способ изотопного обогащения клеток e.coli

Классы МПК:C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
C12N1/38 химическая стимуляция роста или активности путем введения химических соединений, не являющихся существенными факторами роста; стимуляция роста путем удаления химического соединения
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургский государственный университет" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-04-23
публикация патента:

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов. Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния предусматривает культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния 24Mg или 25Mg, или 26Mg. Водный раствор включает NH4Cl, глюкозу, Na2HPO4 , KH2PO4, NaCl и MgSO4 при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды: NH4 Cl - 2 г, MgSO4 - 200-260 мг, глюкоза (сухая) - 8-10 г, Na2HPO4 - 11,9-12,1 г, KH2 PO4 - 5,95-6,05 г, NaCl - 0,98-1,02 г. Изобретение обеспечивает эффективное замещение природного внутриклеточного магния клеток E.coli соответствующим изотопом. 5 табл.

Формула изобретения

Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния, предусматривающий культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния 24Mg, или 25Mg, или 26Mg, включающем NH4Cl, глюкозу, Na2HPO4, KH 2PO4, NaCl и MgSO4, при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды:

NH4Cl 2 г
MgSO4 200-260 мг
глюкоза (сухая) 8-10 г
Na 2HPO4 11,9-12,1 г
KH4PO4 5,95-6,05 г
NaCl 0,98-1,02 г

Описание изобретения к патенту

Способ изотопного обогащения клеток E.coli относится к микробиологии, энзимологии для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов.

Известен способ изотопного обогащения (патент РФ № 2399409, опубл. 20.09.10), содержащий стадию осуществления изотопного обмена между водным раствором, содержащим, по меньшей мере, два компонента, каждый из которых представлен формулой H2O-H2SiF6·nSiF4 (где nспособ изотопного обогащения клеток e.coli, патент № 2499042 0), и газом, содержащим SiF4, для обогащения стабильного изотопа Si. Возможно, что SiF4 растворяют в водном растворе до состояния насыщения, а также, что водный раствор имеет азеотропный состав.

Недостатком данного способа является невозможность его использования для обогащения клеток E.coli, т.к. данный раствор не содержит питательных веществ для бактерий и не имеет pH=6.5-7.5, при котором растут и размножаются клетки.

Техническим результатом заявляемого способа изотопного обогащения клеток E.coli является эффективное замещение природного внутриклеточного магния соответствующим изотопом.

Задача решается тем, что в способе изотопного обогащения клеток E.coli, содержащего стадию изотопного обмена между клетками E.coli и водным раствором, отличающийся тем, что изотопный обмен между клетками E.coli и водным раствором осуществляют в течение 10-16 часов при температуре 37°C, причем в водный раствор, обогащенный по одному из изотопов магния 24Mg, 25Mg, 26Mg, входят NH4Cl, глюкоза, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl и MgSO4, при следующем содержании на 1 л дистиллированной воды:

NH4Cl - 2 г;

MgSO 4 - 200-260 мг;

глюкоза (сухая) - 8-10 г;

Na2HPO4 - 11,9-12,1 г;

KH2PO4 - 5,95-6,05 г;

NaCl - 0,98-1,02 г.

Способ изотопного обогащения клеток E.coli осуществляли следующим образом.

Музейный штамм Escherichia coli K12TG1 предварительно инкубировался в Lb-бульоне (производства Sigma Aldrich Co.), который содержит природный магний, в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее трижды производился посев микроорганизмов исходной концентрации 105 KOE/мл в синтетическую питательную среду М9 - водный раствор с разной концентрацией 6 компонентов на 1 л дистиллированной воды.

Первый водный раствор:

NH 4Cl - 2 г; MgSO4 - 200 мг; глюкоза (сухая) - 8 г; Na2HPO4 - 11,9 г; KH2PO 4 - 5,95 г; NaCl - 0,98 г.

Второй водный раствор:

NH4Cl - 2 г; MgSO4 - 230 мг; глюкоза (сухая) - 9 г; Na2HPO4 - 12 г; KH2PO4 - 6 г; NaCl - 1 г.

