штамм одноклеточных водорослей dunaliella salina - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью

Формула изобретения

Штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina, депонированный в коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (ИФР РАН (IPPAS)) под регистрационным номером IPPAS D-295 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью.

В настоящее время не прекращается поиск веществ, стимулирующих защитные силы организма от агрессивных воздействий среды, усилившихся в результате активизации техногенной деятельности человека. Одной из групп препаратов, вызывающих значительный интерес, являются антиоксидантные вещества, способные подавлять процессы свободнорадикального окисления липидов, и вследствие этого влиять на процессы старения, канцерогенеза, атерогенеза, токсического повреждения тканей и органов и т.д. (Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993. V.90. P.7915-7922. Poli, G. Liver damage due to free radicals. British Medical Bulletin, 1993. V.49 (3). P.604-620). Одним из источников веществ с антиоксидантными свойствами могут служить одноклеточные водоросли.

Известен термофильный штамм Dunaliella bardawil Masazir CCAP 19/38, выделенный из озера Масазыр на Апшеронском полуострове Азербайджанской Республики (патент EA 201000466 A1, МПК C12N 1/12 A61K 36/02 A23K 1/00 C12R 1/89). Штамм предназначен для получения биомассы в качестве добавки в корма для птицеводства, животноводства, рыбоводства и шелководства, а также может быть использован в фармакологии и косметологии.

Наиболее близким аналогом является штамм водоросли Dunaliella salina Teod. CALU - 834, выделенный из прибрежной зоны лимана Сасык (патент SU 1324627 A1, (51)4 A23K 1/00, A01H 13/00, C12N 1/12), который используется в микробиологической промышленности как продуцент белка и -каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добавок в рацион животных, а также для утилизации отходов.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении нового штамма - продуцента биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью.

Указанный технический результат достигается новым штаммом одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295, который выделен из рапы озера Развал (средний уровень солености - 290,9 г/л) г.Соль-Илецк Оренбургской области.

Полученный штамм депонирован в Коллекции одноклеточных водорослей (IPPAS) Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН под номером IPPAS 295.

Выделение проводили следующим способом: образцы природной воды объемом 0,1 мл засевали на жидкую минеральную среду ОПС следующего состава: NaCl - 116 г, MgSO ₄ × 7 Н₂О - 50 г, KNO₃ - 2,5 г, K₂HPO₄ - 0,2 г, NaHCO₃ - 1,0 г, водопроводная вода - 1 л. Для выделения чистой культуры после наращивания биомассы суспензию водорослей (0,1 мл) помещали на агаризованную среду ОПС: NaCl - 116 г, MgSO₄ × 7 Н₂О - 50 г, KNO₃ - 2,5 г, K₂ HPO₄ - 0,2 г, NaHCO₃ - 1,0 г, агар-агар - 10 г, водопроводная вода - 1 л, получение отдельных колоний водорослей обеспечивали методом механического разобщения шпателем Дригальского.

Когда колонии водорослей достигали размеров, видимых невооруженным глазом, их в стерильных условиях микробиологической петлей переносили на жидкую минеральную среду ОПС.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических признаков в соответствии с критериями, приведенными в монографии Масюк Н.П. «Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. и перспективы практического использования» - Киев: Наукова думка, 1973. - С.172-182.

Хранение штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 осуществляется на жидкой минеральной среде ОПС: NaCl - 116 г, MgSO₄ × 7 H₂O - 50 г, KNO₃ - 2,5 г, K₂HPO₄ - 0,2 г, NaHCO₃ - 1,0 г, водопроводная вода - 1 л, при температуре 20°С в течение 2-х месяцев при естественном освещении. Более длительное хранение осуществляется путем периодического (оптимально - раз в 2 месяца, максимально - раз в 5 месяцев) пересева на свежую жидкую минеральную среду ОПС.

Условия и среды для размножения штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295: посев исходной культуры на жидкую минеральную среду ОПС, с последующим выращиванием в условиях круглосуточного освещения люминесцентными лампами (5000 лк) при t 20-25°C в течение 10 суток.

Штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиологическими признаками и биологическими свойствами.

Культуральные свойства.

На жидкой среде ОПС характеризуется ростом в виде зеленой взвеси. Степень чистоты культуры - аксеничная. Отсутствие бактерий проверяли высевами на твердые питательные среды (мясо-пептонный агар, голодный агар и МПА с 8-% содержанием NaCI), отсутствие водорослей других видов контролировали при световой фазово-контрастной микроскопии.

Морфологические признаки

Клетки имеют широко-овальную форму, с расширенным задним и слегка суженным передним концом, размером 11×8 мкм (8-15×5-13 n=33). Пиреноид крупный округлой формы, чашевидный, радиально-симметричный зеленый хроматофор. Клетки с двумя эластичными, гомодинамичными жгутиками, равной длины, примерно равными длине клетки, совершающими веслоподобные движения спереди назад.

При хранении свыше 5 месяцев без пересева клетки обездвиживаются, теряют зеленую окраску, деформируются, образуют цисты.

Физиологические свойства

Оптимальными абиотическими условиями для максимального выхода биомассы штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 является минерализация 93 г/л, наличие перемешивания, температура 20-25°C, круглосуточное освещение люминесцентными лампами 5000 лк. В качестве источника CO ₂ использует воздух при периодическом перемешивании (16 ч с перерывом 8 ч) на перемешивающем устройстве ЛАБ-ПУ-01 «LOIP» (Россия) с частотой колебаний платформы 50 об./мин. В оптимальных условиях культивирования скорость роста, µ: 0,28 млн/мл в сутки.

Применение на практике штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 обуславливается его способностью продуцировать биологически активные вещества, обладающие антиоксидантной активностью. Полученный штамм перспективен для создания на его основе биологически активной добавки (БАД), применяемой для непосредственного употребления в пишу в качестве профилактического средства или для создания функциональных пищевых продуктов.

Продукция антиоксидантных веществ.

Продукцию антиоксидантных веществ штаммом одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 определяли по способности его клеточного экстракта тормозить процессы перекисного окисления липидов, о скорости которых судили по интенсивности хемилюминесценции, регистрируемой в хемилюминомере ХЛ-003 (Россия) (Владимиров Ю.А., Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н., Клебанов Г.И. // Бюл. экспер. биол. 1982. № 4. С.101-102; Фархутдинов P.P., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. Уфа, 1995. 54 с.).

Экстракт клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 снижал интенсивность железо-индуцированного перекисного окисления липидов в условиях in vitro, что отражалось на параметрах хемилюминесценции стандартной хемилюминесцентной системы: снижение максимальной светимости на 68%, снижение светосуммы медленной вспышки на 75%, по сравнению с контролем.

Продукция антиоксидантных веществ штаммом одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 подтверждена и в условиях in vivo.

Так, подавление процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови и в печени в организме крыс отмечали при пероральном приеме экстракта клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295. Светосумма медленной вспышки кривой хемилюминесценции в сыворотке крови животных, получавших клеточный экстракт штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295, снижалась на 27%, что говорит об уменьшении способности липидов крови подвергаться окислению в опытной группе крыс. Уменьшение величины максимальной светимости сыворотки крови, то есть количества образовавшихся перекисных радикалов (ROO^.) в процессе свободно-радикального окисления, составило 44% в группе опытных животных. Аналогично изменялись параметры хемилюминесценции, отражающие интенсивность перекисного окисления липидов, в печени. Светосумма снижения медленной вспышки в опытной группе была на 50% ниже, чем в контрольной группе, максимальная светимость - на 51%.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Культуру штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 выращивали на жидкой минеральной среде ОПС следующего состава:

хлорид натрия 116 г, сульфат магния 7-водный 50 г, нитрат калия 2,5 г, двузамещенный фосфат калия 0,2 г, гидрокарбонат натрия 1,0 г, водопроводная вода 1000 мл.

