способ получения комплекса иммуноглобулинов igg, igm и iga для внутривенного введения

Формула изобретения

1. Способ получения комплекса иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA для внутривенного введения, характеризующийся растворением спиртовой фракции III Кона плазмы, содержащей иммуноглобулины в буферном растворе, доведением концентрации белка до 0,5-5%, установлением pH раствора 4,9-5,1, добавлением 1,0 М соляной кислоты при температуре 0-20°C, ультрафильтрацией, диафильтрацией, диализом или комбинацией этих методов, стерилизующей фильтрацией, при этом очистку от белковых примесей, включая липопротеиды, из фракций плазмы, осуществляют каприлатом натрия, удаление изоагглютининов проводят аффинной хроматографией с использованием 0,1 М ацетатного буферного раствора при pH 5,2-6,5, затем препарат прогревают для снижения антикомплементарной активности не выше 29°C в течение 18-48 ч и выстаивают не менее 1 месяца при комнатной температуре.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление белковых примесей проводят 2,0-3,0% каприлатом натрия, сформировавшийся осадок примесей удаляют центрифугированием.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для удаления изоагглютининов используют аффинную хроматографию на колонках с аффинными сорбентами A _TRI и B_TRI.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к производству медицинских иммунобиологических препаратов из плазмы крови человека, и может быть использовано при получении комплексного препарата IgG, IgM и IgA, а также других иммуноглобулиновых препаратов.

Наиболее высокие требования к очистке, структуре и функциям имеет внутривенный иммуноглобулин. Комплекс иммуноглобулинов GAM имеет более широкий набор антител против бактерий и бактериальных токсинов, чем препараты IgG. Присутствие в препаратах IgM-антител повышает активацию комплемента, фагоцитоз и агглютинацию бактерий. Преимущество внутривенного введения, перед другими способами введения состоит в том, что внутривенно можно вводить препарат в 10-20 раз больших количествах и почти 100% антител становятся биодоступными сразу же после их введения, что значительно увеличивает скорость нейтрализации (разрушения) бактерий и вирусов. Наиболее наглядно это показано в клинических экспериментах по нейтрализации Rh₀D-положительных эритроцитов специфическими иммуноглобулинами. Rh₀D-положительные эритроциты вводили добровольцам, отрицательным по Rh₀D антигену. При внутривенном введении антирезусного (анти-D)-иммуноглобулина, 99% Rh₀D-положительных эритроцитов расщеплялись за 12 часов, в то время как после внутримышечного введения подобный эффект достигался только через 144 часа, то есть при внутривенном способе введения скорость элиминации эритроцитов оказалась в 12 раз выше, чем при внутримышечном (данные на сайте ZLB Bioplasma AG).

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата IgG для внутривенного введения из фракции II Кона, защищенный патентом RU 2192279, кл. А61К 39/395, опубликован 10.11.2002.

Способ осуществляют следующим образом. В качестве сырья используют спиртовую фракцию Кона II (IgG). Готовят раствор с концентрацией белка 0,5-20,0%, pH 6,5-7,8. Приготовленный раствор выстаивают от 8 часов до 1 месяца. Образовавшийся осадок липопротеидов и нестабильных белков удаляют центрифугированием или фильтрацией. Это повышает стабильность раствора. Далее в раствор добавляют суспензию гидроокиси алюминия из расчета 10-40 мл суспензии на 1 л раствора, инкубируют 3-5 часов при комнатной температуре, затем центрифугируют и фильтруют. Применение гидроокиси алюминия позволяет удалить бактериальные и вирусные пирогены. Затем раствор иммуноглобулина разбавляют водой и проводят ультрафильтрацию с одновременным снижением pH до 4,4-4,8 и концентрированием белка до 5,5-6,0%, после чего препарат подвергают стерилизующей фильтрации и прогреву для снижения антикомплементарной активности при температуре 30-37°C в течение от 18 часов до 2 суток, добавляют мальтозу в качестве стабилизатора и разливают во флаконы.

