способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением, включающий отбор венозной крови, проведение аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда и анализа кривой плавления, определение генотипов полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A, выявление аллеля А полиморфизмов rs2414096 и rs749292, при наличии которого прогнозируют риск нарушения фертильности у мужчин с ожирением.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для прогнозирования нарушения фертильности мужчин с ожирением.

Известен способ определения фертильности мужчин (RU 2052202 C1, Посисеева и др., 10.01.1996). В спермальной жидкости исследуют содержание термостабильного альфа-1-гликопротеина и при уровне последнего выше 16 мкг/мл диагностируют сниженную фертильность спермы. Описан также способ диагностики ранних нарушений репродуктивной функции у мужчин (RU 2413949 C1, Тарасова и др., 10.03.2011). В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют концентрации цитокинов IL-8, IL-10 и IL-1RA, затем вычисляют диагностический индекс DI. При DI более 0 диагностируют ранние нарушения репродуктивной функции у мужчин, а при DI менее 0 делают заключение об отсутствии лабораторных признаков нарушений мужской репродуктивной функции. Однако указанные способы не предполагают выявления группы риска развития бесплодия у мужчин с ожирением.

В изобретении (RU 2342660 C2, Семенов, 27.12.2008) описан способ прогнозирования нарушений фертильности у мужчин. Путем проточной цитометрии спермы исследуют соотношение лимфоцитов с фенотипом CD25+ и CD95+. При его значениях менее 0,71 и более 1,20 прогноз фертильности признается неблагоприятным. Однако и этот способ не позволяет выявить группу риска развития бесплодия среди мужчин с ожирением.

Наиболее близким к патентуемому, является способ прогнозирования нарушения фертильности спермы у мужчин в виде астенозооспермии, в котором исследуют периферическую кровь посредством анализа генов (RU 2314530 C1, Фетисова и др., 10.01.2008 - прототип). На выделенной из лимфоцитов ДНК амплифицируют фрагменты генов глутатион-S-трансфераз M1 и Р1. При выявлении одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С и GSTP1 С/С прогнозируют риск развития астенозооспермии. Однако указанный способ дает возможность определить только нарушение подвижности сперматозоидов и не касается морфологии и концентрации.

Вместе с тем известно, что бесплодие развивается не у всех мужчин с ожирением. Одним из возможных факторов, который может объяснить гормональные изменения у мужчин с ожирением, а также различия во влиянии ожирения на конкретного индивидуума, является полиморфизм гена ароматазы, который ответственен за превращение тестостерона в эстрадиол в различных тканях организма, в том числе и жировой ткани (см. обзор литературы в ст. Гамидова С.И и др. в ж. Проблемы репродукции, 2010, N 6, с.79-88). Показано существование полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1, который локализуется в хромосоме 15q21.2. Доказано, что у мужчин с большей частотой повторов ТТТА концентрация эстрадиола в сыворотке крови была значительно выше и зависела от веса. Кроме того, показано, что только мужчины с большей частотой повторов ТТТА в гене ароматазы CYP19A1 имеют шанс снижения уровня эстрадиола после похудения (Hammoud A et al. An aromatase polymorphism modulates the relationship between weight and estradiol levels in obese men. Fertil steril; 2009; 10: 37).

M.R. Sowers и соавт. (Sowers M.R. et al. Aromatase gene (CYP 19) polymorphisms and endogenous androgene concentrations in a multiracial/multiethnic, multisite study of women at midlife. Am J Med. 2006 Sep; 119 (9 Suppl 1): S 23-30)) изучали связь полиморфизма гена ароматазы с концентрацией андрогенов у женщин среднего возраста. Проанализированы пять однонуклеотидных полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 (rs2414096, rs936306, rs2446405, rs1008805, rs749292). Три из пяти полиморфизмов были связаны с изменениями концентрации андрогенов. Однако прямая корреляция связи полиморфизмов указанного гена с фертильностью у мужчин с ожирением в литературе не описана.

Задачей настоящего изобретения является поиск критериев прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением, в чем и состоит технический результат изобретения.

Патентуемый способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением включает отбор венозной крови, проведение аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда и анализа кривой плавления, определение генотипов полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A, выявление аллеля А полиморфизмов rs2414096 и rs749292, при наличии которого прогнозируют риск нарушения фертильности у мужчин с ожирением.

Для определения роли полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 в развитии бесплодия у мужчин с ожирением было обследовано 85 мужчин с ожирением, которым производилось генетическое исследование. Описание полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 приведено в табл.1.

Таблица 1
Полиморфизмы гена ароматазы CYP19A1
Полиморфизм	Замена	Позиция в хромосоме	Локализация в гене
rs2414096	A>G	15q21.1: 51529779	Интрон
rs749292	A>G	15q21.1: 51558731	Интрон
rs936306	C>Т	15q21.1: 51579598	3'UTR

Обследованные мужчины с ожирением были разделены на две группы. В основную группу (группа 1) были включены 50 мужчин с ИМТ более 30 кг/м² и идиопатической патозооспермией; в контрольную группу (группа 2) были включены 35 фертильных пациентов с ИМТ более 30 кг/м².

