средство для стимуляции синтеза белков теплового шока hsp 70 в клетках человека и животных; косметическое средство для стимуляции репаративных процессов; косметическое средство для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур; биологически активная добавка; пищевой продукт; способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур

Формула изобретения

1. Средство для стимуляции синтеза белков теплового шока HSP 70 в клетках человека и животных, включающее, по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений и неионогенное поверхностно-активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 вес.%.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве производных коричной кислоты используют хлорогеновую, феруловую или кофейную кислоты, куркумин или фенилэтиловый эфир кофейной кислоты.

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что смесь фенольных соединений представляет собой экстракт из сырья растительного происхождения.

4. Средство по п.3, отличающееся тем, что в качестве растительного экстракта содержит экстракт ягоды кофе, предпочтительно экстракт зеленой ягоды кофе.

5. Средство по п.1, отличающееся тем, что неионогенное поверхностно-активное вещество выбрано из группы веществ с величиной гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 10 до 18.

6. Средство по п.5, отличающееся тем, что в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества используют полисорбат-20, полисорбат-40, полисорбат-60, полисорбат-80, ПЭГ-40 гидрированное касторовое масло, 35-полиоксиэтилированное касторовое масло или ПЭГ 15 гидроксистеарат.

7. Косметическое средство для стимуляции репаративных процессов, включающее средство по п.1 в количестве не менее 0,1%, предпочтительно от 0,5 до 5%.

8. Косметическое средство по п.7, отличающееся тем, что дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 вес.%.

9. Косметическое средство по п.7, отличающееся тем, что дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 вес.%.

10. Косметическое средство по п.9, отличающееся тем, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

11. Косметическое средство по пп.7-10, отличающееся тем, что представляет собой эмульсию, крем, молочко, бальзам, мазь, гель, шампунь, тоник, лосьон, помаду.

12. Применение средства по п.1 для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур.

13. Применение средства по п.12, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 вес.%.

14. Применение средства по п.12, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 вес.%.

15. Применение средства по п.14, отличающееся тем, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

16. Применение средства по пп.12-15, отличающееся тем, что оно представляет собой эмульсию, крем, молочко, бальзам, мазь, гель, шампунь, тоник, лосьон, помаду.

17. Способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, заключающийся в нанесении на кожу в месте проведения косметологических процедур средства по пп.12-16, при этом средство наносят до, и/или во время, и/или после проводимых процедур.

18. Биологически активная добавка для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур и стимуляции репаративных процессов, включающая средство по п.1.

19. Биологически активная добавка по п.18, отличающаяся тем, что содержит средство по п.1 в количестве не менее 1%.

20. Биологически активная добавка по п.18, отличающаяся тем, что дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 вес.%.

21. Биологически активная добавка по п.18, отличающаяся тем, что дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 вес.%;

22. Биологически активная добавка по п.21, отличающаяся тем, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

23. Биологически активная добавка по пп.18-22, отличающаяся тем, что представляет собой капсулы, таблетки, порошок, гранулы, микросферы, драже, карамель, суспензии, эмульсии, солюбилизаты.

24. Пищевой продукт для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур и стимуляции репаративных процессов, включающий средство по п.1.

25. Пищевой продукт по п.24, отличающийся тем, что содержит средство по п.1 в количестве не менее 0,001%, предпочтительно от 0,01 до 0,5%.

26. Пищевой продукт по п.24, отличающийся тем, что дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 вес.%.

27. Пищевой продукт по п.24, отличающийся тем, что дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 вес.%.

28. Пищевой продукт по п.27, отличающийся тем, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

29. Пищевой продукт по пп.24-28, отличающийся тем, что представляет собой готовый к употреблению продукт, продукт быстрого приготовления, пищевой концентрат или напиток.

30. Способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, включающий употребление биологически активной добавки по пп.18-23 и/или пищевого продукта по пп.24-29 при проведении процедур, причем употребление биологически активной добавки и/или пищевого продукта осуществляют до, и/или во время, и/или после проводимых процедур.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности косметологии, и может быть использовано при создании косметических средств, биологически активных добавок и пищевых продуктов.

Белки теплового шока (HSP, heat shock proteins) - это класс функционально сходных белков, экспрессия которых усиливается при повышении температуры и многих других неблагоприятных воздействиях. К настоящему времени выделено несколько семейств HSP, различающихся по молекулярному весу. Экспрессия генов, кодирующих белки теплового шока, регулируется фактором теплового шока (HSF), который в нормальных условиях находится в форме неактивного мономера, связанного с HSP. После теплового шока или другого неблагоприятного воздействия этот комплекс распадается, а фактор теплового шока образует тримеры, способные связываться с ДНК и активировать транскрипцию HSP. Белки теплового шока обнаружены в клетках практически всех живых организмов, от бактерий до человека.

К HSP в настоящем изобретении относят белки, выполняющие функции молекулярных шаперонов и участвующие в сворачивании вновь синтезируемых белков и белков с частично нарушенной структурой. Такие белки участвуют в предотвращении агрегации неправильно свернутых или частично развернутых белков, сборке и распаде надмолекулярных белковых структур, транспорте белков через мембраны, а также разворачивании поврежденных белков для их последующего катаболизма. Содержание HSP увеличивается в клетках организма, подвергнутых воздействию повышенной температуры или других стрессовых факторов, а также веществ, являющихся «индукторами» HSP.

Из выделяемых пяти классов HSP для целей изобретения представляют интерес HSP60, 70, 90, 100, обладающие максимально выраженной шаперонной функцией. Индукцию указанных HSP считают определяющей в повышении устойчивости клеток к стрессовым факторам.

Активация синтеза HSP в клетках организма, подвергшихся воздействию фактора, нарушающего их нормальное функционирование, в настоящее время рассматривается как защитная реакция, способствующая повышению устойчивости клеток к внешнему воздействию и удалению поврежденных этим воздействием структурных и функциональных белков /Heat Shock Proteins and Whole Body Physiology 1st Edition/. A.A.A. Asea and B.K. Pedersen (eds.), 2010, 430 p./.

В число факторов, устойчивость к которым связана с экспрессией HSP, входит не только повышение температуры. Показана индукция синтеза этих белков при охлаждении, интоксикациях, ультрафиолетовом облучении, голодании, гипоксии, недостатке воды, нарушениях электролитного баланса, тяжелых физических нагрузках, механических повреждениях тканей, инфекциях, воспалительных реакциях любой этиологии. Воздействие перечисленных внешних факторов с интенсивностью, достаточной для нарушения функционирования клеток, но не приводящей к быстрому и необратимому повреждению (некрозу) основных клеток и, следовательно, ткани, характеризуется как стрессовое.

Недостаточный синтез HSP в организме сопровождается низким уровнем клеточного роста и повышенным апоптозом и является отличительной особенностью клеток стареющего организма. Клинически недостаточный синтез HSP сопровождается плохим заживлением ран, нейродегенеративным заболеваниям, повышенной чувствительностью тканей организма к ишемии, репродуктивными нарушениями.

Целенаправленная регуляция уровня HSP в клетках рассматривается как возможность влияния на чувствительность определенной группы клеток, ткани, органа или организма в целом к терапевтическому воздействию, воздействию вредных производственных факторов или неблагоприятных факторов окружающей среды. Практический интерес представляет как индукция HSP, так и их ингибирование.

Ингибирование HSP рассматривается главным образом применительно к терапевтическому воздействию на опухолевые клетки. В связи с этим известен способ использования ингибиторов HSP, содержащих бензо[а]хинолизиновые трехчленные циклы, в составе противоопухолевой терапии с применением гипертермии как способа повышения чувствительности к проводимой терапии / WO 2007/041294 2007 /.

Индукция HSP ориентирована на более широкое применение.

Известно использование способствующих синтезу HSP биологически активные веществ для наращивания мышечной массы /US 2011/0189312, 2011/. С этой целью предлагается использовать композицию, включающую глютамин, креатин и вещества, способствующие увеличению в клетках белков теплового шока.

Известен факт использования повышения уровня HSP в клетках для уменьшения отрицательных последствий гипоксии, гипероксии, ишемии тканей, повышения температуры, ультрафиолетового облучения, цитотоксического или радиационного воздействия, нарушения обмена веществ, механического повреждения. Для этой цели в составе косметических и фармацевтических композиций используют производные гидроксиламинов /US 7148239, 2006/.

Известно использование ацилсалицилатов в составе косметических или фармацевтических композиций в качестве средств, обладающих способностью к стимуляции синтеза HSP /US 20060148767, 2006/. Указанные композиции рекомендуют для использования при лечении дерматологических заболеваний, кардиомиопатий, нейропатий, диабета, ишемий, дегенеративных заболеваний нервной системы.

Недостатком всех описанных композиций является то, что повышенная экспрессия HSP в результате их применения наблюдается только после воздействия стрессового фактора, например повышенной температуры. Без воздействия стрессового или повреждающего фактора повышение экспрессии HSP в описанных случаях незначительно, что существенно снижает эффективность защиты из-за недостаточного количества молекулярных шаперонов в клетках в начале повреждающего воздействия. Это является особенно существенным недостатком при интенсивных воздействиях, характеризующимся высоким уровнем первичных повреждений.

Необходимо отметить, что благодаря своим шаперонным функциям HSP играют важную роль и в репаративных процессах. Под репаративными процессами в биологических системах понимают восстановление их поврежденных частей. О репарации говорят в случае восстановления поврежденных биомакромолекул и надмолекулярных образований (мембран, фибрилл, органелл), являющихся структурными и функциональными элементами клеток. При этом речь идет не о синтезе новой макромолекулы или образовании новой субклеточной структуры взамен поврежденной, а об исправлении поврежденных частей существующей молекулы или структуры. Механизмы исправления повреждений в данном случае построены на функционировании в клетке постоянно активных систем репарации молекулярных повреждений, в первую очередь репарации ДНК.

Известно использование фитоэстрогенов, изофлавонов, олигомеров процианидола, антоцианов, аминокислот, олигопептидов, фитиновой кислоты и других хелатирующиех кальций агентов и содержащих указанные вещества экстрактов растений, в составе косметических композиций для стимуляции репаративных процессов при защите кожи человека от вредных факторов окружающей среды /US 20030138502, 2003/. Недостатком предлагаемого метода является то, что стимуляция функционирования репаративных систем описанной косметической композицией не является устойчивой и требует как предварительной обработки кожи накануне контакта с вредным фактором, так и обработки непосредственно перед вредным воздействием. При этом повышение экспрессии HSP наблюдается только после воздействия вредного фактора (выхлопных газов, табачного дыма). Без воздействия стрессового или повреждающего фактора повышение экспрессии HSP незначительно, что, как уже отмечалось, существенно снижает эффективность защиты.

