комбинация частичного агониста никотиновых рецепторов и ингибитора ацетилхолинестеразы, содержащая ее фармацевтическая композиция и ее применение в лечении когнитивных расстройств

Формула изобретения

1. Комбинация частичного агониста никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитора ацетилхолинестеразы, предназначенная для лечения когнитивных расстройств, отличающаяся тем, что частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 является (2Е)-бут-2-ендиоатом 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилатом и что ингибитор ацетилхолинестеразы выбран из ривастигмина и донепезила.

2. Комбинация по п.1, отличающаяся тем, что частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 является (2Е)-бут-2-ендиоатом 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилатом и ингибитор ацетилхолинестеразы является ривастигмином.

3. Комбинация по п.1, отличающаяся тем, что частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 является (2Е)-бут-2-ендиоатом 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилатом и ингибитор ацетилхолинестеразы является донепезилом.

4. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активных веществ комбинацию по любому из пп.1-8, а также по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, предназначенная для лечения когнитивных расстройств.

5. Набор, содержащий, с одной стороны, частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 и, с другой стороны, ингибитор ацетилхолинестеразы, такие, как определено по п.1, причем частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитор ацетилхолинестеразы находятся в разных отделениях и предназначены для одновременного, раздельного или распределенного во времени введения (последовательное введение), предназначенный для лечения когнитивных расстройств.

6. Применение комбинации частичного агониста никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитора ацетилхолинестеразы, причем частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 является (2Е)-бут-2-ендиоатом 4-бром-фенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата в форме основания, соли присоединения с кислотой, гидрата или сольвата, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения когнитивных расстройств.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что когнитивные расстройства связаны с болезнью Альцгеймера.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к комбинации частичного агониста никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитора ацетилхолинестеразы, к фармацевтической композиции, содержащей комбинацию по изобретению, и к ее применению в лечении когнитивных расстройств и, более конкретно, когнитивных расстройств, связанных с болезнью Альцгеймера.

Под когнитивными расстройствами понимают недостаток высших мозговых функций, к которым относятся, среди прочих, нарушения краткосрочной и долгосрочной памяти, рабочей памяти, процессов внимания и бодрствования, семантической памяти, пространственной памяти, нарушения высших исполнительских функций (способность к абстрагированию и планированию, суждение).

Пациенты, страдающие когнитивными расстройствами, связанными с болезнью Альцгеймера, в настоящее время получают лечение ингибиторами ацетилхолинестеразы.

Одна из трудностей лечения когнитивных расстройств, связанных с болезнью Альцгеймера, ингибиторами ацетилхолинестеразы, заключается в том, что у многих пациентов, получающих лечение, постепенно развиваются нежелательные побочные эффекты при повторных введениях. Так, от 10% до 15% пациентов, получающих лечение, вынуждены прервать лечение в связи с побочными действиями со стороны пищеварительной системы (тошнота, рвота, диарея), и 40% пациентов, получающих лечение, не могут принимать оптимальную терапевтическую дозу в связи с появлением побочного действия. Кроме того, только от 30% до 50% пациентов, получающих лечение, дают ответ на лечение и наблюдаемый терапевтический эффект часто заключается только просто в умеренной стабилизации симптомов (см. отчет Alzheimer's disease. Decision Resources, USA, June 2006).

Таким образом, существует необходимость в получении более эффективных лекарственных средств для лечения пациентов, страдающих когнитивными расстройствами, в частности, когнитивными расстройствами, связанными с болезнью Альцгеймера, которые, кроме того, имели бы меньше нежелательных побочных действий.

Цель изобретения заключается в решении этой технической задачи при помощи комбинации частичного агониста никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитора ацетилхолинестеразы.

Частичные агонисты никотиновых рецепторов типа альфа 7 ( 7-nAChRs) были описаны, как обладающие про-когнитивными свойствами на ряде животных моделей, изучающих различные типы памяти или когнитивных функций (Biton et al., Neuropsychopharmacology, 2007, 32: 1-16, Pichat et al., Neuropsychopharmacology, 2007, 32: 17-34).

