способ изотопного обогащения клеток e.coli
Классы МПК: | C12N1/20 бактерии; питательные среды для них C12N1/38 химическая стимуляция роста или активности путем введения химических соединений, не являющихся существенными факторами роста; стимуляция роста путем удаления химического соединения |
Автор(ы): | Шевченко Ульяна Григорьевна (RU), Карандашев Василий Константинович (RU), Авдеева Елена Ивановна (RU), Бердинский Виталий Львович (RU), Алиджанов Эскендер Куртаметович (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургский государственный университет" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-04-23 публикация патента:
20.11.2013 |
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов. Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния предусматривает культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния 24Mg или 25Mg, или 26Mg. Водный раствор включает NH4Cl, глюкозу, Na2HPO4 , KH2PO4, NaCl и MgSO4 при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды: NH4 Cl - 2 г, MgSO4 - 200-260 мг, глюкоза (сухая) - 8-10 г, Na2HPO4 - 11,9-12,1 г, KH2 PO4 - 5,95-6,05 г, NaCl - 0,98-1,02 г. Изобретение обеспечивает эффективное замещение природного внутриклеточного магния клеток E.coli соответствующим изотопом. 5 табл.
Формула изобретения
Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния, предусматривающий культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния 24Mg, или 25Mg, или 26Mg, включающем NH4Cl, глюкозу, Na2HPO4, KH 2PO4, NaCl и MgSO4, при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды:
NH4Cl | 2 г |
MgSO4 | 200-260 мг |
глюкоза (сухая) | 8-10 г |
Na 2HPO4 | 11,9-12,1 г |
KH4PO4 | 5,95-6,05 г |
NaCl | 0,98-1,02 г |
Описание изобретения к патенту
Способ изотопного обогащения клеток E.coli относится к микробиологии, энзимологии для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов.
Известен способ изотопного обогащения (патент РФ № 2399409, опубл. 20.09.10), содержащий стадию осуществления изотопного обмена между водным раствором, содержащим, по меньшей мере, два компонента, каждый из которых представлен формулой H2O-H2SiF6·nSiF4 (где n 0), и газом, содержащим SiF4, для обогащения стабильного изотопа Si. Возможно, что SiF4 растворяют в водном растворе до состояния насыщения, а также, что водный раствор имеет азеотропный состав.
Недостатком данного способа является невозможность его использования для обогащения клеток E.coli, т.к. данный раствор не содержит питательных веществ для бактерий и не имеет pH=6.5-7.5, при котором растут и размножаются клетки.
Техническим результатом заявляемого способа изотопного обогащения клеток E.coli является эффективное замещение природного внутриклеточного магния соответствующим изотопом.
Задача решается тем, что в способе изотопного обогащения клеток E.coli, содержащего стадию изотопного обмена между клетками E.coli и водным раствором, отличающийся тем, что изотопный обмен между клетками E.coli и водным раствором осуществляют в течение 10-16 часов при температуре 37°C, причем в водный раствор, обогащенный по одному из изотопов магния 24Mg, 25Mg, 26Mg, входят NH4Cl, глюкоза, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl и MgSO4, при следующем содержании на 1 л дистиллированной воды:
NH4Cl - 2 г;
MgSO 4 - 200-260 мг;
глюкоза (сухая) - 8-10 г;
Na2HPO4 - 11,9-12,1 г;
KH2PO4 - 5,95-6,05 г;
NaCl - 0,98-1,02 г.
Способ изотопного обогащения клеток E.coli осуществляли следующим образом.
Музейный штамм Escherichia coli K12TG1 предварительно инкубировался в Lb-бульоне (производства Sigma Aldrich Co.), который содержит природный магний, в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее трижды производился посев микроорганизмов исходной концентрации 105 KOE/мл в синтетическую питательную среду М9 - водный раствор с разной концентрацией 6 компонентов на 1 л дистиллированной воды.
Первый водный раствор:
NH 4Cl - 2 г; MgSO4 - 200 мг; глюкоза (сухая) - 8 г; Na2HPO4 - 11,9 г; KH2PO 4 - 5,95 г; NaCl - 0,98 г.
Второй водный раствор:
NH4Cl - 2 г; MgSO4 - 230 мг; глюкоза (сухая) - 9 г; Na2HPO4 - 12 г; KH2PO4 - 6 г; NaCl - 1 г.
