штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности

Формула изобретения

Штамм микромицета Aspergillus oryzae, депонированный в ГНУ ВНИИСХМ (Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения - RCAM) под регистрационным номером RCAM01135, - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению штамма - продуцента протеолитических и амилолитических ферментов, и может быть применено для гидролиза растительных и животных субстратов в пищевой промышленности, бродильных производствах, сельском хозяйстве.

Известно, что мицелиальный гриб Aspergillus oryzae имеет широкое применение в пищевой промышленности, так как не обладает патогенными свойствами. Биосинтез протеаз и амилаз, характерный для представителей Aspergillus oryzae, используется, например, при изготовлении некоторых пищевых продуктов (ферментированных приправ, ферментированных напитков), когда требуется гидролиз белков и углеводов (RU 2361914, 2009, RU 2187947, 2002).

Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-369, обладающий способностью продуцировать комплекс протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне pH, -амилазу. Однако основным недостатком этого штамма является отсутствие синтеза сопутствующих гидролаз, а также длительный период роста и развития микромицета; штамм интенсивно продуцирует -амилазу и протеазу на жидких средах лишь на четвертые - пятые сутки (SU 1440922, 1988).

Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-683, продуцирующий комплекс кислых и слабокислых протеаз, -амилазы и сопутствующих ксиланаз, глюканаз и цитаз. Известно, что при глубинном культивировании данный штамм продуцирует целый комплекс высокоактивных ферментов. Получаемые ферментные комплексы применяются в пищевой промышленности.

Однако применение штамма является ограниченным из-за недостаточно высокой скорости роста и особых требований к питательным средам, так как он растет на средах с содержанием сухих веществ не более 18% (RU 2070921, 1996).

Задача изобретения состоит в получении штамма Aspergillus oryzae, продуцирующего протеазы и -амилазу, обладающего высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании.

В качестве изобретения предлагается новый штамм микромицета Aspergillus oryzae 37-53, полученный методом многоступенчатой селекции и мутагенеза, депонированный в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под регистрационным номером RCAM01135. Штамм является продуцентом протеаз и -амилазы, обладает высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании, и интенсивным спорообразованием.

Техническим результатом изобретения является более высокая скорость роста предлагаемого штамма Aspergillus oryzae RCAM01135.

В частности, на средах с соевым шротом максимумы протелитической и амилолитической активностей проявляются на третьи сутки культивирования, и интенсивность спорообразования была самой высокой также на третьи сутки. Это позволяет рассматривать заявленный штамм как перспективное средство для использования в пищевой промышленности для переработки сельскохозяйственного сырья, например сои, с целью получения различных пищевых вкусоароматических добавок, в бродильном производстве, хлебопекарной промышленности.

Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

а) характер роста (опушение, край колонии). Колонии пушистые, округлой формы, края ровные, мицелий белый, спорообразующий, цвет колонии от оливкового до темно-зеленого. Вегетативный мицелий септированный, хорошо разветвленный с крупными вздутиями, толщина гиф 6-12 мкм; конидии формируются экзогенно, поверхность конидии гладкая, форма округлая, диаметр спор 5-6 мкм; образует конидиальные головки с одноярусными стеригмами;

б) размер колонии (при определенном времени инкубации). На 3 сутки роста на сусло-агаре диаметр колонии 50×51 мм;

в) воздушный мицелий (наличие, цвет, особенности спороношения). С обильным спороношением темно-зеленого цвета. По краю колонии белый пушистый мицелий 3 мм;

г) цвет субстратного мицелия. Белый;

д) цвет обратной стороны колонии. Светло-коричневый;

е) другие признаки (пигмент, экссудат и т.д.). Пигменты не выделяются, экссудат отсутствует;

ж) изменения культуры по мере старения. Цвет колонии с возрастом темнеет, становится буро-зеленым;

з) поведение на других средах. На среде Чапека с глюкозой: на 3 сутки роста цвет колонии - зеленый, поверхность гладкая; диаметр колонии 32×34 мм.

По исследованиям морфологических признаков культуры проведена идентификация штамма в соответствии с определителем мицелиальных грибов (Билай В.И., Коваль Э.С. Аспергиллы. Определитель. - Киев: Наук. Думка, 1988, - 204 с.).

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста - 28-30°C. Максимальная температура - 50°C. Минимальная температура - 18°C. Оптимальное значение pH для роста гриба - 5,5. Рост гриба отмечается в диапазоне pH от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин и лактозу. Ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки. Штамм не патогенный. В режиме глубинного и твердофазного культивирования была установлена способность к синтезу ферментов амилолитического и протеолитического действия.

Штамм хранится на агаризованном солодовом сусле 8% CB; pH среды - естественный; температура хранения +20-25°C.

Пример 1

Глубинное и твердофазное культивировстие штамма Aspergillus oryzae RCAM01135

Глубинное культивирование штамма Aspergillus oryzae 37-53 осуществляли на различных комплексных естественных средах, составленных с учетом физиологических потребностей продуцента. При конструировании питательных сред принимали во внимание то обстоятельство, что для синтеза протеаз и -амилазы благоприятны крахмал, белки, поэтому основными компонентами среды являлось зерновое сырье. В качестве источника фосфорного питания для микромицета применяли фосфорнокислый калий. Таким образом, для глубинного культивирования штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 были использованы питательные среды следующего состава, %:

1. Ячменная мука - 3,0, пшеничные отруби - 3,0, крахмал - 2,0, KH₂PO₄ - 1,5;

2. Пшеничная мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH₂PO₄ - 1,5%;

3. Соевая мука - 6,0, ячменная мука - 5,0, KH₂PO₄ - 1,5;

4. Соевая мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH₂PO₄ - 1,5;

Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³ стерильной питательной среды, на круговой качалке с числом оборотов 220 об/мин при температуре 30°C. Полученные результаты представлены в табл.1.

