наноантитело, специфически связывающее белок сеа, способ его использования для детекции этого белка

Формула изобретения

1. Наноантитело, специфически связывающее белок СЕА человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

2. Способ детекции белка СЕА в биологических жидкостях человека, включающий приведение в контакт указанной биологической жидкости с наноантителом по п.1 и детектирование связывания наноантитела по п.1 с белком СЕА.

2. Способ по п.2, отличающийся тем, что детекцию белка СЕА с помощью наноантитела осуществляют как в свободном виде в биологических жидкостях, так и на поверхности клеток различных типов, например опухолевых, где этот белок оверэкспрессирован.

Описание изобретения к патенту

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины.

Предшествующий уровень техники

Карциноэмбриональный антиген, (КЭА в русскоязычных публикациях) или Carcinoembryonic antigen (СЕА в англоязычных публикациях), представляет собой гликопротеин с молекулярным весом около 180-200 кДа, вырабатываемый желудочно-кишечным трактом и поджелудочной железой эмбриона и выделяемый в систему циркуляции. У взрослых СЕА определяется при опухолях в плевральной жидкости, в выпоте при асците, секретах желудочно-кишечного тракта и моче. СЕА является наиболее широко используемым маркером рака желудочно-кишечного тракта. Хотя СЕА, прежде всего, ассоциируется с раком прямой кишки, его повышенный уровень может вызываться также злокачественными опухолями груди, легких, желудка, яичника и ряда других органов. Было показано, что в сыворотке крови пациентов с самыми различными типами карцином часто выявляются повышенные (по сравнению с сыворотками здоровых индивидуумов) уровни СЕА (выше 2,5 нг/мл). Повышение концентрации СЕА могут вызывать и некоторые доброкачественные процессы, такие как воспаление легких, цирроз печени или доброкачественные новообразования. В группах заядлых курильщиков уровень СЕА в сыворотке превышает нормальные значения для здоровых людей. Количественное определение СЕА используется при массовых обследованиях с целью ранней диагностики опухолей. В клинической практике исследования уровня СЕА применяются главным образом для диагностики рецидивов рака прямой и толстой кишки после хирургического вмешательства, а также для мониторинга пациентов с диагностированными злокачественными новообразованиями, имеющих повышенный уровень СЕА.

Белок СЕА был впервые идентифицирован еще в 1965 году в экстрактах ткани рака толстой кишки человека (Gold and Freedman, 1965. The Journal of experimental medicine, 121: 439-462). С этого времени, и особенно в последние годы, достигнут существенный прогресс в исследовании этого и ему подобных белков. Сегодня СЕА-подобные белки, как известно, вовлеченные в процессы клеточной адгезии (в связывании клетки с внеклеточным матриксом и другими клетками), объединяют в семейство СЕАСАМ (CEA-related cell adhesion molecules) и в суперсемейство иммуноглобулиновых молекул клеточной адгезии (IgCAM). У человека белки этого семейства кодируются 29 генами. Эти гены кодируют белки, называемые как СЕАСАМ1, СЕАСАМ3 - СЕАСАМ8, СЕАСАМ 16, СЕАСАМ 18 - СЕАСАМ21 и PSG1-PSG11 (11 гликопротеинов, экспрессия которых связана с беременностью). Все белки этого семейства принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов (Ig) и состоят из одного вариабельного (подобного вариабельному домену Ig) и варьирующего числа константных (подобных константным доменам Ig) доменов. СЕАСАМ-молекулы обычно связаны с клеточной мембраной трансмембранным доменом или заякорены с участием гликозил фосфатидилинозитольной модификации. Функция белков СЕАСАМ-семейства широко варьирует: они функционируют как молекулы адгезии, опухолевые супрессоры, регуляторы активности дендритных клеток и лимфоцитов, рецепторы бактерий. Собственно упомянутый выше белок СЕА соответствует в новой номенклатуре белку СЕАСАМ5. Исследование уровня экспрессии именно этого белка как ракового маркера в опухолях эпителиального происхождения и сегодня остается одним из широко распространенных диагностических тестов. (Horst А.К., Wagener С.CEA-related CAMs. / СЕА-подобные молекулы клеточной адгезии. (2004) In: Behrens J, Nelson WJ, editors. Cell Adhesion. Nelson Lab. pp.283-341. Kuespert K., Pils S., Hauck C.R. CEACAMs: their role in physiology and pathophysiology. / СЕАСАМ-белки: их роль в физиологии и патофизиологии. Curr. Opin. In Cell Biol. 2006, 18, 565-571).