В настоящее время для омоложения кожи, устранения дефектов ее развития, а также подавления избыточного увеличения подкожной жировой клетчатки в косметологической практике широко используются агрессивные косметологические процедуры, вызывающие нормированное повреждение клеток проблемных тканей, не превышающее репаративные возможности ткани в целом.

Такие процедуры осуществляют путем воздействия физических или химических факторов, способных вызывать функциональные и/или структурные нарушения в клетках.

Применяемое ограниченное повреждение клеток и тканей кожи, с одной стороны, приводит к удалению старых и неспособных к репарации клеток, а с другой - к стимуляции роста и размножению устойчивых клеток, обладающих достаточным репарационным потенциалом, что обеспечивает репарацию повреждений в подвергнутой воздействию ткани. В дальнейшем происходит последующее формирование молодой ткани как в поврежденных зонах, так и в прилегающих к ним участках.

Однако агрессивные косметологические процедуры, как правило, имеют серьезные побочные эффекты:

- при использовании лазерного излучения и интенсивного импульсного освещения - угревая сыпь, герпетическая инфекция, эрозия;

- при низкотемпературных воздействиях - покраснение, образование гематом и болезненность при прикосновении; покалывание и/или притупление чувствительности на обработанных участках;

- после химического пилинга и микродермабразии - появление очага гиперпигментации и обострение герпетического поражения кожи;

- при электротоковых процедурах - дисхромия - нарушение пигментации кожи;

- при радиочастотных процедурах - боль, покраснение кожи, отек, пузырьки;

- после ультразвуковых процедур - медленно рассасывающиеся серозные или кровянистые скопления под кожей.

Таким образом, агрессивные косметологические процедуры приводят к повышенной доле необратимо поврежденных клеток в проблемной ткани, в частности потому, что невысокое содержание HSP в клетках сопровождается низким уровнем репаративных процессов. Поэтому замедляется восстановление нормальной структуры кожи и увеличивается вероятность побочных эффектов.

Известно, например, использование при проведении агрессивных косметологических процедур, сопровождающихся поглощением энергии кожей и ее разогревом, косметических композиций, включающих в качестве средств, стимулирующих синтез HSP, тяжелые металлы, салицилаты, нестероидные противовоспалительные препараты, никотин, спирт, агонисты PPAR-гамма, кофеин или их смесь. Такие средства рекомендуется наносить на кожу заранее или одновременно с началом тепловой обработки /US 20080031833, 2008/.

Недостатком предлагаемого способа является то, что необходимым условием эффективного повышения экспрессии HSP является разогрев кожи, который происходит при работе используемого в косметологической процедуре устройства. В результате применение косметической композиции не обеспечивает защиты от возможных побочных эффектов из-за низкого уровня HSP в начале проведения агрессивной косметологической процедуры.

Известно использование при проведении дерматологических ультразвуковых процедур композиций, в состав которых в качестве дополнительных компонентов входят средства, стимулирующие синтез белков теплового шока, такие как ацетилсалициловая кислота, салициловая кислота, соли цинка (цинка сульфат, цинка L-карнозинат) /US 20110269693,2011/.

Недостатком предлагаемых композиций является то, что максимальная индукция HSP наблюдается только при сочетании с воздействием используемого в процедуре стрессового фактора.

Таким образом, поиски средства эффективно индуцирующего HSP без влияния стрессового фактора является актуальной практической задачей. Ее решение позволит повысить устойчивость клеток, тканей и организма в целом при воздействии интенсивных и быстро нарастающих повреждающих нагрузок, к которым, в частности, относятся агрессивные косметологические процедуры, тяжелые физические, в том числе спортивные, нагрузки и работы в неблагоприятных и вредных условиях, нарушающие нормальное функционирование репаративных систем организма.

Технической задачей настоящего изобретения является создание средства, обеспечивающего максимально возможный синтез белков теплового шока HSP в клетках человека и животных без дополнительного воздействия стрессового фактора, создание на его основе косметических средств для стимуляции репаративных процессов и снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур; создание на его основе биологически активной добавки, пищевого продукта, а также способа снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур.

Для решения этой задачи предложено средство для стимуляции синтеза белков теплового шока в клетках человека и животных, включающее, по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений, и неионогенное поверхностно активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 весовых %.

При этом предпочтительно, что в качестве производных коричной кислоты используют хлорогеновую, феруловую или кофейную кислоты, куркумин или фенилэтиловый эфир кофейной кислоты.

При этом предпочтительно, что смесь фенольных соединений представляет собой экстракт из сырья растительного или животного происхождения.

При этом предпочтительно, что в качестве растительного экстракта используют экстракт ягоды кофе, предпочтительно экстракт зеленой ягоды кофе.

При этом предпочтительно, что неионогенное поверхностно активное вещество выбрано из группы веществ с величиной гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 10 до 18.

При этом предпочтительно, что в качестве неионогенного поверхностно активного вещества используют полисорбат-20, полисорбат-40, полисорбат-60, полисорбат-80, ПЭГ-40 гидрированное касторовое масло, 35-полиоксиэтилированное касторовое масло или ПЭГ 15 гидроксистеарат.

Для решения вышеуказанной задачи предложено также косметическое средство для стимуляции репаративных процессов, включающее средство для стимуляции синтеза белков теплового шока, включающее, по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений, и неионогенное поверхностно активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 весовых %.

При этом предпочтительно, что оно содержит средство для стимуляции синтеза белков теплового шока в количестве не менее 0,1%, предпочтительно от 0,5 до 5%.

При этом предпочтительно, что оно дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 весовых %.

При этом предпочтительно, что оно дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 весовых %;

При этом предпочтительно, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

При этом, косметическое средство может представлять собой эмульсию, крем, молочко, бальзам, мазь, гель, шампунь, тоник, лосьон, помаду.

Для решения вышеуказанной задачи предложено также косметическое средство для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, включающее средство для стимуляции синтеза белков теплового шока, включающее по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений, и неионогенное поверхностно активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 весовых %.

Предпочтительно, что оно содержит средство для стимуляции синтеза белков теплового шока в количестве не менее 0,1%, предпочтительно от 0,5 до 5%.

При этом предпочтительно, что оно дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 весовых %.

При этом предпочтительно, что оно дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 весовых %;

Предпочтительно, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

При этом, косметическое средство может представлять собой эмульсию, крем, молочко, бальзам, мазь, гель, шампунь, тоник, лосьон, помаду.

Предложен также для решения вышеуказанной задачи способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, включающий проведение косметологических процедур при нанесении на кожу в месте проведения указанных процедур косметического средства для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, при этом, средство наносят до, и/или во время, и/или после проводимых процедур.

Предложена также биологически активная добавка, включающая средство для стимуляции синтеза белков теплового шока, включающее по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений, и неионогенное поверхностно активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 весовых %.

При этом, предпочтительно, что биологически активная добавка содержит средство для стимуляции синтеза белков теплового шока в количестве не менее 1%.

Предпочтительно при этом, что она дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 весовых %.

Предпочтительно при этом, что она дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 весовых %.

Предпочтительно при этом, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

При этом, биологически активная добавка может представлять собой капсулы, таблетки, порошок, гранулы, микросферы, драже, карамель, суспензии, эмульсии, солюбилизаты.

Предложен также пищевой продукт, включающий средство для стимуляции синтеза белков теплового шока, включающее, по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений, и неионогенное поверхностно активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 весовых %.

Предпочтительно при этом, что он содержит средство для стимуляции синтеза белков теплового шока в количестве не менее 0,001%, предпочтительно от 0,01 до 0,5%.

Предпочтительно при этом, что он дополнительно содержит аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 весовых %.

Предпочтительно при этом, что он дополнительно содержит природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 весовых %.

Предпочтительно, что в качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта используют токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

При этом, пищевой продукт может представлять собой готовый к употреблению продукт, продукт быстрого приготовления, пищевой концентрат или напиток.

Предложен также способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, включающий проведение косметологических процедур при употреблении биологически активной добавки или пищевого продукта до, и/или во время, и/или после проводимых процедур.

Многочисленные литературные и патентные источники, изученные авторами, показали, что существует целый ряд веществ, способствующих синтезу белков теплового шока в клетках. При этом, как показали исследования авторов, наибольший интерес представляют собой природные фенольные соединения, являющиеся производными фенольных кислот.

Природные фенольные соединения получают путем извлечения из биогенного сырья растительного или животного происхождения, а также синтетически, полусинтетически и биотехнологически. Их химический состав весьма разнообразен. В качестве основных представителей природных фенольных соединений выделяют фенольные кислоты, флавоноиды, полифенольные амины и полифенолы смешанной структуры.

В растениях фенольные соединения находятся в свободном состоянии или в виде гликозидов. Обладая самыми разнообразными биологическими свойствами, они способны оказывать влияние на многие физиологические процессы, проходящие в организме человека. Фенольные соединения давно нашли свое применение в медицине, где используется их адаптогенное, стимулирующее и спазмолитическое действие; их применяют при лечении неврозов и коронарной недостаточности. Фенольные соединения обладают мочегонным, седативным, желчегонным и кровоостанавливающим действием.

Способность к стимуляции синтеза (индукции) HSP в клетках млекопитающих была обнаружена у природных фенольных соединений, относящихся к производным фенольных кислот - бензойной и коричной.

Известно использование природных полифенолов, относящихся к фенольным кислотам, являющимися производными коричной кислоты, которые способны индуцировать нейропротекторные пептиды, в том числе HSP, для защиты клеток центральной и периферической нервной системы от деградации и гибели при дегенеративных заболеваниях, травмах, возрастных изменениях и других заболеваниях или расстройствах /US 20040167217, 2004/. Однако, сами по себе, указанные соединения характеризуются способностью стимулировать синтез HSP только на фоне воздействия повреждающих факторов, что позволяет их использовать для подавления апоптоза нервных клеток только на фоне не острых патологических процессов, к которым относятся дегенеративные заболевания и возрастные изменения нервной системы, а также посттравматические воспалительные и ишемические состояния в ней.

Однако предварительное введение указанных соединений в организм не обеспечивает достаточно высокого уровня HSP в момент воздействия повреждающих (стрессовых) факторов. Необходимый уровень HSP достигается только лишь через некоторое время после начала воздействия факторов. Это ведет к массированному накоплению поврежденных молекул и сопровождается более высокой долей необратимо поврежденных клеток, особенно в случае быстро нарастающих и интенсивных повреждающих воздействий.

Проведя многочисленные эксперименты и исследования, авторы выяснили, что включение природных полифенолов из группы производных коричной кислоты в состав мицелл неионогенных поверхностно активных веществ (НПАВ), типа полисорбатов и этоксилированного касторового масла, приводит к достижению высокого уровня индукции HSP in vitro и in vivo.

При этом, полученное средство НПАВ с производными коричной кислоты является самоэмульгирующимся и характеризуются высокой биодоступностью входящих в ее состав биологически активных веществ.