Сравнительный анализ пациентов двух групп не выявил статистически достоверных различий в антропометрических показателях, наличии или отсутствии вредных привычек.

Данные, представленные в табл.2, обосновывают наличие связи бесплодия у мужчин с ожирением и присутствием аллеля А полиморфизма rs2414096. У мужчин с ожирением и бесплодием почти в 2 раза чаще, чем у фертильных мужчин, выявляется носительство гомозиготного генотипа АА. Встречаемость аллеля А у бесплодных мужчин составила 60% по сравнению с 42,9% в контрольной группе (p=0,027). Риск развития бесплодия (OR) у мужчин с ожирением при наличии у них аллеля А в геторо- или гомозиготной форме составил 2,0 (95% ДИ: 1,1-3,7).

Таблица 2
Частота полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1
Генотип	Фертильные		Бесплодные
	количество	%	количество	%
АА	7	20,00	19	38,00
AG	16	45,70	22	44,00
GG	12	34,30	9	18,00
Частота аллелей
А	30	42,90	60	60,00*
G	40	57,10	40	40,00
Примечание: * - достоверность различия p=0,027.

Аналогичная ассоциация была обнаружена также и для полиморфизма rs749292. У бесплодных мужчин с ожирением гомозиготный генотип АА встречался в 1,7 раз чаще, чем у мужчин контрольной группы (38,0% и 22,9%, соответственно). Риск развития бесплодия при наличии аллеля А полиморфизма rs749292 составил 1,92 (95% ДИ: 1,04-3,55). Данные о частоте полиморфизма rs749292 в группах представлены в табл.3.

Таблица 3
Частота полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1
Генотип	Фертильные		Бесплодные
	количество	%	количество	%
АА	8	22,9	19	38
AG	14	40	21	42
GG	13	31,1	10	20
Частота аллелей
А	30	42,9	59	59,0*
G	40	57,1	41	41,0
Примечание: * - достоверность различия p=0,038.

Частота аллелей С и Т полиморфизма rs936306 у бесплодных и фертильных мужчин с ожирением была практически одинаковой: 81,4 и 18,6% у фертильных пациентов и 83,0 и 17,3% у пациентов с идиопатическим бесплодием. Данные о частоте полиморфизма rs936306 в группах представлены в табл.4.

Таблица 4
Частота полиморфизма rs936306 в группах
Генотип	Фертильные		Бесплодные
	количество	%	количество	%
СС	23	65,7	35	70
СТ	11	31,4	13	26
ТТ	1	2,9	2	4
Частота аллелей
С	57	81,4	83	83,0
Т	13	18,6	17	17,0

После определения частоты встречаемости полиморфизмов гена ароматазы и их связи с развитием бесплодия у мужчин с ожирением нами проведено сравнение показателей спермограммы и уровня гормонов у пациентов основной группы в зависимости от генотипа полиморфизма гена ароматазы rs2414096 и rs749292, т.е. тех полиморфизмов, для которых была выявлена связь с развитием бесплодия у мужчин с ожирением.

При обследовании пациенты с полиморфизмом rs749292 гена ароматазы CYP19A1 были разделены нами в зависимости от генотипа: генотип АА (19 мужчин), генотип AG (21 мужчина) и генотип GG (10 мужчин).

При математической обработке данных у пациентов с генотипом АА уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона были достоверно ниже, чем аналогичные показатели гормонов у пациентов с генотипами AG и GG. Средний уровень эстрадиола оказался выше у пациентов с генотипом АА (p<0,05). Вышеописанные данные представлены в табл.5.

Таблица 5
Уровни гормонов в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1
Гормон	Генотип АА (N=19)	Генотип AG (N=21)	Генотип GG (N=10)
ЛГ, мЕд/мл	2,8±0,2*	4,0±0,3	4,9±0,5
ФСГ, мЕд/мл	3,1±0,3*	6,1±0,5	6,0±0,7
ТТГ, мЕд/л	2,4±0,2	2,0±0,2	1,9±0,3
Тироксин, нмоль/л	96,1±4,8	103,8±4,3	93,8±6,8
Эстрадиол, пмоль/л	134,9±3,7*	97,2±4,4	86,8±5,2
Прогестерон, нмоль/л	1,4±0,1	1,3±0,1	1,2±0,2
Пролактин, мЕд/л	253,4±25,9	244,7±21,9	222,6±26,5
Тестостерон, нмоль/л	11,1±0,7*	17,2±0,9	20,1±1,0
Кортизол, нмоль/л	305,6±28,2	352,0±30,0	388,5±37,3
Лептин, нг/мл	13,6±1,3	12,6±1,0	10,5±1,2
Примечание: * - p<0,05 при сравнении показателей гормонов у пациентов в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1.

