - неперфторуглеродной подложке.

Было разработано [14] несколько способов, позволяющих использовать преимущества ПФОС как газопереносящих сред, но предотвращающих непосредственный контакт клеток с поверхностью ПФОС. Так, в 2010 г.James W. Edinger Mohammad Heidaran Wolfgang Hofgartner предложили метод [15], при котором на стадии получения мезенхимальных стволовых клеток из плаценты млекопитающих орган подвергался перфузии на холоду (для уменьшения активности протеаз) в присутствии ряда жидких ПФОС, в частности perfluorooctyl bromide (перфтороктилбромид) и perfluorodecyi bromide (перфтордецилбромид) и их эмульсий, где в качестве эмульгатора был использован лецитин. Впоследствии в процессе выделения клеток также происходил контакт стволовых клеток непосредственно с ПФОС (используемых в качестве переносчиков кислорода). При этом в используемую смесь добавлялись ингибиторы апоптоза и некроза, которые авторы работы ожидали как следствие непосредственного контакта клеток с ПФОС. По окончании процедуры выделения клеток ПФОС удаляли. Через 10-15 дней культивирования выделенных таким образом мезенхимальных стволовых клеток часть клеток не адгезировалась ко дну пластикового культурального матраса, поскольку не удавалось полностью удалить perfluorooctyl bromide и per-fluorodecyi bromide с наружной мембраны [16], в результате чего нарушались адгезивные свойства клеток. Эту часть клеток приходилось удалять. Несмотря на использование столь сложной процедуры, при последующем первичном (без пассажирования) культивировании наблюдалась значительная клеточная гибель, а при дальнейшем культивировании происходило спонтанное образование фибробластоидных образований в культуре, которые потом также приходилось удалять.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что использование собственно жидких ПФОС (в неэмульигрованном состоянии) или водных эмульсий ПФОС в качестве компонентов среды или подложки не решает проблему культивирования и сохранения клеток.

В настоящее время во многих лабораториях человеческие эмбриональные стволовые клетки выращиваются на специальных подложках из Matrigel (Matrigel©), представляющего собой желатинированную смесь из белков, секретированных клетками Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) саркомы мыши. Эта смесь содержит комплекс белков межклеточного матрикса и используется как субстрат и каркас для культивирования. Используют охлажденные до 4°C культуральные емкости с небольшим объемом Matrigel. При инкубации при 37°C белки из Matrigel образуют тонкую пленку, которая покрывает используемую поверхность лабораторного пластика и, в некотором смысле, частично воспроизводит подобие межклеточного матрикса [17].

Задача, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в использовании позитивного влияния ПФОС на изолированные клетки и в устранении действия факторов, повреждающих структуру и функциональные свойства животных клеток разного уровня дифференцировки (стволовых клеток, фетальных, прогениторных, эпителиальных, миобластов, мезенхимальных, тканевых) в процессе их культивирования, хранения и криоконсервации.

Единый технический результат, который может быть получен в результате осуществления группы изобретений, состоит в устранении непосредственного контакта мембран клеток с поверхностью ПФОС.

Указанный технический результат по объекту «Средство» достигается за счет того, что средство для культивирования, хранения и криоконсервации стволовых и дифференцированных клеток человека и животных представляет собой гель, содержащий эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС) при стабилизации их в эмульгированном состоянии водным раствором неионогенных поверхностно-активных соединений (ПАВ) на основе блок-сополимера полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ППО) при соотношении ПЭО/ППО от 9:1 до 7:3, с концентрацией ПАВ от 20 до 90% и средней молекулярной массе ПАВ от 5000 Да до 21000 Да, при этом содержание ПФОС в эмульсии составляет от 5 до 70 об.%, размер частиц эмульсии ПФОС находится в интервале от 15 нм до 2000 нм, а осмотическое давление водной фазы находится в диапазоне 250-350 мОсм.

Указанный технический результат для объекта «Способы (культивирования, хранения и криоконсервации)» достигается за счет того, что:

- при хранении стволовых и дифференцированных клеток человека и животных, к культуральной среде добавляют заявленное средство с содержанием ПФОС от 15 до 59 об% при контролируемой величине рН=7,0-7,4, температуре 37°C в атмосфере инкубатора CO ₂. (стандартные условия) или при низком рН 6.0, температуре 20°С, в воздушной атмосфере (нестандартные условия, при которых обычно клетки не культивируются, а гибнут);

- при криоконсервации стволовых и дифференцированных клеток человека и животных, производят отмывание клеток от старой культуральной среды, ресуспендирование клеток в свежей культуральной среде, ресуспендированные клетки помещают в среду, содержащую заявленное средство с содержанием ПФОС 59-70 об.%, после чего производят охлаждение в два этапа: сначала со скоростью 1 градус в мин до - 80°С, а затем с максимально возможной скоростью до температуры -196°С;

- при культивировании стволовых и дифференцированных клеток человека и животных, качестве компонента среды используют заявленное средство с содержанием ПФОС от 15 до 70 об.%, причем при культивировании суспензионных и распластывающихся на подложке клеток дополнительно к стандартным культуральным средам добавляют заявленное средство с содержанием ПФОС не менее 61 об.%;

- при культивировании, хранении и криоконсервации стволовых и дифференцированных клеток человека и животных используют комбинацию заявленного средства с различным содержанием ПФОС.

С целью ликвидации действия факторов, повреждающих структуру и функциональные свойства клеток в процессе их культивирования, хранения и криоконсервации, предлагается использование гелей разной плотности, представляющих уплотненные и структурированные до гелевого состояния эмульсии ПФОС (моносоединение или смеси ПФОС, в том числе перфторированные циклические и гетероциклические соединения, третичные амины, алканы, эфиры и полиэфиры).