Под «самоэмульгирущимся средством» понимается средство на основе поверхностно активного вещества (ПАВ), которое при добавлении в дисперсную среду образует устойчивую дисперсию в технологических процедурах с неинтенсивным перемешиванием. Самоэмульгируемость средства обеспечивает высокую биодоступность используемых в ней биологически активных веществ не только при различных путях поступления в организм, но также создает удобство для ее включения в косметические, фармацевтические и пищевые продукты. При этом, предпочтительно использовать ПАВ со значением ГЛБ 10-18. Для косметических, пищевых и фармацевтических целей последнее время предпочтение отдается неионогенным ПАВ (НПАВ), поскольку они имеют низкую токсичность.

Обнаруженная способность к сильной индукции HSP производными коричных кислот в составе мицелл НПАВ без дополнительного воздействия стрессового фактора позволяет рассматривать средство указанного состава в качестве перспективного для стимуляции репаративных процессов и повышения устойчивости клеток организма к интенсивным и быстро нарастающим стрессовым воздействиям. Перечень интенсивных и быстро нарастающих стрессовых воздействий включает, но не ограничивается, агрессивные косметологические процедуры, тяжелые физические, в том числе спортивные, нагрузки, а также разные работы в неблагоприятных и вредных условиях.

При этом, восстанавливая нативную конформацию денатурированных белков, HSP обеспечивают высокую эффективность всех процессов, лежащих в основе восстановления (репарации) поврежденных биомакромолекул и образуемых ими надмолекулярных клеточных структур. Одновременно, HSP, взаимодействуя с поврежденными белками, не способными к восстановлению, способствует их катаболизму в клетке с образованием аминокислот для ресинтеза новых белков.

Для стимуляции репаративных процессов и снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур предлагаемое средство может использоваться в составе косметических средств, биологически активных добавок и пищевых продуктов.

Способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур включает до, во время и после проведения указанных процедур нанесение на кожу косметических средств, содержащих заявляемое средство для стимуляции синтеза HSP, и/или употребления содержащих его биологически активной добавки или пищевого продукта.

Под «агрессивными косметологическими процедурами» понимаются косметологические процедуры, в которых используется воздействия физических или химических факторов, способных вызывать функциональные и/или структурные нарушения в клетках. Применяемое в таких процедурах ограниченное повреждение клеток и тканей, не превышающее их компенсаторные возможности, способствует активации процессов, приводящих к омолжениию кожи и восстановлению ее нормальной структуры.

Перечень агрессивных косметологических процедур, при которых применение заявляемого средства приведет к повышению эффективности и уменьшению сопутствующих нежелательных явлений, включает, не ограничивая, лазерный фракционный фототермолиз, лазерный пилинг, фотоэпиляцию, фотоомоложение, фотоудаление пигментных пятен, фотоудаление сосудистой сетки и другие процедуры, проводимые с помощью лазерного излучения или интенсивного импульсного освещения, гипо- (крио-) и гипертермические дерматологические процедуры, электроэпиляцию и другие электротоковые процедуры, радиочастотные процедуры, ультразвуковую чистку и другие ультразвуковые процедуры, микродермабразию, механическую чистку, химический пилинг и другие.

Применение косметических средств, содержащих заявляемое средство для стимуляции синтеза HSP, и/или употребления содержащих его биологически активной добавки или пищевого продукта при подготовке и проведении агрессивных косметологических процедур, а также в ходе последующего восстановительного периода позволяет не только уменьшить количество побочных эффектов, присущих указанным процедурам, но и сократить продолжительность восстановительного периода.

Для приготовления предлагаемого средства используют приемлемые для косметических, фармацевтических или пищевых целей:

- по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений в количестве от 0,1 до 25 весовых %;

- НПАВ предпочтительно с величиной гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 10 до 18 или смесь таких веществ в количестве от 75 до 99,9 весовых %.

В качестве производных коричной кислоты используют хлорогеновую, феруловую или кофейную кислоты, куркумин или фенилэтиловый эфир кофейной кислоты. Однако приведенный перечень не ограничивает возможность использования других производных коричной кислоты. Использование в изобретении смесей указанных соединений предполагает возможность их нахождения в составе экстрактов из сырья растительного или животного происхождения. В качестве примера экстракта, не ограничивающего возможность использования других экстрактов, выступает декофеинизированный экстракт ягоды кофе, обогащенный смесью хлорогеновой кислоты с другими гидроксикоричными кислотами (феруловой и кофейной). Экстракты с наиболее высоким содержанием хлорогеновой кислоты получают из зеленой ягоды кофе.

В изобретении используют мицеллообразующие НПАВ с ГЛБ 10-18, обладающие высокой солюбилизирующей способностью. К указанным соединениям, не ограничивая возможность использования в изобретении других НПАВ, относятся полисорбат-20, полисорбат-40, полисорбат-60, полисорбат-80, ПЭГ-40 гидрированное касторовое масло (Cremophor RH 40), 35-полиоксиэтилированное касторовое масло (Cremophor EL), ПЭГ 15 гидроксистеарат (Solutol HS15).

Для приготовления заявляемого средства в НПАВ, разогретом до 80°С, растворяют необходимое количество природного фенольного соединения или смеси таких соединений. В зависимости от используемого НПАВ при остывании до комнатной температуры получается или жидкая прозрачная композиция, или пастообразная непрозрачная, превращающаяся в прозрачную жидкость при нагревании до 30-40°С. Цвет композиции определяется цветами входящих в ее состав компонентов.

Самоэмульгирующийся характер композиции проявляется в том, что при добавлении при комнатной температуре до 30 весовых % жидких композиций в воду и перемешивании на встряхивателе типа «вортекс» при 2000 об·мин^-1 в течение 30 секунд образуется прозрачная или слабо оплесцирующая дисперсия, устойчивая при комнатной температуре не менее 3 месяцев. Для пастообразных композиций диспергирование необходимо проводить при температуре не ниже 35°С и тех же условиях перемешивания. В этом случае образуется опалесцирующая дисперсная система, не оседающая при комнатной температуре в течение не менее 3 месяцев.

Для получения более стабильного средства с увеличенной способностью к индукции HSP в композицию дополнительно включают вещества, способные восстанавливать природные полифенольные соединения и их окисленные формы в клетках животных и человека, а также включают гидрофобные антиоксиданты. В качестве восстановителей природных полифенольных соединений в изобретении предпочтительно использовать аскорбиновую кислоту и ее производные (соли аскорбиновой кислоты, аскорбил глюкозид, аскорбил пальмитат, аскорбил стеарат). Перечень гидрофобных антиоксидантов, используемых в изобретении, включает токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон и их производные. Приведенные перечни не ограничивают возможность использования в изобретении других восстановителей и других гидрофобных антиоксидантов.

Готовят предлагаемое средство для стимуляции синтеза белков теплового шока в клетках человека и животных следующим образом.

Вещество, способное восстанавливать указанные фенольные соединения и их окисленные формы в клетках животных и человека (например, аскорбиновую кислоту или ее производные), в количестве от 0,01 до 20 весовых %, и природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 весовых % вместе с необходимым количеством природного фенольного соединения или смеси таких соединений, растворяют в НПАВ, разогретом до 80°С. При этом все используемые вещества должны быть гидрофобными (жирорастворимыми). В случае гидрофильности используемых веществ сначала готовят раствор гидрофильных соединений в воде при 80°С, а затем этот раствор смешивают с раствором гидрофобного антиоксиданта в НПАВ. Содержание воды в средстве возможно до 10 весовых %. В зависимости от используемого НПАВ при остывании до комнатной температуры получается или жидкая прозрачная композиция, или непрозрачная пастообразная композиция, превращающаяся в прозрачную жидкость при нагревании до 30-40°С. Цвет композиции определяется цветами входящих в ее состав компонентов.

Низкое содержание или отсутствие в составе заявляемого средства воды обеспечивает стабильность входящих в ее состав биологически активных веществ в течение длительного времени. Это, а также жидкое или пастообразное физическое состояние заявляемого средства при комнатной температуре позволяет рассматривать ее как удобный ингредиент для производства косметических средств, биологически активных добавок, пищевых продуктов и фармацевтических изделий. Кроме того, безводные варианты средства представляют интерес для производства продукции, наличие воды в составе которой является неприемлемым. Например, возможно использование средства в качестве наполнителя мягких желатиновых капсул, предназначенных для применения в качестве пищевых добавок или лекарственных средств.

Для приготовления косметических средств для стимуляции репаративных процессов и косметических средств для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур добавляют приготовленное вышеописанным способом средство для стимуляции синтеза белков теплового шока на любой стадии производства продукта.

Предпочтительным является добавление его на заключительных стадиях технологического процесса производства косметических продуктов при температуре 35-40°С для пастообразных и более низкой температуре для жидких композиций. Самоэмульгирующийся характер заявляемого средства позволяет при этом не использовать интенсивного перемешивания для эффективного диспергирования добавляемого средства. Таким образом, возможно получение однородного косметического продукта в виде эмульсии, суспензии, крема, молочка, геля, мази, бальзама, шампуня, тоника, лосьона, помады. Заявляемое средство совместимо как с косметическими основами масло в воде, так и вода в масле.

Для обеспечения необходимой биологической активности описанные косметические средства должны содержать заявляемое средство для стимуляции синтеза белков теплового шока в количестве не менее 0,1%, предпочтительно от 0,5 до 5%.

Для получения косметического продукта с оптимальным проявлением биологической активности в композицию дополнительно вводят аскорбиновую кислоту или ее производные в количестве 0,01-20 весовых % и/или природный или синтетический жирорастворимый антиоксидант или смесь таких антиоксидантов в количестве 0,01-2 весовых %. В качестве природного или синтетического жирорастворимого антиоксиданта могут быть использованы токоферол, каротин, ретинол, лютеин, ликопин, убихинон или их производные.

Такие косметические средства могут дополнительно содержать различные биологически активные вещества, в том числе обладающие увлажняющим действием, регенеративным действием, способностью стимулировать синтез коллагена, витамины, клеточные факторы роста и иные ингредиенты природного и химического происхождения, разрешенные к применению с косметическими целями.

При изготовлении биологически активной добавки с использованием заявляемого средства для стимуляции синтеза белков теплового шока предпочтительно максимально возможное его включение в состав биологически активной добавки. Использование в ней менее 1% заявляемого средства не целесообразно, так как трудно обеспечить эффективную дозу действующих веществ.

В этой связи привлекательны безводные варианты средства для стимуляции синтеза белков теплового шока, которые пригодны для наполнения мягких желатиновых капсул с максимальным включением средства. Для приготовления суспензий, эмульсий, солюбилизатов, а так же карамели заявляемое средство добавляют на любой удобной технологической стадии, предполагающей в дальнейшем достаточно продолжительное, но не обязательно интенсивное перемешивание.