Третий водный раствор:

NH4Cl - 2 г; MgSO4 - 260 мг; глюкоза (сухая) - 10 г; Na2 HPO4 - 12, 1 г; KH2PO4 - 6,05 г; NaCl - 1,02 г.

Первые три вещества, NH 4Cl, глюкоза (сухая) и MgSO4, входят в питательный раствор, необходимый для поддержания жизнеспособности клеточной культуры и ее роста, требуемого для накопления изотопно-обогащенной магнием клеточной биомассы. Последние три вещества, Na2 HPO4, KH2PO4 и NaCl, являются буферным раствором, который поддерживает pH=6.5-7.5 среды. Два раствора готовятся отдельно, стерилизуют в автоклаве 25 минут при давлении 1,5-2 атм. После автоклавирования растворы сливаются; pH контролируют до и после стерилизации. Изотопы магния добавляют в среду в виде сульфата магния MgSO4, концентрация которого составляет 2.2 мМ/л. Характеристики существующих в природе стабильных изотопов магния и их природное содержание приведены в таблице 1.

Таблица 1
ИзотопМагнитный момент (µв) Природное содержание, %
24Mg0 79
25Mg 0.8510
26Mg0 11

Для приготовления сульфатов использовались изотопно-чистые оксиды 24MgO, 25MgO и 26MgO производства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно. Паспортные данные оксидов изотопов магния приведены в таблицах 2-3.

Таблица 2
способ изотопного обогащения клеток e.coli, патент № 2499042 Содержание изотопа магния, ат.%
Изотоп для 24MgOдля 26 MgOдля 25MgO
24Mg99,88±0,02 97,70±0,2099,37±0,08
25Mg 0,071,980,33
26Mg 0,050,200,30

Таблица 3
способ изотопного обогащения клеток e.coli, патент № 2499042 Содержание примесей, вес.%
Элемент для 24MgOдля 26 MgOдля 25MgO
K<0,005 <ПО0,017
Na0,002<ПО 0,004
Ca <0,0050,008 0,34
Fe <0,0050,019 0,048
Al 0,00110,0008 0,031
Si <0,005<ПО <0,005
Cr -<ПО0,0030
Ni0,0001 <0,0002<0,0001
Cu0,0029 0,00210,0004
Mn0,0032 0,00210,059
Pb<ПО*<ПО 0,0015
Lu <ПО<ПО 0,0003
Pt <ПО0,00310,0002
B<ПО 0,0080,0026
Ti<ПО <ПО0,0015
Co<ПО<ПО 0,0011
Sr <ПО<ПО 0,0002
Ba <ПО0,00030,0002
La<ПО <ПО0,0003
Eu<ПО <ПО0,0002
Zn0,00060,0005 0,0009
Ru <ПО0,0001 <ПО
Cd <ПО0,0001<ПО
P<0,005 <ПО<ПО

Контроль соотношения изотопов магния, содержащихся в питательной среде М9, осуществлялся с помощью масс-спектрометрического анализа. Соотношение изотопов магния для сред М9 в % приведено в таблице 4.

Таблица 4
ИзотопСреда М9 с 24Mg Среда М9 с 25Mg Среда М9 с 26Mg
24Mg99,7 1,44,5
25Mg0,12 98,10,61
26Mg0,13 0,594,9

В подготовленные таким образом водные растворы производили посев микроорганизмов с начальной концентрацией 105 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл раствора). После этого образцы выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 10, 13 и 16 часов. Контроль накопления клеточной биомассы осуществлялся с помощью стандартных методов измерения оптической плотности суспензии микроорганизмов и измерения колониеобразующих единиц. При достижении бактериями плотности популяции 108-10 9 КОЕ/мл или 0,6-0.7 отн. ед. оптической плотности клеточная биомасса осаждалась методом центрифугирования на 15 тыс. об. в течение 15 минут. После производился двукратный отмыв клеточной биомассы бактерий E.coli дистиллированной водой с повторным центрифугированием.