Стабилизация ПФОС в эмульгированном виде и формирование гелевой структуры достигается с помощью водорастворимых неионогенных поверхностно-активных соединений, которые в наиболее частом случае могут включать полаксомеры - блок-сополимеры полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ППО) при соотношении ПЭО/ППО от 9:1 до 7:3, и средней молекулярной массе ПАВ от 5000 Да до 21000 Да (нижняя и верхняя границы гелеобразования). Третьим важным параметром гелевой структуры является размер частиц субмикронной эмульсии ПФОС, который должен быть в диапазоне от 15 нм до 2000 нм. При этом, формированию гелевой структуры способствуют наличие частиц эмульсии ПФОС в концентрации от 5 об.% до 70 об.% ПФОС, удлинение полиэтиленоксидных и полипропиленоксидных цепей блок-сополимера, изменение соотношения ПЭО/ППО, а также вариации концентрации ПАВ, неорганических и органических осмолитов.

Указанные три параметра являются ведущими и определяют возможности получения и использования гелей для криоконсервации, культивирования in vitro и ex vivo, сохранения в течение 96 часов и более, жизнеспособных клеток в стандартных комфортных условиях (при температуре 37°С, величине рН порядка 7,0-7,4, в атмосфере, обогащенной CO₂) или в экстремальных условиях в диапазоне пониженных температур порядка 16-22°С, при кислом рН 6.0, в атмосфере воздуха, не обогащенного CO₂ .

Наиболее приемлемой оказалась система, содержащая в составе геля эмульсию из ПФОС в смеси перфтордекалина с перфторметилциклогексилпиперидином в соотношении от 3:1 до 1:1 объемных частей, при стабилизации их в эмульгированном состоянии поласкомерами - проканолом 168, проксанолом 268, плюроником F68 или по необходимости их производными, например, полиэтиленгликолевым эфиром токоферола.

Водная фаза геля, содержащая высокомолекулярные неионогенные ПАВ, неорганические и органические соли, структурированную воду и метаболиты, должна иметь осмотическое давление в диапазоне 250-350 мОсм, что достигается смешиванием с эмульсионно-гелевой основой культуральной среды, выбранной в зависимости от типа клеток, в том числе с добавкой осмолитов неорганической (NaCl, KC, MgCl₂, MgSO₄, CaCl₂, NaHCO ₃) и/или органической (глюкоза, фруктоза, маннитол, бетаин, карнозин, таурин) природы. При этом в зависимости от вида осмолита изменение концентрации осмолитов приводит к разжижению или повышению концентрации и вязкости геля.

Залипание ПФОС на поверхности клеточной мембраны при использовании геля предотвращается благодаря тому, что отсутствует прямой контакт биологических мембран с ПФОС, так как каждая частица эмульсии, включенная в гель, имеет наряду с адсорбционным слоем ПАВ вокруг ПФОС плотную гидратную оболочку из упорядоченных молекул воды. При этом гель высокой плотности обладает способностью к самосборке (после раздробления) в гомогенную гелеподобную структуру. Во всех случаях при смешивании геля на основе эмульсий ПФОС с культуральной средой происходит формирование границы раздела фаз между гелем и культуральной средой, независимо от плотности геля. Культивируемые клетки могут располагаться на границе раздела фаз, но при этом они контактируют непосредственно не с ПФОС, а с «упакованными» частицами ПФОС, покрытыми слоем ПАВ и слоем структурируемой (гидратной) воды. При этом высокоплотная гелевая структура эмульгированных ПФОС моделирует межклеточный матрикс.

Предлагаемое изобретение решает не только проблему предотвращения повреждения клеток химически активными соединениями, например, используемым в качестве криопротектора ДМСО, но и способствует улучшению газообмена (дополнительный технический результат), в котором участвуют структуры частиц эмульсии ПФОС гелевого матрикса. При этом, прирост площади газообмена намного больше, чем при использовании слоя жидкого однородного, не раздробленного на частицы ПФОС, поскольку диспергированный в геле ПФОС представляет собой субмикронную эмульсию с размерами частиц от 15 нм до 2000 нм: при равном количестве нераздробленного на частицы ПФОС, например, в виде слоя жидкости, диффузионная поверхность газообмена в случае раздробления ПФОС на субмикронные частицы увеличивается как минимум на 2-3 порядка.

Предположительно положительный эффект заявленного (перфторуглеродного) геля достигается как благодаря формированию гелевого каркаса-матрикса, так и увеличению массообмена по газам. При этом за счет мембранотропного действия отдельных молекул ПФОС, диффундирующих в липиды мембран, как это происходит при Оствальдовой молекулярной перегонке: диффузии через адсорбционный слой и водную фазу молекул ПФОС из субмикронной эмульсии в более крупную дисперсию - клетки, в мембране клеток происходит молекулярное растворение незначительных количеств молекул ПФОС, не влияющих на адгезивность клеток, но способствующих повышению резистентности мембран и их эластичности [Образцов В.В. и др.].

Физико-химические свойства гелевой структуры такие, как вязкость, светопропускание, диффузия газов, зависят от плотности упаковки частиц эмульсии ПФОС поверхностно-активными соединениями и конечной концентрации полимерного ПАВ, резко замедляющего диффузию любых малых молекул [18].

Гель может иметь различную плотность, которая повышается градуально за счет повышения концентрации или молекулярной массы ПАВ, прироста содержания фазы ПФОС, уменьшения объема несвязанной водной фазы и растворенных в водной фазе неорганических и органических осмолитов и их солей.

