способ прогнозирования "тлеющей" формы хронического лимфолейкоза

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения хронического лимфолейкоза, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом ПЦР полиморфизма гена ВАХ с последующими амплификацией и рестрикцией, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного локуса - 248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (ВАХ - 248G>A) и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - наиболее распространенный вид лейкоза в странах Европы и Северной Америки. В этих странах на его долю приходится 30% от всех лейкозов (Волкова М.А., 1998). Ежегодная заболеваемость составляет 3,0-3,5 на 100 тыс. населения, а для лиц старше 60 лет - до 20 на 100 тыс.населения (Cheson BD et al, 1996, S.C. Finch et al., 1969). Выживаемость больных ХЛЛ варьирует от 2 до 20 лет и более.

Индивидуальные различия в патогенезе и течении гемобластозов могут быть установлены через изменчивость генного полиморфизма. Ряд генов вовлечены в патогенез различных онкозаболеваний и выступают в качестве факторов риска при различных заболеваниях, связанных с неблагоприятным действием факторов внешней среды.

Особое внимание уделяют в последние годы разным формам ХЛЛ. У некоторых больных ХЛЛ может протекать без прогрессии годами и десятилетиями. Такой вариант В-ХЛЛ называется «тлеющим» (по аналогии с «тлеющей» миеломой). Критерии диагностики «тлеющего» хронического лимфолейкоза предложены профессором E.Montserrat в 1993 году: это стадия по Binet - «А», тип инфильтрации в костном мозге - не диффузный, время удвоения лимфоцитов больше 12 месяцев, уровень гемоглобина больше или равен 130 г/л. Если пациент удовлетворяет всем перечисленным признакам, то ожидаемая продолжительность жизни составляет около 20 лет. Также Montserrat E (1993) выделяет эту группу больных ХЛЛ по следующим параметрам: отсутствие увеличенных лимфоузлов и селезенки или минимальное их увеличение, нормальный уровень гемоглобина и тромбоцитов, уровень лейкоцитов меньше 30×10⁹/л, фаза плато лимфоцитоза в течение 3 лет.

Исторически терапия ХЛЛ была основана на применении алкилирующего препарата - хлорбутина или его сочетания с глюкокортикоидными гормонами. Обычно применяют хлорбутин в дозе 0,1-0,2 мг/кг массы тела. Он весьма эффективно понижает лейкоцитоз у 70-75% больных, и с его помощью удается надежно контролировать заболевание в течение многих лет, несмотря на изменение дозы или полную отмену препарата. С появлением новых препаратов и схем лечения ХЛЛ, терапия хлорбутином отошла на задний план. Несмотря на это пациентам, у которых ХЛЛ протекает в «тлеющей» форме, применение хлорбутина вполне оправдано, в связи с тем, что причинами летального исхода таких пациентов являются осложнения от проводимой химиотерапии. Также благодаря непроведению химиотерапии у таких пациентов, возможна экономическая выгода, так как лечение ХЛЛ одно из самых дорогостоящих.

Существует много предложений по прогнозированию различных форм ХЛЛ на основе данных биохимического, иммунохимического, цитологического и молекулярно-генетического обследования. Так, Т.П. Загоскиной, В.И. Шардаковым, Е.Л. Назаровой, М.М. Куликовой, И.М. Земцовой предложен способ дифференциальной диагностики доброкачественной и прогрессирующей формы хронического лимфолейкоза, включающий определение ²-микроглобулина в сыворотке крови с помощью радиоиммунологического метода с I¹²⁵ в дебюте заболевания, на ранних стадиях опухолевого процесса, при этом доброкачественную форму ХЛЛ определяют уровнем ²-микроглобулина <5 мг/л; а прогрессирующую >5 мг/л [патент RU 2242004, 2004 г.]. Однако данный метод остается достаточно трудоемким и дорогостоящим. Также его недостатком, на который указывают авторы является прогнозирование формы заболевание лишь в его дебюте.