При анализе особенностей показателей спермограммы у мужчин с ожирением и идиопатической патозооспермией в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1 были обнаружены следующие особенности. Все три группы были сопоставимы по объему эякулята и подвижности сперматозоидов (p>0,05). В то же время, концентрация сперматозоидов у мужчин с генотипом АА была достоверно ниже, чем у мужчин с генотипом GG, а показатели концентрации сперматозоидов у мужчин с генотипом AG являлись промежуточными. Аналогичная ситуация была отмечена при анализе количества нормальных форм сперматозоидов - 14,1±1,3% и 20,8±2,5% соответственно (p<0,05) (см. табл.6).

Таблица 6
Показатели спермограммы в зависимости от генотипа полиморфизма гена ароматазы rs749292
Показатели спермограммы	Генотип АА (N=19)	Генотип AG (N=21)	Генотип GG (N=10)
Объем эякулята, мл	3,2±0,2	2,9±0,2	2,6±0,2
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	34,8±7,9	42,3±8,3	46,8±9,1*
Подвижность категория А, %	11,2±1,1	12,7±1,2	13,5±1,5
Подвижность категория А+В, %	26,7±2,0	30,1±2,1	31,5±3,2
Морфология, %	14,1±1,3	18,3±2,1	20,8±2,5*
Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА и GG полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1.

При оценке гормонального профиля у мужчин с идиопатической патозооспермией и ожирением, в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1, получены результаты, которые представлены в табл.7.

Таблица 7
Уровни гормонов в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1
Гормон	Генотип АА (N=19)	Генотип AG (N=22)	Генотип GG (N=9)
ЛГ, мЕд/мл	2,5±0,2*	4,3±0,2	4,7±0,6
ФСГ, мЕд/мл	2,5±0,2*	6,4±0,4	6,1±0,8
ТТГ, мЕд/л	2,3±0,2	2,2±0,2	1,8±0,3
Тироксин, нмоль/л	98,9±4,8	99,6±4,4	96,9±7,0
Эстрадиол, пмоль/л	137,9±2,8*	96,9±3,7	84,8±6,4
Прогестерон, нмоль/л	1,4±0,1	1,4±0,1	1,2±0,2
Пролактин, мЕд/л	255,4±27,5	242,4±20,5	223,3±27,3
Тестостерон, нмоль/л	11,2±0,8*	17,0±0,9	20,1±1,3
Кортизол, нмоль/л	318,5±30,0	342,8±27,3	386,7±42,9
Лептин, нг/мл	14,5±1,3	11,4±0,9	11,7±1,3
Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА с генотипами AG и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1

При математической обработке данных у пациентов с генотипом АА уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона были достоверно ниже, чем аналогичные показатели гормонов у пациентов с генотипами AG и GG. Средний уровень эстрадиола оказался выше у пациентов с генотипом АА (р<0,05).

Данные спермиологического исследования при анализе влияния генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1 представлены в табл.8.

Таблица 8
Показатели спермограммы в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1
Показатели спермограммы	Генотип АА (N=19)	Генотип AG (N=22)	Генотип GG (N=9)
Объем эякулята, мл	3,2±0,2	2,8±0,2	2,8±0,3
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	38,3±6,7	42,9±8,4	52,5±12,6*
Подвижность сперматозоидов (категория А), %	11,0±1,0	12,1±1,5	14,3±1,1
Подвижность сперматозоидов (категория А+В), %	25,0±1,9	27,1±2,3	33,3±2,2*
Морфология, %	13,0±1,2	18,0±1,2	23,2±4,2 **
Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1;
** - p<0,05 при сравнении генотипа АА с генотипами AG и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1.

У пациентов с генотипом АА этих полиморфизмов уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона достоверно выше, чем у мужчин с генотипами AG и GG. Одновременно с этим, у мужчин с генотипом АА отмечаются более высокие показатели эстрадиола.

При оценке показателей спермограммы у пациентов с гомозиготной формой полиморфизмов гена ароматазы rs2414096 и rs749292 отмечается снижение концентрации сперматозоидов и количества сперматозоидов с активной подвижностью (категория А и А+В) в эякуляте. Кроме этого, у пациентов с генотипом АА полиморфизма гена ароматазы rs2414096 достоверно ниже содержание в эякуляте количества сперматозоидов с нормальным строением (морфология).

При наличии генотипа АА полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A1 происходит более активная ароматизация тестостерона в эстрадиол, что приводит к относительному снижению концентрации тестостерона и соответствующему повышению уровня эстрадиола, что в свою очередь приводит к снижению ФСГ и ЛГ, при этом замыкается порочный круг, так как снижение концентрации ЛГ уменьшает выработку тестостерона клетками Лейдига. Эти гормональные сдвиги и приводят к снижению сперматогенеза, особенности изменения которого описаны выше.

Таким образом, представленные экспериментальные данные доказывают достижение технического результата: выявлена связь бесплодия у мужчин с ожирением с присутствием аллеля А полиморфизмов rs749292 и rs2414096, которая может использоваться в качестве прогностического критерия риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением.