ингибитор возбудителя бактериального ожога плодовых культур (erwinia amylovora)

Формула изобретения

Применение штамма гриба Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 в качестве продуцента ингибитора возбудителя бактериального ожога плодовых культур.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в агробиотехнологии, микробиологии и растениеводстве.

Известен ингибитор вируса герпеса простого 1-ого типа [Ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа. Патент РФ № 2022012, 1994. Алексеев С.Б., Березов Т.Т., Анджапаридзе О.Г. и другие] и ингибитор вируса иммунодефицита человека [Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2022011, 1994. Алексеев С.Б., Веса B.C., Смирнова И.П. и другие], в качестве которых использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - гомогенный фермент L-лизин-a-оксидаза.

В последние годы резко возрос импорт посадочного материала декоративных и плодовых растений, который является хозяином возбудителя бактериального ожога плодовых культур (Erwinia amylovora). Бактериальный ожог - одно из наиболее опасных заболеваний плодовых культур, имеющее карантинный статус в Российской Федерации. Основными и наиболее восприимчивыми к бактериальному ожогу являются плодовые и декоративные растения из семейства Rosaceae подсемейства Pomoideae. Кизильник - самая восприимчивая к бактериальному ожогу культура, среди плодовых деревьев больше всего страдает от заболевания груша. Кроме того, возбудитель болезни поражает боярышник, айву, хеномелес, яблоню, рябину, иргу, мушмулу, пираканту, странвезию, дикую грушу, розу [Вредные организмы, имеющие карантинное фитосанитарное значение для Российской Федерации: справочник / под ред. С.А. Данкверта, М.И. Маслова, У.Ш. Магомедова, Я.Б. Мордковича. - Воронеж: Научная книга, 2009, С 280 - 286].

Бактериальный ожог плодовых культур вызывает большие потери урожая и гибель деревьев. Вредоносность ожога плодовых весьма велика вследствие очень быстрого его распространения. Экономический ущерб выражается в снижении или полной потере урожая, гибели плодовых деревьев, затратах на выкорчевку погибших и пораженных деревьев и закладку нового сада и др. В сильно зараженных садах возбудитель заболевания может поражать от 20 до 50%, в отдельных случаях до 90% деревьев, часть из которых полностью погибает [Шнейдер Е.Ю. Анализ фитосанитарного риска возбудителя бактериального ожога плодовых Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. для территории Российской Федерации. ФГУ ВНИИКР, 2009, С.5-6, 13-14, 24].

В нашей стране частные и промышленные сады занимают большие площади, а применяемые меры борьбы не препятствуют акклиматизации возбудителя. Согласно Списку пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в настоящее время, в нашей стране не зарегистрировано препаратов для борьбы с возбудителем бактериального ожога плодовых культур [Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. 2010 г. ООО «Спектр-П», Курск. Справочное издание, 804 с.]. Все это говорит о том, что проникновение и акклиматизация возбудителя Е. amylovora приносит огромные убытки плодоводству и декоративному садоводству.

Техническим результатом изобретения является снижение потерь декоративных и плодовых культур, вызванных возбудителем бактериального ожога плодовых культур Е. amylovora.

Технический результат достигается тем, в качестве продуцента ингибитора возбудителя бактериального ожога плодовых культур применяют штамм гриба Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F - 180.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180 в 1987 году (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1. Институт генетики и селекции).

Морфолого-биохимическая характеристика штамма.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный,

распростертый. На 4-е - 5-е сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желто или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12µ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5µ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные.

На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агаре. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует.Аэробный гриб. Температурный оптимум +28-+29°C. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при рН 4-6, однако может расти и при pH от 1,5 до 9.

Trichoderma harziatum Rifai в одинаковой степени усваивает, как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, дает положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai обладает L-лизин- -оксидазной активностью. Активность L-лизин- -оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai рассчитывали по приросту H₂O₂, количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазидиновым микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции H₂O₂ с O-дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг 0-дианизидингидрохлорида и 0,1-0,5 мг белка в 1 мл конечного объема. После 20 минут инкубирования в термостате при температуре +37°C пробы охлаждали до +4°C. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мг белка или 1 мл культуральной жидкости.

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г.Пущине).

Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г.Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и pH.

Для приготовления питательной среды в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение pH 5.8-6,0 устанавливали 10%-ным раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t°+125°C. Затем подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°C, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину pH в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения pH от 5,3 до 7,5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин в течение часа при температуре +2-+4°C. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Активность полученного экстракта из культуры Trichoderma harzianum Rifai составляла 5,4 Ед/мл.

Возбудитель бактериального ожога плодовых культур - бактерия Erwinia amylovora, была выявлена в образцах побегов декоративного растения пираканта (лат.Pyracantha m.roem.) методом полимеразной цепной реакции и подтверждена посевом на питательную среду.

Для постановки опыта по определению ингибирующего действия экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai на бактерию Е. amylovora использовали метод диффузии в агар. В качестве питательной среды использовали сахарозно-пептонный агар.

Сахарозо-пептонный агар, Sucrose Pepton Agar (SPA)

Сахароза	20 г
Пептон	5 г
K2HPO4	0,5 г
MgSO4×7H 2O	0,25 г
Бактоагар	15 г
Дистиллированная вода	до 1 л

pH 7,0-7,2

Стерилизовали автоклавированием при температуре +121°C в течение 15 минут.

В чашки Петри наливали питательную агаровую среду в количестве 20-30 мл и давали ей застыть. Посев культур на чашки Петри проводили путем нанесения одной петли чистой культуры бактерий на питательную среду и равномерного ее распределение путем растирания по поверхности агаровой среды с помощью стеклянного шпателя Дригальского.

Для размещения экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai готовили лунки, для чего в застывшей среде с поверхностно нанесенной культурой стерильным сверлом диаметром 10 мм просверливали необходимое количество лунок глубиной около 5 мм, после чего в лунки вносили экстракт на 1 мм ниже уровня среды (по 200 мкл в лунку). В лунки контрольных чашек вносили стерильную дистиллированную воду.

Приготовленные чашки Петри с образцами и контрольные чашки Петри помещали в термостат (температура +26±2°C). Образцы выдерживали в термостате 1-3 суток, отмечая интенсивность роста бактерий на чашках, замеряя зоны угнетения их роста и делая записи в журнале.

Ингибирующее действие экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai против Erwinia amylovora определяли по степени подавления роста чистой культуры возбудителя на питательной среде. Измерение зоны подавления роста культуры проводили через 24 часа после постановки опыта и далее наблюдали изменения в течение 3-х суток.

Пример.

Ингибирующее действие экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai определяли по степени подавления роста чистой культуры возбудителя на питательной среде. Опыт проводили в трех повторностях: в опытные чашки в лунки вносили экстракт штамма Trichoderma harzianum Rifai. В контрольную чашку в лунки вносили стерильную дистиллированную воду. Через 24 часа после поверхностного посева культуры Erwinia amylovora на питательную среду и внесения экстракта в лунки в опытных чашках наблюдали зоны подавления роста культуры возбудителя вокруг лунок. Радиус зон подавления составлял 5-9 мм. На остальной поверхности чашки наблюдался рост культуры возбудителя без признаков угнетения. На контрольной чашке, на всей поверхности среды наблюдался активный рост культуры возбудителя заболевания, без признаков подавления. Это указывает на то, что экстракт штамма Trichoderma harzianum Rifai оказывает ингибирующее действие на возбудителя бактериального ожога плодовых культур.