Использование частичного агониста, а не полного агониста, является значительным технологическим прогрессом. На самом деле никотиновый рецептор альфа 7 известен, как имеющий быстрое и резко выраженное десенсибилизирующее действие. Частичный агонист, в отличии от полного агониста, оказывает очень слабо десенсибилизирующее действие на рецептор, что выражается в устойчивом терапевтическом эффекте при повторных курсах лечения.

Комбинация по изобретению обладает улучшенным действием по сравнению с действием обоих активных веществ, взятых отдельно. Действительно, наблюдается лучший эффект комбинации по шкале про-когнитивных фармакологических эффектов по сравнению с эффектом, который дают оба активные вещества, взятые отдельно.

Этот лучший эффект комбинации позволит:

- снизить назначаемую дозу и, следовательно, обеспечивает лучшую переносимость лечения (уменьшение побочных действий на пищеварительную систему);

- более длительное лечение пациентов за счет улучшенной переносимости;

- повысить процент пациентов, дающих ответ на комбинированное лечение по сравнению с лечением только ингибиторами ацетилхолинестеразы.

Первым объектом изобретения является комбинация частичного агониста никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитора ацетилхолинестеразы.

Вторым объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая такую комбинацию в качестве активного вещества.

Третьим объектом изобретения является применение такой комбинации для лечения когнитивных расстройств различного происхождения и, более конкретно, когнитивных расстройств, связанных с болезнью Альцгеймера.

Таким образом, первым объектом изобретения является комбинация частичного агониста никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитора ацетилхолинестеразы.

Из частичных агонистов никотиновых рецепторов типа альфа 7 по изобретению можно назвать частичные агонисты никотиновых рецепторов типа альфа 7 общей формулы (I)

в которой

Х обозначает атом кислорода или группу формулы NZ, в которой Z обозначает атом водорода или (C₁-C₆) алкильную группу,

n обозначает число 0, 1 или 2 и

R ₁, R₂, R₃, R₄ и R ₅ обозначают каждый независимо друг от друга атом водорода или галогена или группу: трифторметил, трифторметокси, циано, гидрокси, (C₁-C₆)алкил, (C₁-C ₆)алкокси, фенокси или фенил, возможно замещенную атомом галогена или трифторметильной, циано, гидрокси, (C₁ -C₆)алкильной или (C₁-С₆)алкокси группой, или R₂ и R₃ образуют вместе группу формулы -ОСН₂О- или -СН₂СН₂СН ₂СН₂-,

в виде основания или соли присоединения с кислотой, гидрата или сольвата.

Соединения общей формулы (I) описаны в документе WO 00/58311.

В рамках настоящего изобретения понимают под:

-C_t-C_z, где t и z могут принимать значения от 1 до 6: углеродную цепочку, которая может содержать от t до z атомов углерода, например, углеродную цепочку C ₁-С₃, которая может содержать от 1 до 3 атомов углерода;

- атомом галогена: атом фтора, хлора, брома или йода;

- алкильной группой: алифатическую насыщенную линейную или разветвленную группу. В качестве примеров можно назвать метильную, этильную, пропильную, изопропильную, бутильную, изобутильную, третбутильную, пентильную группы и т.д.;

- алкокси группой: -O-алкил, алкильная группа которого является такой, как определено выше.

Соединения общей формулы (I), указанные выше, были описаны в документе WO 00/58311 в качестве частичных агонистов никотиновых рецепторов типа альфа 7.

Соли соединений общей формулы (I), пригодные по изобретению, можно получить с фармацевтически приемлемыми кислотами, но соли других кислот, пригодных, например, для очистки или выделения соединений общей формулы (I), также относятся к изобретению.

Соединения общей формулы (I) могут быть в форме гидратов или сольватов, а именно в форме комбинаций или комбинаций с одной или несколькими молекулами воды или с растворителем. Такие гидраты и сольваты также относятся к изобретению.

Соединения общей формулы (I) могут содержать один или несколько ассиметрических атомов углерода. Они, следовательно, могут существовать в форме энантиомеров или диастереоизомеров. Эти энантиомеры, диастереоизомеры, а также их смеси, включая рацемические смеси, относятся к изобретению.