Недостатком этого препарата является отсутствие или низкое содержание антибактериальных антител.

Аналогов и прототипа получения комплекса иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA в литературе не выявлено.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - создание способа получения препарата, содержащего не только высокую концентрацию противовирусных, но и антибактериальных антител, ареактогенного при внутривенном введении.

Способ получения комплекса иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA для внутривенного введения характеризуется растворением спиртовой фракции плазмы, содержащей иммуноглобулины в буферном растворе, доведением концентрации белка до 0,5-5%, установлением pH раствора 4,9-5,1 добавлением 1,0 М соляной кислоты при температуре 0-20°C, ультрафильтрацией, диафильтрацией, диализом или комбинацией этих методов, стерилизующей фильтрацией, при этом очистку от белковых примесей, включая липопротеиды, из фракций плазмы, осуществляют каприлатом натрия, удаление изоагглютининов проводят аффинной хроматографией, затем препарат прогревают для снижения антикомплементарной активности и выстаивают не менее 1 месяца при комнатной температуре.

Удаление белковых примесей проводят 2,0-3,0% каприлатом натрия, сформировавшийся осадок примесей удаляют центрифугированием.

Для удаления изоагглютининов используют аффинную хроматографию на колонках аффинными сорбентами A_TRI и В_TRI.

Препарат прогревают для снижения антикомплементарной активности при температуре не выше 30°C.

Способ осуществляют следующим образом.

Спиртовую фракции III Кона растворяют с использованием 0,05 М ацетатного буферного раствора с pH 4,0-4,3, при соотношении осадка и буфера 1:10 до концентрации белка 0,5-5,0%. К полученному раствору добавляют натрия хлорид до 0,05 М. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение концентрации белка увеличивает объем экстрагирующего раствора, а увеличение концентрации белка уменьшает растворимость и выход целевого продукта. Доведение буфера до 0,1 М повышает экстрагирование иммуноглобулинов IgM и IgA из раствора. Дальнейшее повышение ионной силы технологически нецелесообразно. Добавление 2,0-3,0% каприлата натрия проводят при 18-20°C и устанавливают pH 4,9-5,1 добавлением 1,0 М соляной кислоты. После проведения осаждения полученный осадок балластных белков отделяют центрифугированием. Осадок не используют. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение концентрации каприлата натрия приводит к неполному удалению белковых примесей, а ее увеличение является технологически нецелесообразным. Затем центрифугат очищается от эндотоксинов (пирогенов) добавлением в него 15-30 мл на 1 л раствора геля гидроокиси алюминия при последующем перемешивании в течение 2-3 часов. Комплекс гель-эндотоксин удаляют центрифугированием с последующей осветляющей фильтрацией. Указанное количество геля гидроокиси алюминия является оптимальным, поскольку уменьшение количества геля приводит к неполной очистке, а использование более 30 мл на 1 л раствора ведет к потере целевого продукта. Затем из фильтрата удаляют изоагглютинины, пропуская раствор через колонки с аффинными сорбентами A_TRI и B_TRI, в 0,1 М ацетатном буферном растворе при pH 5,2-6,5. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение pH буфера приводит к снижению взаимодействия изоагглютининов с аффинным сорбентом, а его увеличение приводит к сильной опалесценции раствора, выпадению осадка. Очистку центрифугата от солей, проводят путем диафильтрации, концентрируют препарат ультрафильтрацией. Преимущество этой технологии заключается в том, что из производства исключаются две стадии - получения осадка иммуноглобулинов осаждением с помощью этанола и стадия разведения препарата. Концентрат подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Затем препарат прогревают при температуре не выше 29°C в течение 18-48 часов для снижения антикомплементарной активности. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку повышение температуры выше 30°C приводит к денатурации высокомолекулярных белков, в частности IgM, раствор становится опалесцирующим, мутным. По окончании прогрева корректируют белок в растворе до 5-6%, pH до 4.3-4,8 и добавляют глицин до содержания его в препарате до 0,3 М, натрия хлорид до 0,003 М. Препарат подвергают стерилизующей фильтрации, выстаивают в течение 1 месяца при комнатной температуре и разливают в бутылки.