Используемый гель ПФОС высокой плотности, содержащий от 59 до 70 об.% выполняет роль не только матриксной подложки, но и организует ниши и карманы для клеток, обеспечивая тем самым специфическое микроокружение. Последнее может увеличивать влияние диффузионной составляющей со стороны молекул ПФОС на мембраны (мембранотропное действие и газообменные эффекты), что также вносит свой вклад в сохранение (консервацию) фазы клеточного цикла. Очевидно, такие «карманы» с одной стороны предохраняют от повреждения микрокристаллами воды при криоконсервации, а с другой - стабилизируют, консервируют клетки во время хранения в условиях относительно гипотермии (ниже 37°С) в той фазе клеточного цикла, во время которой произошло их погружение в гелевый «карман». ПФОС-содержащий гель высокой плотности обеспечивает возможность культивирования на косяках различные виды клеток, в том числе образующие плотный тканеподобный монослой. При таком способе культивирования достигается баланс по количеству и способам гидрофобных контактов между межклеточным матриксом, включающим гелевую массу эмульсии ПФОС, и такого же состава подложкой, что обеспечивает равномерность разрастания клеточного монослоя. В итоге получается истинный ровный монослой, что позволяет решать, например, проблему выращивания искусственной сетчатки. Особенностью этого геля является его способность к быстрому восстановлению гомогенной структуры после раздробления на крупные фрагменты.

Гель высокой плотности с объемным содержанием фазы эмульгированного ПФОС не менее 61% преимущественно используют для криоконсервации и для культивирования распластывающихся клеток в качестве подложки.

Для хранения клеток используется гель относительно низкой плотности, который содержит от 15 до 55-59 об.% ПФОС и образует желеобразную структуру. В геле низкой плотности способность «самовосстанавливать» гомогенную структуру после измельчения на отдельные фрагменты пропадает, очевидно, в виду более высокой сальватации частиц эмульсии ПФОС (наблюдается так называемый эффект растворителя [19]). Гель низкой плотности особенно благоприятен для сохранения клеток в экстремальных условиях (при ацидозе, в отсутствии избытка СО₂ и пониженной температуре 15-20°С). В геле низкой плотности клетки могут «зарываться» в верхний слой геля и как бы «консервироваться» там, т.е. оставаться в той же фазе клеточного цикла на все время хранения не менее 96 часов при температуре 20°С.

Жидкий гель при концентрации ПФОС в эмульсии от 5 до 12-15 об% обладает текучестью, но нацело не смешивается с водой и образует границу раздела фаз, определяемую визуально или под микроскопом при малом увеличении (порядка ×100).

Жидкий гель преимущественно используется для хранения клеток в экстремальных условиях и, тем более, при сохранении клеток в условиях стандартного культивирования.

При криоконсервации наиболее благоприятные условия сохранения структуры и функции клеток достигаются при использовании более плотного геля при содержании ПФОС на уровне 61-62 об.%. геля, реже - менее плотного геля, в котором содержание ПФОС может быть снижено до 5 об.% - 10 об.%.

Принципиально при культивировании, хранении и криоконсервации стволовых и дифференцированных клеток человека и животных возможно использование комбинации (сочетания) гелей разной плотности (с различным содержанием ПФОС), когда культуральная среда наслаивается на жидкий гель, под которым находится слой плотного геля. Жидкий гель ПФОС является компонентом культуральной среды вместе с водно-солевой средой при культивировании суспензионных и распластывающихся культур, а также при замораживании клеточных культур без использования какого-либо дополнительного криопротектора.

Содержащий субмикронную эмульсию ПФОС (моносоединение или смеси ПФОС) заявленные гели различной плотности одновременно выполняют роль каркаса и имитируют межклеточный матрикс и могут быть использованы в качестве дополнения к стандартным культуральным средам при культивировании суспензионных и распластывающихся на подложке клеток, может служить газообменной средой и химически инертной подложкой, в том числе при длительной транспортировке клеток в неблагоприятных условиях.

Гель, содержащий эмульсию одного ПФОС или смеси ПФОС добавляют к культуральной среде для сохранения клеток (включая стволовые, прогениторные и дифференцированные клетки) человека и животных в течение 96 часов в стандартных условиях культивирования при контролируемой величине рН 7,0-7,4, температуре 37°С, в атмосфере инкубатора CO₂ или в экстремальных условиях при низком рН 6.0, при температуре 16-22°С, в обычной воздушной атмосфере, без использования CO₂-инкубатора. Как правило, культивирование проводят в культуральной среде с использованием геля низкой плотности при концентрации ПФОС в диапазоне от 15 до 55-59 об.%.

Для последующей криоконсервации клеток (включая стволовые, прогениторные и дифференцированные клетки) человека и животных к культуральной среде добавляют гель, отличающийся высокой плотностью - при концентрации эмульсии перфторуглеродов 59-70 об%. При этом, процедура криоконсервации клеток с использованием плотного геля включает отмывание клеток от старой культуральной среды, ресуспендирование клеток в минимальном объеме свежей культуральной среды. Перед началом охлаждения ресуспендированные клетки помещают в среду, содержащую плотный гель, охлаждение проводят в два этапа: сначала со скоростью 1 градус в мин до - 80°С, а затем с максимально возможной скоростью до температуры - 196°С.

Заявленный гель может быть использован в качестве криопротектора при хранении в криобанках. При этом отпадает необходимость использования таких криопротекторов, как ДМСО или глицерин, или маннитол.