Приготовленную среду стерилизовали при 1 атм. в течение 20 мин, остужали до 20-25°C и разливали по стерильным флаконам в объеме 50 мл.

В готовую среду стерильной пипеткой вносили культуру штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 в объеме 5 мл. Посевы выращивали в условиях круглосуточного освещения люминесцентными лампами (5000 лк) при t20-25°C в течение 10 суток.

Из выращенной культуры готовили экстракт клеток. Для этого водоросли концентрировали путем центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об/мин (концентрация клеток - 3×10 ⁷ клеток/мл), полученный осадок разводили дистиллированной водой до конечной концентрации NaCl 0,85%, замораживали при температуре - 20°C, а затем оттаивали.

В экстракте клеток определяли наличие антиоксидантных веществ. Для этого готовили стандартную хемилюминесцентную систему, состоящую из лецитина «AppliChem» (Германия), разведенного в фосфатном буфере. Состав фосфатного буфера: фосфат калия двузамещенный 2,72 г, хлорид калия 7,82 г, дистиллированная вода 1 л, pH - 7,45.

Экстракт клеток в количестве 2 мл добавляли к 20 мл стандартной хемилюминесцентной системы и помещали в кюветную камеру хемилюминомера ХЛ-003 (Россия). Свечение индуцировали добавлением 1 мл 50 мМ раствора FeSO₄*7H₂ O при постоянном перемешивании, что приводило к окислению ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, к ускорению процессов перекисного окисления липидов и регистрировалось в виде вспышки хемилюминесценции.

При оценке результатов определяли несколько основных параметров хемилюминесценции: высоту быстрой вспышки, зависящую от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов; высоту медленной вспышки, отражающую способность липидов к перекисному окислению; максимальную интенсивность ПОЛ после введения Fe²⁺.

Одновременно с этим оценивали светосумму медленной вспышки, определяемую как площадь под кривой на графике от начала медленной вспышки до достижения максимального значения, выявляющую число боковых цепей разветвления, т.е. количество образовавшихся перекисных радикалов (ROO ^.), приходящихся на 1 ион Fe²⁺.

Эффект тушения хемилюминесценции определяли как процент снижения высоты медленной вспышки и других параметров хемилюминесценции относительно контрольной стандартной хемилюминесцентной системы, не содержащей экстракта клеток водоросли.

Для сравнения использовали препарат «Биоастин» (НПО «Источник долголетия», Россия), содержащий экстракт клеток водоросли Haematococcus pluvialis Flotow, 1844.

Добавление экстракта клеток водоросли к стандартной хемилюминесцентной системе приводило к снижению всех основных параметров хемилюминесценции (спонтанной светимости, светосуммы медленной вспышки, высоты быстрой вспышки, высоты медленной вспышки, максимальной светимости), что свидетельствовало о способности штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 к продукции антиоксидантных веществ.

По результатам количественного сравнения уровня антиоксидантной активности разных препаратов наиболее существенными и достоверными оказались различия по параметрам светосуммы медленной вспышки и величины максимальной светимости стандартной хемилюминесцентной системы.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1
Изменение параметров хемилюминесценции стандартной хемилюминесцентной системы под действием антиоксидантов
Параметры хемилюминесценции пробы	Спонтанная светимость, усл.ед.	Светосумма медленной вспышки, усл.ед.	Быстрая вспышка, усл.ед.	Максимальная светимость, усл.ед.
Контроль	0,71±0,04	4,60±0,23	0,89±0,04	1,14±0,06
Биоастин	0,37±0,02	1,53±0,08	0,37±0,02	0,37±0,02
Экстракт клеток Dunaliella salina IPPAS 295	0,37±0,02	1,17±0,06	0,42±0,02	0,37±0,02

Как видно из таблицы 1, снижение максимальной светимости в присутствии экстракта клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 составило 68%, по сравнению с контролем, что свидетельствовало о снижении интенсивности железо-индуцированного перекисного окисления липидов.

Одновременно под действием экстракта клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 зарегистрировано снижение светосуммы медленной вспышки на 75%, которое оказалось более выраженным, чем под влиянием препарата «Биоастин» (67%).

В сравнении с контролем отмечено уменьшение и других показателей интенсивности ПОЛ: спонтанной светимости на 48% и быстрой вспышки - на 53%, что свидетельствовало об уменьшении содержания гидроперекисей липидов в изучаемой системе.

По результатам изменения параметров хемилюминесценции стандартной хемилюминесцентной системы штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 способен к продукции антиоксидантных веществ, уровень которых сопоставим с известными аналогами.

Пример 2.

Для того чтобы определить, насколько антиоксидантный эффект будет реализовываться в условиях целого организма, был проведен опыт на животных. Животные - самцы крыс массой 220-250 г содержались в стандартных условиях вивария на стандартном рационе и были одного возраста.

Ежедневно в одно и то же время в течение 10 дней, под эфирным рауш-наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики 10 опытным животным с помощью зонда вводили 0,5 мл экстракта клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295, приготовленного аналогично примеру 1, а 10 контрольным животным под рауш-наркозом зондом вводили препарат плацебо (0,5 мл 0,85% раствора NaCl).

Животные выводились из опыта путем ингаляции летальной дозы эфира на 11 сутки эксперимента.

Исследования на животных проводили в соответствии с проектом Федерального Закона № 97802163-2 «О защите животных от жестокого обращения», принятым Госдумой РФ 1 декабря 1999 г., а также приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

В таблице 2 отражены данные о влиянии экстракта клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 на интенсивность перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс по показателям хемилюминесценции, отражающих процессы перекисного окисления липидов.

В сыворотке крыс опытной группы наблюдалось снижение всех показателей, отражающих интенсивность ПОЛ, по сравнению с контрольной группой, наиболее существенными и достоверными оказались различия по светосумме медленной вспышки и величине максимальной светимости сыворотки крови крыс. Светосумма снижения медленной вспышки в опытной группе была на 27% ниже, чем в контрольной группе, максимальная светимость - на 44%. Полученные данные демонстрируют достоверное снижение интенсивности перекисного окисления липидов в сыворотке крови у опытных животных, получавших экстракт клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295.

Таблица 2
Показатели хемилюминесценции, отражающие интенсивность перекисного окисления липидов в сыворотке крыс, усл.ед.
Параметры хемилюминесценции	Контроль	Опыт	Критерий Манна-Уитни	p
Светосумма медленной вспышки	1,83±0,27	1,34±0,13	30	0,01
Максимальная светимость	0,61±0,22	0,34±0,03	30	0,01

Учитывая высокую активность обменных процессов в печени, наряду с оценкой интенсивности перекисного окисления в сыворотке крови, были исследованы показатели хемилюминесценции в гомогенатах печени крыс.

В таблице 3 представлены показатели хемилюминесценции в гомогенатах печени крыс опытной и контрольной групп.

Светосумма снижения медленной вспышки в опытной группе была на 50% ниже, чем в контрольной группе, максимальная светимость - на 51%. Полученные данные демонстрируют достоверное снижение интенсивности перекисного окисления липидов в печени у опытных животных, получавших экстракт клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295.

Таблица 3
Показатели хемилюминесценции, отражающие интенсивность перекисного окисления липидов в гомогенатах печени крыс, усл.ед.
Параметры хемилюминесценции	Контроль	Опыт	Критерий Манна-Уитни	Р
Светосумма медленной вспышки	19,64±7,65	9,82±3,04	28	>0,05
Максимальная светимость	5,33±2,08	2,62±0,53	30	0,01

Из результатов оценки интенсивности хемилюминесценции в сыворотке крови и печени следует, что экстракт клеток штамма одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 содержит антиоксид антные вещества и подавляет перекисное окисление липидов в организме.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что выделенный штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 является продуцентом антиоксидантных веществ и может быть использован как основа для разработки биологически активной добавки, применяемой для непосредственного употребления в пишу в качестве профилактического средства или для создания функциональных пищевых продуктов.