Белок CEA/CEACAM5 является продуктом гена СЕАСАМ5 и состоит из 7 экстраклеточных доменов: 34-аминокислотной последовательности лидерного пептида, за которой следует 108-аминокислотный N-концевой участок, подобный вариабельному домену Ig, затем идут три двухдоменных 178-аминокислотных участка, подобных константному С2-домену Ig и названных соответственно А1 и В1, А2 и В2, A3 и В3. На С-конце этого белка находится 27-аминокислотный участок, включающий гликофосфатидил-инозитоловый конец, который полупроницает клеточную мембрану и обеспечивает связывание белка на поверхности клетки (Berinstein, 2002, J.Clin.Oncol., v.20, 2197-2207).

В последние годы все большее внимание при создании новых диагностических и терапевтических препаратов для выявления и лечения многих болезней уделяется препаратам на основе антител, как правило, моноклональных классических антител. Антитело способно специфически связывать определенный антиген/белок, как свободный или находящийся в комплексе с другими молекулами, так и белок, оверэкспрессированный и локализующийся на поверхности клетки определенного типа. Такое связывание может блокировать важный биологический процесс, каскад, а также стимулировать иммунную систему пациента атаковать клетки, с которыми связалось антитело. Антитело может быть также средством специфической доставки других терапевтических молекул, субстанций или радиоизотопов. Наконец, возможно использование ди- и полифункциональных и многокомпонентных конструкций на основе получаемых антител или их производных. Ранее неоднократно уже проводились работы с целью получить антитела, специфически связывающиеся с белком СЕА. В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести следующий пример.

Заявка WO2011023787 (Affinity-maturated humanized anti СЕА monoclonal antibodies - Прошедшие процесс аффинного дозревания гуманизированные анти-СЕА моноклональные антитела, дата публикации - 03.03.2011). В данном патенте описывается получение моноклональных гуманизированных антител, прошедших процесс аффинного дозревания in vitro с помощью введения новых мутаций в гипервариабельных участки и последующего отбора наиболее высокоаффинных вариантов антител с помощью метода фагового дисплея. Антитела были получены к эпитопу СЕА-специфического домена В3, который характерен именно для белка СЕА, связанного с поверхностью клетки. Полученные антитела могут быть использованы как для детекции мембраносвязанного СЕА, так и для терапевтического воздействия на опухолевые клетки, на поверхности которых оверэкспрессирован СЕА.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.

Недостатками прототипа являются:

- Относительно дорогостоящее производство антител, сложность поддержания и хранения продуцента, очень высокие требования к качеству используемых реактивов и условий культивирования.

- Относительно большой размер получаемых антител, что влечет за собой пониженную проницаемость тканей.

- Структурные особенности накладывают ограничение на узнавание некоторых «скрытых» эпитопов, находящихся, например, в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.

- Ограниченность и относительная трудоемкость генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, сложность создания многовалентных и многофункциональных производных заявленных антител.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых антител - антиген-узнающих молекул, лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих белок СЕА.

Задачей настоящего изобретения является создание новых антител, способных эффективно связывать белок СЕА, получение этих антител, производство и хранение которых должно быть экономичным. Новые антитела должны быть эффективны и относительно просты; их размер должен быть в несколько раз меньше, чем у классических антител.

Техническая задача решается за счет того, что получено наноантитело, специфически связывающее белок СЕА человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. При этом способ детекции белка СЕА в биологических жидкостях человека включает приведение в контакт указанной биологической жидкости с наноантителом по п.1 и детектирование связывания наноантитела по п.1 с белком CEA. Причем детекцию белка CEA с помощью наноантитела осуществляют как в свободном виде в биологических жидкостях, так и на поверхности клеток различных типов, например опухолевых, где этот белок оверэкспрессирован.

