фитоэстрогенные композиции для предотвращения или лечения симптомов, связанных с менопаузой

Формула изобретения

1. Композиция для предотвращения или лечения симптома менопаузы, включающая: терапевтически эффективное количество коричной кислоты или шанжизид метилового эфира.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная композиция обладает фитоэстрогенной активностью.

3. Композиция для предотвращения или лечения симптома менопаузы, включающая терапевтически эффективное количество смеси коричной кислоты и шанжизид метилового эфира.

Описание изобретения к патенту

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к фитоэстрогенной композиции для предотвращения или лечения симптомов, связанных с менопаузой.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гормон, секретируемый фолликулами в яичниках, эстроген, обуславливает развитие половых органов и обеспечивает их функционирование с развитием вторичного полового признака, а также ускоряет развитие матки, рост эндометрия, развитие молочной железы и регулярную менструацию. Помимо яичников, эстроген секретируется в малом количестве плацентой, корой надпочечников и яичками. Известны три типа стероидов, обнаруживаемые в организме: эстрон, эстрадиол и эстриол.

Эстроген образуется из андрогенных предшественников в ходе ферментативного процесса, ароматизации. 17-бета-эстрадиол (Е2) - наиболее эффективный эстроген, который встречается в основном у женщин в период перименопаузы, синтезируется в ходе формирования фолликулов яичников, секретируется в кровоток, частично связывается с глобулином, связывающим половые гормоны, после чего переносится циркулирующей кровью к клеткам организма. Основной метаболический путь эстрадиола заключается в обратимом окислении до эстрона (Е1) - слабого эстрогена, и в итоге в превращении в эстриол (Е3). Эстрон также образуется в результате ароматизации предшественника - андрогена в периферической ткани. Указанные выше соединения метаболизируются с образованием сульфата и глюкоринида и выводятся из организма (Lievertz RW. Pharmacology and pharmacokinetics of estrogen. Am J Obstet Gynecol 156: 1289-1293 (1987)). Поскольку ароматизация происходит в жировой ткани, у тех, у кого больше жировой ткани, больше эстрогена. Эстрадиол и эстрон могут быть метаболизированы в печени до эстриола, очень слабого эстрогена (Anderson F. Kinetics and pharmacology of estrogens in pre- and postmenopausal women. Int J Fertil 38 (suppl 1): 53-64 (1993)). Другие метаболиты эстрогена, а также эстрадиол и эстрон, могут функционировать как эстроген. Соответственно, можно понять, что системные эффекты эстрогена у женщин зависят как от эстрогена, так и от его метаболитов.

Пиковые концентрации эстрадиола, а также эстрона составляют 200-400 пг/мл и 170-200 пг/мл в поздней фолликулярной фазе и снижаются до минимальной концентрации 40-60 пг/мл для обоих веществ в ранней фолликулярной фазе.

Отношение эстрадиола к эстрону перед менопаузой обычно выше 1 (Odonnell MB. Pharmacokinetic and pharmacologic variation between different estrogen products. J Clin Pharmacol 35 (suppl): 18S-24S (1995)). После менопаузы эстрон, образующийся путем преобразования андростендиона надпочечников, становится преобладающим эстрогеном.

Метаболический путь, включающий 2-гидроксилирование, более сложен и приводит к образованию катехолэстрогенов. Этот путь имеет более важное значение в нервной системе, в частности, в мозге, чем в периферических тканях. Эффекты эстрогена проявляются в модификации метаболизма катехоламина (Lievertz RW. Pharmacology and pharmacokinetics of estrogen. Am J Obstet Gynecol 156: 1289-1293 (1987)). Поскольку катехоламин взаимодействует с рецептором дофамина (предшественника адреналина), рецептором альфа-1-адреналина и рецептором серотонина, он считается важным. Кроме того, гидрокси-производные эстрогена играют другие роли. Например, 4-гидроксиэстрон обладает эстрогенной активностью, однако, 2-гидроксиэстрон такой активностью не обладает. Однако 2-гидрокси-производные эстрадиола обладают не только эстрогенной, но также катехоламинэргической активностью (Lievertz RW. Pharmacology and pharmacokinetics of estrogen. Am J Obstet Gynecol 156: 1289-1293 (1987)). Это частично является обуславливает механизм, по которому эстрогены воздействуют на центральную нервную систему.