Для пояснения сущности заявленного изобретения представлены следующие графические материалы:

- на фиг.1 структурно показан жидкий гель, частицы которого окружены микромицеллами, где 1 - микромицеллярное окружение; 2 - частицы жидкого геля;

- фиг.2 - микрофотография клеток из образца № 1 (пример 1);

- фиг.3 - микрофотография клетки из образца № 2 (пример 1);

- фиг.4 - микрофотография клетки из образца № 3 (пример 1);

- фиг.5 - микрофотография клеток, перенесших криоконсервацию в присутствии перфторуглерод - содержащих геля низкой плотности (пример 1);

- на фиг.6 - микрофотография клеток, перенесших криоконсервацию в присутствии перфторуглерод - содержащих геля высокой плотности (пример 1);

- фиг.7 (А, В) - микрофотография клетки из образца № 4 (пример 1);

- фиг.8, 9, 10 - микрофотография клеток из образца № 1 (пример 2);

- фиг.11 - живая, вошедшая в митотическое деление клетка после хранения в жидком геле с 10 об% ПФОС в эмульсии (образец 2) при экстремальных условиях (пример 2);

- фиг.12 - пересев клеток после хранения с жидким перфторуглеродным гелем (эмульсия 15 об%) (пример 2);

- фиг.13 - иллюстрация использование геля высокой плотности (образец № 4) (пример 2);

- фиг.14 - пересев после хранения в среде с гелем высокой плотности (пример 2).

- фиг.15 - иллюстрация использования геля низкой плотности (пример 2);

- фиг.16 показан пересев клеток после хранения в присутствии геля низкой плотности (пример 2);

- фиг.(17, 18, 19) - микрофотографии клеток из образцов 6, 7, 8 (пример 2);

- фиг.20-22 приведены диаграммы распределения по размерам частиц получаемой эмульсии в составе гелей разной плотности:

- жидкий гель (фиг.20) с объемом фазы ПФОС 15%; по гистограмме средний размер частиц ПФОС 150.0 нм; определение распределения частиц под углом лазерного луча 90,0 градусов;

- гель низкой плотности (фиг.21) с содержанием объемной фазы ПФОС менее 59%: в первой части гистограммы средний размер частиц 31,6 нм, их доля составляет 38,62%; во второй части гистограммы средний размер части - 173,9 нм, их доля составляет 71,38%; от общего числа частиц эмульсии ПФОС в геле низкой плотности; определение распределения частиц под углом лазерного луча 90,0 градусов;

- гель высокой плотности (фиг.22) с объемным содержанием перфторуглеродной фазы более 65%: по гистограмме средний размер частиц ПФОС 136.4 нм; определение распределения частиц под углом лазерного луча 90,0 градусов. - фиг.23 - диаграмма температурного градиента охлаждения от 4°С до -6°С при центрифугировании с ускорением от 3000g до 35000д для дополнительного повышения вязкости геля в зависимости от требуемой вязкости и плотности геля.

Ниже, на конкретных примерах приводятся доказательства, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением вышеуказанного технического результата.

В примере 1 приводится иллюстрация преимуществ перфторуглерод-содержащих гелей разной плотности как криопротекторов для сохранения (выживаемости) стволовых клеток человека в процессе криоконсервации.

Пример 2 иллюстрирует преимущества перфторуглерод-содержащих гелей разной плотности как консервантов для хранения стволовых клеток человека при стандартных условиях культивирования и в экстремальных условиях температуре 20°С более трех суток.

Пример 1. Криоконсервация и культивирование клеток in vitro

Взято 2 флакона - культуральных матрацев (Costar, площадь дна 25 см²) с выращенной в них культурой фетальных (10-12 недель) фибробластоподобных клеток человека кожно-мышечного пула, перенесших 9 пассажей. Общая численность выросших клеток составляет 3х10⁶. Из матрацев удаляется культуральная среда (DMEM/F12 (50/50) (Sigma), содержавшая 5% FBS (Gibco)).

В каждый культуральный матрац, содержащий прикрепленные к пластиковому дну матраца стволовые клетки, вносят 1 мл смеси, содержащей раствор трипсина (0,025%, Sigma) и версена (0,025%, Sigma), посредством покачивания обмывают дно. Заполненные этой смесью флаконы выдерживают в суховоздушном термостате (ТСвЛ-80 УХЛ 4,2) при 37°С, два раза по 3 минуты, до ошаривания клеток и отрыва всех клеток от поверхности дна флакона (визуальный контроль с помощью микроскопа БиоЛам П-3, Ломо). Суспензию отделенных клеток переносят в одноразовые стерильные микропробирки объемом 2 мл (Eppendorf) и центрифугируют (ELMI) при 1500 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок клеток ресуспендируют в культуральной среде DMEM/F12 (50/50) (Sigma) с добавлением 5% FBS (Gibco) и объединяют осадки из нескольких пробирок в общем в объеме 1,3 мл в стерильной пробирке на 2 мл (Eppendorf). Клетки вновь центрифугируют (5 минут при 1000 об/мин) и надосадочную жидкость удаляют. Полученный осадок ресуспендируют в 1,5 мл культуральной среды DMEM/F12 (50/50) (Sigma) с добавлением 5% FBS (Gibco). Конечная концентрация клеток должна составлять 300 тысяч в 100 мкл. В 4 стерильные криопробирки с внутренней резьбой объемом 2 мл помещают по 100 мкл полученной суспензии клеток.

В пробирку № 1 вносят 1 мл жидкого гель, содержащего 10 об.% перфторуглеродной фазы.

В пробирку № 2 вносят 330 мкл геля высокой плотности с концентрацией субмикронной эмульсии ПФОС 70 об.%

В пробирку № 3 вносят 350 мкл геля низкой плотности 55 об.% ПФОС.

В каждую из 4-х пробирок вносят дополнительно по 900 мкл культуральной среды DMEM/F12 (50/50) (Sigma) с добавлением 5% FBS (Gibco).

Затем в пробирку № 4 добавляют концентрированный ДМСО так, чтобы его конечное содержание составляло 5% от общего объема пробы и пипетируют для гомогенного распределения ДМСО.

Пробирки с образцами герметично закрывают и охлаждают в криоконтейнере при скорости заморозки 1 град/мин до -80°С, затем переносят в сосуд с жидким азотом, имеющим температуру -196°С. Замороженные образцы выдерживают в жидком азоте не менее 24 часов.