Третий водный раствор:
NH4Cl - 2 г; MgSO4 - 260 мг; глюкоза (сухая) - 10 г; Na2 HPO4 - 12, 1 г; KH2PO4 - 6,05 г; NaCl - 1,02 г.
Первые три вещества, NH 4Cl, глюкоза (сухая) и MgSO4, входят в питательный раствор, необходимый для поддержания жизнеспособности клеточной культуры и ее роста, требуемого для накопления изотопно-обогащенной магнием клеточной биомассы. Последние три вещества, Na2 HPO4, KH2PO4 и NaCl, являются буферным раствором, который поддерживает pH=6.5-7.5 среды. Два раствора готовятся отдельно, стерилизуют в автоклаве 25 минут при давлении 1,5-2 атм. После автоклавирования растворы сливаются; pH контролируют до и после стерилизации. Изотопы магния добавляют в среду в виде сульфата магния MgSO4, концентрация которого составляет 2.2 мМ/л. Характеристики существующих в природе стабильных изотопов магния и их природное содержание приведены в таблице 1.
Таблица 1 | ||
Изотоп | Магнитный момент (µв) | Природное содержание, % |
24Mg | 0 | 79 |
25Mg | 0.85 | 10 |
26Mg | 0 | 11 |
Для приготовления сульфатов использовались изотопно-чистые оксиды 24MgO, 25MgO и 26MgO производства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно. Паспортные данные оксидов изотопов магния приведены в таблицах 2-3.
Таблица 2 | |||
Содержание изотопа магния, ат.% | |||
Изотоп | для 24MgO | для 26 MgO | для 25MgO |
24Mg | 99,88±0,02 | 97,70±0,20 | 99,37±0,08 |
25Mg | 0,07 | 1,98 | 0,33 |
26Mg | 0,05 | 0,20 | 0,30 |
Таблица 3 | |||
Содержание примесей, вес.% | |||
Элемент | для 24MgO | для 26 MgO | для 25MgO |
K | <0,005 | <ПО | 0,017 |
Na | 0,002 | <ПО | 0,004 |
Ca | <0,005 | 0,008 | 0,34 |
Fe | <0,005 | 0,019 | 0,048 |
Al | 0,0011 | 0,0008 | 0,031 |
Si | <0,005 | <ПО | <0,005 |
Cr | - | <ПО | 0,0030 |
Ni | 0,0001 | <0,0002 | <0,0001 |
Cu | 0,0029 | 0,0021 | 0,0004 |
Mn | 0,0032 | 0,0021 | 0,059 |
Pb | <ПО* | <ПО | 0,0015 |
Lu | <ПО | <ПО | 0,0003 |
Pt | <ПО | 0,0031 | 0,0002 |
B | <ПО | 0,008 | 0,0026 |
Ti | <ПО | <ПО | 0,0015 |
Co | <ПО | <ПО | 0,0011 |
Sr | <ПО | <ПО | 0,0002 |
Ba | <ПО | 0,0003 | 0,0002 |
La | <ПО | <ПО | 0,0003 |
Eu | <ПО | <ПО | 0,0002 |
Zn | 0,0006 | 0,0005 | 0,0009 |
Ru | <ПО | 0,0001 | <ПО |
Cd | <ПО | 0,0001 | <ПО |
P | <0,005 | <ПО | <ПО |
Контроль соотношения изотопов магния, содержащихся в питательной среде М9, осуществлялся с помощью масс-спектрометрического анализа. Соотношение изотопов магния для сред М9 в % приведено в таблице 4.
Таблица 4 | |||
Изотоп | Среда М9 с 24Mg | Среда М9 с 25Mg | Среда М9 с 26Mg |
24Mg | 99,7 | 1,4 | 4,5 |
25Mg | 0,12 | 98,1 | 0,61 |
26Mg | 0,13 | 0,5 | 94,9 |
В подготовленные таким образом водные растворы производили посев микроорганизмов с начальной концентрацией 105 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл раствора). После этого образцы выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 10, 13 и 16 часов. Контроль накопления клеточной биомассы осуществлялся с помощью стандартных методов измерения оптической плотности суспензии микроорганизмов и измерения колониеобразующих единиц. При достижении бактериями плотности популяции 108-10 9 КОЕ/мл или 0,6-0.7 отн. ед. оптической плотности клеточная биомасса осаждалась методом центрифугирования на 15 тыс. об. в течение 15 минут. После производился двукратный отмыв клеточной биомассы бактерий E.coli дистиллированной водой с повторным центрифугированием.