Приготовление гранулятов, содержащих заявляемое средство, с использованием его спиртовых растворов путем влажной грануляции обеспечивает возможность приготовления биологически активных добавок в виде твердых желатиновых капсул, таблеток, порошков, гранул, микросфер, драже по стандартным технологиям приготовления перечисленных лекарственных форм с применением соответствующих вспомогательных ингредиентов.

Изготовление биологически активной добавки с использованием заявляемого средства возможно как с использованием только этого средства, так и в комбинации с другими биологически активными компонентами.

Описанные для приготовления биологически активных добавок технологические подходы также могут быть использованы для приготовления пищевого продукта в виде готового к употреблению продукта, продукта быстрого приготовления, пищевого концентрата или напитка. Учитывая то, что пищевые продукты употребляются в больших количествах, содержание заявляемого средства в них должно быть меньше, чем в биологически активной добавке. Однако нецелесообразно содержание заявляемого средства в пищевом продукте менее 0,001%. Предпочтительно использование в пищевых продуктах от 0,01 до 0,5% заявляемого средства. Содержание его в пищевом продукте более 1% допустимо в пищевых концентратах, предполагающих разведение при приготовлении продукта для употребления в пищу.

Способы снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур с использованием предлагаемого средства для стимуляции синтеза белков теплового шока осуществляют следующим образом:

до и/или, во время и/или после проведения агрессивных косметологических процедур на кожу в месте проведения указанных процедур наносят косметическое средство, содержащее заявляемое средство, и/или пациент употребляет содержащую средство биологически активную добавку или пищевой продукт.

При поверхностном характере агрессивной косметологической процедуры (лазерный фракционный фототермолиз, лазерный пилинг, фотоэпиляция, фотоомоложение, фотоудаление пигментных пятен, фотоудаление сосудистой сетки и другие процедуры, проводимых с помощью лазерного излучения или интенсивного импульсного освещения, механическая чистка, химический пилинг) допускается совместное и отдельное использование накожного и пероральное применения заявляемого средства.

В случае, если процедура захватывает глубокие слои кожи и подкожную жировую клетчатку (гипо- (крио-) и гипертермические дерматологические процедуры, электроэпиляция и другие электротоковые процедуры, радиочастотные процедуры, ультразвуковая чистка и другие ультразвуковые процедуры, микродермабраз), отдельное применение целесообразно только для пероральных продуктов, содержащих заявляемое средство.

Косметическое средство наносят в количестве 0,05-0,2 г на см² поверхность кожи, которая будет обрабатываться в ходе планируемой агрессивной косметологической процедуры. Биологически активная добавка или пищевой продукт должны приниматься в количестве, содержащем от 1 до 15 мг заявляемого средства на кг массы тела в день, предпочтительно 2-10 мг/кг/день.

С учетом временных характеристик индукции HSP применение содержащих заявляемое средство косметических продуктов и/или прием содержащих это средство биологически активной добавки или пищевого продукта необходимо начинать за 1-3 дня до проведения агрессивных косметологических процедур. После проведения указанных процедур применение содержащих заявляемое средство продуктов целесообразно продолжить для поддержания повышенного уровня репаративных процессов в течение нескольких недель до полного завершения реабилитационного периода.

Описанное в способе снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур употребление содержащих заявляемое средство биологически активной добавки или пищевого продукта позволяет также снизить повреждение мышечных клеток после тяжелых физических нагрузок. Тяжелые физические нагрузки включают спортивные нагрузки, различные работы в неблагоприятных и вредных условиях труда и не ограничиваются приведенным перечнем.

Биологически активная добавка или пищевой продукт принимают в этом случае в количестве, содержащем от 1 до 15 мг заявляемого средства на кг массы тела в день, предпочтительно 5-10 мг/кг/день. Прием указанных биологически активной добавки или пищевого продукта необходимо начинать за 1-3 дня до тяжелых физических нагрузок и целесообразно продолжить для поддержания повышенного уровня репаративных процессов в течение нескольких недель до полного завершения реабилитационного периода.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его по существу.

Примеры 1-12. Различные варианты НПАВ и производных коричной кислоты, а также их количества сведены в Таблицу 1.

Для приготовления средства берут необходимое количество НПАВ и нагревают до температуры 80°С. Затем добавляют необходимое количество производного коричной кислоты в соответствии с таблицей 1.

Смесь, поддерживая указанную температуру, перемешивают до растворения добавленного вещества. Затем приготовленную композицию охлаждают до комнатной температуры и, в зависимости от примененного НПАВ, получают прозрачную жидкую или непрозрачную пастообразную композицию, превращающеюся в прозрачную жидкость при нагревании до 35°С.

Таблица 1
Ингредиент	Содержание ингредиента в примере, г
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Производное коричной кислоты
хлорогеновая кислота	10,0					10,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
феруловая кислота		5,0
кофейная кислота			2,5
куркумин				0,75
фенилэтиловый эфир кофейной кислоты					1,0
экстракт ягод кофе (Svetol)												25,0
НПАВ
полисорбат 20 (Tween 20)						90,0
полисорбат 40 (Tween 40)							95,5
полисорбат 60 (Tween 60)								95,0
полисорбат 80 (Tween 80)
ПЭГ 40 гидрированное 95,0 касторовое масло (Cremophor RH 40)									95,0
35 полиоксиэтилированное 95,0 касторовое масло (Cremophor EL),										95,0
ПЭГ 15 гидроксистеарат 95,0 (Solutol HS15)											95,0
Характеристика получаемого продукта	Ж	Ж	Ж	Ж	Ж	Ж	П	П	П	П	П	Ж
Примечание.
Ж-прозрачная жидкая композиция, при смешивании с водой, нагретой до 37°С, образующая слабо опалесцирующий солюбилизат,
П - пастообразная непрозрачная композиция, превращающаяся в прозрачную жидкость при нагревании до 35°С. Смешивание этой жидкости, нагретой до 37°С, с водой, нагретой до той же температуры, дает сильно опалесцирующую дисперсную систему, не оседающую при комнатной температуре в течение не менее 3 месяцев.

Данные композиции могут быть использованы при изготовлении косметических средств, биологически активных добавок, пищевых продуктов.

Пример 13. Повышение содержания HSP70 в клетках культуры кератиноцитов in vitro при воздействии хлорогеновой кислоты, феруловой кислоты, кофейной кислоты, куркумина, фенилэтилового эфира кофейной кислоты и экстракта ягоды кофе (Svetol) в составе композиций с полисорбатом-80 без дополнительного воздействия стрессового фактора.

Кератиноциты получали из образцов кожи, отобранных в ходе косметологических операций на здоровых добровольцах после подписания информированного согласия. Промытые PBS фрагменты кожи с удаленной подкожной жировой клетчаткой в течение ночи инкубировали при 4°С в растворе PBS, содержащем диспазу. После этого эпидермис отделяли от дермы и помещали его в раствор, содержащий трипсина и ЭДТА, при 37°С. По окончанию инкубации активность трипсина в среде подавляли добавлением ингибитора трипсина из семян сои и после ресуспендирования кератиноциты осаждали центрифугированием. Полученные клетки культивировали в бессывороточной среде для кератиноцитов с добавлением ростовых факторов при 37°С и 5% CO₂ культуральных флаконах. Смену среды проводили через каждые 3-4 дня. За сутки до эксперимента по 3×10⁵ клеток вносили в лунки 6-луночных планшетов.

Для исследования влияния веществ и композиций на продуцирование HSP из лунок удаляли культуральную среду и наливали по 2,0 мл подогретых до 37°С предварительно приготовленных смесей полной среды для кератиноцитов с композициями производных коричных кислот с полисобатом 80 по примерам 1-5 и 12 или растворами производных коричной кислоты в воде или спирте, при плохой растворимости в воде смеси готовили добавлением необходимого количества раствора или композиции с последующим перемешиванием до получения прозрачной дисперсии или раствора. Окончательная концентрация в инкубационной среде составляла: производных коричных кислот - 50 мкМ, экстракта ягоды кофе - 50 мкг/мл, полисорбата 80 - не более 0,25%, этанола - не более 0,05%. Контрольные лунки содержали в инкубационной среде 0,25% полисорбата 80 или 0,05% этанола.

После добавления описанных смесей культуральной среды с исследуемыми веществами и композициями часть планшетов помещали на 4 часа при 42°С, а остальные на тоже время при 37°C. По окончанию инкубации из лунок удаляли инкубационную среду, отделяли клетки от субстрата раствором Версена и трижды промывали их PBS использованием центрифугирования. Полученный осадок клеток лизировали раствором, содержащим ингибиторы протеаз, в соответствие с протоколом подготовки проб для иммуноферментного анализа (ИФА). Содержание HSP70 в полученных, пробах определяли методом ИФА.

Синтез HSP70 в кератиноцитах человека после 4 часов инкубации при 37°С и 42°С (тепловой шок) в присутствии производных коричной кислоты при внесении указанных соединений в культуральную среду в составе композиций с полисорбатом 80 и в виде водных (хлорогеновая кислота, экстракт ягоды кофе Svetol) или спиртовых (феруловоя кислота, кофейная кислота, куркумин, фенилэтиловый эфир кофейной кислоты) растворов показан на Фиг.1.

Приводимое относительное содержания HSP70 представляет собой отношение к среднему абсолютному содержанию HSP70 в лунках без добавок, инкубировавшихся при 37°С, и приведены в виде среднее±стандартное отклонение по трем экспериментам. * - Р<0,05 при сравнении со значениями в пробах без теплового шока и добавлением индивидуальных веществ. Здесь и далее используется непарный

t-критерий Стьюдента.

Полученные результаты (фиг.1.) демонстрируют способность заявляемого средства, включающего фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений и неионогенное поверхностно активное вещество, индуцировать синтез HSP70 самостоятельно без дополнительного воздействия стрессовых факторов до уровня, близкого к достигаемому при тепловом шоке.

Пример 14. Повышение содержания HSP70 в клетках культуры фибробластов in vitro при воздействии хлорогеновой кислоты в составе композиций с полисорбатом 20, полисорбатом 40, полисорбатом 60, полисорбатом 80, ПЭГ 40 гидрированным касторовым маслом (Cremophor RH 40), 35 полиоксиэтилированным касторовым маслом (Cremophor EL), ПЭГ 15 гидроксистеаратом (Solutol HS 15) без дополнительного воздействия стрессового фактора.

Культивирование фибробластов мыши линии NIH/3T3 проводили в среде DMEM с добавлением L-глутамина, пенициллина, стрептомицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С, 5% CO₂. Пассирование клеток проводили 2 раза в неделю, когда конфлуентность монослоя достигала 80-90%. За сутки до эксперимента по 3×10⁵ клеток вносили в лунки 6-луночных планшетов.