Сущность изобретения состоит в глубокой очистке иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA из спиртовой фракции Кона III от липопротеидов, эндотоксинов, изоагглютининов, низкомолекулярных примесей. Их экстрагируют из фракции III плазмы крови человека 0,05 М ацетатным буферным раствором при pH 4,0-4,3, содержащем 0,05 М натрия хлорида, при соотношении фракции иммуноглобулинов и буферного раствора 1:10. Очистку от белковых и липидных примесей проводят каприлатом натрия в концентрации от 2,0 до 3,0%, температуре 18-20°С, pH 4,9-5,1. Раствор центрифугируют и проводят очистку препарата от эндотоксинов (пирогенов) с помощью геля гидроокиси алюминия из расчета 15-30 мл на 1 литр раствора, перемешивают в течение 2-4 часов. Раствор центрифугируют. Надосадочную жидкость, содержащую целевой продукт подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Затем из фильтрата удаляют изоагглютинины, пропуская препарат в 0,1 М ацетатном буферном растворе с pH 5,2 через колонки с аффинными сорбентами A_TRI и B_TRI изоаглютининов. Очистку препарата от солей проводят методом ультрафильтрации, включающим стадии диафильтрации и концентрирования до содержания белка 6,0-7,5% при одновременной корректировке pH раствора до 4,2-4,6. Целевой продукт подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Затем препарат прогревают при 30°C в течение 18-48 часов для снижения антикомплементарной активности, проводят коррекцию белка в растворе до 5-6%, pH до 4.3-4,8, добавляют глицин до содержания его в препарате 0,3 М. Препарат выстаивают в течение 1 месяца при комнатной температуре и разливают в бутылки.

Пример 1. 1 кг спиртовой фракции III Кона растворяют в 10 литрах ацетатного буферного раствора с pH 4,0-4,3. К полученному раствору добавляют натрия хлорид до 0,05 М, затем до 2,0% каприлат натрия и устанавливают pH 4,9-5,1 добавлением 1,0 М соляной кислоты. Осаждение проводят при 18-20°C. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин на центрифуге с проточно-зональным ротором ОТР-101. Осадок не используют. В центрифугат добавляют 15 мл на 1 л раствора геля гидроокиси алюминия, перемешивая в течение 2 часов. Комплекс гель-эндотоксин (пироген) удаляют центрифугированием с последующей осветляющей фильтрацией. Затем из фильтрата удаляют изоагглютинины, пропуская его в 0,1 М ацетатном буферном растворе с pH 5,2 через колонки с аффинными сорбентами A_TRI и B_TRI. Очистку центрифугата от солей проводят путем диафильтрации, концентрируют препарат ультрафильтрацией. Концентрат подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Затем препарат прогревают при 29°С в течение 18 часов для снижения антикомплементарной активности. По окончании прогрева корректируют уровень белка в растворе до 5-6%, pH до 4.3-4,8 и добавляют глицин до содержания его в препарате до 0,3 М. Затем препарат подвергают стерилизующей фильтрации и выстаивают в течение 1 месяца при комнатной температуре и разливают в бутылки.

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но осаждение проводят 3,0% каприлатом натрия, удаление эндотоксинов осуществляют добавлением в него 30 мл на 1 л раствора геля гидроокиси алюминия, перемешивая смесь в течение 4 часов. Изоагглютинины удаляют, пропуская раствор в 0,1 М ацетатном буферном растворе с pH 6,5 через колонки с аффинными сорбентами A_TRI и B_TRI. Препарат прогревают при 29°C в течение 48 часов для снижения антикомплементарной активности.