Известен способ дифференциальной диагностики развернутой и терминальной стадии ХЛЛ, характеризующийся тем, что в крови больного определяют способность эритроцитов сорбировать витальные красители. При значении сорбционной способности эритроцитов менее 44,5% судят о развернутой стадии, при ее значении более 44,5% - о терминальной стадии ХЛЛ [патент RU 2138808, 1998 г.]. Существенным недостатком этого способа является отсутствие ранней диагностики ХЛЛ.

Известен способ диагностики форм ХЛЛ, заключающийся в том, что в лимфоцитах периферической крови больного определяют количество ядрышковых организаторов на клетку путем импрегнации серебром и при значении их 1,0-1,39 диагностируют прогрессирующий вариант ХЛЛ, а при значении - 1,4-1,7 диагностируют опухолевую форму заболевания [патент RU 2068995, 1996 г.]. Способ позволяет упростить диагностику форм ХЛЛ и повысить ее точность. Недостатком данного способа является отсутствие диагностики «тлеющей» формы заболевания.

Известен способ прогнозирования прогрессирования хронического лимфолейкоза, заключающийся в определении количественного содержания ядрышкового белка В23/нуклеофозмина в иммуноблотах лизатов клеток, повышенный уровень которого является наиболее ранним предвестником прогрессирования заболевания [патент RU 2310201, 2007 г.].

Прототипом данного изобретения является метод, описанный O. Moshynska и др. (Molecular detection of the G(-248)A BAX promoter nucleotide change in В cell chronic lymphocytic leukaemia. O. Moshynska, K. Sankaran, A. Saxena, Mol Pathol. 2003 August; 56(4): 205-209.), включающий генотипирование методом ПЦР полиморфизма гена ВАХ с последующими амплификацией и рестрикцией, повышение частоты полиморфизма гена ВАХ у больных ХЛЛ по сравнению с контрольной группой. На основании полученных данных авторы сделали заключение о вовлечении продукта гена ВАХ в патогенез ХЛЛ.

Недостатками данных методов является следующее.

1. Отсутствие данных о полиморфизме указанных генов при ХЛЛ в зависимости от форм заболевания.

2. Малая выборка больных ХЛЛ.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования «тлеющей» формы ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования течения хронического лимфолейкоза, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом ПЦР полиморфизма гена ВАХ с последующими амплификацией и рестрикцией, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфного локуса -248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (ВАХ -248G>A) и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза.

Предлагаемый способ прогнозирования осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона X-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис HCl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин. при 4000 об./мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трис HCl до pH 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5мл деионизированной H₂O; раствор хранят при -20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ F: 5 -CATTAGAGCTGCGATTGGACCG-3 , R: 5 -GCTCCCTCGGGAGGTTTGGT-3 . Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO ₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°C - 45 секунд, 55°C - 45 секунд, 72°C - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°C в течение 7 минут.

Нуклеотидную замену G A в положении -248 гена ВАХ выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MspI, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют IX боратный буфер (0,089М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25%) ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 96 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель G и гомозиготный генотип GG, при наличии двух фрагментов размером 96 и 76 пн идентифицируется гетерозиготный генотип GA, при наличии фрагмента размером 76 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип АА. При выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза.

Обследовано 133 больных ХЛЛ, находившихся на стационарном лечении в гематологическом отделении Республиканской клинической больнице. Средний возраст обследованных пациентов, отобранных случайным образом, составил 49,57±1,42 лет. Половое соотношение мужчин к женщинам - 56,4% (75) к 43,6% (58). Клиническое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования. В группу с «тлеющим» течением хронического лимфолейкоза включено 30 больных в возрасте от 65 до 85 лет (средний возраст 68,23±0,41). В момент диагностики больные предъявляли жалобы на слабость, потливость, незначительное увеличение лимфатических узлов, без увеличения печени и селезенки. Клинико-гематологическая характеристика представлена в таблицах 1-2.

Как видно из данных таблиц, в анализах крови больных наблюдается лейкоцитоз (18,7±1,4×10(9)/л), лимфоцитоз (76,5±5,5%), нейтропения (16,7±2,7%). Количество тромбоцитов было в пределах нормы и составило 228,2±1,3×10(9)/л, гемоглобина - 127,0±5,8 г/л.