Главная физиологическая функция эстрогенов состоит в регуляции роста, дифференцировки и функционирования половых тканей, включая молочную железу, матку и яичники (Kuiper GGJM, Carlsson В, Grandien K, et al. Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and beta. Endocrinology 138: 863-870 (1997)). Эстрогены стимулируют рост эндометрия, миометрия, влагалища и эпителия уретры. Дополнительно, эстроген имеет функциональное значение для равномерного тока крови в половых тканях, увеличение секреции маточной железы, а также индуцирует экспрессию прогестерона и рецептора лютеинизирующего гормона. Эстроген влияет на рост и развитие скелета, распределение жира у женщин в дополнение к развитию женских репродуктивных органов и вторичных половых признаком в период полового созревания. Эстроген оказывает влияние на кожу, коллагеновую ткань, нервную и сердечно-сосудистую системы.

Дефицит эстрогена вызывает такие симптомы как приливы жара, вызванные вазомоторной нестабильностью, а в долгосрочном периоде урогенитальную атрофию, остеопороз, потерю зубов, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца и т.д., и потенциально увеличивают риск деменции (Maddox RW, Carson DS, Barnes CL Estrogens and postmenopausal women. U S Pharmacist 23: 141-150 (1998); and Guyton AC, Hall JE. Textbook of Medical Physiology. 9th ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 1996).

После менопаузы, когда функция яичников затухает, женщины испытывают состояние дефицита эстрогена, который вызывает различные симптомы менопаузы, такие как приливы крови к лицу, депрессия и т.д. Некоторым женщинам рекомендуется гормонозаместительная терапия для облегчения менопаузальных симптомов дефицита эстрогена, а также для минимизации возможных долгосрочных последствий дефицита эстрогена.

Введение эстрогена у женщин в постеменопаузе улучшает вазомоторику и течение заболеваний мочеполовой системы, защищает от остеопороза и сдерживает его, а также снижает риск ишемической болезни сердца (Maddox RW, Carson DS, Barnes CL. Estrogens and postmenopausal women. US Pharmacist 23: 141-150(1998)).

Однако существует проблема, заключающаяся в том, что такая гормонозаместительная терапия может увеличивать активность гена, стимулирующего рак, что приводит к увеличению числа случаев заболевания раковыми заболеваниями, такими как рак груди и рак матки.

Известные эстроген-замещающие агенты синтезируются искусственно или могут быть получены из природных источников. Например, премарин получают из мочи беременных лошадей с концентрацией эстрадиола и эстрона, повышенной до уровня фазы секреции (Stumpf PG. Pharmacokinetics of estrogen. Obstet Gynecol 75 (suppl): 9S-14S (1990)). Однако в течение нескольких десятков лет сообщалось о том, что эстроген-заместительная терапия вызывает серьезные побочные эффекты. Было запланировано многоцентровое рандомизированное двойное слепое клиническое исследование Инициатива по охране здоровья женщин (Women s Health Initiative WHI) продолжительностью 8 лет с участием 16000 женщин в постменопаузе, однако оно было прекращено через 5 лет из-за тяжелых побочных эффектов. В результате в 2003 г.FDA (Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами, США) постановило, что все продукты для ГЗТ должны быть снабжены черной предупреждающей этикеткой. Согласно клиническим испытаниям WHI, ГЗТ увеличивает число случаев рака груди на 26%, заболеваний сердца на 29%, а инсульта на 44%. Число тромбозов у получавших ГЗТ было повышено в два раза (Journal of the American Medical Association, июль 2002). NAMS (North America Menopause Society - Северо-Американское общество по вопросам менопаузы) настоятельно рекомендует: «должно быть запрещено применение комбинированной гормональной терапии для первичной и вторичной профилактики сердечнососудистых заболеваний» и «нежелательно применять только терапию эстрогенами, если не получены убедительные научные данные».

