способ изготовления r-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (рнга)

Формула изобретения

Способ изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизацию их сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием, отличающийся тем, что антиген извлекают из R-штамма В.abortus 16/4, воздействуя на бактериальные клетки 0,5% концентрацией додецилсульфата натрия при температуре 68-70°С в течение 60 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам изготовления диагностических препаратов, применяемых при серологических исследованиях в ветеринарии и может быть использовано в медицине.

Известен способ приготовления антигена для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза у животных, включающий получение бактериальной массы штамма В.abortus R-1096 и инактивацию ее путем гамма-облучения [SU 946039 А, 05.02.79 г.]. Однако антиген, полученный таким способом, используется только для постановки реакции агглютинации и реакции связывания комплемента.

Известен также способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана, их обработку додецилсульфатом натрия в 1% концентрации при 50-60°С в течение 30 минут, с последующей сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл штамма В.abortus 19, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацией, экстрагированием и отделением сенситина центрифугированием [RU 2283498 С1, 22.02.2005 г.].

Данный способ получения бруцеллезного антигена для РНГА при бруцеллезе не позволяет получить антиген для выявления в сыворотке крови R-гемагглютининов, т.к. для его изготовления используют штамм бруцелл в S-форме.

Техническим результатом изобретения является получение активного и специфичного R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для выявления в сыворотке крови R-бруцеллезных антител в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Технический результат способа изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации достигается приготовлением формалинизированных эритроцитов барана, с последующей их сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы В.abortus 16/4, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование, отделение сенситина центрифугированием, воздействием на бактериальные клетки 0,5% концентрацией додецилсульфата натрия при температуре 68-70°С в течение 60 минут.

Способ осуществления. Трехсуточную агаровую культуру бруцелл вакцинного штамма В.abortus 16/4 смывают 12% раствором хлорида натрия, фильтруют и подвергают автоклавированию при 1 атм. (120°С) в течение 20-30 минут, доводят концентрацию бруцелл до 40-50 млрд м.к. в 1 мл 12% раствором NaCl. К бактериальной взвеси добавляют 0,5% додецилсульфата натрия, после чего ее нагревают в водяной бане при температуре 68-70°С в течение 60 минут, при периодическом перемешивании. Взвесь декантируют путем центрифугирования при 8-10 тыс об/мин в течение 60 минут, полученный экстракт используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.

Формалинизацию эритроцитов барана проводят по методу R.Weinbach (1958), при этом концентрация формальдегида в процессе обработки эритроцитов составляет 1,5%, соотношение фиксатора и эритроцитов 0,375:1. Полученную взвесь эритроцитов с формальдегидом переносят в термостат и формалинизируют при температуре 37-38°С в течение 18-20 часов. После окончания формалинизации эритроциты отмывают от избытка формалина 3 раза 10-кратным объемом физиологического раствора на центрифуге при 1000-1500 об/мин в течение 10-15 минут (Каральник Б.Н. Эритроцитарные диагностикумы. - М., Медицина. - 1976. - 164 с.).

В таблице 1 представлены результаты воздействия на бактериальную массу с целью извлечения сенситина разных концентраций додецилсульфата натрия.

Таблица 1
Влияние концентрации додецилсульфата натрия на активность и пецифичность R-бруцеллезного эритроцитарного антигена
Концентрация додецилсульф ата натрия	Количество антигена на 1 мл 5,0% взвеси эритроцитов	Титр РИГА с R-бруцеллезной сывороткой	Негативная сыворотка крупного рогатого скота с 1:50	Контроль с физиологическим раствором
0,1%	0,25	-	-	-
	0,5	-	-	-
	1	-	-	-
	2	-	-	-
	3	-	-	-
0,25%	0,25	-	-	-
	0,5	-	-	-
	1	1:100++++	-	-
	2	1:400++++	-	-
	3	1:800++++	-	-
0,5%	0,25	1:1600++++	-	-
	0,5	1:3200++++	-	-
	1	1:6400++++	-	-
	2	1:12800++++	1:100++++	-
	3	1:25600++++	1:200++++	++++
1,0%	0,25	1:25600++++	1:400++++	++++
	0,5	1:25600++++	1:400++++	++++
	1	1:25600++++	1:400++++	++++
	2	1:25600++++	1:400++++	++++
	3	1:25600++++	1:400++++	++++

Анализ данных таблицы 1 показывает, что оптимальной концентрацией детергента при изготовлении R-антигена является 0,5% додецилсульфата натрия, при этом специфичный эритроцитарный антиген с заданной активностью не ниже 1:3200 при титрации с R-бруцеллезной сывороткой можно получить при соотношении формалинизированных эритроцитов и сенситина 1:0,5. При применении 0,25% концентрации додецилсульфата в процессе извлечения сенситина диагностикум не обладает достаточной активностью. При использовании додецилсульфата натрия в концентрации 1,0% эритроцитарный диагностикум становится неспецифичным, получены положительные результаты с негативной сывороткой крупного рогатого скота в разведении 1:50 и выше и с физиологическим раствором.

Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят оптимальной дозой сенситина, которую определяют путем титрации его с использованием R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки. При титрации сенситина для сенсибилизации эритроцитов к 1 мл 5,0% взвеси эритроцитов добавляют его в количествах 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2; 3,0 мл. Результаты испытания специфичности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результат испытания специфичности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена
Сыворотки крови, подвергнутые исследованию	Количество исследуемых проб	Разведение сыворотки крови	Результат исследования
невакцинированный против бруцеллеза крупный рогатый скот из благополучных по бруцеллезу хозяйств	505	1:50	отрицательно
здоровые кролики	20	1:10	отрицательно
здоровые морские свинки	26	1:10	отрицательно
кролики, гипериммунизированные вакцинным штаммом B.abortus 104 M(S-форма)	10	1:10	отрицательно
крупный рогатый скот больной бруцеллезом из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств	79	1:50	отрицательно

Из представленных в таблице 2 данных следует, что предложенный способ позволяет получить специфичный R-бруцеллезный эритроцитарный антиген, т.к. позволяет получить отрицательные результаты РИГА у здоровых и сенсибилизированным бруцеллезным S-антигеном животных. Результаты испытания активности R-бруцеллезного антигена отражены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты испытания активности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена
№ п/п	Объект исследования	Результаты исследования
		РНГА	РА с единым антигеном (титр ME)	РСК с единым антигеном (разведение сыворотки крови)
1	сыворотки крови кроликов, зараженных В.abortus 54-70 (R-форма)	1:2560	-	-
2		1:2560	-	-
3		1:2560	-	-
4		1:3200	-	-
5		1:200	-	-
6		1:1600	-	-
7		1:1600	-	-
8		1:3200	-	-
9		1:800	-	-
10		1:100	-	-
1	сыворотки крови крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82 (R S -форма)	1:200	-	-
2		1:400	-	-
3		1:1600	50МЕ+++	-
4		1:800	-	-
5		1:400	-	-
6		1:3200	-	1:10++
7		1:800	-	-
8		1:400	-	-
9		1:200	-	-
10		1:3200	100МЕ++	-

Из таблицы 3 следует, что R-бруцеллезный эритроцитарный антиген обладает активностью, так гемагглютинины в сыворотке крови кроликов, зараженных R-формой бруцелл, содержались в титре от 1:100 до 1:3200, в сыворотке крови крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82 от 1:200 до 1:3200.

Определение чувствительности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена проводили при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма В.abortus 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах (таб. 4, 5).

Таблица 4
Результаты серологических исследований сыворотки крови крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма В.abortus 82, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах
Срок исследования (сутки)	№ хозяйства	Исследовано проб	Реагировало в РНГА с R-антигеном		РА+РСК с единым антигеном
			абс.	%	абс.	%
30	1	49	34	69,4	3	6,1
	2	198	171	86,4	43	21,7
60	1	196	106	54,1	6	3,1
90	1	189	130	68,8	11	5,8
120	1	199	60	30,1	3	1,5
180	1	198	30	15,2	6	3
210	1	191	22	11,5	6	3,1
ИТОГО:		1220	553	45,3	78	6,4

Обследование благополучного по бруцеллезу крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82, показало, что с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена на протяжении 210 суток удалось обнаружить от 11,5 до 86,4% реагирующих животных.

Таблица 5
Результаты серологических исследований сыворотки крови крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, в неблагополучных по бруцеллезу стадах
Срок исследования после вакцинации (сутки)	Количество голов	Количество животных, реагирующих в:
		РА+РСК+РНГА+РИД с S-антигенами в высоких титрах		РНГА с R-антигеном
		абс.	%	абс.	%
60	539	31	5,8	25	80,6
90	504	16	3,2	15	93,7
120	471	7	1,5	7	100,0
Итого:	1514	54	3,6	47	87,0

Данные таблицы 5 показывают, что R-бруцеллезные антитела в сыворотке крови больных бруцеллезом животных, привитых вакциной из штамма В.abortus 82 (SR-форма), можно диагностировать с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена, изготовленного данным способом, в разные сроки после иммунизации животных.

Предлагаемый R-бруцеллезный эритроцитарный антиген обладает специфичностью и чувствительностью, его используют в лаборатории ГНУ ВНИИБТЖ при проведении контроля иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами, а также при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств с целью сохранения от необоснованного убоя животных с поствакцинальными реакциями.