агглютинация частиц в наконечнике

Формула изобретения

1. Аналитический наконечник, предназначенный для выполнения визуально детектируемой реакции агглютинации после всасывания в него реактивов и образца, включающий:

a) первое отверстие, предназначенное для приложения отрицательного или положительного давления к внутреннему объему указанного аналитического наконечника;

b) камеру для образца указанного внутреннего объема, которая находится в жидкостной связи с указанным первым отверстием;

c) по меньшей мере, одну боковую камеру указанного внутреннего объема, которая расположена по периметру указанной камеры для образца, а ее геометрическая ось расположена под острым углом относительно вертикальной центральной оси указанного аналитического наконечника, причем указанная, по меньшей мере, одна боковая камера имеет такую форму, которая позволяет улавливать частицы в образце после отделения частиц от остальных компонентов образца, где указанная, по меньшей мере, одна боковая камера находится в жидкостной связи с камерой для образца;

d) камеру детектирования указанного внутреннего объема, которая предназначена для обнаружения агглютинированных частиц в образце, где указанная камера детектирования находится в жидкостной связи с камерой для образца;

e) переходную зону указанного внутреннего объема, расположенную между камерой для образца и камерой детектирования, где указанная переходная зона предназначена для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через указанную переходную зону, между камерой детектирования и камерой для образца посредством ее встряхивания; и

f) второе отверстие, находящееся в жидкостной связи с камерой детектирования, которое предназначено для всасывания реактивов и образца в указанный внутренний объем указанного аналитического наконечника или для удаления их оттуда.

2. Аналитический наконечник по п.1, где вертикальная ось указанной камеры для образца и геометрическая ось указанной, по меньшей мере, одной боковой камеры образуют угол 45° или меньше.

3. Аналитический наконечник по п.1, где отделение частиц от остальных компонентов образца происходит в результате разделения с помощью центрифугирования или разделения в магнитном поле.

4. Аналитический наконечник по п.3, где центрифугирование происходит в результате вращения аналитического наконечника вокруг указанной геометрической вертикальной оси аналитического наконечника.

5. Аналитический наконечник по п.1, где указанная, по меньшей мере, одна боковая камера предназначена для выполнения ресуспендирования осажденных после центрифугирования частиц с реактивами, всасываемыми в указанную, по меньшей мере, одну боковую камеру.

6. Аналитический наконечник по п.1, где указанная, по меньшей мере, одна боковая камера предназначена для обеспечения потока ресуспендированных центрифугированных частиц в указанную камеру для образца и камеру детектирования аналитического наконечника.

7. Аналитический наконечник по п.1, где внутренний диаметр стенки камеры для образца превышает внутренний диаметр стенки камеры детектирования.

8. Аналитический наконечник по п.1, где камера детектирования оптически прозрачна, чтобы обеспечивать оптическое детектирование агглютинации.

9. Аналитический наконечник по п.1, где указанный аналитический наконечник изготовлен из материала, который обеспечивает обнаружение флуоресценции в камере детектирования.

10. Аналитический наконечник по п.1, где стенки указанной камеры детектирования способны пропускать свет с длиной волны, требуемой для возбуждения флуоресцентного лиганда, и электромагнитного излучения с длиной волны, характерной для последующей эмиссии флуоресценции.

11. Способ выполнения реакции агглютинации в одиночном аналитическом наконечнике, включающий стадии:

a) предоставления аналитического наконечника по п.1;

b) всасывания образца в камеру для образца аналитического наконечника;

c) отделения частиц от остальных компонентов образца и улавливание частиц в указанной, по меньшей мере, одной боковой камере аналитического наконечника;

d) удаления супернатанта образца из аналитического наконечника;

e) всасывания реактивов для агглютинации в аналитический наконечник;

f) ресуспендирования осадка образца из указанной, по меньшей мере, одной боковой камеры и

g) перемещения ресуспендированнного осадка образца в камеру детектирования, в которой детектируется агглютинация в ресуспендированном осадке образца.

12. Способ по п.11, где образец включает суспензию клеток.

13. Способ по п.12, где суспензия клеток включает, по меньшей мере, одно из группы, включающей эритроциты, цельную кровь пациента, а также сыворотку пациента и эритроциты донора.

14. Способ по п.11, где реактивы для агглютинации содержат, по меньшей мере, одно из группы, включающей лиганд-связывающую молекулу, реактив Кумбса, микросферы, связанные с лиганд-связывающими молекулами, и эритроциты известной группы крови.

15. Способ по п.14, где лиганд-связывающая молекула является антителом.

16. Способ по п.11, где агглютинация является гемагглютинацией.

17. Способ по п.11, где осадок образца ресуспендируется посредством вращательного перемешивания в указанной переходной зоне аналитического наконечника.

18. Набор для выполнения визуально детектируемых реакций агглютинации в одиночном аналитическом наконечнике согласно способу по п.11, включающий:

a) аналитический наконечник по п.1;

b) реактивы для агглютинации.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Заявка относится к устройству и способу быстрого обнаружения присутствия или отсутствия агглютинации частиц внутри одиночного съемного наконечника.

Уровень техники

Диагностические анализы, основанные на взаимодействии лиганда и лиганд-связывающей молекулы, известны в уровне техники и широко применяются в клинических лабораториях для обнаружения различных антигенов или антител в биологическом образце. Исторически сложилось так, что реакция агглютинации обеспечивает простой способ обнаружения специфичного взаимодействия между антигеном и антителом через образование и осаждение больших структур иммунных комплексов.

Клетки в целом, и эритроциты в частности, также применяются в разнообразных способах агглютинации. Стандартные тесты на определение групповой принадлежности крови, такие как прямая и непрямая реакции Кумбса, основаны на агглютинации эритроцитов с целью определения совместимости группы крови или диагностики тяжелых аутоиммунных заболеваний, таких как гемолитическая анемия.

Прямая реакция Кумбса, или прямой антиглобулиновый тест, используется для обнаружения антител или факторов системы комплемента, связанных с поверхностными антигенами эритроцитов пациента in vivo. В положительной реакции Кумбса добавление антител кролика против иммуноглобулина человека (реактив Кумбса) к эритроцитам пациента, связанным человеческим антителом, приводит к агглютинации и осаждению эритроцитов, и, таким образом, является показателем аутоиммунной гемолитической анемии.

В непрямой реакции Кумбса, или непрямом антиглобулиновом тесте, сыворотку пациента инкубируют с эритроцитами потенциального донора. Если антитела в сыворотке пациентов связываются с эритроцитами донора, добавление реактива Кумбса приводит к агглютинации и осаждению эритроцитов донора и, таким образом, указывает на несовместимость между пациентом и кровью потенциального донора. Наоборот, отсутствие агглютинации указывает, что антитела в сыворотке пациента не узнают поверхностные антигены на эритроцитах донора. Таким образом, кровь донора совместима и может применяться для гемотрансфузии.

Хотя иммуноанализы с агглютинацией являются простыми и рентабельными, они часто обладают недостаточной чувствительностью, необходимой для обнаружения малых количеств антигена, а также склонны к субъективности при интерпретации результатов. Недавно был проведен анализ по типу реакции агглютинации, обладающий повышенной чувствительностью и воспроизводимостью благодаря присоединению антител к микросферам субмикронного размера из полистирола, часто называемым "однородными латексными частицами". Указанные броуновские частицы значительно повысили чувствительность детектирования благодаря увеличению рассеянного света, когда между частицами привитых коллоидов происходит агрегация. Данные усовершенствования иммуноанализов с агглютинацией привели к быстрому расширению коммерчески доступных диагностических наборов для обнаружения широкого разнообразия антигенов, связанных с заболеваниями. Анализы с агглютинацией на основе клеток, такие как реакция Кумбса, или упрощенные методы определения групповой принадлежности крови, такие как система ID-Micro Typing, Inc., раскрытая в патенте США 5,338,689 (Stiftung fur diagnostische Forschung), продолжают предоставлять ценный инструмент клинической диагностики, особенно ввиду растущей потребности в переливаниях крови и необходимости быстрого определения группы крови при переливаниях крови в учреждениях скорой помощи.

Несмотря на усовершенствования в последние годы, анализы по типу реакции агглютинации, и в частности анализы по типу реакции агглютинации на основе клеток, остаются трудоемкими и затруднительными из-за необходимости в многочисленных стадиях промывки и последовательного добавления реактивов, как предписано в соответствии с экспериментальной методикой. Следовательно, указанные анализы сложно автоматизировать. Обработка большого количества образцов, полученных от пациентов, например, проб крови, также повышает вероятность экспериментальной ошибки, снижает воспроизводимость, повышает риск контаминации и инфицирования лабораторного персонала такими возбудителями заболеваний человека, как ВИЧ и вирусы гепатита B и C.

Информацию, относящуюся к попыткам решения вышеописанных проблем, можно найти в патентах США 4,087,248; 4,590,157; 4,775,515; 4,960,566; 4,963,498; 5,019,351; 5,144,139; 5,174,162; 5,891,740; 5,942,442; 5,976,896; 6,218,193; 6,261,847; 6,375,817; 6,517,778; в опубликованных заявках на патент США US 2003/0022382; US 2005/0048519; US 2006/0194342, публикациях международных заявок PCT PCT/US87/02054; PCT/US94/01182; PCT/GB1999/000052; PCT/GB2005/004166; PCT/EP2005/001029; PCT/GB1990/000202, европейских патентных документах EP 212314, EP 340562, EP 483117; EP 542655, а также в японских патентных документах JP 58073866, JP 62240843 и JP 2005164330. Каждая из перечисленных ссылок обладает, впрочем, одним или несколькими следующими недостатками: Реакции агглютинации частиц требуют многократного вмешательства персонала лаборатории, отсутствие описания прибора, в котором могут протекать все стадии, требуемые в реакции агглютинации частиц, отсутствие автоматизации многочисленных реакций агглютинации частиц с применением такого прибора и отсутствие средства обнаружения реакции агглютинации частиц в таком приборе.