Первой группой соединений формулы (I), пригодных по изобретению, является группа, в которой Х обозначает атом кислорода.

Второй группой соединений формулы (I), пригодных по изобретению, является группа, в которой n обозначает число 0.

Третьей группой соединений формулы (I), пригодных по изобретению, является группа, в которой R₁, R₂, R ₃, R₄ и R₅ обозначают каждый независимо друг от друга атом водорода или галогена.

Четвертой группой соединений формулы (I), пригодных по изобретению, является группа, в которой R₁, R₂, R₄ и R₅ обозначают каждый атом водорода и R₃ обозначает атом галогена.

Пятой группой соединений формулы (I), пригодных по изобретению, является группа, в которой

Х обозначает атом кислорода,

n обозначает число О,

R₁, R₂, R₄ и R₅ обозначают каждый атом водорода и R₃ обозначает атом галогена.

Из соединений формулы (I), пригодных в рамках изобретения, можно в частности назвать 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилат в виде основания или соли присоединения с кислотой, гидрата или сольвата.

Примером соли 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата, пригодной по изобретению, является соль ((2Е-бут-2-бутендиоат)фумарата.

Согласно изобретению соединения общей формулы (I) можно получить способом, описанным в заявке WO 00/58311.

Пример: Получение (2Е)-бут-2-ендиоата 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата

В реактор с двойным корпусом объемом 6 л помещают 232,45 г 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата (WO 00/58311) в 2331 мл этанола. Реакционную среду нагревают до 60°С. Затем добавляют раствор 87,17 г фумаровой кислоты в 1000 мл этанола и 97 мл воды, предварительно нагретый до 60°С. Затем дистиллируют 1900 мл растворителя, после чего реакционную среду охлаждают до 20°С в течение 2,5 часов. После 2,5 часов контакта при 20°С (2Е)-бут-2-ендиоат 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата фильтруют, промывают 2 раза по 400 мл этанола, затем сушат в вакууме при 50°С.

Точка плавления (DSC): 175°С.

ЯМР ¹H, (400 МГц, ДМСО-d ₆; (м.д.): 1,80 (уширенный синглет, 2Н), 2,10 (уширенный синглет, 2Н), 3,10 (уширенный синглет, 6Н), 3,71 (уширенный синглет, 1Н), 3,84 (уширенный синглет, 1Н), 4,25 (уширенный синглет, 0,5Н), 4,40 (уширенный синглет, 0,5Н), 6,58 (с, 2Н), 7,14 (м, 2Н), 7,57 (м, 2Н), 11 (уширенный синглет, 2Н).

По настоящему изобретению ингибитор ацетилхолинестеразы можно выбирать из всех известных из литературы ингибиторов ацетилхолинестеразы. В качестве примера можно назвать, в частности, ривастигмин (Exelon^® ) и донепезил (Aricept^®).

Таким образом, примером комбинации по изобретению является комбинация, состоящая из (2Е)-бут-2-ендиоат 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата и ривастигмина.

Еще одним примером комбинации по изобретению является комбинация, состоящая из (2Е)-бут-2-ендиоат 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата и донепезила.

Второй объект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного вещества комбинацию, такую, как определена выше, и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Фармацевтическая композиция содержит минимальную активную дозу каждого активного вещества, присутствующего в комбинации по изобретению.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей субактивную дозу каждого активного вещества, присутствующего в комбинации по изобретению. Использование таких субактивных доз позволяет избежать побочного действия одного или нескольких активных веществ, присутствующих в комбинации по изобретению.

Эксципиенты выбирают в соответствии с требуемой фармацевтической формой и способом введения из традиционных эксципиентов, которые известны специалисту.

Композиция может вводиться пероральным, парентеральным или ректальным путем.

Соответствующие стандартные лекарственные формы включают формы для введения пероральным путем, такие как таблетки, мягкие или твердые желатиновые капсулы, порошки, гранулы и питьевые растворы или суспензии, формы для сублингвального, буккального, интратрахеального, интраокулярного, интраназального введения, введения путем ингаляции, формы для топического, чрескожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения, формы для ректального введения и имплантаты. Для топического нанесения можно использовать активные вещества по изобретению в составе кремов, гелей, мазей или лосьонов.

По изобретению оба активных вещества вводят одним путем, например, пероральным, или одно из активных веществ вводят первым путем, например, пероральным, а другое активное вещество вводят другим путем, например, парентеральным.

Если получают композицию в виде таблеток, смешивают активные ингредиенты с одним или несколькими фармацевтическими эксципиентами, такими как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, кремнезем, гуммиарабик, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, гипромеллоза или аналоги.

Можно также покрывать таблетки сахарозой, целлюлозным производным или другим веществом, пригодным для образования покрытия. Таблетки можно получать разными технологиями, такими как прямое прессование, сухое или влажное гранулирование или горячее плавление.

Фармацевтическую композицию можно также получать в виде желатиновой капсулы, путем смешивания активных ингредиентов с разбавителем и введения полученной смеси в мягкие или твердые капсулы.

Для парентерального введения используют водные суспензии, изотонические солевые растворы или стерильные растворы для инъекций, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например, пропиленгликоль или бутиленгликоль.

В соответствии с традиционной практикой дозировка, подходящая каждому пациенту, определяется врачом в соответствии со способом введения, возрастом, массой тела и реакцией этого пациента.

Дозы зависят от требуемого эффекта, продолжительности лечения и используемого пути введения.

Например у при пероральном введении суточные дозы каждого из активных веществ комбинации по изобретению следующие:

- частичные агонисты никотиновых рецепторов типа альфа 7: от 0,5 до 500 мг в день на человека, в частности, от 1 до 100 мг в день на человека;

- ингибитор ацетилхолинестеразы: от 3 до 200 мг в день на человека, в частности, от 5 до 100 мг в день на человека.

В отдельных случаях могут требоваться более высокие или более низкие дозировки. Такие дозировки не выходят за рамки изобретения.

Соответствующие дозы частичных агонистов никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибиторов ацетилхолинестеразы главным образом по существу идентичны между собой или могут отличаться друг от друга.

В качестве примера стандартная лекарственная форма частичных агонистов никотиновых рецепторов типа альфа 7 в виде таблетки содержит следующие ингредиенты:

Соединение	4 мг
Маннит	174 мг
Натриевая кроскармеллоза	6 мг
Кукурузный крахмал	15 мг
Гидроксипропилметилцеллюлоза	2 мг
Стеарат магния	3 мг

Также в качестве примера форма разового введения ингибитора ацетилхолинестеразы в форме таблетки может содержать 10 мг ингибитора ацетилхолинестеразы и традиционные эксципиенты, например, микрокристалическую целлюлозу, коллоидный кремнезем, тальк, натриевую кроскармеллозу, магния стеарат.

Введение каждого из активных веществ может также быть одновременным, раздельным или распределенным во времени (последовательное введение).

Если введение осуществляют одновременно, оба активных вещества можно объединить в одной фармацевтической композиции, содержащей оба активных вещества, такой как таблетка или желатиновая капсула.

Два активных вещества независимо от того, вводятся ли они одновременно или раздельно, могут также содержаться в разных фармацевтических композициях. С этой целью комбинация по изобретению может иметь форму набора, содержащего, с одной стороны, по меньшей мере один частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7, такой как определен выше, и, с другой стороны, по меньшей мере один ингибитор ацетилхолинестеразы, такой как определен выше, при этом частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 и ингибитор ацетилхолинестеразы находятся в разных отделениях и предназначены для одновременного, раздельного или распределенного во времени введения (последовательное введение).

Другим объектом изобретения является применение комбинации, такой, как описана выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения когнитивных расстройств и, более конкретно, когнитивных расстройств, связанных с болезнью Альцгеймера.

Объектом изобретения также является способ лечения когнитивных расстройств и, более конкретно, когнитивных расстройств, связанных с болезнью Альцгеймера, который включает введение пациенту минимальной активной или суб-активной дозы частичного агониста никотиновых рецепторов типа альфа 1, такого, как определен выше, и минимальной активной или субактивной дозы ингибитора ацетилхолинестеразы, такого, как определен выше, причем указанные дозы вводятся одновременно, раздельно или распределены во времени, как описано выше.