Полученная таким образом клеточная биомасса исследовалась на содержание изотопов магния масс-спектральным (PlasmaQuad 2, VG Elemental, Англия) и атомно-эмиссионным методами (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США). Клеточная биомасса предварительно подвергалась лиофильной сушке и автоклавному разложению. Данные по соотношению изотопов магния в клетках E.coli после цикла культивирования на изотопных средах М9 приведены в таблице 5.

Таблица 5
ИзотопИсход-ная куль тура Выдержка в термоста-те, час. Клетки, выращенные на среде М9 с 24MgКлетки, выращенные на среде М9 с 25Mg Клетки, выращенные на среде М9 с 26Mg
1-й водный р-р2-й водный р-р3-й водный р-р 1-й водный р-р2-й водный р-р 3-й водный р-р1-й водный р-р 2-й водный р-р3-й водный р-р
24Mg 87,81090,8 94,595,1 5,96,36,1 12,59,8 9,8
13 91,199,599,4 6,06,6 6,510,410,0 9,9
16 93,599,5 99,56,26,6 6,59,7 10,010,0
25Mg5,9 106,23,5 3,490,2 91,991,32,1 3,33,7
135,8 0,230,2291,9 92,592,1 2,01,62,6
164,7 0,240,23 92,392,592,4 2,21,6 1,7
26 Mg6,3 103,02,0 1,43,9 1,82,685,4 86,986,5
133,1 0,231,52,1 0,871,4 87,688,487,5
161,8 0,220,22 1,50,871,1 88,188,4 88,3
* Погрешность определения от 1.2% отн. для 95%; до 15% для 0.5%

После 10-16 часов культивирования на магний-изотопных средах, в течение которых происходил изотопный обмен между клетками и водным раствором, бактерии были обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 по сравнению с исходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из второго столбца данных таблицы 5. Цикл культивирования бактерий на питательных средах М9, содержащих изотопы магния, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп.

Используемый способ изотопного обогащения микроорганизмов в присутствии магнитного и немагнитных изотопов магния оказался уникальным и применяется впервые. Данный способ может использоваться для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов, который найдет свое применение в различных исследовательских работах в микробиологии, энзимологии. Кроме того, он может использоваться в различных медицинских и биотехнологических приложениях как простой и нетрудоемкий способ получения изотопно-обогащенных биомолекул (АТФ, ДНК и т.д.), клеточных подструктур и самих клеток. Немаловажно, что подобные выделенные молекулы и клеточные подструктуры нерадиоактивны, так как для изотопного обогащения используются только стабильные изотопы. Данный способ может быть модифицирован для других стабильных изотопов жизненно важных химических элементов, а также для других микроорганизмов.

Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ изотопного обогащения клеток E.coli позволяет эффективно проводить до 90% изотопный обмен между природным магнием, изначально содержащимся в клетках, и изотопом магния из водного раствора.

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Класс C12N1/38 химическая стимуляция роста или активности путем введения химических соединений, не являющихся существенными факторами роста; стимуляция роста путем удаления химического соединения

способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи -  патент 2511031 (10.04.2014)
способ получения спорового материала бактерий рода clostridium -  патент 2509151 (10.03.2014)
стимулятор роста yersinia pseudotuberculosis -  патент 2502796 (27.12.2013)
способ получения биогаза с контролируемыми концентрациями микроэлементов -  патент 2499049 (20.11.2013)
способ активации дрожжей -  патент 2492230 (10.09.2013)
способ повышения продуктивности микроорганизмов e.coli -  патент 2476593 (27.02.2013)
ростостимулирующее средство для культивирования сульфатвосстанавливающих бактерий -  патент 2459865 (27.08.2012)
способ получения биологически активной субстанции из эмбрионально-яичной массы для приготовления противоожоговой пластины и противоожоговая пластина на его основе -  патент 2433171 (10.11.2011)
стимулятор роста молочнокислых бактерий в молоке -  патент 2430157 (27.09.2011)
способ получения культур молочнокислых бактерий и стартовая культура молочнокислых бактерий -  патент 2370533 (20.10.2009)
Наверх