По вышеизложенным причинам, в уровне техники существует неудовлетворенная потребность в осуществлении автоматизации анализов по типу реакции агглютинации частиц, чтобы они требовали минимального взаимодействия с оператором и, таким образом, обеспечивали повышение безопасности, надежности, рентабельности и эффективности таких важных клинических анализов.

Сущность изобретения

Описан способ выполнения всех этапов, требуемых в реакции агглютинации частиц, в одном или более съемных аналитических наконечниках. Изобретение также относится к устройству для визуального обнаружения агглютинации частиц в некотором количестве аналитических наконечников.

Согласно одному аспекту аналитический наконечник применяется для выполнения визуально детектируемой реакции агглютинации после всасывания реактивов и образца в наконечник. Аналитический наконечник включает первое отверстие, предназначенное для приложения отрицательного или положительного давления к внутреннему объему аналитического наконечника. Внутренний объем аналитического наконечника включает: (a) камеру для образца в жидкостной связи с первым отверстием (b), по меньшей мере, одну боковую камеру, предназначенную для улавливания частиц в образце после отделения частиц от остальных компонентов образца, где боковая камера находится в жидкой связи с камерой для образца; (c) камеру детектирования, предназначенную для обнаружения агглютинированных частиц в образце, где камера детектирования находится в жидкостной связи с камерой для образца, (d) переходную зону, расположенную между камерой для образца и камерой детектирования, и предназначенную для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через переходную зону, между зоной детектирования и камерой для образца, посредством ее встряхивания; и (e) второе отверстие в жидкостной связи с камерой детектирования, предназначенное для обеспечения всасывания реактивов и образца во внутренний объем аналитического наконечника, или их удаления оттуда.

Согласно другому аспекту образец в аналитическом наконечнике включает суспензию клеток. В одном варианте суспензия клеток включает эритроциты, такие как эритроциты донора, или сыворотку пациента и эритроциты донора.

В другом аспекте образец включает лиганд-связывающую молекулу, такую как антитело или реактив Кумбса.

В другом аспекте частицы представляют собой микросферы. В одном варианте микросферы присоединены к лиганд-связывающим молекулам, где лиганд-связывающие молекулы представляют собой антитела, а частицы представляют собой клетки, такие как эритроциты.

В другом аспекте агглютинация является гемагглютинацией.

Согласно еще одному аспекту вертикальная ось камеры для образца и вертикальная ось, по меньшей мере, одной боковой камеры образуют угол, равный 45 градусам или меньше.

В еще одном аспекте отделение частиц от остальных компонентов образца является результатом разделения с помощью центрифугирования или разделения в магнитном поле.

В еще одном аспекте центрифугирование является результатом вращения аналитического наконечника вокруг вертикальной геометрической оси аналитического наконечника.

В еще одном аспекте боковая камера служит для ресуспендирования центрифугированных частиц с реактивами, всасываемыми в боковую камеру.

В другом аспекте боковая камера служит для пропускания потока ресуспендированных центрифугированных частиц в камеру для образца и в камеру детектирования аналитического наконечника.

В другом аспекте внутренний диаметр стенки камеры для образца превышает внутренний диаметр стенки камеры детектирования.

В другом аспекте камера детектирования оптически прозрачна, чтобы обеспечивать оптическое обнаружение агглютинации.

В другом аспекте аналитический наконечник изготовлен из материала, который позволяет детектировать флуоресценцию в камере детектирования.

В другом аспекте стенки камеры детектирования способны пропускать свет при определенных заданных длинах волн.

Согласно другому варианту аналитический наконечник служит для выполнения визуально детектируемой реакции агглютинации после всасывания в него реактивов и образца. Аналитический наконечник включает первое отверстие в жидкостной связи с внутренним объемом аналитического наконечника. Внутренний объем наконечника включает: (a) камеру для образца в жидкостной связи с первым отверстием; (b) камеру детектирования, предназначенную для детектирования агглютинированных частиц в образце, где камера детектирования находится в жидкостной связи с камерой для образца; (c) переходную зону, расположенную между камерой для образца и камерой детектирования, и предназначенную для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через переходную зону, между зоной детектирования и камерой для образца, посредством ее встряхивания; (d) второе отверстие в жидкостной связи с камерой детектирования, предназначенное для обеспечения всасывания во внутренний объем аналитического наконечника реактивов и образца, или их удаления оттуда, и (e) третье отверстие в жидкостной связи с внутренними камерами аналитического наконечника.

В одном варианте исполнения наконечника третье отверстие расположено сбоку относительно аналитического наконечника.

Согласно другому варианту исполнения третье отверстие находится в жидкостной связи с камерой вытеснения, где камера вытеснения предназначена для приложения отрицательного или положительного давления к внутреннему объему аналитического наконечника.

Камера вытеснения может включать в себя поршень, где объем камеры вытеснения изменяется в результате возвратно-поступательного движения поршня в камере вытеснения. Указанное возвратно-поступательное движение поршня внутри камеры вытеснения вызывает вытеснение столба воздуха, который в свою очередь прокладывает возвратно-поступательное усилие к образцу и реактивам через переходную зону аналитического наконечника. Движение поршня может быть независимым. Согласно другому варианту движение поршня в камере вытеснения наконечника может быть скоординировано с вращением камеры вытеснения в роторе, поддерживающем аналитический наконечник, вокруг оси ротора.

Согласно еще одному варианту предложено устройство для обнаружения реакций агглютинации в некотором количестве аналитических наконечников. Устройство включает некоторое количество держателей, предназначенных для размещения некоторого количества аналитических наконечников, при этом каждый из некоторого количества аналитических наконечников включает: (i) первое отверстие, предназначенное для приложения отрицательного или положительного давление к внутреннему объему аналитического наконечника, (ii) камеру для образца в жидкостной связи с отверстием, (iii) по меньшей мере, одну боковую камеру, предназначенную для улавливания частиц в образце после отделения частиц от остальных компонентов образца, где боковая камера находится в жидкостной связи с камерой для образца; (iv) камеру детектирования, предназначенную для детектирования агглютинированных частиц в образце, где камера детектирования находится в жидкой связи с камерой для образца; (v) переходную зону, расположенную между камерой для образца и камерой детектирования, предназначенную для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через переходную зону, между зоной детектирования и камерой для образца, посредством ее перемешивания; и (vi) второе отверстие в жидкостной связи с камерой детектирования, предназначенное для обеспечения всасывания реактивов и образца во внутренний объем аналитического наконечника, или удаления их оттуда, а также средства для отделения частиц, присутствующих в образце, от остальных компонентов образца.

Согласно одному варианту исполнения частицы, присутствующие в образце, могут быть отделены от остальных компонентов образца посредством центрифугирования.

Указанное центрифугирование может быть выполнено согласно одному варианту путем вращения аналитического наконечника вокруг вертикальной геометрической оси аналитического наконечника. В альтернативе, частицы в образце могут быть отделены от остальных компонентов образца с помощью магнитных средств.

Согласно еще одному варианту предложено устройство для обнаружения реакций агглютинации в некотором количестве аналитических наконечников. Устройство включает некоторое количество держателей, предназначенных для размещения некоторого количества аналитических наконечников, при этом каждый из некоторого количества аналитических наконечников включает: (a) первое отверстие в жидкостной связи с внутренним объемом аналитического наконечника, включающим: (i) камеру для образца в жидкостной связи с первым отверстием; (ii) камеру детектирования, предназначенную для детектирования агглютинированных частиц в образце, где камера детектирования находится в жидкостной связи с камерой для образца; (iii) переходную зону, расположенную между камерой для образца и камерой детектирования, предназначенную для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через переходную зону, между зоной детектирования и камерой для образца, посредством ее встряхивания; и (iv) второе отверстие в жидкостной связи с камерой детектирования, предназначенное для обеспечения всасывания реактивов и образца во внутренний объем аналитического наконечника, или удаления их оттуда, и

(v) третье отверстие в жидкостной связи с внутренними камерами аналитического наконечника.

Третье отверстие может быть расположено сбоку аналитического наконечника, или, в качестве альтернативы, третье отверстие может находиться в жидкостной связи с камерой вытеснения, где устройство дополнительно включает поршень, расположенный относительно вытеснения.

В одном варианте исполнения объем камеры вытеснения изменяется при движении поршня в камере вытеснения, где возвратно-поступательное движение поршня внутри камеры вытеснения перемещает столб воздуха, который, в свою очередь, прикладывает возвратно-поступательное усилие к образцу и реактивам через переходную зону аналитического наконечника.

Движение поршня может осуществляться различными средствами. В одном варианте движение осуществляется с помощью независимого приводного механизма. В другом варианте приводной механизм скоординирован с вращением камеры вытеснения в роторе, который вмещает наконечник, где наконечник вращается вокруг оси ротора. Устройство дополнительно включает средства для детектирования агглютинации в аналитических наконечниках.

