сочетание рекомбинантной микробактерии и биологически активного средства в качестве вакцины

Формула изобретения

1. Сочетание, индуцирующее иммунный ответ против рака или инфекционных заболеваний, содержащее первый компонент и отдельно второй компонент, где первый компонент представляет собой бактериальную клетку, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид высвобождения из фаголизосомы, где пептид или полипептид высвобождения из фаголизосомы является листериолизином, где бактериальная клетка представляет собой клетку микобактерии, дефицитную по уреазе; а второй компонент представляет собой биологически активный агент, индуцирующий иммунный ответ против рака или инфекционного заболевания.

2. Сочетание по п.1, где клетка представляет собой клетку Mycobacterium bovis.

3. Сочетание по п.1, где по меньшей мере одна нуклеиновая кислота бактериальной клетки, кодирующая клеточную субъединицу уреазы, является инактивированной.

4. Сочетание по п.3, где инактивирована по меньшей мере последовательность, кодирующая субъединицу бактериальной уреазы С.

5. Сочетание по п.1, где домен для выхода из фаголизосомы кодирует молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, включающей

a) нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотиды 211-1722 последовательности SEQ ID NO: 1;

b) нуклеотидную последовательность, кодирующую такую же аминокислотную последовательность, что и последовательность пункта a); и

c) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью пункта а) или b).

6. Сочетание по п.1, где бактериальная клетка содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид, способный индуцировать иммунный ответ у млекопитающего.

7. Сочетание по п.6, где пептид или полипептид выбран из аутоантигенов, опухолевых антигенов, вирусных антигенов, паразитарных антигенов, бактериальных антигенов и их иммуногенных фрагментов.

8. Сочетание по п.6 или 7, где пептид или полипептид является фрагментом слитого полипептида.

9. Сочетание по п.8, где слитый полипептид содержит

a) по меньшей мере один домен полипептида, где полипептидный домен способен индуцировать иммунный ответ у млекопитающего, и

b) домен выхода из фаголизосомы.

10. Сочетание по п.9, где домен выхода из фаголизосомы представляет собой домен выхода из фаголизосомы по любому из пп.1-8.

11. Сочетание по п.1, где биологически активный агент представляет собой эукариотическую клетку, более предпочтительно, генетически измененную эукариотическую клетку, которая экспрессирует цитокин.

12. Сочетание по п.11, где цитокин выбран из группы, включающей интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12 и интерферон-гамма.

13. Сочетание по п.12, где клетка одновременно экспрессирует два или более цитокинов.

14. Сочетание по п.13, где клетка одновременно экспрессирует IL-2 и интерферон-гамма.

15. Сочетание по п.11, где клетка является аутологичной для индивида, которому вводят или собираются вводить клетку и/или композицию.

16. Сочетание по п.11, где клетка является аллогенной для индивида, которому вводят или собираются вводить клетку и/или композицию.

17. Сочетание по п.11, где клетка выбрана из группы, включающей неспециальные антиген-презентирующие клетки, специальные антиген-презентирующие клетки, опухолевые клетки и дендритные клетки.

18. Сочетание по п.17, где опухолевая клетка представляет собой клетку иммуногенной опухоли, и где опухолевая клетка предпочтительно, выбрана из группы, включающей клетки меланомы, клетки рака почки, клетки опухоли молочной железы, клетки опухоли мозга, клетки опухоли простаты, клетки немелкоклеточной карциномы легкого, клетки карциномы толстой кишки и клетки сквамозной опухоли головы и шеи.

19. Сочетание по п.11, где клетка является аллогенной и совпадает по антигенам HLA класса I.

20. Сочетание по п.11, где клетка экспрессирует другую иммунную молекулу, выбранную из группы, включающей цитокин, молекулу адгезии, кофактор стимуляции, связанный с опухолью антиген, опухолеспецифический антиген и паразитарный антиген.

21. Сочетание по п.20, где паразитарный антиген представляет собой белок gp190/MSP1 Plasmodium, предпочтительно Plasmodium falciparum, или его фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ у млекопитающего.

22. Сочетание по п.1, где биологически активное средство представляет собой белок gpl90/MSP1 Plasmodium, предпочтительно Plasmodium falciparum, или его фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ у млекопитающего.

23. Сочетание по п.1, где биологически активный агент представляет собой цитомегаловирус человека.

24. Сочетание по п.1, где биологически активный агент представляет собой вирусную частицу или совокупность вирусных частиц, предпочтительно, высвобождаемых после инфицирования клеток млекопитающего цитомегаловирусом человека, при этом частицы (a) окружены липидной мембраной, в которую внедрены вирусные гликопротеины, и (b) не содержат ни вирусной ДНК, ни капсидов.

25. Сочетание по п.24, где частицы содержат слитый белок, содержащий одну или несколько частей T-клеточного антигена pp65 (UL83) и одну или несколько частей одного или нескольких белков, отличных от pp65.

26. Сочетание по п.25, где T-клеточный антиген pp65 слит с одним или несколькими фрагментами гликопротеина цитомегаловируса человека, где гликопротеин выбран из группы, включающей гликопротеин gH HCMV, белок IE1 (ppUL123) HCMV и гликопротеин qB HCMV.

27. Сочетание по п.25, где T-клеточный антиген слит с одним или несколькими фрагментами белка, который является частью патогена человека, отличного от HCMV.

28. Сочетание по п.27, где патоген выбран из группы, включающей HIV-1, HBV, HCV и вирус гриппа.

29. Сочетание по п.24, где частица(ы) содержит(содержат) фрагменты по меньшей мере двух гликопротеинов, которые являются вариантами конкретных гликопротеинов разных штаммов HCMV.

30. Сочетание по п.29, где один из двух вариантов конкретного гликопротеина HCMV представляет собой вариант, полученный из штамма Towne HCMV, а другой представляет собой вариант, полученный из штамма Ad169 HCMV.

31. Сочетание по п.24, где клетки млекопитающего представляют собой фибробласты, предпочтительно фибробласты крайней плоти.

32. Сочетание по п.24, где частица представляет собой плотное тело.

33. Сочетание по п.1, где биологически активное средство представляет собой плотное тело, предпочтительно, плотное тело HCMV.

34. Сочетание по п.1, где биологически активное средство представляет собой антиген микобактерии, предпочтительно Mycobacterium ssp.

35. Сочетание по п.34, где микобактерия выбрана из группы, включающей в себя M.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis.

36. Сочетание по п.34, где антиген представляет собой антиген 85.

37. Индуцирующая иммунный ответ композиция, предпочтительно фармацевтическая композиция, содержащая сочетание по любому из пп.1-36 и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

38. Применение сочетания по любому из пп.1-36 для получения лекарственного средства.

39. Применение по п.38, где лекарственное средство предназначено для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы, включающей раковые и инфекционные заболевания.

40. Применение по п.39, где рак представляет собой иммуногенную опухоль и, более предпочтительно, выбран из группы, включающей в себя рак простаты, меланому, рак почки, опухоль молочной железы, опухоли мозга, немелкоклеточную карциному легкого, рак толстой кишки и сквамозную опухоль головы и шеи.

41. Применение по п.39, где инфекционное заболевание представляет собой малярию.

42. Применение по п.41, где биологически активное средство представляет собой белок gp190/MSP1 Plasmodium или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

43. Применение по п.39, где инфекционное заболевание представляет собой инфекцию HCMV.

44. Применение по п.43, где биологически активное средство представляет собой плотное тело по любому из предшествующих пунктов.

45. Применение по п.39, где инфекционное заболевание представляет собой туберкулез.

46. Применение по п.45, где биологически активное средство представляет собой антиген микобактерии, предпочтительно Mycobacterium ssp.

47. Применение по п.46, где микобактерия выбрана из группы, включающей M.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis.

48. Применение по п.46 или 47, где антиген представляет собой антиген 85.

49. Применение композиции по п.37 для получения лекарственного средства.

50. Применение по п.49, где лекарственное средство предназначено для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы, включающей раковые и инфекционные заболевания.

51. Применение по п.50, где рак представляет собой иммуногенную опухоль и, более предпочтительно, выбран из группы, включающей в себя рак простаты, меланому, рак почки, опухоль молочной железы, опухоль мозга, немелкоклеточную карциному легкого, рак толстой кишки и сквамозную опухоль головы и шеи.

52. Применение по п.50, где инфекционное заболевание представляет собой малярию.

53. Применение по п.52, где биологически активное средство представляет собой белок gp190/MSP1 Plasmodium или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

54. Применение по п.50, где инфекционное заболевание представляет собой инфекцию HCMV.

55. Применение по п.54, где биологически активное средство представляет собой плотное тело по любому из предшествующих пунктов.

56. Применение по п.50, где инфекционное заболевание представляет собой туберкулез.

57. Применение по п.56, где биологически активное средство представляет собой антиген микобактерии, предпочтительно Mycobacterium ssp.

58. Применение по п.57, где микобактерия выбрана из группы, включающей М.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis.

59. Применение по п.57 или 58, где антиген представляет собой антиген 85.

60. Применение сочетания по любому из пп.1-36 для получения терапевтической и/или профилактической вакцины.

61. Способ лечения пациента, страдающего заболеванием и нуждающегося в таком лечении, включающий введение сочетания по любому из пп.1-36 или фармацевтической композиции по п.37 в эффективном количестве, где заболевание выбрано из группы, состоящей из рака и инфекционных заболеваний.

62. Способ получения фармацевтической композиции по п.37, включающий стадии

получения в качестве первого компонента бактериальной клетки, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид высвобождения из фаголизосомы, где пептид или полипептид высвобождения из фаголизосомы представляет собой листериолизин, где бактериальная клетка представляет собой клетку микобактерии, дефицитную по уреазе; получения в качестве второго компонента биологически активного агента, индуцирующего иммунный ответ против рака или инфекционных заболеваний; и

получения фармацевтической композиции, содержащей первый и второй компоненты.

63. Способ по п.62, где композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в одну упаковку.

64. Способ по п.62, где композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в разные упаковки.

65. Способ по любому из пп.63 и 64, где упаковки могут содержать одну разовую дозу или несколько разовых доз.

66. Способ получения фармацевтической композиции по п.37, включающий стадии

получения в качестве первого компонента бактериальной клетки, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид, высвобождения из фаголизосомы, где пептид или полипептид высвобождения из фаголизосомы является листериолизином, где бактериальная клетка представляет собой клетку микобактерии, дефицитную по уреазе; получения в качестве второго компонента биологически активного агента, индуцирующего иммунный ответ против рака или инфекционных заболеваний; и

получения отдельных композиций первого и второго компонентов.

67. Способ по п.66, где композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в одну упаковку.

68. Способ по п.66, где композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в разные упаковки.

69. Способ по любому из пп.67 и 68, где упаковки могут содержать одну разовую дозу или несколько разовых доз.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к сочетанию, содержащему по меньшей мере два компонента, к применению такого сочетания в качестве фармацевтической композиции и в производстве лекарственного средства, к способам лечения пациента с использованием такого сочетания, а также к способу промышленного получения такого сочетания.

Современная молекулярная медицина уделяет большое внимание применению иммуногенных соединений или соединений, модулирующих иммунную систему пациента, для лечения такого пациента. Заболевания, которые можно лечить с помощью таких соединений, включают в себя, в числе прочих, опухоли и инфекционные заболевания.

В обоих случаях антигенные соединения, т.е. соединения, способные вызывать или усиливать иммунный ответ, вводят в организм пациента. Однако применение указанных соединений ограничено в тех случаях, когда для достижения соответствующих клиническим требованиям эффективности и интенсивности воздействия требуется усиление иммунного ответа. Такого усиления можно достичь путем повторного введения указанного средства или путем применения адъюванта.

На предыдущем уровне техники предлагаются различные адъюванты, такие как минеральные масла, инактивированные микобактерии, соединения алюминия и т.п.

Однако известные в данной области адъюванты не всегда удовлетворяют потребностям медицины, особенно при использовании новых способов лечения, таких как применение клеток, экспрессирующих цитокины, которые описаны, например, в международной патентной заявке PCT/US94/01631.

Таким образом, основной задачей настоящего изобретения является получение композиций, более конкретно, фармацевтических композиций, которые содержат по меньшей мере первый компонент и второй компонент, где первый компонент представляет собой адъювант, а второй компонент представляет собой биологически активное средство.

В первом аспекте данная задача решается благодаря сочетанию, включающему в себя первый компонент и второй компонент, где первый компонент представляет собой бактериальную клетку, содержащую по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид фаголизосомального истечения (пептид или полипептид, способствующий транспортировке соединений из фаголизосомы); и где второй компонент представляет собой биологически активное средство.

В одном из вариантов осуществления бактериальная клетка является дефицитной по уреазе.

В другом варианте осуществления бактериальная клетка представляет собой клетку Mycobacterium.

В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой клетку Mycobacterium bovis.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота бактериальной клетки, кодирующая по меньшей мере одну клеточную субъединицу уреазы, является инактивированной.

В более предпочтительном варианте осуществления инактивированной является последовательность, кодирующая по меньшей мере субъединицу С бактериальной уреазы.

В одном из вариантов осуществления домен фаголизосомального истечения представляет собой домен фаголизосомального истечения Listeria.

В одном из вариантов осуществления фаголизосомальный домен кодирует молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из

a) нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотиды 211-1722, как показано в SEQ ID NO: 1;

b) нуклеотидной последовательности, кодирующей такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность пункта a); и

c) нуклеотидной последовательности, гибридизующейся в жестких условиях с последовательностью пункта a) или b).

В одном из вариантов осуществления бактериальная клетка содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид, способный индуцировать иммунный ответ у млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления пептид или полипептид выбирают из аутоантигенов, опухолевых антигенов, вирусных антигенов, паразитарных антигенов, бактериальных антигенов и их иммуногенных фрагментов.

В другом предпочтительном варианте осуществления пептид или полипептид является частью слитого полипептида.

В одном из вариантов осуществления слитый полипептид содержит

a) по меньшей мере один домен полипептида, где полипептидный домен способен вызывать иммунный ответ у млекопитающего, и

b) домен фаголизосомального истечения.

В предпочтительном варианте осуществления полипептид представляет собой полипептид по пункту 9 или его часть.

В другом предпочтительном варианте осуществления домен фаголизосомального истечения представляет собой домен фаголизосомального истечения по любому из пунктов 1-11.

В предпочтительном варианте осуществления бактериальная клетка представляет собой rBCG:Hly или rBCG ureC:Hly.

В одном из вариантов осуществления биологически активное средство представляет собой эукариотическую клетку, более предпочтительно, генетически измененную эукариотическую клетку, которая экспрессирует цитокин.

В предпочтительном варианте осуществления цитокин выбран из группы, включающей в себя интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12 и интерферон-гамма.

В более предпочтительном варианте осуществления клетка одновременно экспрессирует два или более цитокинов.

В еще более предпочтительном варианте осуществления клетка одновременно экспрессирует IL-2 и интерферон-гамма.

В предпочтительном варианте осуществления клетка является аутологичной по отношению к субъекту, которому вводят или собираются вводить данную клетку и/или композицию.

В предпочтительном альтернативном варианте осуществления клетка является аллогенной по отношению к субъекту, которому вводят или собираются вводить данную клетку и/или композицию.

В предпочтительном варианте осуществления клетка выбрана из группы, включающей в себя непрофессиональные антиген-презентирующие клетки, профессиональные антиген-презентирующие клетки, опухолевые клетки и дендритные клетки.

В более предпочтительном варианте осуществления опухолевая клетка представляет собой клетку иммуногенной опухоли, где опухолевая клетка предпочтительно выбрана из группы, включающей в себя клетки меланомы, клетки рака почки, клетки опухоли молочной железы, клетки опухоли мозга, клетки опухоли простаты, клетки немелкоклеточной карциномы легкого, клетки карциномы толстой кишки, клетки сквамозной опухоли головы и шеи.

В предпочтительном варианте осуществления клетка является аллогенной и сингенной по антигенам HLA класса I.

В другом предпочтительном варианте осуществления клетка экспрессирует другую иммунную молекулу, выбранную из группы, включающей в себя цитокин, молекулу адгезии, кофактор стимуляции, ассоциированный с опухолью антиген, опухолеспецифический антиген и паразитарный антиген.

В более предпочтительном варианте осуществления паразитарный антиген представляет собой белок gp190/MSP1 Plasmodium, предпочтительно Plasmodium falciparum, или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой белок gpl90/MSPl Plasmodium, предпочтительно Plasmodium falciparum, или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

В одном из вариантов осуществления биологически активное средство представляет собой человеческий цитомегаловирус.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой вирусную частицу или совокупность вирусных частиц, предпочтительно высвобождаемых после инфицирования клеток млекопитающего человеческим цитомегаловирусом, при этом частицы (a) окружены липидной мембраной, в которую внедрены вирусные гликопротеины, и (b) не содержат ни вирусной ДНК, ни капсидов.

В предпочтительном варианте осуществления частицы содержат слитый белок, включающий в себя одну или несколько частей T-клеточного антигена pp65 (UL83) и одну или несколько частей одного или нескольких белков, отличных от pp65.

В предпочтительном варианте осуществления T-клеточный антиген pp65 слит с одним или несколькими фрагментами гликопротеина человеческого цитомегаловируса, где гликопротеин выбран из группы, включающей в себя гликопротеин gH HCMV, белок IE₁ (ppUL123) HCMV и гликопротеин gB HCMV.

В предпочтительном варианте осуществления T-клеточный антиген слит с одним или несколькими фрагментами белка, который является частью человеческого патогена, отличного от HCMV.

В предпочтительном варианте осуществления патоген выбран из группы, включающей в себя HIV-I, HBV, HCV и вирус гриппа.

В предпочтительном варианте осуществления частица(ы) содержит фрагменты по меньшей мере двух гликопротеинов, которые являются вариантами конкретных гликопротеинов из разных штаммов HCMV.

В более предпочтительном варианте осуществления один из двух вариантов конкретного гликопротеина HCMV представляет собой вариант, полученный из штамма HCMV Towne, а другой представляет собой вариант, полученный из штамма HCMV Ad169.

В предпочтительном варианте осуществления клетки млекопитающего представляют собой фибробласты, предпочтительно, фибробласты крайней плоти.

В предпочтительном варианте осуществления частица представляет собой плотное тело.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой плотное тело, предпочтительно, плотное тело HCMV или плотное тело, определенное в данном описании.

В одном из вариантов осуществления биологически активное средство представляет собой антиген микобактерии, предпочтительно Mycobacterium ssp.

В предпочтительном варианте осуществления микобактерия выбрана из группы, включающей в себя M.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis.

В предпочтительном варианте осуществления антиген представляет собой антиген 85.

Во втором аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря композиции, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей сочетание, предлагаемое в первом аспекте настоящего изобретения, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В третьем аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря сочетанию, предлагаемому в первом аспекте настоящего изобретения, или сочетанию, предлагаемому во втором аспекте настоящего изобретения, или каждому из компонентов такого сочетания, в производстве лекарственного средства.

В одном из вариантов осуществления лекарственное средство предназначено для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы, включающей в себя раковые и инфекционные заболевания.

Специалисты в данной области могут подтвердить, что композицию настоящего изобретения и ее компоненты, по отдельности или в сочетании, желательно использовать для профилактики заболевания. Соответствующие предпочтительные варианты осуществления основаны на том факте, что первый компонент сочетания способен вызывать иммунный ответ, более конкретно, специфический иммунный ответ, который позволяет соответствующему организму человека или животного бороться с заболеванием до проявления заболевания, более конкретно, до проявления клинических или медицинских симптомов заболевания.

В предпочтительном варианте осуществления рак представляет собой иммуногенную опухоль, где опухоль предпочтительно выбрана из группы, включающей в себя рак простаты, меланому, рак почки, опухоль молочной железы, опухоли мозга, немелкоклеточную карциному легкого, рак толстой кишки и сквамозную опухоль головы и шеи.

В альтернативном варианте осуществления инфекционное заболевание представляет собой малярию.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой белок gp190/MSP1 Plasmodium или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

В альтернативном варианте осуществления инфекционное заболевание представляет собой инфекцию HCMV, предпочтительно, инфекцию человеческого HCMV.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой плотное тело, как указано в данном описании.

В альтернативном варианте осуществления инфекционное заболевание представляет собой туберкулез.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой антиген из микобактерии, предпочтительно Mycobacterium ssp. Более предпочтительно, микобактерия выбрана из группы, включающей в себя M.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis. Еще более предпочтительно, антиген представляет собой антиген 85.

В четвертом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря применению сочетания, предлагаемого в первом аспекте настоящего изобретения, или каждого из компонентов такого сочетания, в производстве вакцины.

В пятом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря способу лечения пациента, страдающего заболеванием и нуждающегося в таком лечении, причем данный способ включает в себя введение сочетания, предлагаемого в первом аспекте настоящего изобретения, или фармацевтического сочетания, предлагаемого во втором аспекте настоящего изобретения.

В шестом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря способу промышленного получения фармацевтического сочетания, предпочтительно, фармацевтической композиции согласно второму аспекту настоящего изобретения, который включает в себя стадии

- предоставления в качестве первого компонента бактериальной клетки, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид фаголизосомального истечения;

- предоставления в качестве второго компонента биологически активного средства; и

- получения фармацевтической композиции, содержащей первый и второй компоненты.

В седьмом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря способу промышленного получения фармацевтического сочетания, предпочтительно, фармацевтической композиции согласно второму аспекту настоящего изобретения, который включает в себя стадии

- предоставления в качестве первого компонента бактериальной клетки, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид фаголизосомального истечения;

- предоставления в качестве второго компонента биологически активного средства; и

- получения отдельных композиций первого и второго компонентов.

В одном из вариантов осуществления композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в одну упаковку.

Альтернативно, композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в разные упаковки.

В более предпочтительном варианте осуществления упаковки могут содержать одну разовую дозу или несколько разовых доз.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что грамположительная или грамотрицательная бактериальная клетка, экспрессирующая пептид или полипептид фаголизосомального истечения, является особенно эффективным адъювантом, который можно использовать в сочетании с биологически активным средством. Более конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что Mycobacterium bovis, предпочтительно бацилла Кальметта-Герена (BCG) Mycobacterium bovis, и более предпочтительно микобактерия, такая как BCG, кодирующая или экспрессирующая пептид или полипептид фаголизосомального истечения, является подходящим средством для индуцирования или усиления иммунного ответа, особенно при использовании биологически активных средств, более предпочтительно других биологически активных иммуногенных средств. К наиболее предпочтительному типу биологически активных средств, вызывающих иммунный ответ, относятся клетки, экспрессирующие по меньшей мере один цитокин или паразитарный антиген, или опухолевый или паразитарный антиген, или вирусный антиген.

Без связи с какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что пептид или полипептид фаголизосомального истечения позволяет антигенам, полученным из бактериальной клетки или из биологически активного средства, более эффективно индуцировать иммунный ответ, если такой пептид фаголизосомального истечения является доступным. Другими словами, истечение антигенов, образующихся при улавливании бактериальной клетки фаголизосомами, из фаголизосомов и презентирование их для иммунной системы увеличивает доступность специфических антигенов BCG и, следовательно, обеспечивает превосходный эффект адъюванта, используемого в соответствии с настоящим изобретением.

Данный вид доставки пептидов в путь презентирования MHC класса I может усиливать уже существующий BCG-специфичный иммунный ответ и адъювантную активность BCG.

Адъювантный эффект BCG, более конкретно, BCG или любого микроорганизма, предпочтительно любого микроорганизма Mycobacterium, который кодирует или экспрессирует пептид или полипептид фаголизосомального истечения, является другим неожиданным открытием авторов настоящего изобретения, которому можно найти применение путем использования такого микроорганизма, вызывающего адъювантный эффект, в сочетании или при совместном введении с другим или вторым биологически активным средством. В отличие от других адъювантов, которые индуцируют иммунный ответ TH2, описанный выше адъювант, т.е. микроорганизм, может вызывать иммунный ответ TH1. Такой иммунный ответ TH1 полезен тем, что он индуцирует клеточный иммунный ответ. Следовательно, в другом аспекте данное изобретение относится к применению микроорганизма, который кодирует и/или экспрессирует пептид фаголизосомального истечения, причем микроорганизм предпочтительно представляет собой BCG, более предпочтительно BCG, описанный в данном документе, и наиболее предпочтительно ureC-дефицитный BCG, в качестве адъюванта.