В основе настоящего изобретения находятся не классические бивалентные антитела, которые рассматриваются в качестве прототипа, а малые однодоменные наноантитела, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими моноклональными антителами для практического применения в области терапии заболеваний. Поскольку наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных классических антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Наноантитела могут обладать новыми структурными особенностями, в принципе позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы. Существуют эффективные способы получения и селекции таких антител в отношении различных, в том числе низкоиммуногенных антигенов.

Полным эквивалентом термина «однодоменные наноантитела» для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX, а также «однодоменное мини-антитело».

Рекомбинантные однодоменные наноантитела получают на основе особых неканонических одноцепочечных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства Верблюдовых и у некоторых видов хрящевых рыб. Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной без первого константного района СН1 тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «наноантитело», «nanobody» или однодоменное наноантитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса IgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка, определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions». В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (-листов), один - из четырех аминокислотных цепочек, и второй - из пяти (Padlan Е.А. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C, Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. - Узнавание антигенов фрагментами однодоменных антител: избыточная роскошь спаренных доменов. TIBS 2001; 26: 230-235). В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны V-домена, где они участвуют в узнавании антигена и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже в CDR2 и CDR3). При исследовании кристаллических структур VHH было показано, что эти цистеиновые остатки формируют дисульфидные связи, что приводит к дополнительной стабилизации структуры петель данного антигена. Наиболее явным и воспроизводимым отличительным признаком VHH являются четыре замены гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные во втором каркасном участке (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, согласно нумерации Кабат). Этот каркасный участок в случае VH домена является высококонсервативным, обогащен гидрофобными аминокислотными остатками и особо важен для образования связи с вариабельным доменом VL легкой цепи. VHH-домен в этом плане сильно отличается: указанные замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные делают невозможной ассоциацию VHH и VL. Эти замены также объясняют высокую растворимость VHH, наноантитела, когда его получают в виде рекомбинантного белка (Тиллиб СВ. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85).

По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи наноантитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.

Характерными особенностями однодоменных наноантител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии, являются следующие (см. обзор: Тиллиб СВ. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85).

- Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител.

- Малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа (улучшенная проницаемость клеток).

- Структурные особенности (способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.

- Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры). Продемонстрирована возможность их эффективной наработки в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.

- Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

Низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.

Возможность получения рекомбинантных однодоменных наноантител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства Camelidae функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина (без легких цепей), специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом (Hamers-Casterman С, Atarhouch Т, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. - Существующие в природе антитела без легких цепей. Nature 1993; 363:446-448). Техническая реализация отбора однодоменных наноантител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага «фаговый дисплей».

Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для функционального отбора из больших рекомбинантных библиотек последовательностей ДНК, кодирующих пептиды и белки, обладающие заданными свойствами и экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов (Brissette R & Goldstein N1. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. - Использование пептидных фагово-дисплейных библиотек для фундаментальных исследований и исследований трансляции. Methods Mol Biol. 2007; 383:203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces. - Фаговый дисплей для конструирования и анализа взаимодействий белковых доменов. Curr Opin Struct Biol. 2007; 17:481-7). Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов (Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries. - Селекция и анализ библиотек рекомбинантных антител. Nat Biotechnol. 2005; 23:1105-16). Обычно, вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, в случае правильного сочетания доменов, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменениями. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной

последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к агрегации. Упомянутые проблемы возможно избежать при использовании однодоменных наноантител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.

Однодоменные наноантитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцией антигенов (как в исследовательских, так и в диагностических целях), блокированием активности белка-антигена, специфической доставкой за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом.

Также однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов.

Было показано (Vincke С, Loris R., Saerens D., et al. // J. Biol. Chem. 2009.V. 284. № 5. P. 3273-3284), что можно «гуманизировать» такие верблюжьи наноантитела без заметной потери их специфической активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования наноантител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний (Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. -Однодоменные антитела: многообещающие экспериментальные и терапевтические инструменты в области инфекции и иммунитета. Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.).

Раскрытие настоящего изобретения

Способ получения наноантител, связывающих антигенные эпитопы белка СЕА, включает следующие принципиальные этапы:

1) индукция образования специфических антител в результате иммунизации представителя семейства Верблюдовых (в частности, двугорбого верблюда) аффинноочищенным белком СЕА человека;

2) клонирование последовательностей антиген-узнающих доменов (наноантител) особых одноцепочечных антител, синтезирующихся в лимфоцитах иммунизированного животного, в фагмидном векторе (использующемся в последующей процедуре фагового дисплея), получение специфически обогащенной библиотеки последовательностей, кодирующих наноантитела;

3) селекция методом фагового дисплея (функционального отбора фаговых частиц, несущих на поверхности экспрессируемое наноантитело, а внутри - ДНК, кодирующую это наноантитело) клонов наноантител, связывающихся с заданным антигеном, белком СЕА, из полученной библиотеки наноантител;

4) проведение переклонирования и генно-инженерных модификаций кодирующих последовательностей отобранных наноантител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества используются бактерии E.coli).

В качестве антигена для иммунизации и селекции использовали аффинноочищенный белок СЕА человека.

Способ получения однодоменных наноантител описан в примерах 1 и 2.

Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и рН). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. В силу меньшего размера наноантитела характеризуются лучшей способностью проникать в ткани. Наконец, наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.

Несмотря на то что главным образом в иллюстративных целях авторами настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.

Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:

1) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающийся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры).

2) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

3) Высокая экономическая рентабельность производства. Автор настоящего изобретения исходит из того, что, как

известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности однодоменных наноантител могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования.

Так, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата однодоменного наноантитела, например увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами однодоменных наноантител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином "однодоменные наноантитела" как первичные, исходно получаемые, "минимальные" аминокислотные последовательности однодоменных наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптации или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности исходного однодоменного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15 и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного однодоменного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к аминокислотной последовательности исходного однодоменного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поскольку гипервариабельные районы наноантител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, то именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности наноантител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности наноантител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках (указанных в перечне последовательностей как CDR1, CDR2 и CDR3, определяющих комплементарность антител участков) на другие, но очень близкие по свойствам аминокислоты (консервативных замен).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное однодоменное наноантитело, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид исходного однодоменного наноантитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, и установления активности экспрессируемого продукта.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.

Полипептиды однодоменных наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, и подпадающих под объем настоящего изобретения.

Получение функционально-активных наноантител аСЕА-1, специфически связывающих белок СЕА, описано в примерах 1 и 2.

Возможность использования полученных наноантител аСЕА-1 для детекции белка СЕА как в свободном состоянии, так и в том случае, когда он связан с поверхностью клетки, в которой он экспрессируется в повышенном количестве, в биологических жидкостях человека показано в примерах 3, 4.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая полученное однодоменное наноантитело аСЕА-1 (SEQ ID NO: 1). Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO: 2). В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфического узнавания наноантителом аСЕА-1 белка СЕА. Стрелками указаны позиции аминокислотных остатков, являющихся характеристическими для вариабельных доменов особых одноцепочечных антител (отличающихся от остатков в вариабельных доменах тяжелых цепей классических антител). В CDR1 и CDR3 участках аСЕА-1 выявляются остатки цистеина, часто встречающиеся именно в наноантителах и стабилизирующие наноантитело, образуя дополнительную С-С связь между первым и третьим гипервариабельными участками.

На фиг.2 представлена электорофореграмма полиакриламидного геля с наработанным с помощью отобранной клонированной кодирующей последовательности и затем очищенным наноантителом аСЕА-1. Справа - дорожка (М) с маркерными белками известного размера (в кДа).

На фиг.3 представлены результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранным однодоменным наноантителом аСЕА-1 иммобилизованный в лунках иммунологической плашки аффинноочищенный белок СЕА человека. В качестве контроля использовали лунки ( № 1) с иммобилизованным белком бычьим сывороточным альбумином. Интенсивность сигнала отражает эффективность связывания наноантитела аСЕА-1.

На фиг.4 представлены результаты иммуноферментного анализа (ИФА) детекции белка СЕА, экспрессированного на поверхности клеток линий А549 и Lim1215 (или контрольных СЕА-негативных клеток линии НЕК293), с помощью отобранного наноантитела аСЕА-1 (в концентрации 100 нг/мл). Сверху показаны ячейки с соответствующими тремя типами иммобилизованных клеток после проведения ИФА. Величина оптической плотности при длине волны 405 нм, указанная на графике, отражает эффективность связывания наноантитела.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1

Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антител

Иммунизация

Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (в при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фрейнда. В качестве антигена использовали белок СЕА человека, очищенный с помощью иммуноаффинной хроматографии из крови больного с диагнозом метастатической печеночной карциномы. Этот белок (кат.номер R224) был куплен у компании «Хема Медика» (Россия). Брали примерно 0,26 мг белка для каждого этапа проведения инъекций. Вторую инъекцию (стадию иммунизации) проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще три иммунизации. Взятие крови (150 мл) проводили через 5 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (100 ед./мл) и ЭДТА (3 мМ).

Кровь разводили в 2 раза раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800хд. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.

Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем на колонке с олиго(аТ)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.

Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу (Sambrook et al., 1989) с использованием обратной транскриптазы H^- M-MuLV и праймера олиго(dТ)₁₅ в качестве затравки.

Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам Ncol(Pstl) и Not! в фагмидный вектор, как описано ранее (Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006). Процедуру селекции проводили также аналогично тем, что в указанных работах. Она базировалась на методе фагового дисплея, в которой в качестве фага-помощника использовали бактериофаг М13К07 (New England Biolabs, США).

Пример 2

Селекция однодоменных наноантител, специфически узнающих СЕА.

Селекцию однодоменных наноантител проводили методом фагового дисплея с использованием того же, что и для иммунизации, препарата белка СЕА человека, который иммобилизовали на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген однодоменного наноантитела внутри, а экспрессирующееся однодоменное наноантитело - в составе поверхностного фагового белка pIII) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили, как описано в публикациях (Тиллиб СВ., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman С, Atarhouch Т., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448; Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889).

Последовательности клонов отобранных наноантител группировали согласно схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей однодоменных наноантител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (Hinfl, Mspl, Rsal). Последовательность кДНК однодоменного наноантитела aMTS1 (SEQ ID NO: 1) была определена (см. фиг.1). Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO: 2). В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими, для специфического узнавания наноантителом аСЕА-1 белка СЕА. Стрелками указаны позиции аминокислотных остатков, являющихся характеристическими для вариабельных доменов особых одноцепочечных антител (отличающихся от остатков в вариабельных доменах тяжелых цепей классических антител). В CDR1 и CDR3 участках аСЕА-1 выявляются остатки цистеина, часто встречающиеся именно в наноантителах и, по-видимому, стабилизирующие наоантитело, образуя дополнительную С-С связь между первым и третьим гипервариабельными участками.

Продукция наноантител

Последовательности кДНК отобранных наноантител переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор - модифицированный вектор pHEN6 (Conrath КЕ, Lauwereys М, Galleni M, Matagne A, Frere JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. - Бэта-лактомазные ингибиторы, происходящие из фрагментов однодоменных антител, индуцированных у Верблюдовых. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45:2807-12), позволяющий присоединение к С-концу однодоменного нано-антитела (His)₆-эпитола (сразу вслед за НА-эпитопом). Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (peIB) нарабатываемый рекомбинантный белок (однодоменное нано-антитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию однодоменных наноантител проводили в Е. coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Однодоменное наноантитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).

На фиг.2 представлена электорофореграмма полиакриламидного геля с наработанным (с помощью отобранной клонированной кодирующей последовательности) и затем очищенным наноантителом аСЕА-1.

Пример 3

Детекция белка СЕА человека с помощью отобранного наноантитела аСЕА-1.

Способность наноантитела аСЕА-1 связываться с иммобилизованным в лунках иммунологической плашки белком СЕА человека проверяли с использованием стандартного протокола метода иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур или бычьим сывороточным альбумином (неспецифические белки).

В качестве вторичных антител к НА-тагу (присутствующему на С-конце проверяемого наноантитела аСЕА-1) использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США). Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат).

Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованным неспецифическим белком, белком овальбумином кур или бычьим сывороточным альбумином) не содержали антиген и далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном).