С другой стороны, такие растения как соевые, финиковая пальма и гранат, содержат нестероидные растительные соединения, фитоэстрогены. Природные фитоэстрогены, полученные из этих растений, действуют как агонисты и/или антагонисты (Barrett J. Phytoestrogens: friends or foes? Environ Health Perspect 104: 478-482(1996)).

Кроме того, 17 бета-эстрадиол, эстрон, эстрогенсульфат являются примерами химически модифицированного эстрогена. Такой синтетический эстроген используется обычно в качестве орального контрацептива, но едва ли в гормонзаместительной терапии.

Вкратце, количество секретируемого эстрогена с возрастом снижается, и характер секреции эстрогена прямо связан с возрастом. В данной области признано, что применение гормонозаместительной терапии позволяет улучшить обычные симптомы менопаузы, в то время как обычная гормонозаместительная терапия вызывает тяжелые побочные эффекты.

В тексте данной заявке в круглых скобках содержатся указания на различные публикации и патенты. Раскрытия этих публикаций полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки для обеспечения полного описания данного изобретения и уровня техники в области, к которой относится изобретение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования по разработке нового фитоэстрогенного соединения в качестве активного ингредиента путем анализа активности различных природных соединений. В результате мы обнаружили, что коричная кислота и шанжизид метиловый эфир обладают фитоэстрогенной активностью, способной эффективно индуцировать эстроген-специфичную ЩФ (щелочную фосфатазу) по сравнению с другими природными соединениями.

Соответственно, задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предотвращения или лечения симптома менопаузы.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение пищевой композиции для предотвращения или лечения симптома менопаузы.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа предотвращения или лечения симптома менопаузы.

Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из приведенного ниже подробного описания, а также сопровождающих графических материалов.

В одном аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения симптома менопаузы, включающая: (а) терапевтически эффективное количество коричной кислоты, шанжизид метилового эфира или их смеси; и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена пищевая композиция для предотвращения или лечения симптома менопаузы, включающая коричную кислоту, шанжизид метиловый эфир или их смесь в качестве активного ингредиента.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ предотвращения или лечения симптома менопаузы, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ предотвращения или лечения симптома менопаузы, включающий введение субъекту пищевой композиции согласно настоящему изобретению.

Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования по разработке нового фитоэстрогенного соединения в качестве активного ингредиента путем анализа активности различных природных соединений. В результате мы обнаружили, что коричная кислота и шанжизид метиловый эфир обладают фитоэстрогенной активностью, способной эффективно индуцировать эстроген-специфичную ЩФ (щелочную фосфатазу) по сравнению с другими природными соединениями.

Коричная кислота, которую отобрали в качестве терапевтического агента для лечения симптомов менопаузы, может быть представлена следующей формулой I:

Коричная кислота представляет собой белую кристаллическую кислоту, ее температура плавления равна 133°C, а температура кипения равна 300°C. В соответствии со стандартными методиками, известными средним специалистам в данной области, коричная кислота используется во вкусовых добавках, синтетическом индиго и в некоторых фармацевтических средствах.

Согласно настоящему изобретению коричная кислота может быть получена из синтезированных химически продуктов или природных субстанций. Например, коричная кислота для применения в настоящем изобретении может быть получена путем выделения из природных субстанций, таких как коричное масло, бальзам, масло ши и Cynanchum wilfordii.

Кроме того, коричная кислота может быть получена биосинтетическим способом путем воздействия фермента фенилаланинаммоний-лиазы (PAL) на фенилаланин.

Шанжизид метиловый эфир в качестве другого активного ингредиента согласно настоящему изобретению может быть представлен формулой II:

Шанжизид метиловый эфир представляет собой природное соединение класса гликозидов иридоидов и известен в качестве средства для лечения гипотоксичности, стресса и иммунодефицита у млекопитающих (WO 2003/080087).