Замороженные образцы размораживают, помещая закрытые пробирки в водяную баню при температуре 37°С. После полного термостатирования образцов пробирки открывают и каждый образец пипетируют с помощью полуавтоматической пипетки объемом 1000 мкл (Eppendorf). Из каждого образца забирают по 500 мкл суспензии клеток для окрашивания, помещают взятые аликвоты в стерильные микропробирки объемом 2 мл (Eppendorf), туда же вносят краситель кальцеин AM (Biotium) (финальная концентрация 0,5 мкг в 1000 мкл) микропипеткой в объеме 20 мкл. Пробирки с суспензией клеток и красителем инкубируют при 37°С в течение 20 минут. Затем 10 мкл окрашенных клеток помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют (микроскоп Zeiss, Axiovert 200) при увеличении 600.

На фиг.2 представлена микрофотография (фотографии приведены с компьютерным увеличением) клеток из образца № 1 (криоконсервация в присутствии жидкого геля, содержащего 10 об.% перфторуглеродной фазы), где:

1 - клетки в культуральной жидкости, оторвавшиеся от поверхности жидкого геля;

2 - поверхность жидкого геля (граница раздела между культуральной средой и несмешавшимся с ней жидким гелем);

3 - клетки, частично окруженные жидким гелем - приподнятые над его поверхностью;

4 - клетка, лежащая на поверхности жидкого геля;

5 - клетки, инкорпорированные в жидкий гель.

Показана посадка и отрыв клеток с поверхности жидкого геля после криоконсервации. При этом все клетки имеют неповрежденную внешнюю мембрану, независимо от того, слипаются они в агрегаты или остаются виде одиночных клеток.

На фиг.3. показана микрофотография клетки из образца № 2 (криоконсервация в присутствии геля высокой плотности при содержании перфторуглеродной фазы 70 об.%), где: 1 - клетка; 2 - цитоплазматический ретикулум клетки; 3 - складчатая поверхность геля высокой плотности вокруг зарывшейся в него клетки. Клетка после криоконсервации, окруженная (зарывшаяся в глубь геля) складками геля высокой плотности, все структуры клетки не повреждены.

На фиг.4. показана микрофотография клетки из образца № 3 (криоконсервация в присутствии геля низкой плотности при содержании фторуглеродной фазы 55 об%), где: 1 - клетка; 2 - сложная (галообразная) поверхность геля низкой плотности вокруг клетки; 3 - цитоплазматический ретикулум клетки. Клетка после криоконсервации, окруженная гелем низкой плотности, все структуры клетки не повреждены.

Клетки, перенесшие криоконсервацию в присутствии перфторуглерод-содержащих гелей различной плотности, легко пересеваются и растут в присутствии обычной культуральной среды (фиг.5, 6).

На фиг.5 представлена микрофотография неокрашенной клетки, перенесшей криоконсервацию в присутствии геля низкой плотности, после пересева в культуральный флакон (микроскопическое увеличение ×100, с последующим компьютерным увеличением) с культуральной средой DMEM/F12 (50/50) (Sigma) с добавлением 5% FBS (Gibco), где: 1 - неокрашенная распластанная клетка;.2 - цитоплазматический ретикулум.

На фиг.6 - представлена микрофотография неокрашенных клеток, перенесших криоконсервацию в присутствии геля высокой плотности, после пересева в культуральный флакон (микроскопическое увеличение ×100, с последующим компьютерным увеличением) с культуральной средой (DMEM/F12 (50/50) (Sigma) с добавлением 5% FBS (Gibco)), где: 1 - распластанные клетки.

На фиг.7. (А, В) показана микрофотография клетки из образца № 4 (криоконсервация в присутствии 5% ДМСО), перенесших криоконсервацию присутствии 5% ДМСО, где на фиг.7А - окрашена лишь наружная мембрана с множеством повреждений, внутриклеточные структуры не прокрашиваются, фиг.7В - группа слипшихся клеток, в которых внутриклеточные структуры также не прокрашиваются.

Клетки из образца № 4, замороженные в присутсвии 5% ДМСО, сразу после разморозки выглядели сильно поврежденными. При подъеме (пересеве) этого образца культуры наблюдается не менее 35-40% мертвых клеток и порядка 35% апоптотирующих клеток (по данным проточной цитометрии при окрашивании йодистым пропидием). Среди пересеянных клеток из образцов № 1, 2, 3., перенесших криоконсервацию в присутствии геля разной плотности, апоптотических клеток согласно данным проточной цитометрии не наблюдалось.

Пример. 2 Хранение и культивирование клеток in vitro.

Клетки из пула кожно-мышечных фетальных (10-12 нед) клеток человека получали, как в примере 1. По 100 мкл суспензии отмытых клеток с конечной концентрацией 300 тысяч клеток в 100 мкл внесены в 9 лунок планшета (12 лунок, диаметр лунки 3 см, Nunc). В каждую лунку вносили по 1 мл перфторугелрод-содержащей среды.