Больные наблюдались в амбулаторных условиях. Длительность наблюдения с момента установления заболевания более двух лет. В анализах крови наблюдалось увеличение лимфоцитов - 75-80%, клетки Боткина-Гумпрехта 1-2 в поле зрения. Данной группе больных при появлении прогрессии заболевания была назначена терапия хлорбутином в режиме монотерапии, в дозе 0,5мг/кг в 1-й и 15-й день цикла терапии, каждые 28 дней. Медиана продолжительности терапии в данной группе составила 6 месяцев (5-12 мес). Общая частота достижения эффекта от терапии составила - 42%, полная ремиссия - 3%.

С целью выявления клинико-генетических особенностей течения ХЛЛ проведено исследование полиморфного локуса гена ВАХ между группой с «тлеющей» формой и другими формами хронического лимфолейкоза (таблица 3).

Сравнение общей выборки больных с «тлеющим» течением ХЛЛ с другой группой выявило статистически достоверные различия в распределении частот генотипов между группами. Гомозиготный генотип -248*GG достоверно чаще встречался в группе больных с «тлеющим» течением ХЛЛ (73,33%), тогда как в другой группе частота его составила 45,74% ( ²=5,878, p=0,016, OR=2,45, 95% CI 1,41-4,26). Наличие гетерозиготного генотипа GA было связано с другими формами течения ХЛЛ, но уровня статистически значимых различий достигнуто не было. Также показано, что аллель G чаще встречался в группе больных с «тлеющим» течением ХЛЛ (85,00%), против 67,55%), а в другой группе 67,70% ( ²=6,000; p=0,015) и являлся фактором говорящем о «тлеющем» течении (OR=2,722; 95% CI 1,258-5,889).

На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации генотипа GG полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ с «тлеющей» формой ХЛЛ.

Изобретение иллюстрируется следующим клиническим примером.

Больной К., 1967 года рождения, город Салават, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в апреле 2007 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами 79%. Химиотерапию не получал. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по K. Rai II. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ГЩР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ выявило у больного генотип GG, что позволило прогнозировать «тлеющую» форму ХЛЛ, что было подтверждено в результате трехлетнего наблюдения за пациентом, прогрессирование заболевания не наступило.

Таблица 1
Клиническая характеристика больных с «тлеющей» формой хронического лимфолейкоза
Показатель		Количество
Количество больных	Мужчины	13
	Женщины	17
возраст	65-75	18
	75-85	12
Длительность заболевания	1-3 года	2
	4-5 лет	9
	более 5 лет	21

Таблица 2
Гематологические показатели больных "тлеющей формой хронического лимфолейкоза"
Показатели
Эритроциты (×10 12)	4,1±2,12
Гемоглобин (г/л)	127,0±5,8
Лейкоциты (×109)	18,7±1,7
Тромбоциты (%)	228,2±13,0
Палочкоядерные нейтрофилы (%)	2,1±0,52
Сегментоядерные (%)	16,7±2,7
Эозинофилы (%)	1,6±0,25
Лимфоциты (%)	76,5±5,5
Пролимфоциты (%)	1,3±0,18
Моноциты (%)	1,8±0,55
СОЭ (мм/ч)	18±1,3

Таблица 3
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса - 248G>A гена ВАХ с «тлеющей» формой заболевания и другими видами течения ХЛЛ
Генотипы	«Тлеющий» (N=30)		Другие виды течения ХЛЛ (N=94)		2	P	OR	CI - 95%
	Абс.	%	Абс.	%
GG	22	73,33	43	45,74	5,878	0,016	3,262	1,319-8,066
GA	7	23,33	41	43,62	3,135	0,077	0,394	0,154-1,008
АА	1	3,33	10	10,64	0,734	0,392	0,290	0,036-2,366
G	51	85,00	127	67,55	6,000	0,015	2,722	1,258-5,889
А	9	15,00	61	32,45	6,000	0,015	0,368	0,17-0,796