Таблица 1
Глубинное культивирование гриба Asp.oryzae RCAM01135 на натуральных питательных средах
№ среды	Сутки	Рост (густота, цвет КЖ)	pH	РСВ, %	Ферм, акт-сть, ед./см3
					ПС	АС
1	1	++бежевая каша	4,74	4,0	-	-
	2	+хаки (желтоватая) каша	4,8	2,8	1,5	0,64
	3	+хаки (желтоватая) жижа	5,36	2,2	1,8	0,82
2	1	++++бежевая каша	5,09	3,0	-	-
	2	++хаки (желтоватая) каша	5,42	2,0	1,3	0,93
	3	++хаки светлая жижа	5,6	2,2	1,5	1,10
3	1	+++++очень густая бежевая каша	5,69	5,0	-	-
	2	темная бежевая каша	7,6	5,0	0,05	0,35
	3	++++хаки темная каша	8,46	5,4	0,03	0,56
4	1	+++++густая бежевая каша	7,10	5,0	-	-
	2	темная бежевая каша	8,33	4,9	0,06	0,35
	3	+++хаки темная каша	8,73	5,4	0,02	0,12

Как видно из таблицы 1, селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 на питательных средах, содержащих ячменную или пшеничную муку, а также пшеничные отруби (среды № 1 и 2), проявлял способность к синтезу протеаз и -амилазы: общая протеолитическая активность на 3-и сутки культивирования составила 1,5-1,8 ед. ПС/см³, амилолитическая 0,82-1,10 ед. АС/см³. На средах, в состав которых входила соеваая мука (среды № 3 и 4), уровень активности синтезируемых ферментов снижался в 2-3 раза.

Твердофазное культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на пшеничных отрубях с влажностью 52,4% и на соевом шроте с влажностью 51,8% при температуре 30°C в стационарных условиях. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2
Поверхностное культивирование гриба A.oryzae RCAM01135 на различных средах
Среда для культивирова ния	Характеристика роста гриба, сутки			Ферментативная активность, ед./г
	2	4	7	ПС	АС
Отруби	Белый мицелий, начало спорообразования, цвет спор зеленый	Обильное спорообразование, споры пылят, цвет зеленый с оливковым оттенком	Без изменений	43,5	9,0
Соевый шрот	1	2	3	41,0	12,0
	Белый мицелий	Обильное спорообразование, цвет спор зеленый с оливковым оттенком	Обильное спорообразование, споры оливкового цвета

Результаты глубинного и твердофазного культивирования подтверждают биосинтетическую способность селекционированного штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 по отношению к протеолитическим и амилолитическим ферментам, что характерно грибам рода Aspergillus вида oryzae.

Таким образом, полученный штамм хорошо развивается на жидких и твердых питательных средах, синтезирует ферменты протеолитического и амилолитического действия и идентифицирован как мицелиальный гриб Aspergillus oryzae.

Пример 2

Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 на средах с соевым шротом

Наработку экспериментальных образцов селекционированной культуры Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на среде с соевым шротом и на соевом шроте с добавлением 10% перловки с разной влажностью в течение 3-х суток при 30°C (табл.3).

Таблица 3
Биохимическая характеристика экспериментальных образцов гриба A.oryzae RCAM01135
Среда для культивирова ния	Влажность поверхн. культуры, %	Биохимические показатели гриба
		Белок по Кьельдалю, % а.с.в.	Белок по Лоури, мг/г а.с.в.	мг%/г а.с.в.
Соевый шрот	58,7	43,0	35,0	317,0
Соевый шрот +10% перловки	51,3	41,0	52,8	309,7
	62,4	44,3	58,3	322,5

Экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были получены в результате ускоренного роста микромицета при поверхностном культивировании на соевом шроте, обогащены белком, аминным азотом и могут быть использованы для дальнейшей переработки в производстве продуктов ферментации сои.

Селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 и наработанные экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были исследованы в Испытательной лаборатории технохимического контроля и арбитражных методов анализа ГНУ ВНИИПБТ Россельхоакадемии.

Результаты испытаний по идентификации ГМИ показали, что в чистой культуре микромицета Aspergillus oryzae RCAM01135 трансгенные последовательности отсутствуют (протокол испытаний от 23 марта 2012 г.).

При анализе тяжелых металлов в экспериментальных образцах гриба A. oryzae RCAM01135 было установлено, что их содержание не превышает предельно допустимых концентраций (протокол от 18 апреля 2012 г.). В таблице 4 приведены результаты анализа по содержанию тяжелых металлов в субстрате - соевом шроте и в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135. Аналогичные результаты получены во всех исследуемых экспериментальных образцах.

Таблица 4
Содержание тяжелых металлов в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135
Анализируемый объект	Содержание тяжелых металлов, мг/кг
	Свинец Pb	Мышьяк As	Кадмий Cd	Ртуть Hg
Соевый шрот	0,0052	0,0034	0,0027	0,0009
(ПДК для сои)1 (1 СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»)	0,5	0,3	0,1	0,02
Поверхностная культура гриба A.oryzae 37-53	0,0065	0,0047	0,0029	0,0014