Еще более неожиданным для авторов настоящего изобретения оказалось то, что микроорганизм, предпочтительно BCG или его производные, которые кодируют и/или экспрессируют пептид фаголизосомального истечения, более предпочтительно BCG, описанный в разных вариантах осуществления данного документа, включающий в себя, без ограничения, rBCG:Hly, и наиболее предпочтительно ureC-дефицитный BCG, такой как BCG:rBCG ureC:Hly, а также их производные, превосходят BCG, не содержащий пептид фаголизосомального истечения, поскольку они способны индуцировать четко выраженный ответ CD8, специфичный для соответствующего микроорганизма, такого как микобактерия, и, кроме того, четко выраженный ответ CD8, специфичный для антигена, представленного биологически активным средством, или в виде биологически активного средства, как раскрыто и/или определено в данном описании. Другими словами, микроорганизм, используемый или упоминаемый здесь как первый компонент, в соответствии с данным вариантом осуществления содержащий пептид фаголизосомального истечения и, более предпочтительно, также отрицательный по ureC, не ограничивается способностью вызывать микроорганизм-специфичный иммунный ответ CD8, в противоположность тому, что могли ожидать специалисты в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления такой пептид или полипептид фаголизосомального истечения представляет собой полипептид фаголизосомального истечения L.monocytogenes, листериолизин (Hly). Листериолизин представляет собой порообразующий сульфгидрил-активированный цитолизин и отвечает за высвобождение микроорганизмов L.monocytogenes из фаголизосомальных вакуолей в цитозоль клетки-хозяина. Как описано в международной патентной заявке PCT/EP2004/004345, данная функция высвобождения может выполняться в отношении разных бактериальных клеток, таких как Bacillus subtilis, штаммы Salmonella ssp. с пониженной вирулентностью, а также микобактерии. Кроме того, международная патентная заявка WO 99/101496 раскрывает рекомбинантные штаммы Mycobacterium bovis, которые секретируют биологически активные слитые белки листериолизина. Таким образом, бактериальная клетка, образующая первый компонент композиции настоящего изобретения, обладает механизмом образования пор, обеспечивающим перфорацию эндосомальных мембран и, как следствие, превосходную иммунологическую защиту.

Специалистам в данной области известно, что существует несколько доменов фаголизосомального истечения, причем домен фаголизосомального истечения листерии, описанный, например, в US 5733151, является предпочтительным. Более предпочтительно, домен фаголизосомального истечения получают из организма L.monocytogenes, наиболее предпочтительно домен фаголизосомального истечения кодирует молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из a) нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотиды 211-1722 последовательности SEQ ID NO: 1, b) нуклеотидной последовательности, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и последовательность пункта a), и c) нуклеотидной последовательности, гибридизующейся в жестких условиях с последовательностью пункта a) или b). Другие полипептиды фаголизосомального истечения, которые можно использовать с такой целью, включают в себя, в числе прочих, гемолизин (Perfringolysin) из Clostridium perfringens (O'Brien DK, et al. Infect Immun. 2004 Sep; 72(9): 5204-15); гемолизин из Vibrio, более конкретно, Vibrio vulnificus (Lee SE et al., Biochem Biophys Res Commun. 2004 Nov 5; 324(1): 86-91); гемолизин/цитолизин из стрептококков группы B (Liu GY et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 5; 101(40): 14491-14496. Epub 2004 Sep 20); гемолизин BL из Bacillus, более конкретно, Bacillus cereus (Moravek M et al., FEMS Microbiol Lett. 2004 Sep 1; 238(1): 107-13); гемолизин из Bordetella, более конкретно, Bordetella pertusis (Bassinet L et al., Infect Immun. 2004 Sep; 72(9): 5530-3); гемолизин из Escherichia coli (Wyborn NR et al., Microbiology. 2004 May; 150(Pt 5): 1495-505) и гемолизин из Shigella (Sharma K et al., Microbios. 2001; 106(413): 31-8).

Помимо нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, гибридизующиеся с указанной последовательностью. В настоящем изобретении термин «гибридизация» используется в значении, определенном в Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). Согласно настоящему изобретению термин «гибридизация» используется, если положительный сигнал гибридизации наблюдается после промывания в течение одного часа 1×SSC и 0,1% SDS при 55°C, предпочтительно при 62°C, более предпочтительно при 68°C. Последовательность, гибридизующаяся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 в указанных условиях промывания, представляет собой предпочтительную нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, кодирующую домен фаголизосомального истечения.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая домен фаголизосомального истечения, как описано выше, может быть получена непосредственно из организма Listeria или из любого рекомбинантного источника, например, из рекомбинантной клетки E.coli, содержащей соответствующую молекулу нуклеиновой кислоты Listeria или ее вариант, как описано выше.

Следует понимать, что такая бактериальная клетка, содержащая по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид фаголизосомального истечения, более конкретно, бактериальная клетка, представляющая собой клетку микобактерии, содержащую Hly, является особенно предпочтительной для композиции настоящего изобретения. В другом предпочтительном варианте осуществления указанная бактериальная клетка является также дефицитной по уреазе, более конкретно, дефицитной по ureC. Такой организм также называют BCG:rBCG ureC:Hly или BKG.

Микобактерия, более конкретно, бацилла Кальметта-Герена Mycobacterium bovis (BCG), широко используется как жизнеспособная вакцина для профилактики туберкулеза, хотя ее эффективность остается сомнительной. Тем не менее, известно, что BCG может предотвращать возникновение системного туберкулеза у детей или по меньшей мере облегчать его тяжелые формы.

Однако в настоящее время разработаны новые формы BCG. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти новые формы BCG являются особенно полезными адъювантами при введении вместе с биологически активным средством и, следовательно, могут использоваться в качестве первого компонента сочетания настоящего изобретения.

Бактериальная клетка, которая используется в качестве первого компонента сочетания настоящего изобретения, предпочтительно является дефицитной по уреазе. Данная особенность приводит к повышению профиля безопасности, поскольку из-за недостатка мочевины микобактериальная клетка не выживает в среде, в которой требуется такая ферментативная активность, например, в фаголизосоме.

Дефицита по уреазе можно достичь путем частичной или полной инактивации одной или нескольких молекул клеточных нуклеиновых кислот, которые кодируют субъединицы уреазы, в частности, ureA, кодирующей субъединицу уреазы A, ureB, кодирующей субъединицу уреазы B и/или ureC, кодирующей субъединицу уреазы C. Последовательности ureA, ureB и ureC из Mycobacteria, в частности, M.bovis и M.tuberculosis, а также кодируемые ими белки, описаны Reyrat et al. (1995) и Clemens et al. (1995), которые включены в данное описание в качестве ссылки.

Предпочтительно дефицитный по уреазе бактериальный штамм получают путем делеций и/или инсерций одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях, кодирующих субъединицы уреазы, и/или в последовательностях, контролирующих экспрессию. Делеции и/или инсерции можно осуществить путем гомологичной рекомбинации, инсерции транспозона или с помощью других подходящих методов.

В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность ureC инактивируют, например, путем конструирования вектора-«самоубийцы», содержащего ген ureC, разорванный геном маркера селекции, трансформирования клетки-мишени вектором и отбора клеток, содержащих маркер селекции и имеющих уреаза-отрицательный фенотип, как описано Reyrat et al. (выше).

В соответствии с настоящим изобретением в качестве бактериальной клетки, образующей первый компонент композиции настоящего изобретения, можно использовать разные виды микобактерий, а именно, M.bovis, M.tuberculosis, M.microti, M.smegmatis, M.canettii, M.marinum или M.fortuitum. Согласно настоящему изобретению также можно использовать другие микроорганизмы, предпочтительно внутриклеточные микроорганизмы, которые обладают одной или обоими из вышеупомянутых характеристических особенностей, а именно, кодируют или экспрессируют пептид или полипептид фаголизосомального истечения, и являются отрицательными по уреазе, более конкретно, ureC-отрицательными.

В другом варианте осуществления соответствующая бактериальная клетка является ослабленной. В более предпочтительном варианте осуществления бактериальная клетка является ослабленной, но еще живой и предпочтительно способной вызывать ответ TH1.

В более предпочтительном варианте осуществления соответствующая бактериальная клетка представляет собой живую бактериальную клетку.

В другом варианте осуществления бактериальная клетка дополнительно содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего. В данном описании термин «вызывающий иммунный ответ у млекопитающего» означает, что при воздействии такого пептида или полипептида на иммунную систему млекопитающего, или ее часть, может генерироваться иммунный ответ, опосредованный B-клетками. Однако альтернативно иммунный ответ может опосредоваться T-клетками, более предпочтительно, MHC класса 1-ограниченный CD 8 T-клеточный ответ.

Более предпочтительно такой пептид или полипептид выбран из группы, включающей в себя аутоантигены, опухолевые антигены, вирусные антигены, паразитарные антигены, бактериальные антигены и их иммуногенные фрагменты. Предпочтительно иммуногенный фрагмент представляет собой часть такого антигена, которая еще способна вызвать иммунный ответ. Особенно предпочтительным антигеном является белок gp190/MSP1 Plasmodium, подробно описанный в данном документе. Другим особенно предпочтительным вирусным антигеном является плотное тело HCMV, подробно описанное в данном документе. Следующим антигеном является антиген, способный вызвать иммунный ответ против туберкулеза, более конкретно, против Mycobacterium tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis. Особенно предпочтительным антигеном является антиген 85. Такой антиген в предпочтительном варианте осуществления представляет собой второй компонент.

Специалистам в данной области следует понимать, что используемый в данном описании термин антиген также может включать в себя фрагменты или мутантные формы антигена. Фрагменты и мутантные формы можно использовать в качестве соответствующих антигенов, если мутантная форма или фрагмент обладают по меньшей мере одной характеристической особенностью полноразмерного антигена или антигена дикого типа. Предпочтительно такая характеристическая особенность представляет собой способность вызывать иммунный ответ, более предпочтительно вызывать иммунный ответ при использовании вместе или в сочетании с первым компонентом или адъювантом, как описано в данном документе. В еще более предпочтительном варианте осуществления такой иммунный ответ представляет собой специфический CD8-иммунный ответ. Вышесказанное применимо также к полипептидам и белкам, соответственно.

Кроме того, специалистам в данной области следует понимать, что термины «нуклеиновая кислота» и «нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид или белок» также необязательно включают в себя фрагмент или мутантную форму полипептида или белка, соответственно, как определено в предпочтительных вариантах осуществления данного описания, с учетом вырожденности генетического кода или необходимости адаптации последовательности к использованию кодона соответствующим хозяином или продуцирующим организмом.

Выражение «полипептид, белок или антиген, полученный из организма» предпочтительно означает, что аминокислотная последовательность соответствующего полипептида, белка или антигена является последовательностью соответствующего организма, при этом последовательность и, следовательно, кодирующая ее нуклеиновая кислота могут находиться в виде фрагментов и мутантных форм.

Следует понимать, что пептид или полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, можно использовать в качестве второго компонента композиции. В объем настоящего изобретения входит пептид или полипептид, который является частью слитого полипептида. Предпочтительно такой слитый полипептид содержит пептид или полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, или его домен, сохраняющий данную способность, и, кроме того, слитый полипептид содержит домен фаголизосомального истечения, предпочтительно домен фаголизосомального истечения, описанный выше в связи с вариантами осуществления, относящимися к первому компоненту настоящего изобретения. Домен полипептида, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, в случае, если такой пептид является бактериальным антигеном, может быть получен из микроорганизма, предпочтительно относящегося к роду Mycobacterium, более предпочтительно Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium bovis. Длина данного домена составляет по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 8 аминокислот. Иммуногенный домен предпочтительно является частью нативного полипептида Mycobacterium. Однако в объем настоящего изобретения также входят модифицированные иммуногенные домены, которые можно получить из нативного иммуногенного домена путем замены, делеции и/или добавления одной или нескольких аминокислот.В предпочтительном варианте осуществления домен представляет собой домен белка gp190/MSP1 Plasmodium.

В одном из вариантов осуществления слитый белок кодирует рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, а именно, молекула нуклеиновой кислоты с последовательностью SEQ ID NO: 1. Данная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид (нуклеотиды 1-120), последовательность, кодирующую иммуногенный домен (нуклеотиды 121-153), последовательность, кодирующую линкерный пептид (нуклеотиды 154-210), последовательность, кодирующую фаголизосомальный домен (нуклеотиды 211-1722), последовательность, кодирующую другой линкерный пептид (нуклеотиды 1723-1800), и последовательность, кодирующую рандомизированный пептид (нуклеотиды 1801-1870). Соответствующая аминокислотная последовательность приведена в SEQ ID NO: 2.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, более конкретно, если первый компонент представляет собой либо rBCG:Hly, либо rBCGAureC:Hly, второй компонент представляет собой биологически активное средство, более конкретно, генетически измененную клетку. Предпочтительно генетически измененная клетка представляет собой эукариотическую клетку. Более предпочтительно такая генетически измененная клетка экспрессирует по меньшей мере один цитокин. Под цитокином в данном описании подразумевается секретируемый белок, который влияет на поведение и характеристические особенности других клеток. Предпочтительными цитокинами являются интерлейкины, хемокины, лимфокины, монокины и факторы роста. Особенно предпочтительными цитокинами являются интерлейкины и интерфероны, причем предпочтительными интерлейкинами являются интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, предпочтительно интерлейкин-2, а интерферон предпочтительно представляет собой интерферон-альфа, интерферон-бета или интерферон-гамма, более предпочтительно интерферон-гамма.

В данном описании генетически измененная клетка представляет собой клетку, модифицированную с использованием генетической конструкции, которую получают путем вставки экзогенного генетического материала. Такая модификация с использованием генетической конструкции включает в себя введение генетического материала, пока не присутствующего в клетке, который на самом деле является чужеродной нуклеиновой кислотой, или активирует часть эндогенного генетического материала, причем такой эндогенный генетический материал не присутствует или не активен в отсутствие указанного экзогенного генетического материала, а экзогенный генетический материал не обязательно является генетическим материалом, но может представлять собой любое вещество, обладающее соответствующей активностью. Способы осуществления такой модификации хорошо известны в данной области. Например, для введения экзогенной ДНК в клетку можно использовать метод осаждения фосфатом кальция, вирусный вектор, электропорацию, липофекцию, системы вирусных векторов, такие как аденоассоциированные вирусные системы, микроинъекцию или биолистические методы. Результат такой генетической манипуляции заключается в том, что генетически измененная клетка приобретает способность экспрессировать определенный генный продукт, который она не экспрессировала ранее.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что совместная экспрессия интерлейкинов, более конкретно, интерлейкина-2 и интерферона-гамма, в сочетании с бактериальной клеткой, описанной как первый компонент сочетания настоящего изобретения, позволяет эффективно усилить иммунный ответ организма, более конкретно, ответ TH1. Конкретная клетка может быть выбрана из ряда таких клеток, как непрофессиональные антиген-презентирующие клетки, профессиональные антиген-презентирующие клетки, опухолевые клетки и дендритные клетки. Среди указанных типов клеток особенно предпочтительны опухолевые клетки. Введение таких опухолевых клеток раковым пациентам повышает эффективность противоопухолевой вакцинации. Клетки для такой вакцинации предпочтительно получают из опухоли, идентичной или подобной опухоли, подлежащей лечению сочетанием настоящего изобретения. Таким образом, благоприятные эффекты, оказываемые генетически измененными клетками, которые описаны, в числе прочих, в международной патентной заявке WO 94/18995, дополнительно увеличиваются при применении бактериальной клетки в качестве первого компонента сочетания настоящего изобретения.

В объем настоящего изобретения входит профессиональная антиген-презентирующая клетка, которая представляет собой дендритную клетку, либо используемую в качестве биологически активного средства, как описано в данном документе, либо представляющую собой дополнительный компонент биологически активного средства, причем в таком варианте осуществления биологически активное средство предпочтительно представляет собой генетически измененную клетку, более предпочтительно клетку, экспрессирующую цитокин, как описано в данном документе, еще более предпочтительно клетку, одновременно экспрессирующую два цитокина, наиболее предпочтительно интерлейкин-2 и интерферон-гамма. Дендритные клетки предпочтительно нагружают антигенами, полученными из опухоли, подлежащей лечению с использованием дендритной клетки, предпочтительно в сочетании с адъювантами, как описано в данном документе, и/или с использованием сочетания адъюванта и биологически активного средства, такого как, например, указанные клетки, совместно экспрессирующие цитокины. Способы нагружения дендритных клеток известны специалистам в данной области и описаны, например, Van and Hart ((2004), Cytotherapy: 6(2): 111-121). Такие дендритные клетки сами по себе или в сочетании с любым из описанных в данном документе адъювантов, в особенности BCG и BKG, или любое сочетание первого и второго компонентов, описанное в данном документе, предпочтительно используют для лечения любого из описанных в данном документе заболеваний. Предпочтительно такое заболевание представляет собой описанное в данном документе опухолевое заболевание.

Предпочтительные опухолевые и раковые заболевания, соответственно, которые можно лечить с помощью описанного способа, включают в себя, в частности, иммуногенные опухолевые или раковые заболевания, такие как, в числе прочих, меланома, рак почки, опухоль молочной железы, опухоль мозга, опухоль простаты, немелкоклеточная карцинома легкого, карцинома толстой кишки и сквамозные опухоли головы и шеи.

Экспрессия цитокина и, более конкретно, совместная экспрессия интерлейкина-2 и интерферона-гамма обеспечивают повышенную эффективность опухолевых антигенов, презентированных генетически измененной клеткой. Усиление противоопухолевого ответа обусловлено двумя разными механизмами, действующими в одном направлении. С одной стороны, секреция IFN вызывает увеличение экспрессии MHC и молекул адгезии на клеточной поверхности, что приводит к улучшению презентации опухолеспецифичных антигенов T-клеткам CD8⁺ при посредстве молекул MHC I и, следовательно, к улучшению распознавания опухолевых клеток T-клетками. С другой стороны, секреция IL-2 вблизи опухолевых клеток вызывает увеличение активности T-клеток CD8⁺ . Таким образом, генетически измененная клетка, предпочтительно экспрессирующая по меньшей мере один цитокин, в предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере в некоторой степени относится к опухоли, для лечения которой ее используют. Конечно, следует понимать, что можно использовать другие клеточные линии, причем предпочтительно, если указанная клетка помимо того, что она является генетически измененной, как описано в данном документе, также экспрессирует определенные антигены, характерные для опухоли, подлежащей лечению с помощью указанного способа.

Специалисты в данной области допускают, что генетически измененной клеткой в принципе может быть аутологичная клетка. Это означает, что клетки берут у пациента, подлежащего лечению сочетанием настоящего изобретения, причем клетки обычно берут из опухоли, подлежащей лечению, и подвергают их манипуляциям с получением генетически измененных клеток, описанных в данном документе. Затем полученные клетки снова вводят пациенту как часть сочетания настоящего изобретения.

Чтобы повысить эффективность генетически измененных клеток, им придают способность экспрессировать другую иммунную молекулу. В данном описании термин «иммунная молекула» относится к молекуле, способной влиять на иммунную систему. Иммунные молекулы включают в себя, в числе прочих, цитокины, молекулы адгезии, кофакторы стимуляции, ассоциированные с опухолью антигены, опухолеспецифические антигены и паразитарные антигены.

В другом варианте осуществления генетически измененная клетка представляет собой аллогенную клетку. В предпочтительном варианте осуществления аллогенная клетка представляет собой клетку, взятую у другого организма того же вида. Аллогенные клетки - это клетки, полученные от организмов одного вида, но имеющие разный антигенный профиль. В особенно предпочтительном варианте осуществления аллогенная клетка совпадает с клетками соответствующей опухоли, подлежащей лечению. Более предпочтительно совпадение существует по некоторым или всем классам человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA), присутствующих у пациентов, подлежащих лечению сочетанием настоящего изобретения. Однако можно использовать клетки с разной степенью совпадения. Более конкретно, совпадение существует по HLA класса I. HLA класса I включают в себя подклассы A, B и C. Совпадение по HLA класса I имеет место, если существует совпадение между клеткой, используемой в качестве второго компонента композиции настоящего изобретения, и клетками опухоли пациента, подлежащего лечению указанной композицией.

Следует понимать, что совпадение и степень такого требуемого совпадения находятся в сфере компетенции рядового специалиста в данной области. Один из возможных экспериментальных подходов включает в себя инокулирование разных групп животных/пациентов клетками с разной степенью совпадения и затем сенсибилизацию опухолью с последующим анализом полученных эффектов. Альтернативно, тестирование можно проводить непосредственно на опухолевых пациентах.

Особенно предпочтительной клеточной линией является LNCaP, которая одновременно экспрессирует интерлейкин-2 и интерферон-гамма и которую можно использовать в качестве второго компонента в сочетании настоящего изобретения, более конкретно, для лечения рака простаты, причем первым компонентом является rBCG:Hly или rBCG ureC:Hly.

В другом варианте осуществления биологически активное средство представляет собой паразитарный антиген, более конкретно, белок gp190/MSP1 Plasmodium. Предпочтительно соответствующий антиген получают из Plasmodium falciparum. Предпочтительно соответствующий антиген получают из аминокислотной последовательности белка MSP-1 Plasmodium, предпочтительно из белка MSP-1 Plasmodium falciparum. Термин «паразитарный антиген» в данном описании относится к полноразмерному антигену, а также к его фрагментам, способным вызывать иммунный ответ, более предпочтительно ответ TH1 или ответ, опосредованный TH1, предпочтительно у млекопитающего, более предпочтительно в составе композиции настоящего изобретения, причем первый компонент наиболее предпочтительно представляет собой rBCG:Hly и rBCG ureC:Hly, соответственно.

Данный вариант осуществления в особенности используется при лечении малярии.

В объем настоящего изобретения входит паразитарный антиген, который может экспрессироваться бактериальной клеткой, действуя как первый компонент или сочетание настоящего изобретения, или эукариотической клеткой, действуя как второй компонент композиции настоящего изобретения. Однако в объем настоящего изобретения также входит паразитарный антиген, экспрессирующийся бактериальной клеткой, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид фаголизосомального истечения, как указано в разных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Следует понимать, что gp190/MSP состоит из нескольких природных доменов и что такие домены либо по отдельности, либо в сочетании могут составлять паразитарный антиген, предпочтительно используемый в данном изобретении. gp190/MSP1 считается потенциальным кандидатом для вакцины против малярии. Однако его получение является очень сложным, и широкомасштабное производство данного антигена считается невозможным. С этой точки зрения потенциальная вакцина против малярии пока не доступна. Однако благодаря техническим разработкам международной патентной заявки WO 98/14583 данный антиген Plasmodium в настоящее время можно получать в больших количествах. Следует понимать, что такой паразитарный антиген включает в себя не только антиген gp190/MSP1, но и его гомологи, обнаруженные в других видах Plasmodium, отличных от Plasmodium falciparum, например, в P.vivax. Технические разработки указанной международной патентной заявки включены в данное описание в качестве ссылки и позволяют специалисту в данной области получать данный антиген в любых количествах, необходимых для включения его в состав композиции настоящего изобретения в качестве второго компонента. ДНК-вакцины описаны, например, в Grode L, Mollenkopf HJ, Mattow J, Stein M, Mann P, Knapp B, Ulmer J, Kaufmann SH. Application of mycobacterial proteomics to vaccine design: improved protection by Mycobacterium bovis BCG prime-Rv3407 DNA boost vaccination against tuberculosis. Infect Immun. 2004 Nov; 72(11):6471-9.

В другом варианте осуществления биологически активное средство представляет собой частицу или группу вирусных частиц, или совокупность вирусных частиц, которые предпочтительно высвобождаются после инфицирования клеток млекопитающего человеческим цитомегаловирусом (HCMV), при этом частицы (a) окружены липидной мембраной, в которую внедрены вирусные гликопротеины, и (b) не содержат ни вирусной ДНК, ни капсидов, или представляют собой плотные тела, предпочтительно плотные тела человеческого цитомегаловируса. Такие частицы, как более подробно описано ниже, предпочтительно используют для профилактики и/или лечения инфекции человеческого цитомегаловируса, который представляет собой вирус бета-герпеса. Способ лечения с использованием сочетания данного аспекта настоящего изобретения особенно подходит для пациентов, которым предстоит трансплантация костного мозга.

Иммунокомпетентные субъекты обычно не замечают инфекцию HCMV, которая имеет слабовыраженные и неспецифические симптомы. И наоборот, в некоторых группах риска, например, у пациентов с ослабленным иммунитетом, таких как пациенты, страдающие от СПИДа, реципиенты трансплантата и пациенты, перенесшие внутриутробную инфекцию, инфекция HCMV протекает тяжело, и, следовательно, такие субъекты составляют другую группу пациентов, которых можно лечить сочетанием адъюванта и соответствующих частиц.

Технические разработки международной патентной заявки PCT/EP 00/01794 доказывают, что так называемые плотные тела HCMV эффективно индуцируют иммунный ответ и, в конечном счете, иммунную защиту против инфекции HCMV. Так, указанные плотные тела обеспечивают длительную индукцию нейтрализующих антител, которые защищают от инфекции HCMV с перекрывающимися штаммами. Данный механизм реализуется путем эффективной индукции так называемого хелперного ответа против HCMV (опосредуемого CD4-положительными T-лимфоцитами), который способствуют созреванию В-лимфоцитов, секретирующих антитела. Кроме того, указанные плотные тела могут индуцировать образование цитотоксических T-клеток против HCMV, которые играют важную роль в прекращении существующей инфекции HCMV и ограничивают распространение вируса в организме. Наконец, плотные тела способны минимизировать побочные эффекты вакцины.

Плотные тела образуются при инфицировании HCMV и высвобождаются в питательную среду культуры инфицированных первичных фибробластов человека. Они представляют собой структуры, видимые под электронным микроскопом и имеющие белковую массу, которая более чем на 90% состоит из pp65. Они сравнимы с вирусными частицами по способности модифицировать клеточную липидную мембрану вирусными гликопротеинами и выходить из клетки. Вирусные гликопротеины присутствуют в наружной оболочке, имеющей прииродную конформацию, с высокой степнью вероятности. Поскольку плотные тела не содержат вирусной ДНК и вирусного капсида, они не являются инфекционными. Их можно выделить из супернатанта клеточной культуры с помощью известных методов. Такие плотные тела, особенно в сочетании с описанным в данном документе адъювантом, можно использовать для получения как профилактических, так и терапевтических вакцин.

Плотные тела окружены липидной мембраной, которая делает возможным слияние частиц с некоторыми клетками млекопитающих, в результате чего содержимое частицы проникает в цитоплазму клетки. Мембрана частицы содержит вирусные гликопротеины, которые являются основными антигенами для антител, нейтрализующих вирусы. Частицы также характеризуются отсутствием вирусной ДНК и капсидов. Кроме того, они содержат вирусный T-клеточный антиген pp65 (ppUL83), который стимулирует образование T-хелперных клеток и является необходимым условием для индуцирования цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) против HCMV.

Перечисленные свойства, особенно сочетание антигенов, способных индуцировать образование нейтрализующих антител и адекватный клеточный ответ, делают указанные частицы пригодными для применения в качестве вакцины против HCMV.

Кроме того, независимо от способа введения, плотные тела индуцируют Т-хелперные ответы типа Th1, что позволяет квалифицировать их как вакцину против HCMV.

В другом варианте осуществления описаны плотные тела или соответствующие частицы, которые содержат слитый белок, одна часть которого включает в себя один или несколько фрагментов вирусного T-клеточного антигена pp65 (ppUL83) или белка, а другая часть включает в себя один или несколько фрагментов одного или нескольких других белков.

Это позволяет оптимизировать антигенность частиц, поскольку указанный слитый белок присутствует в частицах в большом количестве. Кроме того, экспрессия антигенов клеточного и гуморального иммунного ответа в одной молекуле может заметно повышать антигенность. Разные фрагменты pp65 и других белков могут быть слиты вместе непосредственно или, например, с помощью четырех линкерных последовательностей, которые не являются природными компонентами одного из используемых белков и находятся между разными фрагментами. Последовательности данного типа могут возникать в результате клонирования, или они могут быть введены специально с целью изменения свойств антигена. Однако слитый белок предпочтительно не содержит чужеродных последовательностей, которые не являются компонентами одного из партнеров слияния. В таких вариантах осуществления слитый белок состоит из одного или нескольких фрагментов pp65 и одного или нескольких фрагментов одного или нескольких других белков.

Во всех описанных вариантах осуществления слитый белок может содержать полноразмерный pp65 или один или несколько его фрагментов. Фразу «слитый белок (включающий в себя) pp65» в контексте данной заявки не следует понимать, как ограниченную полноразмерным pp65. «Часть» или «фрагмент» белка, входящие в состав слитого белка, включают в себя по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 8, наиболее предпочтительно по меньшей мере 9, 15 или 20 последовательных аминокислот белка, к которому относятся часть или фрагмент.

Предпочтительный вариант осуществления включает в себя слитый белок pp65 (ppUL83) и один или несколько нейтрализующих эпитопов вирусных гликопротеинов gB или gH. Частицы данного типа можно получить по способу, описанному в международной патентной заявке PCT/EP 00/01794. Слитый белок может проникать, посредством антиген-специфичного поглощения, в B-клетки, специфичные к гликопротеину, который, в свою очередь, может презентировать эпитопы обоих гликопротеинов и pp65 в рамках MHC класса II. Кроме того, фрагменты слитого белка также могут презентироваться профессиональными антиген-презентирующими клетками (APC) в рамках MHC класса II. В обоих случаях достигается эффективная стимуляция ответа TH как на pp65, так и на вирусные гликопротеины. Клетки TH способны стимулировать гликопротеин-специфичные B-клетки, которые презентируют пептиды pp65 и вирусные гликопротеины в рамках MHC класса II, к синтезу нейтрализующих антител, как гомологичных, так и гетерологичных. Кроме того, частицы данного типа могут, подобно инфекционным вирионам, поглощаться клетками, а пептиды pp65 можно вводить путем экзогенной загрузки в путь MHC класса I. Этого достигают, не всегда в случае инактивированных вакцин, путем стимуляции CTL-ответа на HCMV.

В другом предпочтительном варианте осуществления частицы содержат слитый белок, состоящий из pp65 и одного или нескольких фрагментов другого белка HCMV, белка IE1 (ppUL123). В состав слитого белка предпочтительно входят фрагменты белка IE1, против которых направлены цитотоксические T-клетки, продуцирующиеся в организме человека в процессе естественной инфекции. В некоторых случаях пептиды белка IE1 и пептиды pp65 презентируются разными молекулами MHC класса I. Добавление таких других эпитопов CTL из IE1 предпринимают для того, чтобы гарантировать, что после иммунизации инокулированные субъекты, которые экспрессируют разные молекулы MHC класса I, способны генерировать CTL против HCMV в максимально возможном объеме.

В другом предпочтительном варианте осуществления частицы содержат слитый белок, состоящий из pp65, одного или нескольких нейтрализующих эпитопов гликопротеинов HCMV и одного или нескольких эпитопов CTL IE1. Слияние pp65 с нейтрализующими эпитопами и эпитопами CTL осуществляют для того, чтобы обеспечить одновременную продукцию нейтрализующих антител и CTL у инокулированных субъектов в максимально возможном объеме, т.е. у максимального числа людей, различающихся по профилю MHC класса I.

В другом предпочтительном варианте осуществления частицы содержат слитый белок, состоящий из pp65 и одного или нескольких эпитопов другого человеческого патогена. Подходящими фрагментами других человеческих патогенов являются антигены, против которых в организме человека образуются нейтрализующие антитела. Вследствие слияния таких «нейтрализующих антигенов» с T-клеточным антигеном pp65 можно ожидать значительного увеличения иммунного ответа (гуморального) по сравнению с применением выделенного «нейтрализующего антигена». Примерами таких «нейтрализующих антигенов», которые следует отметить, являются поверхностные белки вируса гепатита B (из участка HBsAG), вируса гепатита C (например, E2), вируса иммунодефицита человека (HIV, из участка Env), вируса гриппа (гемагглютинин, нейраминидаза, нуклеопротеин) или других вирусных патогенов. Другими подходящими человеческими патогенами являются бактерии, такие как Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria, meningitidis и другие. Наконец, с pp65 могут быть слиты антигены из эукариотических патогенов, таких как Plasmodia (малярия).

В другом предпочтительном варианте осуществления частицы содержат слитый белок, состоящий из pp65 и одного или нескольких фрагментов белков других патогенов, против которых в организме человека генерируются CTL при естественной инфекции данных патогенов. Примерами таких эпитопов CTL, которые могут быть отмечены, являются фрагменты белков HIV-I, HBV, HCV или вируса гриппа. Цель такой процедуры заключается в использовании уникальных иммуногенных свойств плотных тел для генерирования защитных CTL против гетерологичных патогенов у людей.

В другом предпочтительном варианте осуществления частицы содержат слитый белок, состоящий из pp65, одного или нескольких нейтрализующих эпитопов гетерологичного патогена и одного или нескольких эпитопов CTL того же патогена. Это слияние осуществляют для того, чтобы обеспечить одновременную продукцию защитных антител и CTL против данного патогена у инокулированных субъектов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вирусным частицам, содержащим по меньшей мере два разных гликопротеина, которые являются вариантами одного и того же гликопротеина из разных штаммов HCMV.

Предпочтительный вариант осуществления содержит именно два варианта, причем один вариант соответствует штамму HCMV Towne, а другой вариант соответствует штамму HCMV Ad169. Предпочтительный вариант осуществления содержит гликопротеин gB как из штамма Towne, таки и из штамма Ad169.

Два указанных белка можно с одинаковой эффективностью внедрить в мембрану рекомбинантных плотных тел, находящихся в инфицированной клетке. Такие рекомбинантные плотные тела способны индуцировать не только штамм-перекрывающий, но и штамм-специфичный нейтрализующий иммунный ответ против двух эталонных штаммов HCMV.

Наконец, данное изобретение также относится к способу получения вирусных частиц, которые совсем не содержат инфекционного вируса. В данном описании термин «не содержащий инфекционного вируса» предпочтительно означает, что полученные препараты не являются инфекционными на детектируемом уровне. Если частицы получают из клеточной популяции, инфицированной HCMV, существует риск, что инфекционные вирусные частицы будут присутствовать в процессе очистки частиц. Это является недостатком для вакцины.

Способ данного изобретения минимизирует этот риск. Для достижения данной цели вначале получают штамм HCMV, несущий делецию в основном гене. Под данной делецией подразумевают делецию функции гена. В большинстве случаев это означает, что отсутствует функциональный генный продукт, но это также может означать, что произошло нарушение функции регуляторной последовательности гена, приводящее к утрате жизнеспособности HCMV. Этого можно достичь путем изменения нуклеотидной последовательности HCMV, например, в результате точечных мутаций, конкретных делеций, инсерций или других мутаций. Полученный дефектный вирус может реплицироваться только в клетках, которые экспрессируют ген, удаленный из HCMV, и, следовательно, обеспечивают условия для сборки вириона. В настоящее время единственной системой, пригодной для репликации HCMV in vitro, являются первичные фибробласты. До настоящего времени стабильная трансфекция таких клеток была возможна только с использованием ретровирусов. Однако это является серьезным недостатком, если такие клетки используются для получения вакцин. Способ данного изобретения позволяет получать трансфицированные клетки, в которых может реплицироваться HCMV, без использования ретровирусного гена.

Предпочтительный вариант осуществления включает в себя фибробласты крайней плоти человека, стабильно трансфицированные геном основного капсидного белка UL86. Предпочтительно трансфекцию проводят с использованием липид-содержащего вспомогательного средства, значительно повышающего эффективность трансфекции. В предпочтительном варианте осуществления для трансфекции используется «реагент Fugene», который поставляется Roche Diagnostics, Mannheim.

Дефектный вирус, у которого удален ген основного капсидного белка UL86, может быть реплицирован в данных клетках. Если «не взаимодействующие с комплементом» фибробласты инфицируют данным дефектным вирусом, то впоследствии из них можно выделить частицы вирусной вакцины, не содержащие инфекционных вирусных частиц.

Другим способом получения частиц данного изобретения, не обладающих инфекционностью, является воспроизведение данных частиц в клетках, не инфицированных HCMV. В данном способе все гены, кодирующие компоненты частиц, экспрессируют в указанных клетках. Для достижения этого указанные гены должны быть введены в клетки.

Для этой цели предпочтительно используют клетки насекомых, инфицированные бакуловирусами. Гены, кодирующие полипептидные компоненты частиц, клонируют в бакуловирусных векторах экспрессии. Продукция рекомбинантных бакуловирусов сопровождается одновременным инфицированием клеток насекомых, предпочтительно клеток Sf9, разными вирусами. Гены экспрессируют в клетках насекомых и полученные полипептиды объединяют с получением целевых частиц. После чего частицы высвобождаются из клеток насекомых. Описанный способ позволяет получать неинфекционные частицы, которые можно использовать в качестве вакцин.

Альтернативным способом является клонирование компонентов, необходимых для воссоздания плотных тел, в рекомбинантных бакуловирусах под контролем основного промотора/энхансера IE HCMV (MIEP). Показано, что рекомбинантные бакуловирусы способны инфицировать клетки высших эукариотов, такие как, например, клетки млекопитающих, и что чужеродные гены под контролем эффективного эукариотического промотора, такого как MIEP, интенсивно экспрессируются в таких клетках. Преимущество данного способа заключается в том, что любые важные модификации антигенных белков плотных тел, такие как гликозилирование, в клетках млекопитающих происходят более естественным образом, чем в клетках насекомых. Кроме того, существует ряд таких клеточных линий, утвержденных для применения в производстве вакцин.

В другом варианте осуществления биологически активное средство представляет собой антиген-презентирующую клетку, которая презентирует антигены, способные вызывать иммунный ответ против возбудителей туберкулеза, более конкретно, против Mycobacterium tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis. В предпочтительном варианте осуществления антиген-презентирующая клетка представляет собой микроорганизм, более предпочтительно микроорганизм, выбранный из группы, включающей в себя M.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis. Сочетание настоящего изобретения, содержащее бактериальную клетку в качестве первого компонента и такую антиген-презентирующую клетку, или такой антиген сам по себе, в качестве второго компонента, или в качестве биологически активного средства, предпочтительно можно использовать для профилактики и/или лечения туберкулеза. Предпочтительно антиген представляет собой антиген 85.

В объем настоящего изобретения входит первый компонент композиции настоящего изобретения в разных проявлениях, описанных в данном документе, в особенности, разные воплощения микроорганизмов, содержащих домен фаголизосомального истечения, такие как rBCG:Hly и rBCG ureC:Hly, который действует и, следовательно, может использоваться как адъювант, это означает, что он отвечает за повышение иммунного статуса пациента, подлежащего лечению или нуждающегося в лечении, более предпочтительно, иммунного статуса, связанного с TH1, еще более предпочтительно, иммунного статуса, характеризующегося увеличением ответа TH1 по сравнению с субъектом, не подвергающимся лечению.

Как описано в данном документе, второй компонент предпочтительно физически отличается или физически отделен от первого компонента так, чтобы индуцировать у пациента специфический биологический, биохимический, физиологический или медицинский ответ. Тот факт, что первый и второй компонент физически разделены, позволяет вводить эти два компонента независимо или отдельно. Если биологически активное средство представляет собой генетически измененную клетку, которая экспрессирует цитокин, более предпочтительно такая клетка является раковой клеткой, специфический иммунный ответ направлен на антигены, предоставляемые такой генетически измененной клеткой. Тем не менее, следует понимать, что цитокины, благодаря их собственной активности, оказывают общее благоприятное воздействие, которое также можно отнести к эффекту адъюванта, который обеспечивает первый компонент.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей сочетание настоящего изобретения и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательные средства, или другие среды для лекарств. Предпочтительно такие носители, разбавители, вспомогательные средства и среды являются инертными и нетоксичными. Фармацевтическая композиция существует в виде разных вариантов осуществления, приспособленных к разным способам введения. Такое введение включает в себя системное и местное введение, а также пероральное, подкожное, парентеральное, внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное, интратекальное и внутриглазное. Предпочтительная фармацевтическая композиция представляет собой водный или физиологический буфер, содержащий первый и второй компонент.

Специалистам в данной области известно, что вводимое количество фармацевтической композиции зависит от клинического состояния конкретного пациента, участка и способа введения, схемы введения, возраста, пола и массы тела пациента, а также от других факторов, известных специалистам в области медицины. Таким образом, количество, эффективное для профилактики и/или лечения, определяют с учетом таких факторов, используя известные в области медицины методы. Предпочтительно количество является эффективным для достижения улучшения, в том числе, без ограничения, для улучшения состояния заболевания или для обеспечения более быстрого восстановления после болезни, улучшения или устранения симптомов, а также для улучшения других факторов, выбираемых специалистами в области медицины в качестве показателей.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать другие фармацевтически активные соединения.

Фармацевтическую композицию предпочтительно получают так, чтобы обеспечить возможность введения одной или нескольких доз.

В одном из вариантов осуществления первый компонент и второй компонент, либо как таковые, либо в составе фармацевтической композиции, либо в виде фармацевтической композиции, вводят одновременно в составе одной композиции или в составе разных композиций. В случае разных композиций, первая композиция содержит первый компонент, а вторая композиция содержит второй компонент. В предпочтительных вариантах осуществления указанные первую и вторую композиции получают по любому из способов, используемых в данном описании для получения фармацевтических композиций.

Настоящее изобретение также включает в себя раздельное введение первого и второго компонентов. Предпочтительно интервал между введением первого и второго компонента, соответственно, составляет приблизительно один час или менее, предпочтительно приблизительно 30 минут или менее, более предпочтительно приблизительно 15 минут или менее.

Следует понимать, что в объем настоящего изобретения также входит применение первого или второго компонента, или обоих компонентов, в разных формах, как описано в данном документе, для профилактики любого из описанных здесь заболеваний.

Далее настоящее изобретение описывается со ссылкой на фигуры и примеры, которые дополнительно иллюстрируют признаки, варианты осуществления и преимущества данного изобретения, в соответствии с чем

На фиг.1 показана диаграмма, изображающая иммунный ответ, оцениваемый по количеству CD8+ Tet+ T-клеток, при совместном введении BKG и вакцины по сравнению с контролями;

На фиг.2-4 показаны схемы иммунизации для профилактической противоопухолевой вакцинации;

На фиг.5-7 показаны схемы иммунизации для терапевтической противоопухолевой вакцинации; и

На фиг.8 и 9 показаны диаграммы, изображающие влияние разных схем иммунизации на количество IFN-гамма-положительных T-клеток CD8 при стимуляции разными пептидами.

Пример 1: Применение BKG в качестве адъюванта для противоопухолевой вакцины.

В данном примере определяют пригодность BKG для применения в качестве адъюванта в противоопухолевой вакцине. BKG, как указано в данном описании, экспрессирует пептид фаголизосомального истечения из Listeria monocytogenes (Hly) и, кроме того, является дефицитным по ureC. Такой модифицированный BCG в данном описании также называют rBCG: ureC:Hly.

В основном, пациентов и животных моделей, соответственно, вакцинируют с помощью стандартной схемы вакцинации, также называемой протокол «прайм-буст». Затем животных стимулируют опухолью. В таких условиях у животных, вакцинированных BKG/опухолевой клеткой, после стимуляции опухоль не развивается, или дольше сохраняется устойчивость против опухоли, чем у животных, вакцинированных опухолью без BKG как адъюванта. Пациенты, вакцинированные BKG/опухолевой клеткой, могут противостоять развитию опухоли дольше, чем пациенты, получающие противоопухолевую вакцину без BKG в качестве адъюванта.

Если не указано иначе, используют следующие материалы и методы

Клетки:

Используют следующие клеточные линии: J558^mOVA (клетки J558, экспрессирующие OVA, который связывается с клеточной мембраной), J558^sOVA (клетки J558, экспрессирующие OVA, который секретируется в окружающую среду) и EL-4^OVA (клетки EL-4, экспрессирующие OVA). Вначале клеточные культуры держат под давлением G418 в течение 14 дней. Анализ на микоплазму дает отрицательные результаты. После начальных пассажей, проводимых для увеличения числа клеток, три клеточные линии замораживают порциями по 10×10⁶ в ДМСО и хранят в жидком N₂ в течение по меньшей мере 7 дней перед первым применением на животных.

Бактерии

Используемые бактерии обозначают: BKG(rBCG ureC:Hly); далее их называют BKG . BKG выращивают в полной среде 7H9 и замораживают в 10% растворе глицерина в PBS. Бактерии можно разморозить и снова заморозить (однако повторное замораживание можно проводить только в том случае, если перед этим бактериальные препараты не разбавляли).

При первом вакцинировании и при 2 последующих бустер-вакцинациях мышам вводят 19,3 мкл = 1×10⁶ BKG.

Получение вакцины:

Замороженные клетки размораживают и дважды промывают стерильной средой DMEM. Затем клетки ресуспендируют в стерильной среде DMEM и считают. Общий вводимый объем составляет 100 мкл (рассчитывают, используя таблицу 1). Перед инъекцией клетки облучают в стерильном шприце (гамма-излучение, 150 Gy). Контроли in vitro: из размороженных клеток до и после облучения, соответственно, берут по одной аликвоте из каждой клеточной линии и помещают ее в клеточную культуру. Данные контроли демонстрируют хорошее восстановление после размораживания (необлученные клетки) и отсутствие клеточной пролиферации в течение более 14 дней после облучения.

Мыши:

Самок C57/B6 в возрасте 12 недель (полученных в возрасте 6 недель и приспособившихся к условиям лаборатории в течение 6 недель) вакцинируют п.к. 100 мкл с использованием иглы 25 G в основании хвоста; через 7 дней под общей анестезией берут 0,3 мл крови для отслеживания иммунного ответа (тетрамер против OVA). Использование мышей согласовано с соответствующими ведомствами.

Схема вакцинации BKG эксп. #1:

день 0	первичная вакцинация (прайм)
7 день	1ое взятие крови
28 день	1ая бустер-вакцинация (1ый буст)
35 день	2ое взятие крови
53 день	2ая бустер-вакцинация (2ой буст
60 день	3 е взятие крови
74 день	стимуляция опухолью

Используемых мышей разделяют на 2 экспериментальные группы и одну контрольную группу:

- Группа, получающая вакцину плюс BKG (n=9): подгруппы #1.1, #1.3 и # 1.5 (см. таблицу 1)

- Группа, получающая вакцину минус BKG (n=9): подгруппы #1.2, #1.4 и #1.6

- контрольная группа (n=2): подгруппа #1.7

Таблица 1 Подгруппы и вводимые вакцины
Эксп. группа	Клетки	BKG	DMEM [мкл]	BKG [n]	BKG [мкл]	Клетки [n]	Клетки [мкл]	n=
#1.1	J558mOVA	+	-	1×l0 6	19,3	10×106	80,7	3
#1.2	J558mOVA	-	-	-	-	10×106	100,0	3
#1.3	J558sOVA	+	-	1×l06	19,3	l0×l06	80,7	3
#1.4	J558sOVA	-	-	-	-	l0×106	100,0	3
#1.5	EL-4OVA	+	-	1×l0 6	19,3	10×106	80,7	3
#1.6	EL-4OVA	-	-	-	-	10×106	100,0	3
#1.7	Ctr	-	100	-	-	-	-	2
								20

Содержание животных:

Условия S2, клетки IVC, 2 штуки; периодичность замены 3-4 дня.

Анализ FACS:

С помощью анализа FACS определяют количество SIINFEKEL-специфичных T-клеток слепым способом. После сортировки клеточных компонентов плазму замораживают и хранят до последующих анализов при -80°C.

Параллельные эксперименты in vitro:

Клеточные культуры

Клетки, полученные для вакцинации и стимуляции опухолью

Контрольные клетки, используемые в экспериментах на животных in vitro

Культуры клеток, используемых в качестве контролей в экспериментах FACS, продуцирующие тетрамеры

Векторы

Рекомбинантный вектор (SINvector) конструируют для получения IL-2, IFN-гамма и OVA. Данный вектор используют для создания линии мышиных опухолевых клеток, соответствующим клеткам LNCaP-IL-2-IFNгамма.

Результаты:

Первые результаты иммунологического мониторинга, изображенные на фиг.1, демонстрируют, что существует тенденция к увеличению количества T-клеток, способных распознавать пептид OVA, в группе мышей, получающих BKG в качестве адъюванта, по сравнению с группой животных, не получающих адъюванта. Это подтверждает, что BKG может служить адъювантом при противоопухолевой вакцинации, поскольку он усиливает иммунный ответ на вакцину.

Пример 2: Оптимизация режима лечения противоопухолевой вакцинацией с использованием BKG

Ниже приведен метод оптимизации режима введения терапевтических средств, описанных в примере 1, с помощью которого специалист в данной области может выбрать наилучший режим лечения, раскрытого в данном документе. Если не указано иначе, в данном примере используют материалы и методы, описанные в примере 1.

Режим 1:

Клеточную линию, полученную путем тройной стабильной трансфекции J558 (H2K^b) и экспрессирующую IL-2, IFNгамма и овальбумин, вводят мышам (C57 BL/6 (H2K^b)) в трех разных дозах, а именно, 5×10⁶ клеток, 10×10⁶ клеток и 15×10⁶ клеток. Каждую дозу вводят группе мышей, состоящей из пяти животных, с использованием следующей схемы иммунизации: первичная иммунизация, затем три бустинга через каждые 30 дней; при этом введение осуществляют с BKG (1×10 ⁶ КОЕ) или без BKG. С помощью иммунологических методов определяют наличие у животных овальбумин-специфичного иммунного ответа, и, в частности, имеет ли место усиление иммунного ответа, опосредованного BKG.

Режим 2:

Данное исследование состоит из ряда предварительных экспериментов («предварительные эксперименты 1-7») и четырех основных экспериментов («эксперименты 1-4»).

Предварительный эксперимент 1: Определение дозы прививочной опухоли с BKG или без BKG в качестве адъюванта.