Согласно настоящему изобретению, шанжизид метиловый эфир может быть получен из химически синтезированных продуктов или природных материалов. Например, шанжизид метиловый эфир для применения в настоящем изобретении может быть получен путем выделения из природных субстанций, таких как Mussaenda pubescens, Phlomis spinidens, Lamlum purpureum, Phlomis umbrosa and Scoparia ericacea.

Коричная кислота и шанжизид метиловый эфир, используемые в качестве активных ингредиентов в настоящем изобретении, демонстрируют более значительную эстрогенную активность, чем обычные эстроген-замещающие агенты.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, композиция включает смесь коричной кислоты и шанжизид метилового эфира. Как показано ниже в разделе Примеры, смесь коричной кислоты и шанжизид метилового эфира обладает синергетической эстрогенной активностью в сравнении с отдельными веществами.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена в форме фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению включает фармацевтически приемлемый носитель в дополнение к соединению, представляющему собой активный компонент. Фармацевтически приемлемый носитель, содержащийся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, который часто используется в фармацевтических составах, включает, но не ограничивается перечисленными: лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат калия, аргинат, желатин, силикат калия, микрокристаллическую целлюлозу, воду, сиропы, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно включать лубрикант, увлажнитель, подсластитель, вкусовое вещество, эмульгатор, суспендирующий агент и консервант. Подробное описание подходящих фармацевтически приемлемых носителей и составов моно найти в Remington s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995), которая включена в настоящее описание путем ссылки.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально и в предпочтительном случае вводят парентерально.

Подходящая дозировка фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может варьировать в зависимости от способов приготовления фармацевтической композиции, способов введения, возраста, массы тела, пола, патогенного состояния, диеты пациента, времени введения, пути введения, скорости экскреции и чувствительности к используемой фармацевтической композиции.

Термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для того, чтобы обеспечить описанные выше эффективность и активность соединения согласно настоящему изобретению. В предпочтительном случае коричную кислоту и шанжизид метиловый эфир, содержащиеся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, можно вводить в ежедневной дозе, равной 0.001-10000 мг/кг (массы тела).

В соответствии с обычными методиками, известными специалистам в данной области, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена с фармацевтически приемлемым носителем и/или средой, описанными выше, с получением нескольких форм, включая однодозовую форму и многодозовую форму. Неограничивающие примеры лекарственных форм включают, но не ограничиваются перечисленными: раствор, суспензию или эмульсию в масляной или водной среде, элексир, порошок, гранулу, таблетку и капсулу, и могут дополнительно включать диспергирующий агент или стабилизатор.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена в форме пищевой композиции. В дополнение к коричной кислоте и шанжизид метиловому эфиру в качестве активных ингредиентов, пищевая композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена в разнообразных формах, например, включающих белки, углеводороды, жирные кислоты, питательные вещества, вещества, обеспечивающие пригодность к употреблению, и вкусовые вещества. Например, природные углеводы могут включать обычные сахара, такие как моносахариды (например, глюкоза, фруктоза и т.д.), дисахариды (например, мальтоза, сахароза, олигосахариды и т.д.) и полисахариды (например, декстрин, циклодекстрин и т.д.); и сахарные спирты (например, ксилитол, сорбит, эритритол, и т.д.). В составе вкусового вещества могут быть использованы природные вкусовые вещества [тауматин, thaumatin, экстракт стевия (например, ребаудиозид А, глицирризин), и т.д.] и синтетические вкусовые вещества (например, сахарин, аспартам и т.д.).

В случае когда пищевая композиция имеет форму напитка, она может дополнительно включать лимонную кислоту, жидкую фруктозу, азотную кислоту, яблочную кислоту, фруктовый сок, экстракт эвкомии вязолистной, экстракт ююбы, экстракт солодки и т.д.