Согласно еще одному варианту описан способ выполнения реакции агглютинации в одиночном аналитическом наконечнике, включающий этапы: (a) предоставления аналитического наконечника, включающего первое отверстие, предназначенное для приложения отрицательного или положительного давления к внутреннему объему аналитического наконечника, включающему: (i) камеру для образца в жидкостной связи с первым отверстием; (ii) по меньшей мере, одну боковую камеру, предназначенную для улавливания частиц в образце после отделения частиц от остальных компонентов образца, где боковая камера находится в жидкостной связи с камерой для образца; (iii) камеру детектирования, предназначенную для детектирования агглютинации в образце, где камера детектирования находится в жидкостной связи с камерой для образца; (iv) переходную зону между камерой для образца и камерой детектирования, предназначенную для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через переходную зону; и (v) второе отверстие в жидкостной связи с камерой детектирования, предназначенное для обеспечения всасывания реактивов во внутренний объем аналитического наконечника, или удаления их оттуда; (b) всасывания образца в камеру для образца аналитического наконечника; (c) отделения частиц от остальных компонентов образца и их улавливание, по меньшей мере, в одной боковой камере аналитического наконечника; (d) удаления супернатанта образца из аналитического наконечника; (e) всасывания реактивов для агглютинации в аналитический наконечник; (f) ресуспендирования осадка образца, по меньшей мере, из одной боковой камеры; и (g) перемещения ресуспендированнного осадка образца в камеру детектирования, в которой детектируют агглютинацию в ресуспендированнном осадке образца.

Согласно одному варианту осадок образца может быть ресуспендирован путем вращательного перемешивания в переходной зоне аналитического наконечника. Образец согласно одному варианту осуществления включает суспензию клеток, где суспензия клеток может включать эритроциты, цельную кровь пациента, и/или сыворотку пациента и эритроциты донора. Реактивы для агглютинации могут включать лиганд-связывающую молекулу, где лиганд-связывающая молекула является антителом. В другом варианте осуществления, реактивы для агглютинации включают реактив Кумбса. В другом варианте осуществления реактивы для агглютинации включают микросферы, где микросферы присоединены к лиганд-связывающим молекулам. Реактивы для агглютинации могут также включать эритроциты известной группы крови.

В другом варианте осуществления частицы отделяют от остальных компонентов образца с помощью центрифугирования или разделения в магнитном поле.

Согласно еще одному варианту предложен набор для выполнения визуально детектируемых реакций агглютинации в одиночном аналитическом наконечнике, включающий: (a) аналитический наконечник, который включает первое отверстие, предназначенное для приложения отрицательного или положительного давления к внутреннему объему аналитического наконечника, включающему: (i) камеру для образца в жидкостной связи с отверстием; (ii) боковую камеру, предназначенную для улавливания частиц в образце после отделения частиц от остальных компонентов образца, где боковая камера находится в жидкостной связи с камерой для образца; (iii) камеру детектирования, предназначенную для детектирования агглютинации в образце, где камера детектирования находится в жидкостной связи с камерой для образца; (iv) переходную зону между камерой для образца и камерой детектирования, предназначенную для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через переходную зону; и (v) второе отверстие в жидкостной связи с камерой детектирования, предназначенное для обеспечения всасывания реактивов во внутренний объем аналитического наконечника, или удаления их оттуда, и (b) реактивы для агглютинации. Реактивы для агглютинации могут включать в себя одну или более лиганд-связывающих молекул или микросферы, к которым присоединены лиганд-связывающие молекулы, где лиганд-связывающие молекулы являются антителами. В другом варианте осуществления, реактивы для агглютинации включают реактив Кумбса. В другом варианте осуществления, реактивы для агглютинации включают эритроциты известной группы крови.

В другом варианте осуществления набора, описанного в настоящей заявке, частицы отделяют от остальных компонентов образца с помощью центрифугирования или разделения в магнитном поле.

Согласно еще одному варианту предложен набор для выполнения визуально детектируемых реакций агглютинации в одиночном аналитическом наконечнике, включающий: (a) аналитический наконечник, включающий первое отверстие в жидкостной связи с внутренним объемом аналитического наконечника, включающим: (i) камеру для образца в жидкостной связи с первым отверстием; (ii) камеру детектирования, предназначенную для детектирования агглютинация в образце, где камера детектирования находится в жидкостной связи с камерой для образца; (iii) переходную зону между камерой для образца и камерой детектирования, предназначенную для вращательного перемешивания образца, перемещающегося назад и вперед через переходную зону; (iv) второе отверстие в жидкостной связи с камерой детектирования, предназначенное для обеспечения всасывания реактивов во внутренний объем аналитического наконечника, или удаления их оттуда; (v) третье отверстие в жидкостной связи с камерой для образца и камерой детектирования наконечника, и (vi) камеру вытеснения в жидкостной связи с третьим отверстием, где камера вытеснения имеет поршень, и (b) реактивы для агглютинации. Реактивы для агглютинации включают в себя одну или более лиганд-связывающих молекул или микросферы, к которым присоединены лиганд-связывающие молекулы, где лиганд-связывающие молекулы включают антитела. Реактивы для агглютинации могут включать в себя реактив Кумбса или эритроциты известной группы крови.

В другом варианте осуществления объем камеры вытеснения изменяется в результате движения поршня в камере вытеснения, где возвратно-поступательное движение поршня в камере вытеснения перемещает столб воздуха, который в свою очередь прикладывает возвратно-поступательное усилие к образцу и реактивам через переходную зону аналитического наконечника. Движение поршня может быть независимым или скоординированным с вращением камеры вытеснения в роторе вокруг оси ротора.

Следует понимать, что настоящая заявка не ограничивается вариантами осуществления, раскрытыми в разделе "Сущность", и, как предполагается, охватывает модификации и изменения, которые находятся в компетенции специалистов, обладающих достаточной квалификацией в данной области, и как определено в соответствии с формулой.

Ранее описанные варианты осуществления обладают многими преимуществами, включая возможность выполнения реакции агглютинации в одиночном аналитическом наконечнике, что требует минимального вмешательства персонала лаборатории. Реакции являются и рентабельными и выполняются быстрее, чем обычные способы с картриджами, известные в уровне техники. Способы, раскрытые в настоящей заявке, таким образом, особенно полезны для автоматизации высокопроизводительных анализов по типу реакции агглютинации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг.1 изображен вид в разрезе аналитического наконечника, сделанного в соответствии с первым вариантом исполнения;

На Фиг.2(A) и (B) представлен увеличенный местный вид аналитического наконечника Фиг.1, показывающий сбор отделенных частиц внутри боковой камеры наконечника;

На Фиг.3(A) изображен вид в разрезе наконечника Фиг.1 и 2;

Фиг.3(B) представляет собой сечение наконечника Фиг.3(A), взятое по линии 3(B)-3(B);

На Фиг.4(A) изображен местный вид в разрезе наконечника Фиг.1-3(B), показывающий вращательное смешивание в переходной зоне аналитического наконечника;

На Фиг.4(B) изображены последовательные виды части аналитического наконечника Фиг.1-4(A), показывающие отделение агглютинированных клеток от неагглютинированных клеток в аналитическом наконечнике;

На Фиг.5(A)-5(K) показаны последовательные виды в разрезе аналитического наконечника Фиг.1, представляющие способ формирования реакции агглютинации в аналитическом наконечнике;

На Фиг.6(A)-6(G) изображено устройство, включающее аналитический наконечник, сделанный в соответствии со вторым вариантом исполнения, включающий поршень 660, перемещаемый в обратном направлении, при этом наконечник применяется для агглютинации частиц;

На Фиг.7(A)-7(G) изображены виды сверху в разрезе устройства в соответствии с третьим вариантом исполнения для обнаружения агглютинации частиц в нескольких аналитических наконечниках. На Фиг 7(A)-7(E) отрицательное или положительное давление приложено к внутреннему объему аналитических наконечников через хоботок наверху каждого аналитического наконечника, тогда как на Фиг.7(F)-7(G) давление приложено к нижней части каждого аналитического наконечника с помощью поршня или деформируемой мембраны;

На Фиг.8(A)-8(D) показаны последовательные виды устройства для агглютинации частиц в нескольких аналитических наконечниках с применением блока, сделанного в соответствии с четвертым вариантом исполнения;

На Фиг.9(A)-9(C) показана прямая реакция Кумбса в аналитическом наконечнике, тогда как на Фиг.9(C)-9(D) показана непрямая реакция Кумбса в аналитическом наконечнике; и

На Фиг.10 показан вид в разрезе диск инкубатора, который смещен относительно центра.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, как обычно понимается специалистом в данной области. Следующие определения представлены с целью пояснения описания и формулы настоящей заявки. В том случае, если определение в данном разделе не согласуется с определениями где-либо еще, определение, представленное в данном разделе, имеет преимущественную силу.

Термин "некоторое количество", используемый в настоящей заявке, относится к количеству из двух или более.

Элемент находится в "жидкостной связи" с другим элементом, когда жидкость способна перемещаться из одного элемента в другой посредством капиллярного действия и/или под действием гравитации. Элементы могут быть в прямом контакте, но не обязательно должны находиться в прямом контакте; то есть, между ними могут находиться другие элементы, через которые указанная жидкость может проходить. Элемент "не находится в жидкостной связи" с другим элементом, когда жидкость не способна перемещаться из одного элемента в другой посредством капиллярного действия и/или под действием гравитации. Как правило, элементы физически разделены, то есть, расположены на некотором расстоянии друг от друга.

Используемый в настоящей заявке термин "частица" включает, помимо прочего, любую частицу, используемую в реакциях агглютинации, к которой может быть присоединен лиганд или лиганд-связывающая молекула. Частицы могут представлять собой клетки, например, бактерии или эритроциты, или лейкоциты. В другом варианте осуществления частицы изготовлены из латекса, хотя также в объем изобретения включены другие типы частиц, к которым может быть присоединен лиганд. Указанные инертные частицы могут состоять из любого подходящего материала, такого как стекло или керамика, или углерод, и/или из одного или более полимеров, таких как, например, нейлон, политетрафторэтилен (тефлон), полистирол, полиакриламид, полимеры стирола- дивинилбензола, такие как сефадекс, сефароза или сефакрил (поставляемые Pharmacia AB, Uppsala, Sweden), агароза, целлюлоза, производные целлюлозы или декстран, и/или могут включать металлы. Также могут применяться частицы пористого стекла или силикагеля. Другие примеры частиц включают, помимо прочего, пластиковые частицы, керамические частицы, углеродные частицы, микрогранулы полистирола, стеклянные гранулы, магнитные гранулы, полые стеклянные гранулы, металлические частицы, частицы сложных составов, частицы, изготовленные с применением микротехнологии или с помощью микрообработки.