Таблица
эксперимента выглядела следующим образом
Номера лунок в плашке	Условия хранения и культивирования
Образец № 1	культуральная среда
Образец № 2	жидкий гель, содержащий 10 об.% ПФОС в составе субмикронной эмульсии и культуральная среда
Образец 3 №	жидкий гель, содержащий 15 об.% ПФОС в составе субмикронной эмульсии и культуральная среда
Образец № 4	плотный гель, содержащий 61 об.% смеси перфтордекалина и перфторметилциклогексилпиперидина и культуральная среда
Образец № 5	гель низкой плотности, содержащий 55 об.% смеси перфтордекалина (ПФД), перфторметилцикло-гексилпиперидина (ПМЦП)и перфтортрибутилиаминаа и культуральная среда
Образец № 6	жидкий перфтордекалин и культуральная среда
Образец № 7	Жидкий перфторметилциклогексилпиперидин и культуральная среда
Образец № 8	Смесь жидких ПФОС в составе 2 объемов ПФД и 1 объема ПМЦП и культуральная среда
Образец № 9	жидкий фожалин и культуральная среда

Плашки с образцами инкубировали в течение 96 часов одну плашку в стандартных условиях культивирования, вторую в экстремальных условиях: при температуре 20°С вне СО₂-инкубатора, без компенсации кислотного сдвига при рН 5.9. После окончания эксперимента клетки микроскопировали (БиоЛам П-3 Ломо). Получены следующие результаты:

Культивируемые клетки располагались в разных образцах среды по-разному. В образцах № 1 и № 9 до 20% клеток прилипали ко дну лунки, остальные находились во взвешенном состоянии. Наблюдалось множество апоптирующих клеток при окрашиваним кальциином AM (Biotium) (финальная концентрация 0,5 мкг в 1000 мкл), микроскоп Zeiss, Axiovert 200, увеличение × 600; (фиг.8, 9, 10).

На микрофотографии клеток из образца № 1 (фиг.8) видны апоптотирующие нативные клетки кожно-мышечного пула фетальных (10-12 нед) клеток человека после хранения в течение 96 часов в негерметично закрытых плашках, 20°С, без CO ₂-инкубатора, без компенсирования «кислого» рН добавкой HEPES. Среда DMEM/F12.

На микрофотографии клеток из образца № 1 (фиг.9) видны слипшиеся погибающие клетки кожно-мышечного пула фетальных (10-12 нед) клеток человека после хранения в течение 96 часов в негерметично закрытых плашках при 25°С, без СО ₂-инкубатора, без компенсирования «кислого» рН 6,0. Среда DMEM/F12.

На микрофотографии (фиг.10) клеток из образца № 9 показана апоптирующая клетка, культивировавшаяся в присутствии жидкого ПФОС (коммерческое название - которого фожалин), в течение 96 часов в негерметично закрытых плашках при 25°С, без СО ₂-инкубатора, без компенсирования «кислого» рН 6,0. Среда DMEM/F12.

В образце № 2 после культивирования и хранения в экстремальных условиях в присутствии жидкого геля не наблюдалось ни мертвых, ни апоптирующих клеток (фиг.11). Показана (фиг.11) живая, вошедшая в митотическое деление клетка после хранения в жидком геле с 10 об% ПФОС в эмульсии (образец 2) при экстремальных условиях - температуре 23°С, без СО₂-инкубатора, без компенсирования «кислого» рН 6,0. Среда DMEM/F12. Видны два ядра: 1 и 2. Окраска с Hechst342 (Sigma) (финальная концентрация 10 мкг в 1000 мкл).

При пересеве клеток после хранения с жидким гелем (концентрация эмульсии 15 об% смеси ПФД и ПМЦП в образце № 3) микроскопирование без окраски показало обычное распластывание клеток на две матраца. На фигуре приведены клетки сразу после митоза.

На фиг.12 показан пересев клеток после хранения с жидким перфторуглеродным гелем (эмульсия 15 об.%). Не разошедшиеся после митоза пластующиеся клетки (без окраски): 1 - клетка 2. - клетка.

На фиг.13 иллюстрируется использование геля высокой плотности (образец № 4). Показана клетка из пула кожно-мышечных фетальных (10-12 нед) клеток человека, снятая с поверхности геля высокой плотности и помещенная в стандартную культуральную среду DMEM/F12 (окраска кальцеином AM, Biotium). Клетки хранились в течение 96 часов в негерметично закрытых плашках, при 20°С, без СО₂ -инкубатора, в среде с не компенсированной величиной «кислого» рН 5,9. 1.внешняя граница живой клетки; 2. эндоплазматический ретикулум; 3. ядро.

После пересева клеток с геля высокой и низкой плотности клетки сохраняли жизнеспособность, распластывались на дне матраца и легко входили в митоз плотности (фиг.14, 15, 16).

На фиг.14 показан пересев после хранения в среде с гелем высокой плотности. Видны поделившиеся, но еще не разошедшиеся клетки 1 и 2 (без окраски);

На фиг.15 показана клетка из пула кожно-мышечных фетальных (10-12 нед) клеток человека, снятая с поверхности геля низкой плотности и помещенная в стандартную культуральную среду DMEM/F12 (окраска кальцеином AM, Biotium). Клетки хранились в течение 96 часов в негерметично закрытых плашках, при 20°С, без СО₂ -инкубатора, в среде с не компенсированной величиной «кислого» рН 5,8. Видны внешняя граница живой клетки - 1; эндоплазматический ретикулум - 2 и ядро - 3.

На фиг.16 показан пересев клеток после хранения в присутствии геля низкой плотности. Распластанные на дне матраца клетки, (без окраски)

Как ясно из проведенных экспериментов образцы № 1, 6, 7, 8 9 показали негативные результаты: нарушалась структура клеток, клетки залипали в жидком перфторуглероде, слипались друг с другом, при последующем пересеве не распластывались и погибали. Микрофотографии клеток из образцов 6, 7, 8 приведены на нижеследующих фигурах (17, 18, 19).

Образец № 6 (фиг.17) хранение клеток в присутствии ПФД. Видна Группа клеток, часть из которых находится в капле ПФД. 1-капля ПФД, 2 - клетки. Клетки неправильной формы, слипшиеся.

Образец № 7 (фиг.18) хранение с жидким ПМЦП. Клетка неправильной формы, похоже на разрыв внешней мембраны в верхней части изображения, 1-эндоплазматический ретикулум смещен к внешней мембране.