Композиция согласно настоящему изобретению, включающая одно или более соединений из коричной кислоты шанжизид метилового эфира, может быть высоко эффективной в облегчении различных симптомов, связанных с менопаузой. Термин «симптомы, связанные с менопаузой» относится ко всем симптомам, индуцируемым снижением уровня эстрогена в течение перименопаузы, менопаузы и постаменопаузы. Перименопауза представляет собой период перед фактическим началом менопаузы. В течение перименопаузы продукция эстрогена нерегулярна и вероятность беременности у женщин значительно снижена. Перименопауза может продолжаться несколько месяцев или лет. Кроме того, в период перименопаузы могут возникать климактерические симптомы.

Симптомы менопаузы включают климактерические симптомы, такие как сухость влагалища, нарушение сна, проблемы с сознанием, артралгия, заболевания опорно-двигательного аппарата, расстройства пищеварения, недержание мочи, вялость, приливы жара, вызванные вазомоторной нестабильностью, покраснение лица, ночные поты, сердцебиения, депрессия, тревожность и раздражительность. Кроме того, серьезные нарушения или состояния, вызванные недостаточностью эстрогена, могут включать остеопороз, потерю зубов и потерю коллагена кожи.

Признаки и преимущества настоящего изобретения можно суммировать следующим образом:

(a) Композиция согласно настоящему изобретению включает полученные из природных субстанций соединения, коричную кислоту или шанжизид метиловый эфир в качестве активного ингредиента, и обладает прекрасной эстрогенной активностью;

(b) композицию согласно настоящему изобретению можно эффективно применять для лечения или предотвращения разнообразных симптомов в течение перименопаузы, менопаузы и постменопаузы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 представлена гистограмма, демонстрирующая анализ эстроген-специфичной ЩФ-индуцирующей активности. Контроль, Е2 и C+S представляют отрицательный контроль, группу, обработанную 17 -эстрадиолом, и группу, обработанную смесью коричной кислоты, и шанжизид метилового эфира в весовом отношении 1:1, соответственно.

Ниже настоящее изобретение описано более подробно. Для специалиста в данной области очевидно, что приведенные примеры предназначены для более конкретной иллюстрации, а объем изобретения, определяемый прилагающейся формулой изобретения, не ограничен приведенными примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Приготовление образцов

Коричную кислоту приобретали в Sigma-Aldrich (США), а шанжизид метиловый эфир получали в Chemos GmbH (Германия). Каждая экспериментальная группа: группа 1, группа 2 и группа 3 представляет коричную кислоту, шанжизид метиловый эфир и смесь коричной кислоты и шанжизида в весовом отношении 1:1.

Пример 2: Анализ эстрогенной активности

Для подтверждения эффекта состава согласно настоящему изобретения проводили измерения эстрогенности на нерепродуктивной ткани-мишени. Более подробно, было известно, что индукция ЩФ (щелочной фосфотазы) в остеобластных клетках SaOS-2 увеличивается и снижается по действием эстрогена и антиэстрогена (Nasu, M., Sugimoto, Т., Kaji, H. and Chihara, K. (2000). Эстроген модулирует пролиферацию и функцию остеобластов, регулируемые паратгормоном, у остеобластных клеток SaOS-2: Role of insulin-like growth factor (IGF)-1 and IGF-binding protein-5. J. Endocrinol. 167, 305-313), и, в частности, периодическая обработка эстрогеном усиливает образование минерализованных костных узелков (Rao, L.G., Liu, L.J., Murray, T.M., McDemott, E. and Zhang, X. (2003). Периодически, но не постоянно, добавляемый эстроген стимулирует дифференцировку и образование костей в клетках SaOS-2. Biol. Pharm. Bull. 26(7), 936-945).

В связи с этим, в данном исследовании эстрогенную активность составов экспериментальных групп, описанных выше в примере 1, анализировали с использованием клеток SaOS-2.

Для экспериментов линию клеток SaOS-2 приобрели из Корейской коллекции типовых культур (KTCC). Клетки SaOS-2 культивировали во флаконах для клеток Т-75 (площадь 75 см²) при 37°C в атмосфере с 5% СО₂ и 95% воздуха с использованием среды DMEM с высоким содержанием глюкозы/добавкой F12 (Gibco, Carlsbad, США), дополненной 10% ФБС (бычьей фетальной сыворотки) и 1% пенициллина-стрептомицина. Для определения степени индукции эстроген-специфичной ЩФ клетки SaOS-2 высевали в 96-луночный планшет при плотности 3×10⁴ клетки/лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем среду без фенолового красного заменяли на свежую среду, дополненную 1% пенициллина-стрептомицина, 1% пирувата натрия, 1% NEAA (не-незаменимые аминокислоты, Hyclone, США) и 10% очищенной смесью уголь:декстран ФБР (CDFBS, Hyclone, США), и культивировали в течение 48 часов после обработки 1 нМ 17 -эстрадиола (Е2, Sigma-Aldrich, США) и коричной кислотой, шанжизид метиловым эфиром или их смесью в различных концентрациях (5 мкмоль, 20 мкмоль, 50 мкмоль и 100 мкмоль), соответственно. Затем в культуральную среду каждой лунки добавляли 50 мкл буфера для лизиса клеток (100 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA), а затем тщательно смешивали с 150 мкл 30 мМ п-нитрофенилфосфата (Merk, Германия) при встряхивании, после чего измеряли поглощение на 405 нм в течение 10 мин с интервалом в 50 сек. Индукцию ЩФ рассчитывали следующим образом: % индукции = [(Наклон_{образец})/(Наклон _{17 -эстрадиол})]×100.

Индуцирующее влияние коричной кислоты, шанжизид метилового эфира и их смеси на ЩФ в клетках SaOS-2 представлено на Фигуре 1. На Фиг.1 контроль представляет собой отрицательный контроль, а отдельные столбики на графике, демонстрирующем обработку составом, представляют образцы с концентрациями 5 мкмоль, 20 мкмоль, 50 мкмоль и 100 мкмоль, соответственно, начиная с левого столбика.

Каждый состав демонстрирует ЩФ-индуцирующие эффекты, а смесь коричной кислоты и шанжизид метилового эфира обладала более значительным влиянием на индукцию ЩФ, чем отдельные соединения. В совокупности это позволяет предположить, что коричная кислота и шанжизид метиловый эфир, а также их смесь, обладают значительной эстрогенной активностью, и, кроме того, их смесь демонстрирует синергетический эффект по сравнению с отдельными соединениями.

После описания предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения понятно, что для специалиста в данной области могут стать очевидными его варианты и модификации, соответствующие идее изобретения, и что объем изобретения определяется прилагающейся формулой и эквивалентами.

Ссылки

Belchetz РЕ. Hormonal treatment of postmenopausal women. N Engl J Med, 14:1062-1071(1994).

Greendale GA, Lee NP, Arriola ER. The menopause. Lancet, 353(9152): 571-80(1999).

Bungay GT, Vessey MP, McPherson CK. Study of symptoms in middle life with special reference to the menopause. Br Med J, 19: 181-3(1980).

Herrington DM, Reboussin DM, Brosnihan KB, Sharp PC,, Shumaker SS, Snyder ТЕ, et al. Effects of estrogen replacement on the progression of coronary artery atherosclerosis. N Engl J Med, 343: 522-529(2000).

Lien LL, Lien EJ. Hormone therapy and phytoestrogen. J Clin Pharm Ther, 21: 101-11(1996).

Brzezinski A, Alercreutz H, Shaoul R. Short term effects of phytoestrogen-rich diet on postmenopausal women. Menopause, 4: 89-94(1997).

Elfituri A, Sherif F, Elmahaishi M, Chrystyn H. Two hormone replacement therapy (HRT) regimens for middle-eastern postmenopausal women. Maturitas., In press, 2005.

Edgar D, Staren O, Shuab O. Hormone replacement therapy in postmenopausal women. The American Journal of Surgery, 188:136-49(2004).