Для исследования влияния веществ и композиций на продуцирование HSP из лунок удаляли культуральную среду и наливали по 2,0 мл подогретых до 37°С предварительно приготовленных смесей полной среды DMEM с НПАВ или их композициями с хлорогеновой кислоты по примерам 6-11. Смеси готовили добавлением необходимого количества НПАВ или композиций с последующим перемешиванием до получения прозрачной дисперсии или раствора. Перед приготовлением смесей культуральной среды с композициями по примерам 7-11 и соответствующими НПАВ компоненты смесей предварительно нагревали до 37°С. Окончательная концентрация хлорогеновой кислоты составляла 50 мкМ во всех содержащих ее лунках. Концентрация НПАВ в лунках без хлорогеновой кислоты была 0,035%.

После добавления описанных смесей культуральной среды с исследуемыми веществами и композициями часть планшетов помещали на 4 часа при 42°С, а остальные на тоже время при 37°С. По окончанию инкубации из лунок удаляли инкубационную среду, отделяли клетки от субстрата раствором Версена и трижды промывали их PBS использованием центрифугирования. Полученный осадок клеток лизировали раствором, содержащим ингибиторы протеаз, в соответствие с протоколом подготовки проб для иммуноферментного анализа (ИФА). Содержание HSP70 в полученных пробах определяли методом ИФА.

Синтез HSP70 в фибробластах линии NIH/3T3 после 4 часов инкубации при 37°С и 42°С (тепловой шок) в присутствии хлорогеновой кислоты при ее внесении указанных соединений в культуральную среду в составе композиций с разными НПАВ и в виде водного раствора показан на Фиг.2.

Приводимое относительное содержания HSP70 представляет собой отношение к среднему абсолютному содержанию HSP70 в лунках без добавок, инкубировавшихся при 37°С, и приведены в виде среднее±стандартное отклонение по трем экспериментам. * - Р<0,05 при сравнении со значениями в пробах без теплового шока и добавлением индивидуальных веществ. Полученные результаты (фиг.2.) демонстрируют способность заявляемого средства, включающего фенольное соединение из группы производных коричной кислоты и разные неионогенные поверхностно активные вещества, индуцировать синтез HSP70 самостоятельно без дополнительного воздействия стрессовых факторов до уровня, близкого к достигаемому при тепловом шоке.

Примеры 15-23. Различные варианты НПАВ и производных коричной кислоты, а также их количества сведены в Таблицу 2.

Для приготовления средства берут необходимое количество НПАВ и нагревают до температуры 80°С. Затем добавляют производное коричной кислоты в соответствии с таблицей 2. Смесь, поддерживая указанную температуру, перемешивают до растворения добавленного вещества. В полученную прозрачную композицию добавляют аскорбилпальмитат и гидрофобный антиоксидант в количествах, указанных в той же таблице, и перемешивают до получения прозрачной жидкости. Затем приготовленную композицию охлаждают до комнатной температуры и, в зависимости от использованного НПАВ, получают прозрачную жидкую или непрозрачную пастообразную композицию, превращающаюся в прозрачную жидкость при нагревании до 35°С.

Таблица 2
Ингредиент	Содержание ингредиента в примере, г
	15	16	17	18	19	20	21	22	23
Производное коричной кислоты
хлорогеновая кислота	10,0	1,0
экстракт ягод кофе (Svetol)			15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	10,0
НПАВ
полисорбат-80 (Tween 80)	79,0		74,0	74,95	74,975	74,75	74,75	74,5	78,95
полисорбат-60 (Tween 60)		93,5
Производное аскорбиновой кислоты
аскорбилпальмитат	10,0	5,0	10,0	10,0	10,0	10,0	10,0	10,0	10,0
Жирорастворимый антиоксидант
-токоферол	1,0	0,5	1,0						0,5
-каротин				0,05					0,05
ретинол					0,025
лютеин						0,25
ликопин							0,25
убихинон								0,5	0,5
Характеристика получаемого продукта	Ж	П	Ж	Ж	Ж	Ж	Ж	Ж	Ж
Примечание.
Ж-прозрачная жидкая композиция, при смешивании с водой, нагретой до 37°С, образующая слабо опалесцирующий солюбилизат,
П - пастообразная непрозрачная композиция, превращающаяся в прозрачную жидкость при нагревании до 35°С. Смешивание этой жидкости с водой, нагретой до 37°С, дает сильно опалесцирующую дисперсную систему, не оседающую при комнатной температуре в течение не менее 3 месяцев.

Данные композиции может быть использованы при изготовлении косметических средств, биологически активных добавок, пищевых продуктов.

Пример 24. Приготовление средства: полифенол#1 + ПАВ#1 + аскорбиновая кислота + антиоксидант#1 + вода

К 69 г нагретого до 80°С полисорбата-80 добавляют 1 г -токоферола и 10 г хлорогеновой кислоты, перемешивают до получения прозрачной композиции. Растворяют 10 г аскорбиновой кислоты в 10 г воды, нагретой до 80°С. Добавляют раствор к смеси полисорбата с антиоксидантом. Перемешивают смесь до получения прозрачной композиции и охлаждают ее до комнатой температуры. Получают прозрачную жидкую композицию, при смешивании с водой образующую прозрачный солюбилизат. Данная композиция может быть использована при изготовлении косметических средств, биологически активных добавок, пищевых продуктов.

Пример 25. Приготовление средства: полифенол#1 + ПАВ#1 + аскорбиновая кислота + антиоксидант#1 + вода

К 78 г нагретого до 80°С полисорбата-80 добавляют 1 г -токоферола и перемешивают до получения прозрачной композиции. Растворяют 1 г хлорогеновой кислоты и 10 г аскорбиновой кислоты в 10 г воды, нагретой до 80°С. Добавляют раствор к смеси полисорбата с антиоксидантом. Перемешивают полученную смесь до получения прозрачной композиции и охлаждают ее до комнатной температуры. Получают прозрачную жидкую композицию, при смешивании с водой образующую прозрачный солюбилизат. Данная композиция может быть использована при изготовлении косметических средств, биологически активных добавок, пищевых продуктов.

Пример 26. Приготовление средства с экстрактом зеленой ягоды кофе + ПАВ#1 + аскорбиновая кислота + антиоксидант#1 + вода

К 77 г нагретого до 80°С полисорбата-80 добавляют 1 г -токоферола и перемешивают до получения прозрачной композиции. Растворяют 2 г экстракта зеленой ягоды кофе и 10 г аскорбиновой кислоты в 10 г воды, нагретой до 80°С. Добавляют раствор к смеси полисорбата с токоферолом. Перемешивают полученную смесь до образования прозрачной жидкости, которую затем охлаждают до комнатной температуры. Получают прозрачную жидкую композицию, при смешивании с водой образующую прозрачный солюбилизат. Данная композиция может быть использована при изготовлении косметических средств, биологически активных добавок, пищевых продуктов.

Пример 27. Демонстрация большей стабильности и повышения содержания HSP70 в клетках культуры фибробластов in vitro при воздействии композиции хлорогеновой кислоты с НПАВ, производным аскорбиновой кислоты и антиоксидантом по сравнению с воздействием композиции хлорогеновой кислоты только с НПАВ.

Культивирование фибробластов мыши линии NIH/3T3 и их подготовку к экспериментам проводили, как описано в примере 14.

Для исследования влияния на продуцирование HSP фибробластами из лунок удаляли культуральную среду и наливали по 2,0 мл подогретых до 37°С предварительно приготовленных смесей полной среды DMEM с композициями или растворами в указанной среде входящих в состав композиций вещества. Использовали композиции по примерам 1 и 15, а также композиции полисорбата 80 с -токоферолом и полисорбата 80 с аскорбилпальмитатом, получающиеся при смешивании в соотношениях, приведенных в описании примера 15. Смеси готовили добавлением необходимого количества композиций или индивидуальных веществ с последующим перемешиванием до получения прозрачной дисперсии или раствора. Окончательная концентрация внесенных в культуральную среду хлорогеновой кислоты составляла 50 мкМ, аскорбилпальмитата - 42,7 мкМ, -токоферола - 4,1 мкМ. Концентрация полисорбата 80 в инкубационной смеси, при его добавлении в чистом виде составляла 0,016%, что соответствует его максимальной концентрации при добавлении в составе используемых композиций.

После добавления описанных смесей культуральной среды с исследуемыми веществами и композициями часть планшет инкубировали 1, 2, 3 или 4 часа при 37°С и 5% CO₂, а в части планшет после 4 часов инкубации исследуемые смеси заменяли на полную среду DMEM и инкубировали еще 20 часов при тех же условиях. По окончании каждого варианта инкубации из лунок удаляли инкубационную среду, отделяли клетки от субстрата раствором Версена и трижды промывали их PBS использованием центрифугирования. Полученный осадок клеток лизировали раствором, содержащим ингибиторы протеаз, в соответствие с протоколом подготовки проб для иммуноферментного анализа (ИФА). Содержание HSP70 в полученных, пробах определяли методом ИФА.

Синтез HSP70 в фибробластах линии NIH/3T3 в присутствии хлорогеновой кислоты и ее композиций с НПАВ, производным аскорбиновой кислоты и гидрофобным антиоксидантом показан на Фиг.3.

Приводимое относительное содержания HSP70 представляет собой отношение к среднему абсолютному содержанию HSP70, определенному после удаления культуральной среды перед внесением добавок, и приведены в виде среднее±стандартное отклонение по трем экспериментам. *-Р<0,05 при сравнении со значениями до инкубации с добавками. ** - Р<0,05 при сравнении со значениями после 4 часов инкубации с добавками. Период инкубации с добавками отмечен утолщением оси абсцисс.

Полученные результаты (фиг.3.) демонстрируют более выраженную и устойчивую индукцию синтеза HSP70 заявляемым средством при включении в него кроме фенольного соединения из группы производных коричной кислоты и НПАВ дополнительно производного аскорбиновой кислоты и гидрофобного антиоксиданта.

Пример 28. Демонстрация защитного действия средств по заявляемому изобретению при цитотоксического воздействия на клетки культуры фибробластов in vitro.

Культивирование фибробластов мыши линии NIH/3T3 и их подготовку к экспериментам проводили, как описано в примере 14, с тем отличием, что использовали 96-луночные планшеты, в лунки которых за сутки до эксперимента вносили по 1×10⁵ клеток.

В экспериментах использовали композиции по примерам 17-22, которые добавляли в полную культуральную среду DMEM в количестве 0,02% и композицию по примеру 12, которую добавляли в количестве 0,012%. Также использовали композиции полисорбата 80 с -токоферолом и полисорбата 80 с аскорбилпальмитатом, получающиеся при смешивании в соотношениях, приведенных в описании примера 17, которые добавляли в культуральную среду в количестве, соответствующем их содержанию в добавляемом количестве полной композиции. Смеси с композиций со средой готовили добавлением необходимого количества композиций или индивидуальных веществ с последующим перемешиванием до получения прозрачной дисперсии или раствора. Окончательная концентрация внесенных в культуральную среду экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol) составляла 30 мкг/мл, аскорбилпальмитата - 48,2 мкМ, -токоферола - 4,6 мкМ. Концентрация полисорбата 80 в инкубационной смеси, при его добавлении в чистом виде составляла 0,015%, что соответствует его максимальной концентрации при добавлении в составе используемых композиций.