Полученная таким образом клеточная биомасса исследовалась на содержание изотопов магния масс-спектральным (PlasmaQuad 2, VG Elemental, Англия) и атомно-эмиссионным методами (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США). Клеточная биомасса предварительно подвергалась лиофильной сушке и автоклавному разложению. Данные по соотношению изотопов магния в клетках E.coli после цикла культивирования на изотопных средах М9 приведены в таблице 5.
Таблица 5 | |||||||||||
Изотоп | Исход-ная куль тура | Выдержка в термоста-те, час. | Клетки, выращенные на среде М9 с 24Mg | Клетки, выращенные на среде М9 с 25Mg | Клетки, выращенные на среде М9 с 26Mg | ||||||
1-й водный р-р | 2-й водный р-р | 3-й водный р-р | 1-й водный р-р | 2-й водный р-р | 3-й водный р-р | 1-й водный р-р | 2-й водный р-р | 3-й водный р-р | |||
24Mg | 87,8 | 10 | 90,8 | 94,5 | 95,1 | 5,9 | 6,3 | 6,1 | 12,5 | 9,8 | 9,8 |
13 | 91,1 | 99,5 | 99,4 | 6,0 | 6,6 | 6,5 | 10,4 | 10,0 | 9,9 | ||
16 | 93,5 | 99,5 | 99,5 | 6,2 | 6,6 | 6,5 | 9,7 | 10,0 | 10,0 | ||
25Mg | 5,9 | 10 | 6,2 | 3,5 | 3,4 | 90,2 | 91,9 | 91,3 | 2,1 | 3,3 | 3,7 |
13 | 5,8 | 0,23 | 0,22 | 91,9 | 92,5 | 92,1 | 2,0 | 1,6 | 2,6 | ||
16 | 4,7 | 0,24 | 0,23 | 92,3 | 92,5 | 92,4 | 2,2 | 1,6 | 1,7 | ||
26 Mg | 6,3 | 10 | 3,0 | 2,0 | 1,4 | 3,9 | 1,8 | 2,6 | 85,4 | 86,9 | 86,5 |
13 | 3,1 | 0,23 | 1,5 | 2,1 | 0,87 | 1,4 | 87,6 | 88,4 | 87,5 | ||
16 | 1,8 | 0,22 | 0,22 | 1,5 | 0,87 | 1,1 | 88,1 | 88,4 | 88,3 | ||
* Погрешность определения от 1.2% отн. для 95%; до 15% для 0.5% |
После 10-16 часов культивирования на магний-изотопных средах, в течение которых происходил изотопный обмен между клетками и водным раствором, бактерии были обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 по сравнению с исходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из второго столбца данных таблицы 5. Цикл культивирования бактерий на питательных средах М9, содержащих изотопы магния, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп.
Используемый способ изотопного обогащения микроорганизмов в присутствии магнитного и немагнитных изотопов магния оказался уникальным и применяется впервые. Данный способ может использоваться для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов, который найдет свое применение в различных исследовательских работах в микробиологии, энзимологии. Кроме того, он может использоваться в различных медицинских и биотехнологических приложениях как простой и нетрудоемкий способ получения изотопно-обогащенных биомолекул (АТФ, ДНК и т.д.), клеточных подструктур и самих клеток. Немаловажно, что подобные выделенные молекулы и клеточные подструктуры нерадиоактивны, так как для изотопного обогащения используются только стабильные изотопы. Данный способ может быть модифицирован для других стабильных изотопов жизненно важных химических элементов, а также для других микроорганизмов.
Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ изотопного обогащения клеток E.coli позволяет эффективно проводить до 90% изотопный обмен между природным магнием, изначально содержащимся в клетках, и изотопом магния из водного раствора.
Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
Класс C12N1/38 химическая стимуляция роста или активности путем введения химических соединений, не являющихся существенными факторами роста; стимуляция роста путем удаления химического соединения