На фиг.3 представлен результат иммуноферментного анализа, из которого следует, что наноантитело аСЕА-1 (в концентрации 100 нг/мл - в лунке № 2 и 10 нг/мл - в лунке № 3) специфически связывается с иммобилизованным в лунках 2 и 3 белком СЕА человека. В качестве контроля использовали лунки ( № 1) с иммобилизованным белком бычьим сывороточным альбумином. Интенсивность сигнала (величина поглощения при длине волны 405 нм) отражает эффективность связывания наноантитела аСЕА-1.

Пример 4

Детекция белка СЕА, экспрессированного на поверхности клеток линий А549 и Lim1215, с помощью отобранного наноантитела аСЕА-1.

Узнавание наноантителами изолированного белка СЕА еще не означает, что узнаваемый эпитоп этого белка будет также доступен, когда этот белок локализуется на поверхности клетки. Для проверки возможности использования полученного наноантитела аСЕА-1 для детекции СЕА, оверэкспрессированного на поверхности опухолевой клетки, был проведен иммуноферментный анализ на культуре клеток линий А549 (клетки карциномы легких) и Lim1215 (клетки рака толстой кишки). В качестве негативного контроля использовали клетки линии НЕК293 (происходящей из клеток эмбриональной почки человека), в которых согласно литературным данным белок СЕА не детектируется. Клетки были получены из банка культур НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН, Москва.

Клетки растили в лунках 96-луночного планшета до достижения 80% конфлуэнтности, затем 3 раза промывали раствором стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS) и фиксировали в 3,7% растворе забуференного формальдегида в течение 10 минут, фиксацию останавливали, добавляя раствор глицина до концентрации 125 мМ, фиксированные клетки промывали 3 раза раствором PBS. Фиксированные клетки блокировали в растворе 1% БСА, 1×PBS в течение 2 часов, после чего споласкивали 1×PBS и добавляли раствор (1×PBS, 0,1% БСА) с наноантителом аСЕА-1 в концентрации 100 нг/мл.

В качестве вторичных антител к НА-тагу (присутствующему на С-конце проверяемого наноантитела аСЕА-1) использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США). Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат).

Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованными клетками линии НЕК293) были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками.

На фиг.4 представлены результаты описанного иммуноферментного анализа узнавания наноантителом аСЕА-1 иммобилизованных в лунках иммунологической плашки клеток линий А549 и Lim1215, содержащих на поверхности оверэкспрессированный белок СЕА, при отсутствии такого узнавания в лунках с контрольными СЕА-негативными клетками линии НЕК293. Видно, что, подобно детекции изолированного белка СЕА, наноантитело аСЕА-1 и в этом случае эффективно работает в концентрации 100 нг/мл. Специфическое узнавание клеток А549 и Lim1215 связано с повышенной экспрессией в этих клетках белка СЕА, который располагается на поверхности этих клеток. Напротив, в контрольных клетках НЕК293 белок СЕА практически не экспрессируется, и этому соответствует фоновое значение оптической плотности в соответствующих ячейках.

Таким образом, наноантитело аСЕА-1 способно специфически и эффективно узнавать (детектировать) белок СЕА человека, экспрессированный на поверхности опухолевой клетки.

Приведенные примеры с иллюстрациями доказывают выполнение поставленной данным изобретением задачи. Созданы новые особые наноантитела, способные эффективно связывать белок СЕА. Эти новые особые наноантитела обладают следующими преимуществами по отношению к прототипу (однодоменному антителу, являющемуся производным тяжелой цепи классического иммуноглобулина мыши): их получение, производство и хранение более экономично, эффективно и относительно просто; их получение включает стадию иммунизации и аффинного дозревания in vivo, что обычно способствует более высокой аффинности и существенному повышению эффективности селекции заданных наноантител, они хорошо растворимы, обладают новыми структурными особенностями, позволяющими им потенциально узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы. На базе созданных наноантител появятся новые возможности для более эффективного таргетирования белка СЕА и влияния на связанные с ним биологические процессы и заболевания.

Таким образом, задача, поставленная в данном изобретении, решена.