Всего 14 групп мышей, каждая из которых состоит из пяти животных (C57 BL/6 (H2K^b)), иммунизируют увеличивающимися дозами прививочной опухоли (каждые 2 из 14 групп получают одинаковые дозы прививочной опухоли). Прививочную опухоль, состоящую из облученных овальбумин-экспрессирующих аллогенных опухолевых клеток J558 (H2K^b)), вводят п.к. Семи группам вместе с опухолевыми клетками вводят BKG в дозе 1×10⁶ КОЕ. Через одну неделю, а затем через 5, 9 и 13 недель у животных берут 0,5 мл крови и анализируют овальбумин-специфичную иммунную реакцию, используя метод ELISA и окрашивание внутриклеточных цитокинов или тетрамеров. Используют всего семь разных доз клеток прививочных опухолей с BKG или без BKG. Соответствующие дозы составляют 0,1×10 ⁶, 0,5×10⁶, 1,0×10⁶, 5,0×10 ⁶, 10,0×10⁶, 50,0×10⁶, 100×10⁶, причем в клинических испытаниях на людях предпочтительно используют дозы, находящиеся в интервале от 10×10 ⁶ до 300×10⁶ клеток. Мыши из 2 контрольных групп не получают прививочной опухоли. Одна контрольная группа получает инъекцию BKG.

Предварительный эксперимент 2: Определение дозы тестируемой опухоли (меланома B16_OVA )

В данном испытании четыре группы мышей (C57 BL/6(H2K^b)) получают увеличивающиеся дозы тестируемой опухоли (меланома B16_OVA, п.к.). Рост опухоли регистрируют до тех пор, пока объем опухоли не достигнет 2 см. После достижения этого объема опухоли мышей подвергают эйтаназии, кровь и опухолевую массу извлекают и хранят для анализа in vitro. Если опухолевый рост отсутствует, мышей умерщвляют через 12 недель. Каждая группа снова состоит из пяти мышей, которым вводят четыре разные дозы клеток тестируемой опухоли, а именно, 1,0×10⁶ , 5,0×10⁶, 10,0×10⁶ и 50,0×10 ⁶ клеток.

Предварительный эксперимент 3: Определение дозы адъюванта

Используя дозу, определенную в предварительном эксперименте 1, варьируют дозу BKG, причем дозу адъюванта изменяют в 10, 100, 1000 и 0,1, 0,01 и 0,001 раз по отношению к дозе, используемой в предварительном эксперименте 1. Через одну неделю, а затем через 5, 9 и 13 недель у животных берут 0,5 мл крови и анализируют овальбумин-специфичную иммунную реакцию, используя метод ELISA и окрашивание внутриклеточных цитокинов или тетрамеров.

Предварительный эксперимент 4: Исследование способов введения

Дозу прививочных опухолевых клеток, определенную в предварительном эксперименте 1, и дозу BKG, определенную в предварительном эксперименте 3, варьируют в зависимости от способа введения. Используют внутривенный, внутрикожный, внутрибрюшинный и ипсилатеральный подкожный способы введения. Для каждого способа введения используют дозу BKG, составляющую 1×, 0,1× или 0,01× от дозы, определенной в предварительном эксперименте 3. Анализируемые в данном эксперименте способы введения аналогичны способам, которые потенциально могут использоваться в клинике в применении к человеку, и различаются по участку иммунной системы, который первым контактирует с адъювантом. Через одну неделю, а затем через 5, 9 и 13 недель у животных берут 0,5 мл крови и анализируют овальбумин-специфичную иммунную реакцию, используя метод ELISA и окрашивание внутриклеточных цитокинов или тетрамеров.

Предварительный эксперимент 5: Исследование схем иммунизации

Используя дозу прививочных опухолевых клеток, определенную в предварительном эксперименте 1, и дозу BKG, определенную в предварительном эксперименте 3, исследуют следующие схемы иммунизации:

1. Схема иммунизации 1: однократное совместное введение прививочной опухоли и адъювантов (контрольные группы)

2. Схема иммунизации 2: данная схема соответствует профилактической иммунизации против некоторых заболеваний, например цистицеркоза, и включает в себя три основных иммунизации и бустинг, причем основную иммунизацию проводят вначале, затем через две и четыре недели, а бустинг проводят еще через шесть недель.

3. Схема иммунизации 3: данная схема соответствует основной схеме терапевтической вакцинации и включает в себя продолжительное применение вакцин с разными интервалами вакцинации. Более конкретно, можно использовать три следующие подсхемы.

Схема иммунизации 3a: вакцинация каждые 3 недели (последнее взятие крови и эйтаназия через 12 недель);

Схема иммунизации 3b: вакцинация каждые 6 недель (последнее взятие крови и эйтаназия через 25 недель);

Схема иммунизации 3c: вакцинация каждые 12 недель (последнее взятие крови и эйтаназия через 43 недели).

Все три схемы иммунизации повторяют, при этом доза адъюванта BKG либо равна дозе, определенной в предварительном эксперименте 3, либо изменена по сравнению с ней в 10 или 0,1 раз.

Предварительный эксперимент 6: Определение дозы прививочной опухоли (TRAMP) с BKG или без BKG

Всего 12 групп мышей TRAMP (Jackson Laboratory Lines Nos. 003135) вакцинируют 0,1-кратной, 1-кратной и 10-кратной дозой клеток прививочной опухоли TRAMP-C1 по отношению к дозе, указанной в литературе (5×10⁶ клеток). Используют клетки прививочной опухоли, не содержащие генетической модификации (wtTRAMP), или IL-2/IFNгамма-трансфицированные клетки. Мышей иммунизируют п.к., используя 5×10⁵, 5×10⁶ и 5×10⁷ клеток TRAMP. Шесть групп наряду с опухолевыми клетками получают 1×10⁶ КОЕ BKG в качестве активного адъюванта. Через одну неделю и затем через каждые шесть недель у животных берут 0,5 мл крови и анализируют TRAMP-C1-специфичную иммунную реакцию, используя метод ELISA и окрашивание внутриклеточных цитокинов или тетрамеров. Чтобы отслеживать развитие заболевания, каждые двенадцать недель проводят CT. Мышей TRAMP, которые несут не подвергающийся лечению рак простаты, умерщвляют в возрасте от 32 до 35 недель, чтобы избавить их от излишнего страдания. Чтобы удостовериться, что изменения, наблюдаемые в развитии заболевания, обусловлены вакцинацией, мышей нужно наблюдать до 40^ой недели.

Предварительный эксперимент 7: Определение дозы адъюванта

Дозу клеток прививочной опухоли, определенную в предварительном эксперименте 6, варьируют в зависимости от дозы BKG (используют 0,1-кратную, 1-кратную и 10-кратную дозу BKG по отношению к дозе, определенной в предварительном эксперименте 6). Как и в предварительном эксперименте 6, анализируют и клетки wtTRAMP-C1, и генетически модифицированные клетки IL-2/IFNгамма-TRAMP-C1. Через одну неделю и затем через каждые шесть недель у животных берут 0,5 мл крови и анализируют TRAMP-C1-специфичную иммунную реакцию, используя метод ELISA и окрашивание внутриклеточных цитокинов или тетрамеров. Чтобы отслеживать развитие заболевания, каждые двенадцать недель проводят CT. Последнее взятие крови и эйтаназию проводят через 40 недель.

Эксперимент 1: Профилактическая противоопухолевая вакцинация с использованием овальбуминовой системы

Мышей C57BL/6 (H2K ^b) иммунизируют, используя клетки прививочной опухоли, т.е. облученные овальбумин-экспрессирующие аллогенные опухолевые клетки J558 (H2K^b)), в дозе, определенной в предварительном эксперименте 1. Некоторые животные наряду с прививочной опухолью получают активный адъювант BKG (в дозе, определенной в предварительном эксперименте 3). Через одну неделю и затем через каждые шесть недель у животных берут 0,5 мл крови и анализируют овальбумин-специфичную иммунную реакцию, используя метод ELISA и окрашивание внутриклеточных цитокинов или тетрамеров. Еще через четыре недели определяют реакционноспособность иммунной системы против живых опухолевых клеток путем п.к. инъекции овальбумин-экспрессирующих опухолевых клеток B16 в дозе, определенной в предварительном эксперименте 2, с последующим систематическим наблюдением за ростом опухоли.

Кроме того, влияние BKG на увеличение опухолеспецифической реакции сравнивают с влиянием бактерий BCG дикого типа. В качестве способа введения используют наилучший способ, определенный в предварительном эксперименте 4, в сочетании с двумя оптимальными схемами иммунизации, определенными в предварительном эксперименте 5, которые включают в себя наилучшую схему прайм-буст и наилучшую схему продолжительного вакцинирования.

Эксперимент 2: Терапевтическая противоопухолевая вакцинация с использованием овальбуминовой системы

В отличие от профилактической противоопухолевой иммунизации, описанной в эксперименте 1, в данном эксперименте у мышей C57BL/6 (H2K^b) вызывают рост опухоли путем п.к. инъекции необлученных тестируемых опухолевых клеток в дозе, определенной в предварительном эксперименте 2. После того как опухоль достигнет 0,5 см в диаметре, начинают вакцинацию по схеме, описанной в эксперименте 1, с параллельным тестированием роста опухоли. Тестирование прекращают после того, как опухоль достигнет 2 см в диаметре. Однако животных продолжают наблюдать в течение максимум одного года. Чтобы отслеживать протекающие иммунологические процессы, каждые четыре недели у мышей берут 0,5 мл крови и определяют иммунный ответ по способу, описанному в эксперименте 1.

Эксперимент 3: Профилактическая противоопухолевая вакцинация (TRAMP)

У мышей TRAMP вначале обнаруживается внутриэпителиальная неоплазия в возрасте от шести до семи недель, а начиная с 15 недели, у них наблюдается ясно выраженная клиническая картина карциномы простаты. Такая карцинома простаты вначале является локализованной, но начиная с 24 недели у 10% животных развиваются метастазы, а с 32-35 недели состояние заболевания становится тяжелым. Профилактическую противоопухолевую вакцинацию начинают с 5^ой недели. Клетки прививочной опухоли без адъюванта или с адъювантом вводят однократно. В качестве клеток прививочной опухоли используют получившие смертельную дозу облучения клетки TRAMP-C1, относящиеся к линии клеток карциномы простаты, полученной из мышей TRAMP. Используют либо генетически неизмененные (wtTRAMP), либо IL-2/IFNгамма-трансфицированные клетки прививочной опухоли. Используют две наилучшие схемы иммунизации (схема прайм-буст и долговременная схема), определенные в предварительных экспериментах. Чтобы контролировать развитие PCa, животных каждые двенадцать недель подвергают CT. В эксперименте используют следующие группы:

HV3.1	вакцинация отсутствует (контрольная группа)
HV3.2	вакцинация только опухолью (клетки wtTRAMP-C1) п.к.
HV3.3	вакцинация BKG (клетки wtTRAMP-C1 + BKG) п.к.
HV3.4	вакцинация BCG (клетки wtTRAMP-C1 + BCG) п.к.
HV3.5	вакцинация только опухолью (wtTRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.6	вакцинация BKG (wtTRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.7	вакцинация BCG (wtTRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.8	вакцинация только опухолью (wtTRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.9	вакцинация BKG (wtTRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.10	вакцинация BCG (wtTRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.11	вакцинация только опухолью (клетки IL2/IFNгамма-TRAMP-C1) п.к.
HV3.12	вакцинация BKG (клетки IL2/IFNгамма-TRAMP-C1 + BKG) п.к.
HV3.13	вакцинация BCG (клетки IL2/IFNгамма-TRAMP-C1 + BCG) п.к.
HV3.14	вакцинация только опухолью (IL2/IFNгамма-TRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.15	вакцинация BKG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.16	вакцинация BCG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.17	вакцинация только опухолью (IL2/IFNгамма-TRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.18	вакцинация BKG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV3.19	вакцинация BCG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5

Схема иммунизации, применяемая для групп HV3.2-HV3.4 и HV3.11-HV3.13, изображена на фиг.2 с использованием следующих цифровых обозначений:

1: рождение мыши; неделя -5

2: вакцинация; момент времени 0 (возраст мышей 5 недель)

3: взятие крови через неделю

4: взятие крови через семь недель

5: взятие крови и CT через 13 недель

6: взятие крови через 19 недель

7: взятие крови и CT через 25 недель

8: взятие крови через 31 неделю

9: взятие крови и CT через 37 недель

10: взятие крови через 40 недель и эйтаназия мышей

Схема иммунизации, применяемая для групп HV3.5-HV3.7 и HV3.14-HV3.16, изображена на фиг.3 с использованием следующих цифровых обозначений:

1: рождение мыши; неделя -2

2: вакцинация; момент времени 0 (прайм I)