Действие комбинации в отношении когнитивных расстройств оценивали в двух тестах на поведенческую психофармакологию у грызуна (крыса и мышь).

Эти тесты направлены на один из основных типов когнитивных расстройств, которыми являются нарушения памяти и, более конкретно, нарушения эпизодической зрительной памяти.

Цель заключается в том, чтобы выявить улучшенный эффект комбинации по шкале про-когнитивных фармакологических эффектов по сравнению с эффектом, который дают оба активные вещества, взятые отдельно, в лечении этих когнитивных расстройств.

1. Тест на спонтанное забывание у крысы, не страдающей недостаточностью

Цель первого исследования заключалась в выявлении у взрослой крысы прокогнитивного синергизма комбинации по изобретению при постановке задачи на спонтанное забывание с использованием протокола спонтанного забывания в тесте на узнавание предмета.

1) Фаза привыкания: в этом протоколе животные сначала проходили сеанс привыкания в контексте окружающей среды (деревянный ящик размером 65×45×45 см) в течение 2 минут. Время активного передвижения измеряют хронометром.

2) Фаза обучения: Через 24 часа два совершенно одинаковых предмета (или металлические треугольники, или пирамиды, выполненные из конструктора Lego) помещают в экспериментальное устройство. Каждую крысу помещают в центре ящика, мордочкой к стенке, противоположной той, у которой расположены предметы/стимулы. В каждой группе крыс соблюдают одинаковую последовательность предъявляемых пар предметов. Животных оставляют в экспериментальном ящике до тех пор, пока время ознакомления с обоими предметами не достигнет 20 секунд при максимальной продолжительности 3 минуты. Как только проходит 20 секунд, крысу возвращают в клетку, где она содержится. Эта процедура позволяет получить одинаковую степень ознакомления животных с предметами и, следовательно, уровень обучения, сопоставимый у разных животных.

3) Сеанс воспоминания: Сеанс воспоминания проводится после 24-х часового периода забывания для всех групп. Крысам предъявляют пару предметов, состоящую из предмета, с которым они знакомились во время фазы обучения, и из незнакомого предмета. Крыс помещают также как во время сеанса обучения.

Это испытание длится 3 минуты, в течение которых измеряют время, потраченное на изучение каждого из 2 предметов.

Если животное по существу вспоминает предварительно запомненный предмет, оно главным образом обследует новый предмет. И наоборот, если животное забыло известный предмет, продолжительность обследования нового предмета и уже знакомого предмета будет сходной.

В сеансах обучения и воспоминания обследование учитывается, если животное направляет свою мордочку к предмету в пределах 2 см по периметру последнего и если оно трогает его своей мордочкой и лапами. Если крыса обходит вокруг предмета и садится на него, такое поведение не рассматривается как обследование.

Необработанные данные выражены в секундах.

Тестируемые соединения вводятся перорально за 60 минут (исследование с помощью крыс) до начала каждого из трех сеансов протокола.

Создают четыре экспериментальные группы, получающие соответственно:

1 - наполнитель (метилцеллюлоза+только Tween)

2 - частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 (неактивная доза)

3 - ингибитор ацетилхолинестеразы (неактивная доза)

4 - частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 (неактивная доза)+ингибитор ацетилхолинестеразы (неактивная доза).

Во время сеанса воспоминания, через 24 часа после сеанса обучения, измеряют продолжительность обследования обоих объектов, выраженную в секундах, и показатель узнавания (продолжительность обследования/полная продолжительность обследования нового и знакомого объектов).

- Сходная продолжительность обследования знакомого и нового объектов показывает, что знакомый объект был забыт и, следовательно, что эпизодическая зрительная память является недостаточной.

Напротив, продолжительность обследования нового объекта, более длительная, чем знакомого объекта, указывает на существенное припоминание знакомого объекта и, следовательно, улучшение эпизодической зрительной памяти.