Для исследования влияния индукции HSP на чувствительность фибробластов к цитотоксическому воздействию из лунок удаляли культуральную среду и наливали по 0,2 мл подогретых до 37°С предварительно приготовленных описанных выше смесей. После добавления планшеты инкубировали 4 часа при 37°С и 5% CO₂. Затем исследуемые смеси заменяли на 0,2 мл полной среды DMEM или полной среды DMEM, содержащей 50 мкМ натрия мышьяковокислого и инкубировали еще 20 часов при тех же условиях.

По окончании инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора МТТ (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида) с концентрацией 5 мг/мл в PBS и продолжали инкубировать еще 4 часа. Затем культуральную жидкость полностью удаляли, в каждую лунку вносили по 200 мкл диметилсульфоксида, перемешивали интенсивным встряхиванием планшета в течение 30 минут. Количество образовавшегося формазана, которое пропорционально функциональной активности клеток, оценивали по оптической плотности содержимого лунок при 550 нм на планшетном фотометре.

Жизнеспособность фибробластов линии NIH/3T3 в присутствии композиций экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol) с НПАВ, производным аскорбиновой кислоты и гидрофобным антиоксидантом при токсическом воздействии показана на Фиг.4. Жизнеспособность клеток в лунках характеризована отношением оптической плотности их содержимого к средней оптической плотности содержимого лунок, в которые не вносилось каких-либо добавок. Данные приведены в виде среднее±стандартное отклонение по трем экспериментам. * - Р<0,05 при сравнении со значениями в лунках с такими же добавками исследуемых веществ или композиций без цитотоксического воздействия 50 мкМ натрия мышьяковокислого в течение 20 часов.

Полученные результаты (фиг.4.) демонстрируют выраженный антитоксический эффект композиций экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol) с НПАВ, производным аскорбиновой кислоты и гидрофобным антиоксидантом. Эффект композиции, включающей только экстракт зеленой ягоды кофе и НПАВ, немного ниже. При этом в чистом виде экстракт зеленой ягоды кофе обладает слабым антитоксическим действием.

Пример 29. Приготовление косметического крема для стимуляции репаративных процессов с включением заявляемого средства.

В качестве косметического средства, используемого для стимуляции репаративных процессов может быть использован крем следующего состава:

А
Карбопол ультрез 21	0,30%
Вода	53,34%
В
Триэтаноламин	0,40%
С
Арламол Е	2,66%
Бридж 721	1,99%
Бридж 72	3,32%
D
Вода	31,89%
Е
Композиция по примеру 16	5,00%
(экстракт зеленой ягоды кофе + ПАВ#2 + аскорбиновая кислота
(пальмитат) + антиоксидант#1)
F
Гермабен II	1,00%
Отдушка	0,10%

Для приготовления крема навеску карбополультрез 21 (фаза А) высыпают на поверхность воды и дожидаются полного смачивания порошка, затем перемешивают до однородности. Добавляют триэтаноламин (фаза В) и перемешивают до однородности (фаза АВ). Нагревают Арламол Е, Бридж 721, Бридж 72 (фаза С), воду (фаза D) до 85°С. Добавляют фазу С к фазе D и гомогенизируют на Ultra Turrax в течение 3-х минут до образования однородной эмульсии. Добавляют в фазу АВ горячую фазу CD, тщательно перемешивают на лопастной мешалке. Дают остыть смеси фазы ABCD до 40°С при перемешивании. После этого добавляют композицию по примеру 16 (фаза Е) и гермабен II (фаза F) в фазу ABCD. Продолжают перемешивание до достижения кремом комнатной температуры и получения однородной консистенции. Полученный крем стабилен не менее 12 месяцев.

Описанный крем наносят на открытые участки кожи, подвергающиеся воздействию вредных факторов окружающей среды, в том числе вредных производственных факторов. Крем может использоваться при проведении агрессивных косметологических процедур для стимуляции омоложения и регенерации кожи, а также для снижения побочных эффектов проводимых процедур.

Пример 30. Приготовление косметического крема для стимуляции репаративных процессов и снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур.

В качестве косметического средства, используемого для стимуляции репаративных процессов и снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, в частности, может применяться крем следующего состава:

А
Эмульгейд SE PF	8,00%
Цетеариловый спирт	5,00%
Масло авокадо	3,00%
Эутанол G	3,00%
Диметикон М350	2,00%
Масляный экстракт ромашки	0,50%
В
Вода	до 100%
С
Композиция по примеру 12	3,00%
(экстракт зеленой ягоды кофе + ПАВ#1 + аскорбиновая кислота
(пальмитат) + антиоксидант#1)
D
D-пантенол 75%	1,33%
Микрокар ВМР	1,00%
Отдушка	0,10%

Для приготовления крема нагревают А до 80°С и перемешивают до однородности. Нагревают В до 80°С, и добавляют А к В при интенсивном перемешивании. Продолжая перемешивание, смесь охлаждают, добавив при достижении до 40°С компоненты С и D. Продолжают перемешивание до достижения кремом комнатной температуры и получения однородной консистенции. Полученный крем стабилен не менее 12 месяцев.

Описанный крем наносят на кожу в месте проведения агрессивных косметологических процедур до, во время и после указанных процедур, что приводит к стимуляции омоложения и регенерации кожи, а также снижению побочных эффектов проводимых процедур. Крем может использоваться для нанесения на открытые участки кожи, подвергающиеся воздействию вредных факторов окружающей среды, в том числе вредных производственных факторов.

Пример 31. Приготовление косметического крема для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур.

В качестве косметического средства, используемого для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, в частности, может применяться крем следующего состава:

А
УФ-фильтр Eusolex OCR	9,00%
Эмульгейд SE PF	8,00%
Цетеариловый спирт	5,00%
Масло авокадо	3,00%
Эутанол G	2,00%
Диметикон М350	2,00%
УФ-фильтр Eusolex 9020	2,00%
Витамин Е	0,50%
Масляный экстракт ромашки	0,50%
Аскорбил пальмитат	0,05%
В
Вода	до 100%
Бета 1,3-глюкан	0,50%
Аллонтоин	0,20%
С
Д-пантенол 75%	1,33%
Микрокар DMP	1,00%
Композиция по примеру 12	2,00%
(экстракт зеленой ягоды кофе+ПАВ#1)
Калмосенсин (Calmosensine )	3,00%
D
Отдушка	0,10%

Для приготовления крема нагревают А до 80°С, и перемешивают до однородности. Приготавливают В и нагревают до 80°С. Добавляют А к В при интенсивном перемешивании. Продолжая перемешивание, смесь охлаждают, добавив при достижении до 40°С компоненты С и D. Продолжают перемешивание до достижения кремом комнатной температуры и получения однородной консистенции. Полученный крем стабилен не менее 12 месяцев.

Описанный крем наносят на кожу в месте проведения агрессивных косметологических процедур до, во время и после указанных процедур, что приводит к стимуляции омоложения и регенерации кожи, а так же снижению побочных эффектов проводимых процедур.

Пример 32. Приготовление биологически активной добавки в виде мягкой желатиновой капсулы, содержащей заявляемое средство.

Заявляемое средство по примерам 1-12, 15-23 может быть использовано для заполнения мягких желатиновых капсул с использованием стандартных технологий. В связи с этим было проведено исследование стабильности мягких желатиновых капсул при их заполнении композицией по примеру 17 (экстракт зеленой ягоды кофе + ПАВ#1 + аскорбиновая кислота (пальмитат)+антиоксидант#1) по технологии с завариванием шва. Использовались овальные капсулы размера 10 и продолговатые капсулы размера 11 с массой композиции в капсуле 0,60 г. Проведенные исследования показали, что капсулы стабильны не менее 12 месяцев. В течение этого срока не наблюдается изменений физико-химических свойств, как оболочек капсул, так и их содержимого.

Описанная биологически активная добавка рекомендуется для употребления по 1 капсуле в день с целью восполнения пищевых дефицитов, неблагоприятно сказывающихся на восстановлении организма после воздействия вредных факторов, физических нагрузок, а также для эффективности и безопасности проводимых агрессивных косметологических процедур.

Пример 33. Приготовление биологически активной добавки в виде твердой желатиновой капсулы, содержащей заявляемое средство.

Заявляемое средство может быть использовано для изготовления биологически активной добавки в виде твердой желатиновой капсулы, заполняемой гранулятом, приготовленным из смеси следующего состава:

Композиция по примеру 12.12	17,5%
(экстракт зеленой ягоды кофе + ПАВ#1)
Этанол абсолютный	12,7%
Аскорбиновая кислота	17,5%
Двуокись кремния коллоидная безводная	21,8%
Микрокристаллическая целлюлоза	30,5%

Для приготовления гранулята аскорбиновую кислоту, микрокристаллическую целлюлозу и двуокись кремния загружают в смеситель и перемешивают до однородности. В отдельном сосуде смешивают композицию по примеру 12 с этанолом и полученный раствор медленно добавляют к сухой смеси, продолжая ее перемешивание с низкой скоростью до получения однородной массы для грануляции. Далее проводят влажную грануляцию пропусканием полученной массы через сито гранулятора с отверстиями диаметром 3-5 мм. Полученные гранулы рассыпают тонким слоем на поддонах и сушат при температуре 20-35°С в сушильном шкафу до полного удаления спирта (снижение массы около 12,5%). Затем проводят сухую грануляцию пропусканием полученной массы через сетку гранулятора с отверстиями, диаметром 1-2 мм. В результате получают гранулят с содержанием экстракта зеленой ягоды кофе 5%, который засыпают по 400 мг в твердые желатиновые капсулы размера 0.

Описанная биологически активная добавка рекомендуется для употребления по 2-4 капсулы в день с целью восполнения пищевых дефицитов, неблагоприятно сказывающихся на восстановлении организма после воздействия вредных факторов, физических нагрузок, а также для эффективности и безопасности проводимых агрессивных косметологических процедур.

Пример 34. Приготовление биологически активной добавки в виде таблетки, содержащей заявляемое средство.