3: взятие крови через неделю

4: вакцинация через две недели (прайм II)

5: вакцинация через четыре недели (прайм III) (в возрасте 6 недель)

6: взятие крови через пять недель

7: вакцинация через десять недель (бустер-вакцинация) (в возрасте 12 недель)

8: взятие крови и CT через одну неделю после бустер-вакцинации

9: взятие крови через семь недель после бустер-вакцинации

10: взятие крови и CT через 13 недель после бустер-вакцинации

11: взятие крови через 19 недель после бустер-вакцинации

12: взятие крови и CT через 25 недель после бустер-вакцинации

13: взятие крови через 28 недель после бустер-вакцинации (в возрасте 40 недель) и эйтаназия мышей

Схема иммунизации, применяемая для групп HV3.8-HV3.10 и HV3.17-HV3.19, изображена на фиг.4 с использованием следующих цифровых обозначений:

1: рождение мыши; неделя -2

2: первая вакцинация; момент времени 0

3: взятие крови через неделю

4: вторая вакцинация через шесть недель (интервал вакцинации определен в предварительном эксперименте 5)

5: взятие крови через неделю

6: третья вакцинация через двенадцать* недель

7: взятие крови и CT через неделю

8: четвертая вакцинация через 18* недель

9: взятие крови через неделю

10: пятая вакцинация через 24* недели

11: взятие крови и CT через неделю

12: шестая вакцинация через 30* недель

13: взятие крови через неделю

14: взятие крови через шесть недель

15: взятие крови через 40 недель и эйтаназия мышей

* интервал между вакцинациями зависит от результатов предварительного эксперимента 5

Эксперимент 4: терапевтическая противоопухолевая вакцинация (TRAMP)

У всех мышей TRAMP в возрасте 15 недель обнаруживается опухоль простаты, которая полностью развивается к 32 неделе и вызывает у животных клинические проблемы. Следовательно, животных следует иммунизировать на 24 неделе. Эксперимент останавливают, когда проявляется один из критериев остановки. Животных наблюдают максимум в течение 40 недель. Чтобы отслеживать протекающие иммунологические процессы, каждые шесть недель у мышей берут 0,5 мл крови и определяют иммунный ответ по способу, описанному в эксперименте 1, и каждые двенадцать недель проводят визуализацию, например, методом CT. Используют такие же опухолевые клетки, как и в эксперименте 3.

В эксперименте используют следующие группы:

HV4.1	вакцинация отсутствует (контрольная группа)
HV4.2	вакцинация только опухолью (клетки wtTRAMP-C1) п.к.
HV4.3	вакцинация BKG (клетки wtTRAMP-C1 + BKG) п.к.
HV4.4	вакцинация BCG (клетки wtTRAMP-C1 + BCG) п.к.
HV4.5	вакцинация только опухолью (wtTRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.6	вакцинация BKG (wtTRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.7	вакцинация BCG (wtTRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.8	вакцинация только опухолью (wtTRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.9	вакцинация BKG (wtTRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.10	вакцинация BCG (wtTRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.11	вакцинация только опухолью (клетки IL2/IFNгамма-TRAMP-C1) п.к.
HV4.12	вакцинация BKG (клетки IL2/IFNгамма-TRAMP-C1 + BKG) п.к.
HV4.13	вакцинация BCG (клетки IL2/IFNгамма-TRAMP-C1 + BCG) п.к.
HV4.14	вакцинация только опухолью (IL2/IFNгамма-TRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.15	вакцинация BKG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.16	вакцинация BCG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по схеме прайм-буст, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.17	вакцинация только опухолью (IL2/IFNгамма-TRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.18	вакцинация BKG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5
HV4.19	вакцинация BCG (IL2/IFNгамма-TRAMP) по долговременной схеме, определенной в предварительном эксперименте 5

Схема иммунизации, применяемая для групп HV4.2-HV4.4 и HV4.11-HV4.13, изображена на фиг.5 с использованием следующих цифровых обозначений:

1: рождение мыши

2: взятие крови через шесть недель

3: взятие крови и CT через двенадцать недель

4: взятие крови через 18 недель

5: вакцинация через 24 недели

6: взятие крови и CT через 25 недель

7: взятие крови через 30 недель

8: взятие крови и CT через 36 недель

9: взятие крови через 40 недель и эйтаназия мышей

Схема иммунизации 2, применяемая для групп HV4.5-HV4.7 и HV4.14-HV4.16, изображена на фиг.6 с использованием следующих цифровых обозначений:

1: рождение мыши

2: взятие крови через шесть недель

3: взятие крови и CT через двенадцать недель

4: взятие крови через 18 недель

5: вакцинация через 24 недели (прайм I)

6: взятие крови и CT через 25 недель

7: вакцинация через 26 недель (прайм II)

8: вакцинация через 28 недель (прайм III)

9: взятие крови через 30 недель

10: вакцинация (бустер-вакцинация) через 34 недели

11: взятие крови и CT через 36 недель

12: взятие крови через 40 недель и эйтаназия мышей

Схема иммунизации 3, применяемая для групп HV4.8-HV4.10 и HV4.17-HV4.19, изображена на фиг.7 с использованием следующих цифровых обозначений:

1: рождение мыши

2: взятие крови через шесть недель

3: взятие крови и CT через двенадцать недель

4: взятие крови через 18 недель

5: вакцинация через 24 недели (прайм I)

6: взятие крови и CT через 25 недель

7: вакцинация через 30 недель (прайм II)

8: взятие крови через 31 недель

9: вакцинация через 36 недель (прайм III)

10: взятие крови и CT через 37 недель

11: вакцинация через 42 недели (прайм IV)

12: взятие крови через 43 недели и эйтаназия мышей

Интервалы между вакцинациями предпочтительно зависят от результатов предварительного эксперимента 5.

Пример 3: Композиция для лечения рака простаты

Композиция, которую можно использовать для лечения рака простаты, содержит в качестве первого компонента BCG, который экспрессирует пептид фаголизосомального истечения из Listeria monocytogenes (Hly) и, кроме того, является ureC-дефицитным. Такой модифицированный BCG в данном описании также называют rBCG: delta ureC: Hly. В качестве второго компонента композиция содержит генетически измененные клетки LNCaP. Данные клетки представляют собой клетки карциномы простаты, экспрессирующие рекомбинантный интерлейкин-2 (IL2) и интерферон-гамма (IFN гамма). Предпочтительно такие клетки LNCaP экспрессируют оба цитокина приблизительно в эквимолярных количествах. Данный вид клеток LNCaP описан, например, в международной патентной заявке WO 94/18995. Перед применением такие рекомбинантные клетки рака простаты подвергают гамма-облучению, чтобы сделать их неспособными к репликации.

Для введения пациенту оба компонента суспендируют в забуференном фосфатом физиологическом растворе. В 50 мкл композиции содержится 1×10⁶ клеток BCG и 1×10⁶ клеток LNCaP. Композицию вводят в.в. Эффективность анализируют методом ELISPOT. Такой анализ ELISPOT описан, например, в Mollenkopf HJ., Dietrich G., Fensterle J., Grode L., Diehl K.D., Knapp B., Singh M., O'Hagan D. T., Ulmer J.B., and Kaufinann S. H. Enhanced protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine by adsorption onto cationic PLG microparticles. Vaccine. 2004 Jul 29; 22(21-22): 2690-5.

В альтернативном режиме лечения вышеуказанную композицию вводят однократно, после чего вводят клетки LNCaP. Таким образом, основной принцип настоящего изобретения заключается в том, что первый и второй компонент можно вводить с разной частотой в разных временных режимах.

Регистрируют клинические гистологические анализы, клиническую стадию опухоли, а также состояние здоровья пациентов, подвергающихся лечению с помощью данного способа. Другим параметром может служить профиль уровня PSA и число пациентов, обладающих благоприятным профилем уровня PSA.

При введении пациенту конкретного сочетания наблюдается благоприятный профиль как уровня PSA, так и выживаемости, что хорошо согласуется с эффектами, наблюдаемыми при введении только клеток LNCaP без адъюванта.

Пример 4: Применение BKG в качестве адъюванта для вакцины HCMV

Результаты, полученные в данном примере, показывают, что описанное в настоящем изобретении сочетание BKG как адъюванта и плотных тел HCMV позволяет успешно индуцировать клеточный иммунитет против инфекции человеческого цитомегаловируса. Более конкретно, показано, что клеточный иммунитет может индуцироваться в течение короткого периода времени. Такая быстрая индукция иммунитета против HCMV имеет большое значение для пациентов, подвергающихся трансплантации костного мозга, которая довольно часто происходит одновременно с угрожающей жизни инфекцией HCMV. У пациентов, перенесших трансплантацию, существует потребность в быстром формировании клеточного иммунитета, поскольку нет времени на длительную вакцинацию с помощью стандартных методов.

Используют следующую схему вакцинации:

Антиген:	плотные тела
	доза: 20 мкг/животное
	схема иммунизации:	D: день 0/7/21
		C: день 0/7
		B: день 0
Адъювант:	доза: 1×106 /животное
	схема иммунизации:	день 0

Структура групп приведена в таблице 2.

Таблица 2
Группа	Число животных	Количество вакцины (на животное) день 0	Количество вакцины (на животное) день 7	Количество вакцины (на животное) день 21
A	4
B1	6	20 мкг плотных тел
B2	6	20 мкг плотных тел + l×l0 6 BKG
C1	6	20 мкг плотных тел	20 мкг плотных тел
C2	6	20 мкг плотных тел + 1×10 6 BKG	20 мкг плотных тел
D1	6	20 мкг плотных тел	20 мкг плотных тел	20 мкг плотных тел
D2	6	20 мкг плотных тел + 1×106 BKG	20 мкг плотных тел	20 мкг плотных тел

Препараты получают на каждый 8 и 9 день, соответственно, после последней иммунизации.

Результаты изображены на фиг.8 и 9, причем на фиг.9 приведена диаграмма, демонстрирующая число IFN-гамма-положительных клеток на 10⁵ T-клеток CD8+ после стимуляции HCMV-специфичной пептидной смесью (полученной от JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germany). Последовательности получают из белка HCMV pp65. Они образуют смесь (Pepmix) 138 пептидов (по 15 аминокислот каждый) с последовательностями, перекрывающимися по 11 аминокислотам. На фиг.8 изображена диаграмма, подобная диаграмме фиг.9, причем соответствующее число T-клеток CD8+ определяют после стимуляции неспецифическим контрольным пептидом. Как можно видеть из данных фигур, при использовании BKG в качестве адъюванта во время первичной вакцинации число IFN-гамма-положительных клеток CD8 на 10⁵ T-клеток CD8+ значительно увеличивается во всех случаях. Наиболее значительное увеличение наблюдается в группах B2 и C2. Это означает, что базовая вакцинация с использованием BKG в сочетании с плотными телами, где плотные тела вводят на 0 день и после 7 дня, уже является достаточной для значительного повышения числа IFN-гамма-положительных клеток. Данный факт подтверждает неожиданное открытие, лежащее в основе настоящего изобретения и заключающееся в том, что сочетание плотных тел и BKG позволяет индуцировать клеточный иммунитет против HCMV.

Пример 5: Композиция для лечения и профилактики малярии

Композиция для лечения и профилактики малярии содержит в качестве первого компонента rBCG: delta ureC: Hly, а в качестве второго компонента малярийный антиген gp190/MSP1. Следует понимать, что антиген может находиться либо в виде пептида, либо в виде фрагмента более крупного пептида, полипептида или даже белка.

Данная композиция содержит 50 мкг белка MSP1 и приблизительно 1×10⁶ rBCG: delta ureC: Hly в 50 мкл буфера PBS. Композицию вводят мышам п.к. После окончания иммунизации селезенку и кровь иммунизированных мышей собирают и используют для анализов.

Протекание процесса вакцинации также отслеживают с помощью метода ELISPOT (Mollenkopf H. J., выше) и анализа ингибирования инвазии мерозоита (Blackman et al. 1990 J.Exp. Med. Volume 172 P: 379-382). Авторы настоящего изобретения предполагают, что стимуляция MSP-1-специфичными пептидами может приводить к повышению реакционноспособности иммунной системы и секреции IFN-гамма. Авторы также полагают, что ингибирование инвазии индуцируется сывороткой, собранной от иммунизированных мышей. Результаты анализа уровня EFN-гамма методом ELISPOT и анализа ингибирования инвазии мерозоита свидетельствуют о повышении защитной функции.

Используя признаки настоящего изобретения, раскрытые в данном изобретении, формулу изобретения, список последовательностей и/или рисунки, по отдельности или вместе, можно осуществить данное изобретение в разных формах.