- Невысокий показатель узнавания показывает, что знакомый объект был забыт и, следовательно, что эпизодическая зрительная память является недостаточной.

Напротив, высокий показатель узнавания указывает на существенное припоминание знакомого объекта и, следовательно, улучшение эпизодической зрительной памяти.

Нижеследующие результаты были получены по четырем экспериментальным группам, получающим соответственно:

- Группа 1: наполнитель (метилцеллюлоза+только Tween)

- Группа 2: (2Е)-бут-2-ендиоат 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата 0,1 мг/кг, р.о. (неактивная доза)

- Группа 3: Ривастигмин 0,03 мг/кг, р.о. (неактивная доза)

- Группа 4: (2Е)-бут-2-ендиоат 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата 0,1 мг/кг, р.о.+ривастигмин 0,03 мг/кг, р.о. (неактивная доза).

Указанные выше дозы выражены в основном эквиваленте.

На фигуре 1 и в таблице 1 показано время, прошедшее при передвижении во время сеанса привыкания для каждой экспериментальной группы.

Таблица 1
Экспериментальная группа	Передвижение (секунды)
1	24,80±1,38
2	21,15±1,14
3	24,94±2,38
4	23,31±1,40

После одного введения каждого из двух соединений или комбинации обоих, никакого изменения передвижения не было отмечено во время сеанса привыкания в контексте окружающей среды.

В таблице 2 и на фигурах 2 и 3 показано:

- продолжительность обследования (в секундах) двух объектов, нового и знакомого; и

- показатель узнавания, такой как определен выше, во время сеанса воспоминания для каждой экспериментальной группы.

Во время сеанса воспоминания через 24 часа после сеанса обучения, животные, которые получали только наполнитель или неактивную дозу каждого из двух соединений ((2Е)-бут-2-ендиоата 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата или ривастигмина) не продемонстрировали никакой существенной разницы между знакомым объектом и новым объектом. Это показывает, что знакомый объект был забыт.

Напротив, животные, которые получали комбинацию неактивных доз каждого из тестируемых соединений, обследовали новый объект значительно дольше, чем знакомый, демонстрируя существенное припоминание знакомого объекта. Этот эффект был отмечен по продолжительности обследования обоих объектов, выраженной в секундах, и по показателю узнавания (таблица 2 и фигуры 2 и 3).

Таблица 2
Экспериментальная группа	Продолжительность обследования (сек)		Индекс узнавания (новый/ (новый+знакомый))
	Знакомый объект	Новый объект
1	11,96±1,51	12,09±1,74	0,48±0,05
2	10,47±0,84	11,10±1,44	0,50±0,04
3	10,10±1,56	9,42±1,86	0,48±0,05
4	6,14±0,98	10,92±1,18	0,66±0,05

Результаты, приведенные выше, показывают, что в тесте на эпизодическую зрительную память комбинация по изобретению имеет прокогнитивный эффект, превосходящий прокогнитивный эффект двух активных веществ, взятых отдельно.

2. Тест на недостаточность краткосрочной эпизодической зрительной памяти, вызванную интра-церебро-вентрикулярными инъекциями (ICV) -амилоидного белка 25-35, у мыши

-амилоидные пептиды главным образом образуют старческие бляшки, наблюдаемые при болезни Альцгеймера. Пептидный фрагмент А 25-35 содержит 11 аминокислот, необходимых и достаточных для индуцирования неврологической токсичности. Это причина, по которой интра-церебро-вентрикулярные инъекции (ICV) этого пептида рассматриваются как патопсихологическая модель болезни Альцгеймера с высокой предсказуемой достоверностью.

А 25-35 амилоидный пептид растворяют в дистиллированой воде с финальной концентрацией 3 мг/мл. Затем его инкубируют при 37°С в течение 4 дней для образования агрегатов токсичного пептида. Контрольные животные получают смешанный пептид («scrambled peptide»), состоящий из тех же аминокислот, но организованный в произвольной последовательности. Этот смешанный пептид не обладает нейронной токсичностью (не токсичен).