Образец № 8 (фиг.19) хранение на жидких перфторуглеродах - смесь из 2 объемов ПФД и 1 объема ПМЦП. Видна группа клеток измененной формы, наружная мембрана повреждена, внутриклеточные структуры не прокрашиваются.

Способ получения заявленного средства для культивирования, хранения и криоконсервации стволовых и дифференцированных клеток человека и животных характеризуется осуществлением экструзии под высоким давлением грубой смеси водного раствора неионогенных поверхностно-активных соединений (ПАВ) на основе блок-сополимера ПЭО и ППО с жидкими ПФОС или смесью ПФОС до получения эмульсии, которую затем смешивают в горячем виде с концентрированным водным раствором неорганических солей до достижения полученной смесью осмотического давления в диапазоне 250-350 мОсм, после чего полученный состав охлаждают. Полученное средство перед использованием обычно смешивают с культуральной средой.

При получении геля на основе перфторуглеродной эмульсии исходным сырьем является грубая смесь водного раствора неионогенного ПАВ, представляющего блок-сополимер ПЭО и ППО [20] [18] и жидких ПФОС (моносоединение или смесь нескольких ПФОС). Используются концентрации ПАВ от 20 до 90% со средней молекулярной массой ПАВ от 5000 Да до 21000 Да, при соотношении ПЭО/ППО от 9:1 до 7:3.

В предпочтительном варианте используется 40% раствор блок-сополимера ПЭО и ППО при соотношении ПЭО/ППО 7,5:2,5, которые могут быть дополнены полиэтиленоксидным производным токоферола, а в качестве ПФОС - смесь перфтордекалина (ПФД), перфторметил циклогексилпиперидина (ПМЦП), которая может быть дополнена перфтортрибутиламином (ПФТБА), в соотношении 3:1:1 при исходном содержании ПФОС 50 об.%.

Смесь получают непосредственно перед экструзией путем перемешивания ее компонентов на турбинной мешалке (ультратуракс, ФРГ) при скорости вращения 8000 об в мин и сразу же заливают в емкость экструзера - гомогенизатора высокого давления (AVL-1000). Экструзию осуществляют в замкнутом контуре при охлаждении головки гомогенизатора до температуры 45°С при пульсирующем давлении в диапазоне 400-700 атм., пропуская получаемую смесь через цикл гомогенизации неоднократно - в среднем десятикратно. Основным ориентиром для окончания экструзии является оптически определяемая плотность проб при их анализе с помощью спектрофотометра или светорассеивающего нефелометра, а также по гистограмме размеров частиц эмульсии, определяемой с помощью наносайзера (БЕКМАН КУЛТЕР). Размер получаемой эмульсии в составе гелей разной плотности приведен на фиг.20-22:

- жидкий гель с объемом перфторуглеродной фазы 15% (фиг.20);

- гель низкой плотности с содержанием объемной фазы перфторуглеродов не более 59 об.%(фиг.21);

- гель высокой плотности с объемным содержанием перфторуглеродной фазы более 65 об.% (фиг.22).

Полученная горячая эмульсия смешивается на механической мешалке с концентрированным водным раствором солей так, чтобы после смешивания осмотическое давление смеси не превышало 250-350 мОсм (определяется с помощью криоосмометра Кнауер, ФРГ). В предпочтительном варианте осуществления способа используются концентрированный раствор хлорида натрия (300 мМ) или двойная по концентрации культуральная среда: все зависит от исходного осмотического давления водной фазы эмульсии, если она уже имеет 250-350 мОсм, то берется обычная культуральная среда - неконцентрированная. Затем полученный состав охлаждается. Если плотность геля после остывания до температур 37°С недостаточна или излишне высокая, то плотность эмульсионного геля изменяют одним из нижеописанных способов:

A) Повышение плотности геля обеспечивается путем незавершенной (частичной) лиофильной сушки, когда убирается излишек воды вследствие чего концентрация эмульгированного ПФОС доводится до уровня 60-70 об%, в зависимости от предназначения эмульсии. Длительность незавершенной сушки определяется эмпирически. Как правило, если для полного высушивания порции полученного геля требуется 6 часов, то незавершенная лиофильная сушка должна длиться около 1,5 часов для получения 60% геля или 2 часа для получения 70% геля. Гелеобразная масса сохраняет вид геля без отделения жидкой фазы и без расслоения в широком диапазоне температур: от 40°С до 15°С. Концентрация ПФОС определяется с помощью фторного ядра ЯМР-спектрометра высокого разрешения (600 МГц, Брюккер. ФРГ).

Б) Плотность геля может быть повышена путем центрифугирования с помощью рефрижераторной центрифуги при соблюдении температурного градиента охлаждения от 4°С до -6°С согласно фиг.10 (1-гель низкой плотности; 2 - жидкий гель; 3 - гель высокой плотности), при осаждающем ускорении от 15000 g до 35000 g. После центрифугирования гель располагается на дне пробирки в осадке, надосадочную жидкость удаляют.

B) Для уменьшения плотности геля необходимо на стадии смешивании горячей эмульсии увеличить объем водно-солевого раствора или добавить в него такие осмолиты, как глюкоза, фруктоза, маннитол или бетаин в исходной концентрации, обеспечивающей осмотическое давление на уровне 350 мОсМ, если не используются солевые осмолитики.

Заявленным способом удается получать гели с заданной формой распределения частиц эмульсии ПФОС в геле и требуемой плотности геля: полученные гели при температуре 20°С имеют разную консистенцию в зависимости от вида.

Список цитируемых информационных источников:

1. Цуцаева А.А., Петренко Т.Ф., Криоконсервация культивируемых клеток животных. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. с.63-69.

2. Патент РФ № 2323252, Колесникова А.И., Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo, 27.04.2008.