Размер частиц может составлять от 0,1 микрона до 1000 микронов. Предпочтительно, размер частиц составляет от 1 до 200 микронов. Указанные частицы обычно находятся в форме гранул, гранулированных гелей или микросфер, хотя они могут иметь любую форму. В принципе, любой лиганд может быть ковалентно присоединен к твердо-фазной основе, такой как агарозные гранулы (например, сефароза Pharmacia), с применением известных способов, например, как описано Heam et al., Methods in Enzymology Vol.35:102-117 (1987). Обычно гранулы сначала активируют химическим агентом, таким как глутаральдегид, карбонилдиимидазол, бромцман и гидроксисукцинимид, тозилхлорид и т.п. Затем выбранный лиганд ковалентно присоединяют к гранулам, получая в результате чрезвычайно стабильную связь лиганда с носителем.

Используемый в настоящей заявке "лиганд" представляет собой любую молекулу, которая способна к связыванию с лиганд-связывающей молекулой. В другом предпочтительном варианте осуществления лиганд экспонирован на поверхности аналита, как определено в настоящей заявке. В одном варианте осуществления лиганд является эпитопом антитела. Например, лиганд может являться компонентом вируса, бактерий или паразита. Лиганд может являться поверхностным антигеном на клетке, такой как эритроцит. Также известен ряд лигандов, которые связывают молекулы иммуноглобулина и могут быть ковалентно присоединены к частицам, применяемым в настоящей заявке, например, белок A, белок G, белок A/G и KappaLock ^TM (см. также патент США 5,665,558, содержание которого полностью включено в настоящую заявку путем отсылки). Лиганд может связаться с изотипом антитела, которое используется или тестируется на указанный изотип, или в качестве альтернативы можно использовать мостикообразующее антитело, например, IgG против IgM, для антитела IgM. Таким образом, антитело IgG против IgM было бы связано с лигандом в качестве "мостика", а антитело IgM связывалось бы с антителом IgG против IgM.

Термин "лиганд-связывающий", используемый в настоящей заявке, относится к участнику пары связывания, то есть паре различных молекул, в которой одна из молекул специфично связывается со второй молекулой посредством химического или физического взаимодействия. В дополнение к паре связывания антигена и антитела, другие пары связывания включают, в качестве неограничивающих примеров, биотин и авидин, углеводы и лектины, комплементарные нуклеотидные последовательности, комплементарные пептидные последовательности, эффекторные и рецепторные молекулы, кофакторы ферментов и ферменты, ингибиторы ферментов и ферменты, пептидную последовательность и антитело, специфичное к данной последовательности или полноразмерному белку, полимерные кислоты и основания, красители и связывающие белки, пептиды и специфичные связывающие белки (например, рибонуклеаза, S-пептид и S-белок рибонуклеазы) и т.п. Кроме того, пары связывания могут включать таких участников, которые являются аналогами первичного участника пары, например, аналит-аналог или участник пары связывания, полученный с помощью рекомбинантных технологий или молекулярной инженерии. Если участник пары связывания является иммунореактантом, он может являться, например, моноклональным или поликлональным антителом, рекомбинантным белком или рекомбинантным антителом, химерным антителом, смесью (смесями) или фрагментом (фрагментами) предыдущего, а также препаратом таких антител, пептидов и нуклеотидов, применение которых в качестве участников пар связывания хорошо известно специалистам, квалифицированным в данной области. Лиганд-связывающий участник пары может представлять собой полипептидный аффинный лиганд (см., например, патент США 6,326,155, содержание которого полностью включено в настоящую заявку путем отсылки). В одном варианте осуществления лиганд-связывающий участник пары помечен меткой. Метка может быть выбрана из флуоресцентной метки, хемилюминесцентной метки или биолюминесцентной метки, конструкции фермент-антитело или других подобных подходящих меток, известных в уровне техники.

Используемый в настоящей заявке термин "антитело" включает как поликлональные, так и моноклональные антитела, и может представлять собой интактную молекулу, ее фрагмент (например, Fv, Fd, Fab, Fab' и F(ab)'2 фрагменты) или мультимеры или агрегаты интактных молекул и/или фрагментов, и может встречаться в природе или может быть получен искусственно, например, путем иммунизации, синтеза или с помощью генной инженерии.

Антитело или антиген, используемые в настоящей заявке, зависят от тестируемого антитела или антигена. Например, количество антигенов групп крови и, таким образом, антител к данным антигенам, которые были идентифицированы, является очень большим, причем постоянно выявляют все большее количество антигенов и антител. Международное Общество Переливания крови опубликовало неисключительный список эритроцитарных антигенов в Blood Group Terminology 1990, Vox. Sang. 58:152-169 (1990), включающий, помимо прочих, антитела и антигены A, B, D, C, c, C^w, E, e, K, Fy^a , Fy^b, Jk^a, Jk^b, S и s.

"Агглютинация", используемая в настоящей заявке, относится к агрегации суспензии клеточного или дисперсного антигена под действием реагента, обычно антитела или другой лиганд-связывающей единицы (см., например, патенты США 4,305,721, 5,650,068 и 5,552,064, содержание которых полностью включено в настоящую заявку путем отсылки).

"Гемагглютинация" относится к агглютинации эритроцитов. Гемагглютинация может применяться для идентификации поверхностных антигенов эритроцитов (с применением известных антител) или скринига антител (с применением эритроцитов, экспрессирующих известные поверхностные антигены).

Используемый в настоящей заявке термин "образец" относится к материалу, подозреваемому на содержание, по меньшей мере, одного аналита. Образец может непосредственно применяться в том виде, в каком его получают из источника, или после предварительной обработки с целью изменения свойств образца. Образец может быть получен из любого биологического источника, такого как физиологическая жидкость, включая кровь, слюну, жидкость хрусталика, спинномозговую жидкость, пот, мочу, молоко, асцитную жидкость, мокроту, синовиальную жидкость, перитонеальную жидкость, амниотическую жидкость и т.п. Образец может быть предварительно обработан перед использованием, например, как при получении плазмы из крови, разбавлении вязких жидкостей и т.п.; способы обработки могут включать фильтрацию, дистилляцию, концентрирование, инактивацию нежелательных компонентов и добавление реактивов. Помимо физиологических жидкостей могут применяться другие жидкие образца. Кроме того, в качестве образца может использоваться твердый материал, подозреваемый на наличие аналита. В некоторых случаях может потребоваться модифицировать твердый образец с целью получения жидкой среды или высвобождения аналита.

Термин "аналит", используемый в настоящей заявке, относится к детектируемому или анализируемому соединению или композиции, которые содержат, по меньшей мере, один эпитоп или связывающий сайт или лиганд. Аналит может педставлять собой любое вещество, для которого существует природный связывающий агент или для которого может быть получен связывающий агент. Аналиты включают, помимо прочего, токсины, органические соединения, белки, пептиды, микроорганизмы (бактерии, вирусы или паразиты и т.п.), аминокислоты, нуклеиновые кислоты, гормоны, стероиды, витамины, лекарственные средства, вирусные частицы и метаболиты или антитела к какому-либо из вышеперечисленных веществ. Термин "аналит" также включает любые антигенные вещества, гаптены, антитела, макромолекулы и их комбинации. В одном варианте осуществления аналит является поверхностным антигеном клетки. В другом варианте осуществления аналит является поверхностным антигеном эритроцита.

Используемый в настоящей заявке "реактив Кумбса" относится к препарату антител, индуцированных в организме животных и направленных против одного из следующих человеческих иммуноглобулинов, комплемента или специфического иммуноглобулина, например, IgG против иммуноглобулина человека, предназначенный для применения в реакции Кумбса.

Используемое в настоящей заявке "центрифугирование" относится к вращению объекта вокруг оси вращения. В одном примере осуществления центрифугирование относится к вращению аналитического наконечника вокруг его собственной геометрической вертикальной оси 104, как показано на Фиг.1.

Используемый в настоящей заявке "аналитический наконечник" представляет собой устройство, содержащее одну или более внутренних камер. В одном варианте осуществления аналитический наконечник состоит из формованного твердого материала, который может подвергаться центрифугированию без деформации внутренних камер. В другом варианте осуществления материал не способствует адгезии биологического образца к внутренним стенкам аналитического наконечника. В другом варианте осуществления аналитический наконечник изготовлен из полимерного материала. В примере осуществления аналитический наконечник изготовлен из акрилового полимера. В другом варианте осуществления аналитический наконечник определяется формованной структурой, имеющей внутренние камеры, находящиеся в жидкостной связи с одним или более отверстиями.

Используемый в настоящей заявке термин "камера" относится к любой трехмерной полости внутри описанного аналитического наконечника. В примере осуществления одна или более камер находятся в жидкостной связи друг с другом.

Используемая в настоящей заявке "переходная зона" относится к области во внутренних камерах аналитического наконечника, куда образец и/или реактивы поступают посредством вертикального движения (например, вверх и вниз) образца между смежными камерами в аналитическом наконечнике, чтобы способствовать вращательному перемешиванию содержащегося образца и/или реактивов. В одном варианте осуществления переходная зона имеет меньший определенный внутренний диаметр, чем диаметр смежной части аналитического наконечника, через которую движется образец. Подобные "переходные зоны" описаны в патенте США 6,641,993 и опубликованной заявке US 2007/0054405, содержание которых полностью включено в настоящую заявку путем отсылки.

Используемая в настоящей заявке "суспензия клеток" относится к смеси клеток в жидкости. Клетки могут быть эукариотическими или прокариотическими клетками. В одном варианте осуществления клетки являются бактериями. В другом варианте осуществления клетки являются патогенными бактериями. В предпочтительном варианте осуществления клетки являются клетками крови. В другом предпочтительном варианте осуществления клетки являются эритроцитами.

Используемые в настоящей заявке "эритроциты" (RBCs) могут быть выделены из цельной крови с помощью центрифугирования или через градиент плотности, например, градиент фиколла. В одном варианте осуществления эритроциты имеют гематокрит 3%, 5%, 10%, 20%, 30% или 40%. В предпочтительном варианте осуществления, гематокрит составляет 30-40%.

Используемое в настоящей заявке понятие "улавливать" относится к типу разделения, в котором одна или более молекул или компонентов образца сохраняются в или на одной или более областях поверхности, камере, чипе, пробирке или любой емкости, которые содержат образец, где остальные компоненты образца могут быть удалены из указанной области. В одном варианте осуществления понятие "улавливать" относится к сбору частиц, используемых в настоящей заявке, внутри, по меньшей мере, одной боковой камеры аналитического наконечника. В другом варианте осуществления частицы улавливаются, по меньшей мере, в одной боковой камере наконечника при центрифугировании аналитического наконечника вокруг его собственной геометрической вертикальной оси. В другом варианте осуществления магнитные частицы, используемые в настоящей заявке, улавливаются с помощью магнитного поля.

Используемое в настоящей заявке "обнаружение" относится к обнаружению агглютинации частицы, обычно с помощью фотодетектора (см., например, патент США 5,256,376 и опубликованную заявку US 2004/0166551, содержание которых полностью включено в настоящую заявку путем отсылки). В одном варианте осуществления обнаружение относится к обнаружению биолюминесценции или хемилюминесценции, или флуоресценции.

Используемый в настоящей заявке термин "встряхивание" относится к движению аналитического наконечника, которое приводит к вращательному перемешиванию образца и/или реактивов во внутренних камерах аналитического наконечника. В одном варианте осуществления встряхивание выполняется с помощью поршня, который создает положительное или отрицательное давление во внутренних камерах аналитического наконечника.

Используемый в настоящей заявке термин "поршень" относится к любому элементу, который может прикладывать отрицательное или положительное давление к внутреннему объему аналитического наконечника. В одном варианте осуществления поршень имеет цилиндрическую форму и установлен в канале, имея возможность скольжения в упоре к внутренней стенке канала с обеспечением герметичности (то есть, между цилиндрической поверхностью поршня и стенок не происходит какой-либо существенной утечки воздуха). Движение поршня создает либо вакуум, либо давление во внутреннем объеме аналитического наконечника и, таким образом, направляет движение жидкостей во внутренних камерах аналитического наконечника.

Термин "детектирование флуоресценции" относится к детектированию флуорофор-конъюгированного лиганда или лиганд-связывающей единицы (см., например, патент США 6,596,546, содержание которого полностью включено в настоящую заявку путем отсылки).

Используемое в настоящей заявке "пропускание света с некоторыми заданными длинами волн" относится к способности стенок камеры детектирования аналитического наконечника пропускать электромагнитное излучение с длиной волны, требуемой для возбуждения флуоресцентного лиганда, и электромагнитного излучения с длиной волны, характерной для последующей эмиссии флуоресценции.

Следующее описание относится к конкретным предпочтительным вариантам осуществления заявки, а также к конкретной методике обнаружения агглютинации в одном или более одноразовых наконечниках. Как будет очевидно из пояснения, идеи изобретения, описанные в настоящей заявке, также могут надлежащим образом применяться к другим процессам реакции в дополнение к определению групповой специфичности крови с целью обнаружения антигенов, антител, белков, вирусов и т.п. Кроме того, такие понятия как "верхняя часть", "нижняя часть", "боковая часть", "над", "под" и т.п. также используются для обеспечения удобной системы ориентирования, применяемой в сочетании с сопровождающими чертежами. Впрочем, указанные понятия, если прямо не указано иное, не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Обращаясь к Фиг.1, показан одноразовый аналитический наконечник 100 для обнаружения агглютинация частиц, применяемый в настоящей заявке. Аналитический наконечник 100 определен тремя (3) смежными соединенными внутренними камерами или полостями 120, 130, 140 и 150, каждая из которых связана общей стенкой. Первое впускное отверстие 110 аналитического наконечника 100 может быть соединено с насосом или другим приспособлением (не показано) для создания отрицательного или положительного давления во внутренних камерах аналитического наконечника, как известно из уровня техники. Указанное отрицательное или положительное давление способствует движению одной или более жидкостей во внутренних камерах аналитического наконечника. Движущие механизмы, которые могут применяться в сочетании с аналитическим наконечником согласно изобретению для перемещения жидкости в аналитическом наконечнике 100, более подробно описаны в опубликованных заявках US 2002/0076826 и US 2002/0081747, каждая из которых полностью включена путем отсылки. Жидкость, имеющая заданную плотность и вязкость, не является обязательной. В описанном здесь варианте осуществления внутренние камеры включают камеру для образца 120, боковую камеру 130, смежную с камерой для образца, а также камеру детектирования 150, которая расположена под камерой для образца 120.

На Фиг.3 показан вид 320 из положения наблюдателя 310, смотрящего вниз, вдоль геометрической вертикальной оси 104 аналитического наконечника в горизонтальном разрезе 300 через него. В представленном варианте осуществления боковая камера 130 формирует одиночную желобообразную структуру по периметру камеры для образца 120, образуя выступ 240. В другом варианте осуществления геометрическая вертикальная ось 104 аналитического наконечника 100 и геометрическая вертикальная ось 180 боковой камеры 130 объединяются, формируя острый угол 190, меньший чем 90 градусов. В альтернативе вертикальные оси могут формировать острый угол, равный 65 градусам или меньше, и предпочтительно формировать острый угол, равный 45 градусам или меньше.

Снова обращаясь к Фиг.1 и 2, переходная зона 140 расположена между камерой для образца 120 и камерой детектирования 150 и характеризуется постепенным уменьшением или направленным внутрь сужением внутреннего диаметра стенки 192 переходной зоны 140 от камеры для образца 120 к камере детектирования 150. Диаметр внутренней стенки в верхней части переходной зоны 140, таким образом, существенно больше, чем диаметр внутренней стенки в нижней части переходной зоны 140. Как показано на Фиг.4 и более подробно описано в настоящей заявке, данная ступенчатая структура способствует вращательному перемешиванию жидкостей, перемещающихся назад и вперед через переходную зону 140, и содействует агглютинации частиц в аналитическом наконечнике 100. Описание реакций агглютинации в отсутствии центрифугирования также более подробно раскрыто в патенте США 6,641,993 и опубликованных заявках US 2007/0054405, US 2002/0076826 и US 2002/0081747, содержание которых включено в настоящую заявку в полном объеме.

На Фиг.1 и 2 также показан излучатель 184, такой как фотодиод или СИД, который помещен снаружи одной из стенок камеры детектирования 150 и прилегает к ней. Как правило, агглютинацию частиц обнаруживают при измерении величины рассеяния света тестируемыми образцами в камере детектирования 150 с применением способов, известных в уровне техники. Датчик 188 расположен на одной оси, в соответствующем положении напротив излучателя 184, чтобы улавливать пропускаемый свет 176. В одном варианте осуществления излучатель 184 испускает видимый свет, а датчик 188 измеряет величину рассеяния света в камере детектирования 150. Средний специалист в данной области техники осведомлен, что излучатель 184 также может подавать электромагнитное излучение любой длины волны, в зависимости от способа, выбранного для обнаружения агглютинации частиц. Например, агглютинация частиц может привести к включению флуорофор-конъюгированного антитела в агглютинат. При этом измерение агглютинации частиц потребовало бы детектировать флуоресценцию в камере детектирования 150. Излучатель 184 должен был бы испустить электромагнитное излучение 172 с точной длиной волны для возбуждения флуорофор-конъюгированного антитела в агглютинате. При этом датчик 188 измерял бы величину флуоресценции 176, испускаемой агглютинатом в камере детектирования 150.

Аналитический наконечник 100 может быть изготовлен из любого материала, пригодного для формования в соответствующую форму, такую как описано выше. Примером материала, который может применяться для изготовления аналитического наконечника, как описано в настоящей заявке, является полимерный материал, пригодный для литьевого прессования, такой как акриловый полимер. Предпочтительно, анализируемый образец не прилипает к стенкам внутренних камер аналитического наконечника 100, где указанные поверхности аналитического наконечника могут быть обработаны с целью предотвращения подобной адгезии образца или реактивов к внутренним поверхностям аналитического наконечника. Кроме того, стенка камеры детектирования 150 изготовлена из материала, который является прозрачным, прозрачной пластмассы, такой как акрил, который пропускает свет 172, идущий от источника света 184 через камеру детектирования к датчику 188. В одном варианте исполнения пластмасса аналитического наконечника 100 обеспечивает диапазон проницаемости для электромагнитного излучения с длиной волны приблизительно 220 - 1600 нм.

В ответ на отрицательное или положительное давление, приложенное к внутренним камерам аналитического наконечника 100 через первое впускное отверстие 110, анализируемый образец и/или реактивы во внутренних камерах аналитического наконечника могут всасываться или удаляться через второе отверстие 160. В одном варианте исполнения один или более реактивов для агглютинации частиц могут быть предварительно введены в описанный здесь аналитический наконечник.

Обращаясь к Фиг.2, аналитический наконечник 100 может подвергаться центрифугированию вокруг своей геометрической вертикальной оси 104. Центрифугирование прикладывает центробежную силу, указанную стрелкой 210, к частицам, присутствующим в камере для образца 120, перпендикулярно геометрической оси 104. В другом варианте осуществления частица 200 является магнитной частицей. В присутствии сильного магнитного поля частицы 200 могут перемещаться из камеры для образца 120 в боковую камеру 130 в ответ на силу магнитного притяжения 210. Воздействие указанных сил, независимо от того, являются ли они центробежными или магнитными по своей природе, на частицы 200 в камере для образца 120 вызывает движение частиц в боковую камеру 130, вдоль внешней стенки 220 боковой камеры и их последующий сбор в виде осадка 230 в нижней части боковой камеры 130. Острый угол 190 между геометрической осью 104 аналитического наконечника 100 и геометрической осью боковой камеры 130 формирует выступ 240, что дополнительно способствует улавливанию частиц в боковой камере.

С учетом предыдущего структурного описания подходящего аналитического наконечника 100, далее описывается способ касательно реакций агглютинации для определения групповой специфичности крови. Специалисту, обладающему достаточными знаниями в данной области, будет очевидно, и как описано более подробно, что следующее описание является примерным, и поэтому существует потенциальная возможность применения других носителей антигена кроме эритроцитов.

Обращаясь к Фиг.5A-5K, представлены отдельные стадии, требуемые для анализа посредством непрямой реакции агглютинации Кумбса, с применением аналитического наконечника 100 Фиг.1-3 (B). Непрямая реакция заключается в смешивании сыворотки, потенциально содержащей антитело, с суспензией эритроцитов известной группы крови, добавлении иммуноглобулина против человеческого антитела (реактив Кумбса) с последующим анализом на предмет агглютинации эритроцитов.

Кровь, забранную у пациента, сначала обрабатывают гепарином или эквивалентным полианионом для ингибирования коагуляции. Затем кровь центрифугируют. Супернатант, содержащий сыворотку, отбирают и инкубируют с эритроцитами донора в течение 1-60 минут при 37 градусах Цельсия.

Обращаясь к Фиг.5A, отверстие 160 аналитического наконечника 100 сначала погружают в образец 540, содержащий сыворотку пациента и эритроциты донора. Насос (не показан) подсоединяют к противоположному впускному отверстию 110, после чего откачивают воздух, указанный стрелкой 510, из внутреннего объема аналитического наконечника 100, сформированного камерами 120, 130 и 150. Вытеснение воздуха 510 из аналитического наконечника создает внутри него отрицательное давление, которое вызывает движение 520 и 530 образца 540 в цилиндрическую нижнюю камеру 150 аналитического наконечника. В одном варианте исполнения откачивают аликвоту, равную 0,1-50 микролитров образца 540. В предпочтительном варианте исполнения во внутреннюю камеру 150 аналитического наконечника 100 откачивают аликвоту, равную 0,1-10 микролитрам образца 540.

Как показано на Фиг.5B-5D, отверстие 160 аналитического наконечника 100 отводят от образца 540. Насос, подсоединенный к отверстию 110, откачивает из аналитического наконечника воздух 510, который в свою очередь перемещает засасываемый образец 560 в направлении 570 через внутренний объем аналитического наконечника 100, из камеры 150 в камеру для образца 120 и в прилегающую к ней боковую камеру 130. Затем отверстие 110 закрывают, чтобы гарантировать, что образец 580 останется в камере для образца 120.

Затем, в одном варианте исполнения, аналитический наконечник 100 центрифугируют, вращая наконечник в направлении, показанном стрелкой 590, вокруг его геометрической вертикальной оси 104. Центрифугирование создает центробежную силу, показанную стрелками 554, в камере для образца 120, которая по существу перпендикулярна геометрической вертикальной оси 104. Как показано на Фиг.5E, центробежная сила 554 действует на покрытые эритроциты, перемещая их из камеры для образца 120 вдоль внешней стенки боковой камеры 220 с формированием осадка 558 внизу боковой камеры и отделяя их от остальных компонентов образца (см. также Фиг.2 (B)). Как показано на Фиг.5F, приложение положительного давления 568 через отверстие 110 вызывает движение, показанное стрелкой 562, которое приводит к удалению супернатанта 566 образца из аналитического наконечника 100.

Обращаясь к Фиг.5G-H, отверстие 160 аналитического наконечника 100 затем погружают в реактив для агглютинации, то есть, иммуноглобулин 578 против человеческого антитела (реактив Кумбса). Приложение отрицательного давления, показанного стрелкой 572, через отверстие 110 вызывает всасывание иммуноглобулина 578 против человеческого антитела из нижней камеры 150 аналитического наконечника в камеру для образца 120 и боковую камеру 130. Поочередное приложение положительного и отрицательного давления, показанного стрелками 586, через отверстие 110 способствует ресуспендированию осадков эритроцитов 558 в нижней части боковой камеры 130. Положительное давление через отверстие 110 затем перемещает ресуспендированную массу в переходную зону 140. Как показано на Фиг.5l, поочередное приложение положительного и отрицательного давления 592 через отверстие 110 способствует вращательному перемешиванию эритроцитов 588 с иммуноглобулином 584 против человеческого антитела при движении ресуспендированной массы назад и вперед, как показано стрелкой 594, через переходную зону 140 (см. также Фиг.4). В одном варианте осуществления жидкости перемещаются через переходную зону с шагом 25 л вверх или вниз, с последующим перерывом переменной продолжительности, как описано ниже.

Вытеснение 25 л	Время вытеснения (секунд)
Вверх	5
Вниз	20
Вверх	10
Вниз	30
Вверх	15
Вниз	40
Вверх	20
Вниз	40
Вверх	25
Вниз	35

Наконец, как показано на Фиг.5J и 5 K, приложение положительного давления, показанного стрелкой 596, через отверстие 110 выталкивает суспензию клеток в камеру детектирования 150, где измеряется агглютинация клеток. Свет 598, испускаемый источником света 184, на уровне с верхней половиной камеры детектирования, проходит через суспензию клеток и улавливается датчиком или фотодетектором 188. Способы фотодетектирования более подробно раскрыты в опубликованной заявке US 2007/0054405, содержание которой было ранее полностью включено в настоящую заявку путем отсылки. Возможны два варианта развития событий. Если суспензия клеток 595 однородна, то агглютинация отсутствует, а поглощение света является высоким. Отсутствие агглютинации указывает на то, что сыворотка пациента не способна реагировать с эритроцитами донора, и что донор совместим с пациентом в целях переливания крови (см. Фиг.5J). Если же клетки формируют агрегаты 597, которые опускаются под действием силы тяжести на дно камеры детектирования 150, поглощение света является низким. Наличие агглютинации указывает, что сыворотка пациента содержит одно или более антител, которые могут реагировать с эритроцитами донора. Кровь донора, таким образом, не подходит для переливания пациенту.

Среднему специалисту в данной области, очевидно, что описанный вариант осуществления может быть изменен множеством способов и все же остается в рамках предполагаемого объема настоящей заявки. Например, аналитический наконечник, описанный в настоящей заявке, может применяться в ряду из двух или более аналитических наконечников. Например, первый аналитический наконечник может применяться для сбора гепаринизированной крови пациента и осаждения клеточной фракции крови в боковых камерах с помощью центрифугирования. Затем супернатант сыворотки сливают из камеры для образца в емкость, из которой он может быть обработан во втором аналитическом наконечнике, как описано выше. В другом варианте осуществления аналитический наконечник может всасывать один или более реактивов для агглютинации.

В еще одном варианте осуществления другие частицы, такие как гранулы агарозы или латекса и т.п., могут применяться вместо клеток. Известен ряд лигандов, которые связывают молекулы иммуноглобулина и могут быть ковалентно присоединены к частицам, например, белок A, белок G, белок A/G и KappaLock^TM . Белок G является наиболее предпочтительным лигандом для применения в анализе, в котором иммуноглобулины IgG используются или являются предметом анализа. Одна из причин, по которой белок G является предпочтительным, состоит в том, что он обладает более высокой аффинностью по сравнению с белком A в отношении большинства иммуноглобулинов IgG. Белок G а также связывается со значительно большей аффинностью, чем белок A, с некоторыми подклассами IgG, например, IgG3 человека, IgG1 мыши и IgG2 крысы. Белок G не связывается с человеческими IgM, IgA и IgD.

Белок G представляет собой белок бактериальной клеточной стенки, выделенный и очищенный из стрептококков группы G. Белок G связывается с иммуноглобулинами IgG млекопитающих через их Fc-фрагмент. Поскольку белок G связывается только с Fc-фрагментом иммуноглобулинов IgG, антигенсвязывающая часть иммуноглобулина остается доступной для реакции с его соответствующим антигеном, и при этом иммуноглобулин остается связанным с частицей. Нативный белок G был секвенирован посредством анализа ДНК. В результате анализа ДНК были идентифицированы два IgG-связывающих домена, а также сайты связывания альбумина и сайты связывания с поверхностью клетки.

Иммобилизованный белок G ImmunoPure^® представляет собой коммерчески доступный продукт на основе частиц, который содержит белок G, иммобилизованный на поверхности гранул агарозного геля. Данный продукт поставляется фирмой Pierce (Rockford, Ill). Иммобилизованный белок G подвергли генноинженерной модификации с целью удаления областей связывания с альбумином и поверхностью клетки, и, таким образом, минимизации связывания чего-либо помимо иммуноглобулинов. Иммобилизованный белок G ImmunoPure^® состоит из рекомбинантного белка G, который ковалентно связан (после активации гранул глутаровым альдегидом) с поперечно-сшитой 6% гранулированной агарозой. Материал поставляется в виде 50%-ой суспензии. Материал может связывать 11 мг IgG человека на мл геля.

Белок A представляет собой компонент клеточной стенки, продуцируемый несколькими штаммами Staphylococcus aureus. Белок A способен специфично связывать Fc-области молекул иммуноглобулина, в особенности IgG. Молекула белка A содержит четыре высокоаффинных связывающих сайта, которые способны взаимодействовать с Fc-областью IgG нескольких типов. Белок A взаимодействует с некоторыми подгруппами IgG, и не взаимодействует с другими. Например, IgG1, IgG2 и IgG4 человека связываются сильно, тогда как IgG3 - не связывается. И кроме того, существуют также некоторые случаи, когда моноклональные антитела не связываются с белком A.

Иммобилизованный белок A также коммерчески доступен от Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL. 61105 U.S.A. Данный иммобилизованный белок A представляет собой высокоочищенный белок A, ковалентно связанный с поперечно-сшитой гранулированной агарозой. Стандартная связывающая способность для данного иммобилизованного белка A составляет 12-15 мг IgG человека на миллилитр геля.

Белок A/G представляет собой рекомбинантный белок, в котором скомбинированы IgG-связывающие профили и белка A, и белка G. Белок A/G представляет собой продукт слитого гена, секретируемый непатогенными формами Bacillus. Данный рекомбинантный белок A/G сконструирован таким образом, что содержит четыре Fc-связывающих домена из белка A, и два - из белка G.

Белок A/G связывается со всеми подклассами IgG человека. Кроме того, он связывается с IgA, IgE, IgM, а также, но в меньшей степени, с IgD. Таким образом, белок A/G может являться предпочтительным лигандом в анализах на, или в анализах с применением иммуноглобулинов не IgG класса.

Фирма Pierce также предлагает иммобилизованный белок A/G, ковалентно связанный с гранулированной агарозой, под торговой маркой иммобилизованный белок A/G ImmunoPure ^®.

KappaLock^TM представляет собой универсальный белок, связывающий каппа-область легкой цепи, поставляемый фирмой Aaston, Inc, 12 Falmouth Road, Wellesley, Mass. Он был рекомбинантно получен из ДНК штамма Peptostreptococcus. Указанный белок связывается с каппа-областью легкой цепи всех типов антител. KappaLock^TM был генноинженерно модифицирован с целью удаления областей связывания альбумина и клеточной стенки природного бактериального белка. Полученный в результате рекомбинанный белок содержит четыре антителосвязывающих домена и специфично не связывается с тяжелыми цепями или с Fc-областью иммуноглобулинов. Поскольку каппа легкие цепи являются общими для различных классов антител, KappaLock^TM связывается с антителами, содержащими каппа легкие цепи, независимо от класса тяжелой цепи.

KappaLock^TM может быть иммобилизован на различных носителях, в особенности на агарозных гранулах. Иммобилизованный KappaLock^TM связывает IgG мыши, IgG кролика, IgG человека, IgA человека и IgM человека.

Все предпочтительные лиганды могут быть ковалентно связаны с твердо-фазной матрицей, такой как гранулы агарозы (например, Sepharose Pharmacia), с использованием известных способов, например, как описано Heam et al., Methods in Enzymology Vol. 35:102-117 (1987). Как правило, гранулы сначала активизируют химическим агентом, таким как глутаральдегид, карбонилдиимидазол, бромциан и гидроксисукцинимид, тозилхлорид и т.п. Затем выбранный лиганд ковалентно присоединяют к гранулам, получая в результате чрезвычайно стабильную связь лиганда с носителем.

В еще одном варианте осуществления частицы могут быть связаны бактериофагом, экспрессирующим антитело на своей поверхности, см., например, патент США 6,979,534, содержание которого настоящим включено путем отсылки в полном объеме. В патенте США 6,979,534 описан способ идентификации антиген-содержащей молекулы на клетке, включающий получение смеси, включающей популяцию клеток и популяцию бактериофага, который экспрессирует известное первичное антитело на своей поверхности. Показателем присутствия антиген-содержащей молекулы на клетке является связывание первичного антитела, по меньшей мере, с двумя клетками, в результате чего бактериофаг также связывается, по меньшей мере, с двумя клетками, с добавлением вторичного антитела, специфичного к бактериофагу. Присутствие агглютинации идентифицирует антиген-содержащую молекулу, как молекулу, содержащую антиген, к которому специфично первичное антитело.

Согласно другому варианту осуществления гранулы представляют собой магнитные гранулы. Магнитные частицы могут улавливаться к боковой камере и отделяться от остальных компонентов образца, как описано выше, посредством простого приложения мощного магнита к боковой камере без центрифугирования. Из уровня техники известно много способов, в которых клетки могут быть сделаны магнитными для их выделения и т.п. Например, клетки можно инкубировать с биотинилированными антителами или другими лиганд-связывающими молекулами, которые являются специфичными к поверхностному антигену, характерному для конкретного типа клеток. Добавление стрептавидин-конъюгированных магнитных гранул (Invitrogen/Dynal Biotech) приводит к их связыванию с биотинилированными антителами и, таким образом, делает клетки магнитными и, следовательно, пригодными к разделению с помощью магнитного поля. Описание контролируемого транспорта магнитных гранул раскрыто в патенте США 7,217,561, содержание которого полностью включено в настоящую заявку.

Клетки, применяемые в изобретении, также могут быть помечены с использованием меченых антител, известных из уровня техники. Например, меченые антитела могут являться флуорофор-конъюгированным антителом. Агглютинация может при этом отслеживаться посредством детектирования флуоресценции, испускаемой агглютинированными клетками.

Применение пневматических устройств, способных создавать отрицательное (вакуум) или положительное (нагнетаемое) давление для вытеснения жидкостей во внутреннем объеме аналитического наконечника, используемого в настоящей заявке, также рассматривается в настоящем описании.

На Фиг.6(A) изображен аналитический наконечник согласно второму варианту исполнения, внутренний объем которого состоит из камеры для образца 610, переходной зоны 620, камеры детектирования 630 и камеры вытеснения 640, соответственно, причем все из них связаны. На Фиг.6(B) также показан подвижный поршень 660, который расположен в камере вытеснения 640. Обращаясь к Фиг.6(C)-(D), анализируемый образец 650 по существу добавляют к реактиву для агглютинации частиц 670 в камере для образца 610. Отвод 690 поршня 660 в камере вытеснения 640 создает отрицательное давление во внутреннем объеме аналитического наконечника и вызывает последующее движение 654 образца и реактивов в камеру детектирования 630. Ход 658 поршня в камеру вытеснения 640 и из нее вызывает аналогичное возвратно-поступательное движение жидкостей через переходную зону 620 и, таким образом, способствует вращательному перемешиванию 666 указанных жидкостей. Последовательность движений, которые могут использоваться для вращательного перемешивания в переходной зоне 620, подробно описана в Примере ниже.

Отвод 690 поршня 660 в камере вытеснения 640 вызывает всасывание суспензии частиц в зону детектирования 630, в которой агглютинированные частицы осаждаются под действием гравитации и поля течения в ходе колебательного движения. Затем определяют количество поглощения света 598, используя излучатель 184 и датчик 188, при этом отсутствие поглощения света является показателем агглютинации частиц.

В одном из примеров осуществления движение поршня 660 связано с вращением или круговым колебанием посредством соединения поршня с приводным механизмом вращающегося устройства, например, инкубатора (см. Фиг.10). Инкубатор включает, по меньшей мере, один круглый ротор, имеющий некоторое количество отверстий, размеры которых позволяют устанавливать в них аналитические наконечники, как описанные выше. Приводной механизм, в качестве примера, может быть подсоединен через ременной привод или зубчатый привод, где приводной механизмом управляется в зависимости от вращения ротора. При вращении ротора поршень движется назад и вперед, создавая усилие, которое вызывает колебание жидкости в наконечнике. В результате действия поля течения и силы тяжести все крупные агглютинированные структуры перемещаются вниз наконечника. Напротив, в отрицательной реакции агглютинация не происходит, и наблюдается почти гомогенное перемешивание. Затем величина агглютинации может быть точно оценена с использованием источника света и датчика для измерения поглощения света в камере детектирования 150.

На Фиг.7 показана конфигурация блока аналитических наконечников, который пригоден к автоматизации. На Фиг.7(A) показан ряд 6 аналитических наконечников 782, который может быть подсоединен к насосу (Фиг.7(B)) либо через хоботок, расположенный наверху каждого аналитического наконечника 750 (см. Фиг.7(A)), к ряду поршней 780 (см. Фиг.7(F)), либо посредством деформируемой мембраны 778 (см. Фиг.7(G)), расположенной в нижней части аналитических наконечников. В аналитические наконечники могут быть предварительно введены реактивы 730 для агглютинации частиц, после чего их герметизируют клейкой пластиной. Образец может быть введен из многолуночных планшетов, имеющих некоторое количество лунок. На Фиг.7(C)-7(E) и Фиг.8(A)-8(B) последовательно изображен наконечник при ускорении реакций агглютинации в ряду аналитических наконечников. В одном варианте осуществления приводной ремень 850 используется для скоординированного движения ряда поршней. Компьютерные средства, а также их программирование для автоматизации стадий пипетирования, движения поршней, движения титрационных микропланшетов и движения аналитических наконечников, также рассматриваются в соответствии с настоящим изобретением. Автоматизированная платформа также может включать центрифугу для центрифугирования некоторого количества аналитических наконечников, как определено в настоящей заявке, или приспособления для приложения магнитного поля согласно требованиям анализа агглютинации.

Настоящее описание также предусматривает формат набора, который включает упаковку, содержащую один или более аналитических наконечников согласно настоящему изобретению, а в некоторых вариантах исполнения включает контейнеры с различными реактивами. Набор также может содержать одну или более следующих позиций: реактивы для агглютинации, включающие, помимо прочего, антитела (например: реактив Кумбса), буферные растворы, инструкции и контрольные образцы. Наборы могут включать контейнеры с реактивами, смешанными вместе в подходящих пропорциях для осуществления способов в соответствии с изобретением. Контейнеры с реактивами предпочтительно содержат реактивы в дозированных количествах, что позволяет исключить стадию измерения при выполнении настоящих способов. Наборы могут дополнительно включать аналитические наконечники, предварительно снаряженные реактивами для анализа агглютинации.

Далее изобретение иллюстрировано со ссылкой на следующий пример. Следует понимать, что следующее ниже служит исключительно в качестве примера, и что могут быть сделаны модификации для уточнения, которые все же входят в предполагаемый объем настоящего изобретения.

ПРИМЕР: Непрямая и прямая реакция Кумбса в аналитическом наконечнике

Отдельный капилляр с шагом в канале потока использовали для выполнения определения группы крови и скрининга антитела (прямая и непрямая реакция Кумбса, см. Фиг.9(A)-9(D)). Сначала стеклянный капилляр 992 соединили с коротким отрезком шланга 996, получив наконечник с шагом. Капилляр имел объем 25 л при длине 54 мм. Шланг 996 имел диаметр 3 мм и длину 6 мм. Шприц Hamilton (не показан) использовали для создания потока жидкости. В тесте использовали следующие реактивы:

Реагент	Код продукта (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.)
Anti-A BioClone®	711220
ORTHO® Anti-IgG Green	716760
Antibody Enhancement Solution	718780
ORTHO® Anti-Kell	715150
AFFIRMAGEN® (3%)	719210
SELECTOGEN® (3%)	719610
ORTHO® Coombs Control	719810

Anti-A BioClone включает реактивы для определения групп крови ABO. ORTHO ^® Anti-IgG Green содержит глобулиновые реактивы против человеческих антител. ORTHO^® Anti-Kell содержит реактивы для определения группы крови, а AFFIRMAGEN, SELECTOGEN и ORTHO^® Coombs Control представляют собой реактивы эритроцитов.

33% гепаринизированную кровь центрифугировали для удаления части сыворотки, чтобы гематокрит крови (HCT) стал равен приблизительно 30-40% HCT крови. Все эксперименты проводили при комнатной температуре за исключением получения слоя клеток, которое проводили при 37 градусах Цельсия.

Прямая реакция Кумбса

Следующие реактивы набирали в капилляр (полный объем 10 микролитров):

Прямая реакция I (Фиг.9(A)):

Anti-A BioClone^® и AFFIRMAGEN^® A Cell (положительная реакция) или Anti-A BioClone^® и AFFIRMAGEN^® B Cell (отрицательная реакция) или

Прямая реакция II (Фиг.9(B):

ORTHO^® Anti-IgG Green и ORTHO^® Coombs Control (положительный контроль) или ORTHO^® Anti-IgG Green и AFFIRMAGEN ^® A Cell (отрицательный контроль)

Возвратно-поступательные движения над уступом выполняли, перемещая плунжер шприца Hamilton с шагом 25 л. Каждое движение сопровождалось перерывом переменной продолжительности, как указано в Таблице (колонки Прямая I и II). При завершении протокола суспензию клеток набирали в капилляр с целью визуального осмотра. В случае положительных реакций (982 и 986) агглютинированные комплексы клеток оседали в капилляре под действием силы тяжести, тогда как в случае отрицательных реакций (984 и 990) клетки оставались в суспензии (см. Фиг.9(A)-9(B)). Величину агглютинации определяли количественно путем измерения поглощения света (930) в верхней половине трубки капилляра (см. Фиг.9(C)).

Непрямая реакция Кумбса (Фиг.9(D) и 9(E))

ORTHO^® Anti-Kell смешивали с SELECTOGEN^® Cell (K +), после чего смесь инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°C. Аналогично, ORTHO ^® Anti-Kell смешивали с SELECTOGEN^® Cell (K-), с последующим инкубированием в течение 30 минут при температуре 37ºC. Затем добавляли физраствор и центрифугировали смесь, чтобы отделить клетки от жидкости. Процесс повторяли три раза. Промытые клетки ресуспендировали в физрастворе.

Затем ORTHO^® Anti-IgG Green добавляли к слою SELECTOGEN^® Cell (K+) в случае положительной реакции (960) или SELECTOGEN^® Cell (K-) в случае отрицательного контроля (950) и всасывали в капилляр (полный объем 10 микролитров). Возвратно-поступательные движения с шагом 25 л над уступом выполняли, перемещая плунжер шприца Hamilton. Каждое движение сопровождалось перерывом переменной продолжительности, как указано в Таблице I (см. Таблицу I, колонка Непрямая). При завершении протокола суспензию клеток набирали в капилляр с целью визуального осмотра. В случае положительных реакций (960) агглютинированные комплексы клеток оседали в капилляре под действием силы тяжести, тогда как в случае отрицательных реакций (950) клетки оставались в суспензии (см. Фиг.9(D)). Величину агглютинации также количественно оценивали с помощью измерения поглощения света 970 в верхней половине трубки капилляра (см. Фиг.9(E)). 10X, 25X, 50X и 100X обозначают разведение образца.

	Прямая I	Прямая I	Непрямая
Вытеснение 25 л	Время вытеснения (секунд)
Вверх	5	5	5
Вниз	20	20	20
Вверх	10	10	10
Вниз	30	30	30
Вверх	15	15	15
Вниз	40	40	40
Вверх	Стоп	Стоп	20
Вниз			40
Вверх			25
Вниз			35

Перечень элементов для Фиг.1-10

100 Аналитический наконечник

104 Геометрические вертикальные оси аналитического наконечника

110 Впускное отверстие

120 Камера для образца

130 Боковая камера

140 Переходная зона

150 Камера детектирования

160 Впускное отверстие

170 Стенка аналитического наконечника

172 Электромагнитное излучение

176 Пропускаемый свет

180 Геометрические вертикальные оси боковой камеры

184 Излучатель или источник света

188 Датчик или фотодетектор

190 Угол между геометрической вертикальной осью аналитического наконечника и геометрической вертикальной осью боковой камеры

192 Внутренняя стенка - переходная зона

200 Частица

210 Направляющая сила

220 Внешняя стенка боковой камеры

230 Осадок частиц

240 Выступ

300 Положение поперечного сечения аналитического наконечника

310 Положение наблюдателя, смотрящего вниз на поперечное сечение аналитического наконечника

320 Вид поперечного сечения 320 из положения наблюдателя 310

410 Вертикальное движение жидкостей

420 Агглютинированные частицы

430 Перемещение вязкой жидкости

440 Поле течения

450 Сила тяжести

460 Поле скорости

470 Супернатант

480 Цикл 1

490 Цикл 2

492 Цикл 3

494 Переходная зона

498 Камера детектирования

510 Воздух, всасываемый из внутренних камер аналитического наконечника через отверстие 110

520 Всасывание образца

530 Направление движения реактива

540 Образец

550 Всасывание воздуха

554 Направление центробежной силы

556 Супернатант образца

558 Осадки частиц

560 Всасываемый образец

562 Направление

566 Супернатант образца

568 Положительное давление

570 Направление движения жидкостей

572 Отрицательное давление

574 Реактив для агглютинации.

578 Всасывание реактивов

580 Образец

582 Направление движения

584 Реактив для агглютинации

586 Приложение отрицательного или положительного давления

588 Вращательное перемешивание ресуспендированных клеток

590 Вращение аналитического наконечника

592 Приложение положительного или отрицательного давления

594 Всасывание или выпуск воздуха

595 Ресуспендированные неагглютинированные клетки

596 Приложение положительного давления воздуха

597 Агглютинированные клетки

598 Путь видимого света

610 Камера для образца

620 Переходная зона

630 Камера детектирования

640 Камера вытеснения

650 Образец

654 Вытеснение смеси

658 Стрелка

660 Поршень

662 Возвратно-поступательное движение образца и реактивов для агглютинации частиц

666 Вращательное перемешивание образца и реактивов

670 Реактив

680 Смесь образца и реактивов

690 Движение поршня

710 Установка хоботка

720 Уступ

730 Реактив

740 Воздушная прослойка

750 Отверстие для хоботка

760 Предварительно введенный реактив

770 Удаленный образец

780 Смесь образца и реактива

778 Деформируемая мембрана

780 Поршень

782 Аналитические наконечники

790 Разделение агглютинации

800 Блок аналитических наконечников

810 Блок поршней

820 Образец

830 Реактив(ы) для агглютинации

840 Смесь образца и реактивов для агглютинации

850 Приводной ремень

860 Направление движения наконечника-кюветы

870 Направление движения поршня

900 Прямая агглютинация (ABO)

910 Прямой вариант антиглобулина (IgG)

920 Поглощение в зависимости от положения

930 Поглощение

940 Положение столбика жидкости (снизу вверх)

950 Отрицательная клетка Selectogen (-)

960 Положительная клетка Selectogen (+)

970 Интеграл поглощения

980 Время в секундах

982 Положительный (Тип A),

984 Отрицательный (Тип A),

986 Положительный (реактив Кумбса)

990 Отрицательный (Тип B)

992 Капилляр

996 Шланг

1000 Диск инкубатора

1002 Направление колебательного движения

1004 Смещенные от центра диски приводных насосов в наконечнике

1008 Свет

Хотя настоящее изобретение было конкретно показано и описано со ссылками на предпочтительные варианты его осуществления, квалифицированным специалистам в данной области техники будет очевидно, что в представленных вариантах осуществления могут быть сделаны различные изменения формы и деталей, без отступления от предполагаемого объема изобретения, охватываемого следующей прилагаемой формулой изобретения.