Эффективность препаратов иммуноглобулинов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний зависит от их иммунологической активности. Одним из основных показателей качества выпускаемых препаратов является наличие в препаратах разнообразных антител. В таблице 1 представлены результаты определения 7 видов антител: двух антибактериальных - к сальмонеллам и шигеллам и 5 антивирусных - к парагриппу, гриппу В, респираторному синцитиальному вирусу, гриппу А, аденовирусам в прототипе и в 2 вариантах технологии в аналоге, в котором активным началом является иммуноглобулин G, Отсутствуют антибактериальные антитела, уровни антивирусных антител к парагриппу, гриппу В, респираторному синцитиальному вирусу ниже, чем в иммуноглобулине IgG, IgM и IgA для внутривенного введения, в то время как антитела к гриппу А, аденовирусам в прототипе выше. Оценивая содержание антител в исследуемых препаратах иммуноглобулинов, следует заключить, что иммуноглобулин IgG, IgM и IgA для внутривенного введения содержит в своем составе больше активной субстанции.

В таблице 2 представлены данные контроля прототипа и 2-х вариантов технологии 1 и 2 состава комплекса иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA с крайними параметрами очистки. Изучение препаратов методом электрофореза на ацетате целлюлозы показало хорошую очистку иммуноглобулинов, включая аналог. Среднее количество иммуноглобулинов, содержащегося в препарате аналога составило 97%, для иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA - 98,5-99,0%. Исследованием с моноспецифическими сыворотками установлено наличие в аналоге только одного класса иммуноглобулина G, для двух вариантов технологии комплекса иммуноглобулинов три класса - IgG, IgM и IgA. 50,0-50,% IgG, 24,4-24,8% IgA, 25,1-25,2% IgM. Данные свидетельствуют о значительном обогащении полученного препарата по сравнению с аналогом иммуноглобулинами класса А и М.

Проверка реактогенности и безопасности препаратов (пирогенности, уровня изоагглютининов и антикомплементарной активности) в соответствии с принятыми критериями свидетельствовало, что они соответствовали стандарту-прототипу и имели более низкое содержание примесей изоагглютининов, антикомплементарной активности. Лекарственные формы препаратов при проверке на животных были апирогенны.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препарат, содержащий не только высокую концентрацию противовирусных, но и антибактериальных антител, ареактогенный при внутривенном введении.

Таблица 1
Спектр противовирусных и антибактериальных антител в аналоге и в комплексе иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA для внутривенного введения
Антитела	Метод исследования	Аналог Иммуноглобулин G для внутривенного введения	Предлагаемый комплекс иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA для внутривенного введения
		Титры антител
Антитела к сальмонеллам	Реакция пассивной гемагглютинации	отсутствуют	1:320
Антитела к шигеллам	Реакция пассивной гемагглютинации	отсутствуют	1:320
Антитела к парагриппу	Иммуноферментный анализ	1:3200	1:5600
Антитела к гриппу В	Иммуноферментный анализ	1:2400	1:2720
Антитела к респираторному синцитиальному вирусу	Иммуноферментный анализ	1:2400	1:3680
Антитела к гриппу А	Иммуноферментный анализ	1:6400	1:5600
Антитела к аденовирусам	Иммуноферментный анализ	1:3200	1:2400

Таблица 2
Состав препарата иммуноглобулинов (аналога) и комплекса иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA для внутривенного введения по стадиям обработки
Технологическая стадия	Контролируемый параметр	Результаты контроля
		Аналог	пример 1	пример 2
Конечный продукт	Общее содержание иммуноглобулинов	97,3	98,5	99,0
	Содержание классов иммуноглобулинов: IgG	99,3	50,5	50,0
	IgA		24,4	24,8
	IgM		25,1	25,2
Очистка от пирогенов (эндотоксинов) гидроокисью алюминия	Пирогенность. Суммарное повышение температуры у 3 кроликов не должно превышать 1,2°С в дозе 500 мг/кг масса тела кролика	1,2	1,1	1,0
Очистка аффинной хроматографией от изоагглютининов	анти-А,	1:32	1:16	1:4
	анти-В гемагглютинины	1:32	1:8	1:8
Снижение антикомплементарной активности	Антикомплементарная активность 1 мг иммуноглобулина не должен потреблять более 1 ед. (СН50) комплемента	0,71	0,53	0,33