3. S A Noggle et al Feeder-Free Culture of Human Embryonic Stem Cells (S A Noggle et al.) STEM CELLSFrom Bench to Bedside / edited by Ariff Bongso World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 2005.

4. HOPE, Andrew; MILJAN, Erik; (GB). SINDEN, John (WO/2010/064054) Cellular compositions for use in therapy, 10.06.2010.

5. Патент № 2346981, ЛАДЛОУ Джон В., ФЕРТ Марк Э., БРЮС Эндрю Т., РЕЙД Лола М., СЬЮСИК Роберт Л. Младший, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА, В ТОМ ЧИСЛЕ ПЕЧЕНОЧНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК/КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, 20.02.2009.

6. Берсенев А.В. «Судороги и кома как осложнение, связанное с токсичностью криопротектора (ДМСО) при инфузии гемопоэтических клеток в клинике трансплантации костного мозга»./ Клеточная трансплантология и тканевая инженерия научно-информационный и аналитический журнал. http://www.celltranspl.ru/news/news882: Calmels В, Houze P, Hengesse JC, Ducrot T, Malenfant С, Chabannon С.«Preclinical evaluation of an automated closed fluid management device: Cytomate, for washing out DMSO from hematopoietic stem cell grafts after thawing». Bone Marrow Transplant 2003; 31: 823-828; Rodriguez L, Velasco B, Garcia J, Martin-Henao GA. Evaluation of an automated cell processing device to reduce the dimethyl sulfoxide from hematopoietic grafts after thawing. Transfusion 2005; 45:1391-1397; CN 101070534, C12N 5/06 (2006.01).

7. WO/2009/115581, 24.09.2009. Wouters, Guy; (be).Van Wemmel, kelly; (be).De Waele, Peter; Improved cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells.

8. Патент РФ. 2312141. Чачуэс Хуан Карлос, Проспер Кардосо Фелипе, Херрерос Гонсалес Хесус. Среда для культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников и способы их применения, 10.12.2007: Патент РФ № 2161198, Лепехова С.А, Гольдберг О.А., СРЕДА ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ, 27.12.2000; Патент РФ № 1775882, Межидов С.Х., Беляева ИМ, Воротилин A.M., Моисеев В.А., СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ, 10.09.1995.

9. Патент РФ № 2073972, Майкл Джон Глинн Томас [GB], Сюзан Хелен Белл [GB], Стюарт Грехем Нэш[ОВ], Эрнст Сидней Пэрри, СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ КРАСНЫХ КРОВЯНЫХ КЛЕТОК И РАМА ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ КРАСНЫХ КРОВЯНЫХ КЛЕТОК, 27.02.1997.

10. Патент РФ № 2314687, Одинцова Неллия Адольфовна (RU), Агеенко Наталия Викторовна (RU), Борода Андрей Викторович (RU), Костецкий Эдуард Яковлевич, СПОСОБ КРИОСОХРАНЕНИЯ КЛЕТОК МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ, 20.01.2008.

11. Патент РФ № 1441504, Обозная Э.И., Савчик А.Б, Способ подготовки замороженных клеток костного мозга к использованию, 25.07.1995.

12. Патент US № 2010/0317108, Tomas Stojanov, Cryopreservation of Biological Cells and Tissues, Dec. 16.2010.

13. Белоярцев Ф.Ф., Создание инкубационных сред с высокой кислородной емкостью для биологических экспериментов с переживающими тканями// Перфторированные углероды в биологии и медицине. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1980. С.5-21; Архипов В.В., Культивирование клеток на подлолжках из фторуглеролдных жидкостей, Перфторированные углероды в биологии и медицине. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1980. С.98-100; Иваницкий Г.Р., Архипов В.И., Белоярцев Ф.Ф., Лежнев Э.И. Культивирование животных клеток на жидких перфторуглеродах/УДокл. АН СССР. 1981. Т.258. № 1. С.225; jp61001383, ichikawa yataro·hamamoto·kimihiko·tokashiki michiyuki method of cell culture/ 01/07/1986; Гаврилюк Б.К., Макарова О.П., Белоярцев Ф.Ф., Лежнев Э.И. Культивирование клеток ВНК-21 на жидких фторуглеродах // Цитология. 1982. Т. 24. № 3. С.249; Гайнуллина СМ., Лежнев Э.И., Александров В.Б., Попов В.И. Органное культивирование эксплантатов аденокарциномы толстой кишки человека/УЭксперим. онкол. 1991. Т. 13. № 6. С.11.

14. US 5,702,949, Edward M. Trujillo. Sandy; Catherine Rappaport, CULTURE METHOD FOR MULTILAYER GROWTH OF ANCHORAGE-DEPENDENT CELLS Dec. 30, 1997: US 2004/0023374, Catherin Rapaport, Edward Trujillo / Yvonne Rensch et al., Method and apparatus for multi-layer of ANCHORAGE-DEPENDENT CELLS, Nov. 13. 2001; US 7,498,169 B2 Harpal S. Mangat EXTENDING TISSUE PRESERVATION Mar. 3, 2009.

15. Pub. No.: US 2010/0291679 Al, Nov. 18,2010, Composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition.

16. J.G.Riess Oxygen Carries ( Blood Substitutes - Raison d'Eltre, Chemictry, and Some Phisiology. // Chem. Rev. 2001.101.2797-2919.

17. (S A Noggle et al.) STEM CELLS. From Bench to Bedside / edited by Ariff Bongso.© World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 2005, http://www.worldscibooks.com/lifesci/5729.html.

18. Шенфельд Н. Поверхностно-активные вещества на основе оксида этилена. М. Химия. 1982. Перев. с немецкого. 747 с.

19. А. Терней. Современная органическая химия. В 2-х томах. М. Мир, 1981.