Пептид впрыскивают интра-церебро-вентрикулярным путем мышам штамма CD1, которым сделана анестезия изофлураном. Используют микро-шприц, снабженный иглой 28 gauges и длиной 3 мм. Игла водится односторонне, на 1 мм вправо от центральной линии, равноудаленной от каждого глаза, и на одинаковом расстоянии между осью расположения глаз и осью расположения ушей. 3 мкл сцепленного пептида вводят в течение одной минуты. Мышей используют для поведенческих опытов через 6-14 дней после интрацеребральной инъекции.

Используемый поведенческий экспериментальный протокол сопоставим с используемым в тесте на спонтанное забывание у крысы, описанном выше.

1) Фаза привыкания: В этом протоколе мыши сначала проходят сеанс привыкания в контексте окружающей среды (ящик из ПВХ светло-серого цвета размером 52×52×40 см, освещение 6 Люкс) в течение 10 минут. Время активного передвижения измеряют хронометром.

2) Фаза обучения: через 24 часа два совершенно одинаковых предмета (или металлические треугольники (5,5×3,3 см), или квадратный кирпич Lego красного цвета (3,0×3,0×3,0 см)) помещают в экспериментальное устройство. Каждую мышь помещают в центр ящика, мордочкой к стенке, противоположной той, у которой расположены предметы/стимулы. В каждой группе мышей соблюдают одинаковую последовательность предъявляемых пар предметов. Животных оставляют в экспериментальном ящике до тех пор, пока время ознакомления с обоими предметами не достигнет 10 секунд при максимальной продолжительности 3 минуты. Как только 10 секунд проходят, мышь возвращают в клетку, где она содержится. Эта процедура позволяет получить одинаковую степень ознакомления животных с предметами и, следовательно, уровень обучения, сопоставимый у разных животных.

3) Сеанс воспоминания: Сеанс воспоминания проводится после периода забывания, продолжительностью 1 час для всех групп. Этот короткий период забывания дает хорошие показатели вспоминания у контрольных животных и позволяет выявлять недостаточность, вызванную инъекцией токсичного пептида у других животных. Мышам предъявляют пару предметов, состоящую из предмета, с которым они знакомились во время фазы обучения, и из незнакомого предмета. Мышей помещают в ящик также как во время сеанса обучения.

Это испытание длится 5 минут, в течение которых измеряют время, потраченное на изучение каждого из 2 предметов.

При таком коротком периоде забывания контрольное животное главным образом обследует новый предмет, что свидетельствует о существенном вспоминании знакомого предмета. И наоборот, у животных с недостаточной памятью продолжительность обследования обоих предметов не имеет статистически значимой разницы.

В сеансах обучения и воспоминания обследование учитывается, если животное направляет свою мордочку к предмету в пределах 2 см по периметру последнего и если оно трогает его своей мордочкой и лапами. Если крыса обходит вокруг предмета и садится на него, такое поведение не рассматривается как обследование.

Необработанные данные выражены в секундах.

Тестируемые соединения вводятся интраперитонеальным путем за 60 минут до начала каждого из трех сеансов протокола.

Создают пять экспериментальных групп, получающих соответственно:

1 - контрольный смешанный пептид (не токсичный), носитель

2 - пептид A _25-35 (токсичный), носитель

3 - пептид А _25-35, ингибитор ацетилхолинестеразы (неактивная доза)

4 - пептид А _25-35, частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 (неактивная доза)

5 - пептид А _25-35, ингибитор ацетилхолинестеразы (неактивная доза)+частичный агонист никотиновых рецепторов типа альфа 7 (неактивная доза)

Во время сеанса воспоминания, т.е. через 1 час после сеанса обучения, измеряют продолжительность обследования обоих объектов, выраженную в секундах.

- Сходная продолжительность обследования знакомого объекта и нового объекта показывают, что знакомый объект был забыт и, следовательно, что способность к краткосрочному воспоминанию полностью отсутствует.

- Напротив, более длительная продолжительность обследования нового объекта по сравнению со знакомым объектом указывает на хорошую способность краткосрочной памяти к воспоминанию.

Показатель узнавания (продолжительность обследования нового объекта/полная продолжительность обследования нового и знакомого объектов) также измеряется.