Для изготовления биологически активной добавки в виде таблетки, содержащей заявляемое средство, используют рецептура следующего состава:

Композиция по примеру 17	17,5%
(экстракт зеленой ягоды кофе + ПАВ#1 + аскорбиновая кислота
(пальмитат) + антиоксидант#1)
Этанол абсолютный	12,7%
Лактозы моногидрат	55,0%
Натрия карбоксиметилкрахмал	0,9
Кремния двуокись коллоидная безводная	13,1%
Магния стеарат	0,9%

Для получения таблеточной массы в смеситель загружают и перемешивают до однородности лактозы моногидрат, натрия карбоксиметилкрахмал и двуокись кремния. В отдельном сосуде смешивают композицию по примеру 17 с этанолом и полученный раствор медленно добавляют к сухой смеси, продолжая ее перемешивание с низкой скоростью до получения однородной массы для грануляции. Далее проводят влажную грануляцию пропусканием полученной массы через сито гранулятора с отверстиями диаметром 3-5 мм. Полученные гранулы рассыпают тонким слоем на поддонах и сушат при температуре 20-35°С в сушильном шкафу до полного удаления спирта (снижение массы около 12,5%). Высушенный гранулированный материал помещают в гомогенизатор и измельчают 30 мин. Затем добавляют магния стеарат и смесь перемешивают еще 5 мин. Полученную таблеточную массу с содержанием 3% экстракта зеленой ягоды кофе используют для получения овальных таблеток массой 500 мг.

Описанная биологически активная добавка рекомендуется для употребления по 2-4 таблетки в день с целью восполнения пищевых дефицитов, неблагоприятно сказывающихся на восстановлении организма после воздействия вредных факторов, физических нагрузок, а также для эффективности и безопасности агрессивных косметологических процедур.

Пример 35. Приготовление пищевого продукта в виде напитка, содержащего заявляемое средство.

Учитывая способность композиции к диспергированию в воде с образованием прозрачных и слабоопалесцирующих солюбилизатов, она может быть использована для приготовления как прозрачных, так и непрозрачных напитков, обогащенных биологически активными веществами.

Не ограничивая возможности создания пищевых продуктов и, в частности, напитков с использованием заявляемой композиции приводимым составом, ниже предлагается состав прозрачного безалкогольного напитка с указанием содержания включаемых ингредиентов в мг на 100 мл:

Композиция по примеру 23	50,00
(в ее составе: экстракта зеленой ягоды кофе 5 мг,
витамина Е - 0,25 мг, витамина А-0,025 мг,
коэнзима Q10-0,25 мг, витамина С-5 мг)
Ниацин	1,80
Пантотеновая кислота	0,60
Витамин В6	0,20
Витамин В2	0,16
Витамин В1	0,14
Фолиевая кислота, мкг	20,00
Биотин, мкг	15,00
Витамин В12, мкг	0,10
Подсластитель (сахар)	1000,00
Регулятор кислотности (лимонная кислота)	200,00
Ароматизатор с кофейным запахом	50,00
Краситель пищевой	30,00
Консервант (бензоат натрия)	20,00
Вода питьевая	остальное

Для приготовления напитка растворяют все входящие в его состав ингредиенты, кроме композиции по примеру 23 в соответствующем количестве напитка объеме воды, нагретой до 50°С. Охлаждают приготовленный раствор до комнатной температуры и добавляют композицию по примеру 23. Перемешивают до образования прозрачного продукта.

Описанный напиток рекомендуется для употребления до, во время и после проведения агрессивных косметологических процедур как содержащий питательные вещества, необходимые для эффективного протекания процессов регенерации, в том числе в коже, и обеспечения ее устойчивости к воздействию агрессивных факторов окружающей среды, в том числе при проведении косметологических процедур, а также для употребления с целью восполнения пищевых дефицитов, неблагоприятно сказывающихся на восстановлении организма после воздействия вредных факторов, физических нагрузок.

Пример 36. Описание эффекта применения косметического средства для стимуляции синтеза HSP70 (стимуляции репаративных процессов).

Для демонстрации эффекта стимуляции синтеза HSP в коже при нанесении заявляемого средства в составе косметического крема, использовали крем, приготовленный, как описано в примере 29. Сравнение проводили с кремом на основе той же кремовой базы, с одинаковым содержанием экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol), но добавленного вне заявляемой композиции и без остальных ее компонентов. Для контроля эффекта дополнительных компонентов средства использовали содержащий их крем с кремовой базой по примеру 29 и добавлением композиции по примеру 16, приготовленной без экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol). Для контроля эффекта манипуляций и кремовой базы использовалась группа животных, которым наносился крем без добавления заявляемого средства в виде кремовой базы по примеру 29, то есть без фазы Е.

Исследования были проведены на мышах линии BALB/c весом 20 25 г. Животных содержали при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище (сбалансированный по составу корм для лабораторных крыс и мышей). С участков кожи на спине, подвергающихся экспериментальному воздействию, непосредственно перед первым нанесением крема выстригали шерстный покров. Крема наносили трижды с интервалом в сутки на участок 1 см × 1 см в дозе 0, 1 г на см² и втирали пальцами до полного впитывания. Каждым видом крема обрабатывали по 12 мышей.

Через сутки после последнего нанесения кремов половину животных, обработанных каждым видом крема, помещали на 1 час при 42°С, а затем всех животных еще 6 часов содержали при комнатной температуре (23°С). Затем животных умерщвляли цервикальной дислокацией. У умерщвленных животных вырезали обработанные участки кожи. Кожные лоскуты замораживали и хранили в жидком азоте.

В день проведения анализов образцы размораживались и гомогенизировались с использованием гомогенизатора Polytron в охлажденном на льду PBS, содержащем смесь ингибиторов протеаз, из расчета 100 мг ткани на 1 мл буфера. Полученный гомогенат центрифугировали 20 минут при 10000g для осаждения фрагментов таней и клеток. В полученном супернатанте определяли содержание HSP70 методом ИФА и пересчитывали полученное значение на г ткани.

Синтез HSP70 в коже мышей после обработки косметическим кремом, содержащим заявляемое средство по примеру 29 показан на Фиг.5.

Приводимое относительное содержание HSP70 представляет собой отношение к среднему содержанию HSP70 в коже мышей, которым наносилась только кремовая база по примеру 29 без фазы Е. Данные приведены в виде среднее±стандартное отклонение по 6 животным. * - Р<0,05 при сравнении с животными, которым наносилась кремовая база. **-Р<0,05 при сравнении с животными, которым наносился такой же крем, но которые не подвергались гипертермии.

Полученные результаты (фиг.5.) демонстрируют способность косметического крема, содержащего заявляемое средство, индуцировать синтез HSP70 самостоятельно без дополнительного воздействия стрессовых факторов до уровня, близкого к достигаемому при тепловом шоке. Тем самьм подтверждается способствовать заявляемого средства стимулировать репаративные процессы в коже, до того как она подвергнется стрессовому воздействию, что, в частности, является условием уменьшения нежелательных явлений при проведении агрессивных косметологических процедур.

Пример 37. Описание способа применения косметического средства при агрессивных косметологических процедурах. Сокращение сроков воспалительной реакции после фракционного фототермолиза с использованием лазера Fraxel SR-1500 при нанесении крема по примеру 30, содержащего заявляемое средство, по оценке трансэпидермальной потери воды и эритемы.

Для демонстрации влияния стимуляции синтеза HSP в коже при нанесении заявляемого средства в составе косметического крема на выраженность побочных эффектов агрессивных косметологических процедур, использовали крем, приготовленный, как описано в примере 30. Сравнение проводили с кремом на основе той же кремовой базы, с одинаковым содержанием экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol), но добавленного вне заявляемой композиции и без остальных ее компонентов. Для контроля эффекта дополнительных компонентов средства использовали содержащий их крем с кремовой базой по примеру 30 и добавлением композиции по примеру 17, приготовленной без экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol). Для контроля эффекта манипуляций и кремовой базы использовался крем без добавления заявляемого средства в виде кремовой базы по примеру 30, то есть без фазы С.

В исследованиях участвовали 10 добровольцев с типом кожи II-III шкале Фицпатрика без дерматологических нарушений, которые подписывали информированное согласие на проведение исследований. В течение 3 дней до процедуры каждому из испытуемых на не перекрывающиеся участки кожи размером 5 см × 5 см с внутренней стороны предплечий обоих рук наносили крема описанного состава из расчета 0,1 г на см². Крема равномерно распределялись на соответствующем участке и втирались до полного впитывания.

На следующий день после третьего нанесения крема испытуемым проводилась процедура фракционного фототермолиза с использованием лазера FraxelSR-1500 на обработанных областях предплечий с захватом необработанного участка размером, близким к размерам обработанных участков. Использовался режим обработки с энергией 12 мДж на микротермальную зону (МТЗ) и плотностью 2000 МТЗ/см² (8 проходов по 250 МТЗ/см²).

В качестве побочных эффектов лазерного фракционного фототермолиза исследовались увеличение транэпидермальной потери воды (ТЭПВ) и развитие эритемы на участках кожи с нанесением разных кремов и без нанесения какого-либо крема. Измерения ТЭПВ проводили датчиком Tewameter® ТМ 300, а индекса эритемы - Mexameter® MX 18 с использованием многоканального адаптера МРА5 (Courage & Khazaka Electronic GmbH). При проведении измерений датчики располагали в центрах обработанных областей. Описанные измерения были проведены непосредственно перед процедурой фракционного фототермолиза и на разные сроки после нее.

ТЭПВ на участках кожи после обработки косметическими кремами разного состава показано на Фиг.6.

Данные приведены в виде среднее±стандартное отклонение. * - Р<0,05 при сравнении значений ТЭПВ на участках кожи, обрабатывавшихся кремом по примеру 30, содержащим заявляемое средство, по сравнению с контрольными кремами.

Индекс эритемы на участках кожи после обработки косметическими кремами разного состава показан на Фиг.7.

Данные приведены в виде среднее ± стандартное отклонение. * - Р<0,05 при сравнении значений индекса эритема на участках кожи, обрабатывавшихся кремом по примеру 30, содержащим заявляемое средство, по сравнению с контрольными кремами.

Полученные результаты демонстрируют способность косметического крема, содержащего заявляемое средство, снижать симптомы воспалительной реакции в коже после проведения лазерного фракционного фототермолиза. Это выражается в достоверном сокращении сроков восстановления барьерной функции кожи (фиг.6) и выраженности эритемы (фиг.7) при предварительном применении указанного крема по сравнению с другими исследовавшимися кремами, в том числе кремом, содержащим экстракт зеленой ягоды кофе (Svetol) в виде самостоятельного ингредиента вне заявляемого средства, для которого отмеченные сдвиги носят недостоверный характер. Тем самым подтверждается способность заявляемого средства эффективно уменьшать выраженность побочных нежелательных явлений при проведении агрессивных косметологических процедур за счет предварительной стимуляции репаративных процессов в коже.

Пример 38. Описание способа применения БАД для стимуляции репаративных процессов при физических нагрузках. Снижение повреждения мышечных клеток после физических нагрузок при употреблении биологически активной добавки по примеру 33, содержащей заявляемое средство.