- Невысокий показатель узнавания показывает, что знакомый объект был забыт и, следовательно, что краткосрочная память полностью отсутствует.

Напротив, высокий показатель узнавания указывает на существенное припоминание знакомого объекта и, следовательно, хорошую способность краткосрочной памяти к воспоминанию.

Нижеследующие результаты были получены по пяти следующим экспериментальным группам, получающим соответственно:

1 - контрольный смешанный пептид (не токсичный), носитель

2 - пептид А _25-35 (токсичный), носитель

3 - пептид А _25-35, донепезил, 0,1 мг/кг (неактивная доза)

4 - пептид А _25-35, (2Е)-бут-2-ендиоат 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата, 0,1 мг/кг (неактивная доза)

5 - пептид А _25-35, донепезил, 0,1 мг/кг+(2Е)-бут-2-ендиоат 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата, 0,1 мг/кг (неактивная доза)

Дозы выражены в основном эквиваленте.

После одного введения каждого из двух соединений или комбинации обоих, никакого изменения передвижения не было отмечено во время сеанса привыкания в контексте окружающей среды. Также не было обнаружено никакого изменения продолжительности обследования обоих идентичных объектов во время сеанса обучения.

В таблице 3 и на фигурах 4 и 5 показано:

- время обследования (в секундах) двух объектов, нового и знакомого; и

- показатель узнавания, такой как определен выше, во время сеанса воспоминания для каждой экспериментальной группы.

Во время сеанса воспоминания животные, получавшие нетоксичный контрольный пептид, демонстрируют неповрежденную способность краткосрочной памяти к воспоминанию, которая выражается в существенно более длительном ознакомлении с новым объектом по сравнению со знакомым объектом.

Напротив, животные, получавшие токсичный пептид, демонстрируют полное разрушение способности краткосрочной памяти к воспоминанию, которая выражается в одинаковом ознакомлении со знакомым объектом и с новым объектом.

Доза (2Е)-бут-2-ендиоата 4-бромфенил-1,4-диазабицикло[3.2.2]нонан-4-карбоксилата и доза донепезила являются каждая сама по себе неактивной и не приводят к улучшению способностей.

Напротив, если оба продукта назначают совместно, наблюдается очень сильно выраженный про-мнезический эффект, выражающийся в возврате способности краткосрочной памяти к воспоминанию, подобной, даже превосходящей способность животных, получавших нетоксичный пептид (таблица 3 и фигуры 4 и 5).

Таблица 3
Экспериментальная группа	Продолжительность обследования (сек)		Индекс узнавания (новый/ (новый+знакомый)
	Знакомый объект	Новый объект
1	4,50±0,90	10,00±1,40	0,69±0,05
2	6,50±0,90	6,20±0,80	0,49±0,04
3	4,60±0,70	5,00±0,80	0,52±0,05
4	4,30±0,70	6,30±0,60	0,60±0,04
5	3,70±0,70	11,30±1,90	0,75±0,04

Приведенные выше результаты показывают, что в тесте на недостаточную краткосрочную зрительную эпизодическую память комбинация по изобретению приводит к выраженному превосходящему про-мнезическому эффекту по сравнению с про-мнезическим эффектом, производимым двумя активными веществами, взятыми отдельно.

В целом результаты, полученные в обеих сериях экспериментов, описанных выше, показывают превосходящий эффект комбинации по изобретению в отношении эффективности по сравнению с каждым из активных веществ, вводимых по отдельности и в той же дозировке, в отношении нарушений зрительной эпизодической памяти при постановке задачи на узнавание объектов грызуном. Этот превосходящий эффект наблюдается не только у животных, не страдающих этим расстройством, способности которого улучшаются, но также и на патопсихологической модели болезни Альцгеймера с использованием интрацеребральных инъекций токсичного амилоидного пептида.

Этот превосходящий эффект указывает на эффективность комбинации по изобретению в отношении когнитивных расстройств и, более конкретно, когнитивных расстройств, связанных с болезнью Альцгеймера, патологии, при которой этот вид когнитивной функции считается наиболее ухудшенным.