В исследовании принимали участие 18 здоровых добровольцев мужчин в возрасте 19-25 лет, не занимающихся спортом или другими видами специальной физической подготовки и не имеющих противопоказаний к выполнению работ с повышенной физической нагрузкой, которые подписывали информированное согласие на проведение исследований. В течение 30 дней шестеро испытуемых принимали по 2 капсулы биологически активной добавки по примеру 33, содержащей заявляемое средство. Другая группа из шести испытуемых принимала по 2 капсулы, содержащих такое же с количество экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol), добавленного вне заявляемого средства и без остальных ее компонентов. Третья группа из шести испытуемых принимала по 2 капсулы плацебо без экстракта зеленой ягоды кофе (Svetol), содержащих вспомогательные вещества, используемые при приготовлении биологически активной добавки по примеру 33, с добавлением полисорбата-80, используемого при приготовлении композиции по примеру 12, в соответствующем количестве.

Через сутки и через двое после последнего приема биологически активной добавки испытуемые выполняли в течение 90 минут нагрузочное упражнение на велоэргометре (BodyGuard,. Sandnes, Norway) при вращении педалей с частотой 60 оборотов в минуту и нагрузке 1,5 кгс.

Непосредственно перед выполнением первого упражнения и сразу после выполнения второго у испытуемых брали кровь из вены и получали сыворотку крови после образования кровяного сгустка в течение 30 минут при комнатной температуре центрифугированием при 3000g в течение 10 минут.Полученные образцы сыворотки замораживали и до проведения анализов хранили при -80°С. Определение активности креатинкиназы в сыворотке проводили с использованием стандартного набора реактивов при 37°С. Влияние употребления биологически активной добавки по, примеру 33, содержащей заявляемое средство, на изменение активности креатинкиназы в крови добровольцев после выполнения тяжелой физической нагрузки показано в таблице 3.

Таблица 3
Препарат, принимаемый группой добровольцев	Активность креатинкиназы в сыворотке крови добровольцев, МЕ/л
	до физической нагрузки	после физической нагрузки
Капсулы биологически активной добавки по примеру 33, содержащей заявляемое средство	107,3±68,5	175,3±74,2*,**
Капсулы с экстрактом зеленой ягоды кофе (Svetol), вне заявляемого средства	115,8±75,2	258,4±87,8 *
Плацебо	98,5±57,4	271,8±85,1 *
Примечания.
1. Данные представлены в виде среднее±ошибка среднего.
2. * - Р<0,05 при сравнении со значениями в группе до физической нагрузки. ** - Р<0,05 при сравнении с контрольными группами после физической нагрузки.

В ходе проведенных исследований не было отмечено каких-либо отклонений состоянии добровольцев, принимавших исследуемые препараты. При этом прием биологически активной добавки, содержащей заявляемое средство, приводит к меньшему приросту активности креатинкиназы в крови испытуемых соответствующей группы по сравнению с другими группами (таблица 3). Поскольку прирост активности креатинкиназы в крови является следствием повреждение мышечных клеток при тяжелой физической нагрузке, то полученный результат демонстрирует способность повышать устойчивость организма к физическим нагрузкам у заявляемого средства в отличие от самостоятельного эффекта входящего в его состав экстракта зеленой ягоды кофе.

Примеры 39-46.

Различные варианты смесей НПАВ и производных коричной кислоты, а также их количества сведены в Таблицу 4.

Для приготовления средства необходимые количества НПАВ нагревают до температуры 80°C и перемешивают до однородности. Затем добавляют необходимое количество производного коричной кислоты или смеси таких веществ. Поддерживая указанную температуру, композицию перемешивают до получения прозрачного раствора. Затем приготовленный раствор охлаждают до комнатной температуры и, в зависимости от использованных НПАВ, получают прозрачную жидкую или непрозрачную пастообразную композицию, превращающуюся в прозрачную жидкость при нагревании до 35°C.

Таблица 4
Ингредиент	Содержание ингредиента в примере, г
	39	40	41	42	43	44	45	46
Производное коричной кислоты
хлорогеновая кислота	10,0	10,0	10,0	10,0
экстракт ягод кофе (Svetol)					20,0	20,0	20,0	20,0
НПАВ
полисорбат 20 (Tween 20)	45,0				40,0
полисорбат 80 (Tween 80)	45,0	45,0	45,0	45,0	40,0	40,0	40,0	40,0
ПЭГ 40 гидрированное касторовое масло (Cremophor RH 40)		45,0				40,0
35 полиоксиэтилированное касторовое масло (Cremophor EL),			45,0				40,0
ПЭГ 15 гидроксистеарат (Solutol HS 15)				45,0				40,0
Характеристика получаемого продукта	Ж	П	Ж	П	Ж	П	Ж	П
Примечание.
Ж - прозрачная жидкая композиция, при смешивании с водой, нагретой до 37°C, образующая слабо опалесцирующий солюбилизат.
П - пастообразная непрозрачная композиция, превращающаяся в прозрачную жидкость при нагревании до 35°C. Смешивание этой жидкости, нагретой до 37°C, с водой, нагретой до той же температуры, дает сильно опалесцирующую дисперсную систему.

Данные композиции могут быть использованы при изготовлении косметических средств, биологически активных добавок, пищевых продуктов.

Пример 47. Приготовление пищевого продукта в виде сухого концентрата киселя. содержащего заявляемое средство.

Одним из вариантов приготовления пищевого продукта в виде сухого концентрата киселя, содержащего заявляемое средство, является рецептура следующего состава:

Сахар-песок	61,7
Крахмал модифицированный	25,0
Вода	7,5
Порошок сушеной свеклы	3,0
Пектин яблочный	1,0
Лимонная кислота	0,75
Композиция по примеру 12	0,5
(экстракт зеленой ягоды кофе + НПАВ)
Аскорбиновая кислота	0,5
Сухой ароматизатор	0,05

В воде, предназначенной для приготовления продукта, растворяют аскорбиновую и лимонную кислоты, а затем при неинтенсивном перемешивании диспергируют композицию по примеру 12. Сахарную пудру, крахмал модифицированный, пектин яблочный, порошок свеклы, хлопья овсяные просеивают, при необходимости измельчают, загружают в смеситель и перемешивают в течение 15 минут. Затем полученную смесь увлажняют приготовленной дисперсией продукта по примеру 12 в водном растворе аскорбиновой и лимонной кислот и перемешивают еще 15 минут. Далее смесь подвергают влажному гранулированию, а затем сушат при 35-40°C в течение 16 до удаления добавленной воды. После сушки проводят сухое гранулирование с пропусканием через сито с диаметром ячеек 1-2 мм. К полученному порошку добавляют сухой идентичный натуральному ароматизатор «Голубика» и перемешивают в смесителе 10 минут. Готовый продукт фасуют в герметично закрываемые пакеты или банки.

Для употребления в пищу к 1 части полученного пищевого концентрата добавляют 10 частей горячей воды (96-100°C) и перемешивают до получения однородной массы. Получаемый кисель сразу готов к употреблению в пищу и рекомендуется для приема порциями по 150-200 г 1-2 раза в день до, во время и после проведения агрессивных косметологических процедур, а также в условиях воздействия вредных факторов и при повышенных физических нагрузках.

Пример 48. Приготовление пищевого продукта в виде сухого йогурта, содержащего заявляемое средство.

Одним из вариантов приготовления пищевого продукта в виде йогурта, содержащего заявляемое средство, является рецептура следующего состава в процентах:

Молоко обезжиренное	85,2
Молоко сухое обезжиренное	2,5
Молоко сухое цельное жирности 25%	6,0
Закваска для йогурта	5,0
Композиция по примеру 17	0,5
(экстракт зеленой ягоды кофе + НПАВ + антиоксидант)
Ароматизатор с кофейным запахом	0,5
Краситель пищевой	0,3

Готовят нормализованную молочную смесь из молочных продуктов в соответствии с приведенным составом. Затем приготовленную молочную смесь гомогенизируют при давлении 17,5 МПа и температуре 55°С, пастеризуют при температуре 92°C с выдержкой 5 мин и охлаждают до температуры заквашивания 42°C. В подготовленную для заквашивания молочную смесь вводят закваску для йогурта на основе смеси микроорганизмов S. thermophilus и L. delbrueckii ssp.bulgaricus и сквашивают в течение 4 часов до образования прочного сгустка с рН 4,2±0,2. После этого осуществляют перемешивание полученного сгустка с введением композиции по примеру 17, ароматизатора и красителя до достижения однородной консистенции и охлаждают до температуры 4°C и фасуют.

Описанный йогурт рекомендуется для приема порциями по 110-150 г 1-2 раза в день до, во время и после проведения агрессивных косметологических процедур, а также в условиях воздействия вредных факторов и при повышенных физических нагрузках.

Пример 49. Снижение побочных эффектов агрессивных криотерапевтических косметологических процедур при употреблении пищевого продукта, содержащего заявляемое средство.

Косметологическая процедура выполнялась с использованием аппарата криотерапевтического Zeltiq Breeze System производства Zeltiq Aesthetics, Inc. В исследованиях участвовали 32 испытуемых обоего пола в возрасте от 30 до 50 лет, которые были ознакомлены с целью проводимых исследований и подписали добровольное согласие на процедуру. Испытуемые были разбиты на две группы по 16 человек, сходные по возрасту и конституционным особенностям. Одна группа (опытная) ежедневно употребляла 250 мл напитка по примеру 35, другая группа (контрольная) ежедневно употребляла 250 мл напитка без включения заявляемого средства по примеру 23, но содержащего все остальные ингредиенты по примеру 35. Напитки употребляли в течение месяца, начиная за три дня до процедуры. Воздействию с применением аппарата криотерапевтического Zeltiq Breeze System подвергали зоны жировых отложений по бокам от талии. При обработке использовали режим с коэффициентом интенсивности охлаждения (CIF) 35 в течение 45 минут на одно обрабатываемое место при стандартных настройках вакуума с использованием массажа. Пациенты обследовались ежедневно в течение первых 10 дней после процедуры и далее еженедельно до окончания наблюдения. Окончательный косметический эффект локальной гипотермии (криолиполиза) регистрировался через два месяца.

По результатам проведенных испытаний через два месяца после процедуры с использованием аппарата криотерапевтического Zeltiq Breeze System у всех испытуемых было зарегистрировано уменьшение выраженности жировых отложений в обработанных зонах по результатам фотоморфометрии и измерения толщины жировой складки в обработанных зонах. Однако в опытной группе, употреблявшей напиток по примеру 35, было выявлено существенно меньше побочных эффектов. Так, при обследовании в первые дни после процедуры, устойчивые болезненные ощущения или отечность в обработанной зоне были отмечены у 4 испытуемых в опытной группе и у 10 в контрольной. Кроме того, у всех пациентов опытной группы через месяц после процедуры полностью отсутствовали проявления парестезии, тогда как у 2 пациентов контрольной группы парестезия сохранялась более месяца и полностью исчезла по истечению двух месяцев.

Таким образом, согласно результатам проведенного исследования, употребление пищевого продукта, содержащего заявляемое средство, снижает проявление нежелательных побочных эффектов у пациентов после агрессивных косметологических процедур.