способ ингибирования активности фермента рнк-полимеразы

Формула изобретения

Способ ингибирования активности фермента РНК-полимеразы путем введения в транскрипционную систему ингибитора на основе соединения, содержащего органический макроциклический фрагмент, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используют по крайней мере один макрополициклический комплекс с инкапсулированным ионом переходного металла, выбранный из группы, включающей

1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-диамино-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺);

1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-диметил-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) кобальт(²⁺);

1,8-бис(2-фенилбора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12,17,18-гекса(метилтио)-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) рутений(²⁺);

1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-циклогександимеркаптилбицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺);

1,12-бис-(трет-бутилбора)-2,11,13,22,23,32-гексаокса-3,10,14,21,24,31-гексазапентацикло[11,11.11.0 ^4.90^15,200^25.30]дитри-аконта-3,9,14,20,24,30-гексаен( ^2-) железо(²⁺).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии и касается способа ингибирования активности фермента РНК-полимеразы, ответственного за проведение транскрипции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), то есть за формирование в клетке живого организма макромолекул матричной рибонуклеиновой кислоты (РНК), комплементарной исходной ДНК. Данное изобретение может быть использовано, например, в молекулярной биологии, биохимии, фармакологии и т.д.

Известен способ ингибирования активности фермента РНК-полимеразы путем введения в транскрипционную систему ингибитора на основе функционализированного ароматического мета-диамина (Патент США № 6,194,399 B1, 2001, класс 514/155).

Известен способ ингибирования активности фермента РНК-полимеразы путем введения в транскрипционную систему ингибитора на основе производных (азидонафталин-1-сульфамидо)-гексопиранозил-6-трифосфата при облучении красным светом (Патент России № 20036903, 1991, класс С07С 311/49).

Наиболее близким к заявляемому является известный способ ингибирования активности фермента РНК-полимеразы путем введения в транскрипционную систему ингибитора на основе соединения, содержащего органический макроциклический фрагмент (Патент США № 2009/0137467 А1, класс 514/12, 2009), - прототип. В данном способе в качестве ингибитора используют производное рифамицина.

Недостатком известного способа является его относительная сложность, обусловленная сравнительно низкой химической устойчивостью известного ингибитора в транскрипционной системе, что неизбежно вызывает определенные трудности при работе с этим ингибитором.

Технической задачей изобретения является расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы для ингибирования активности фермента РНК-полимеразы.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе ингибирования активности фермента РНК-полимеразы путем введения в транскрипционную систему ингибитора на основе соединения, содержащего органический макроциклический фрагмент, в качестве ингибитора используют по крайней мере один макрополициклический комплекс с инкапсулированным ионом переходного металла.

Предлагаемый способ может быть использован для ингибирования любой РНК-полимеразы, присутствующей в клетках любых организмов, включая бактериофаги, бактерии, высшие организмы и т.д.

При реализации предлагаемого способа могут быть использованы различные транскрипционные системы, основными компонентами которых являются РНК-полимераза, матричная ДНК и рибонуклеозидтрифосфаты. Кроме того, транскрипционная система может включать спермидин, соль магния, соль натрия, буферную смесь и т.д.

В предлагаемом изобретении в качестве ингибитора используют по крайней мере один макрополициклический комплекс с инкапсулированным ионом переходного металла. В качестве таких соединений могут быть использованы, например, комплексы металлов с органическими лигандами, содержащие два и более макроциклических фрагмента. Такими лигандами могут быть, например, макрополициклические лиганды, образованные, например, сшивкой кислотами Льюиса оксимов и оксимгидразонов, их полиаминные аналоги и т.д. Если в качестве ингибитора вместо макрополициклических комплексов использовать макромоноциклические комплексы переходных металлов, например дифтороборосшитый бис-альфа-бензилдиоксимат железа(II), то предлагаемый способ становится неработоспособным. Предлагаемый способ также будет неработоспособным, если в качестве ингибитора вместо макрополициклического комплекса с инкапсулированным ионом переходного металла использовать немакроциклический комплекс иона такого металла.

В качестве инкапсулированных, т.е. включенных в трехмерную полость макрополициклического лиганда, ионов переходных металлов могут быть использованы, например, ионы железа(II), кобальта(I, II, III), рутения(II) и т.д. Вышеуказанные соединения описаны в научно-технической литературе (например, Я.З. Волошин, О.А. Варзацкий, Ю.Н. Бубнов. Клеточные комплексы переходных металлов в биохимии и медицине. Изв. АН. Сер. хим., 2007, 56, С.555-582, Y.Z. Voloshin, N.A. Kostromina, R. Krämer, Clathrochelates: synthesis, structure and properties, Elsevier, Amsterdam, 2002, 420 с.), однако использование этих соединений для ингибирования активности фермента РНК-полимеразы в литературе не описано.

В предлагаемом техническом решении ингибирование активности РНК-полимеразы доказывают традиционным методом, включающим инкубирование транскрипционной системы в присутствии ингибитора при 37°C в течение 1 часа (ч) с последующим разделением продуктов при помощи электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле и определение количества синтезированной РНК по интенсивности свечения соответствующей полосы. Концентрацию ингибитора (IC ₅₀), приводящую к 50%-ной потере активности РНК-полимеразы, определяют путем анализа зависимости выхода синтезированной РНК от концентрации ингибитора по сравнению с контрольной реакцией, проводимой в отсутствие ингибитора. Для каждого ингибитора проводят несколько независимых экспериментов при каждой концентрации ингибитора.

Дополнительно в предлагаемом техническом решении ингибирование активности ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот при блокировании интерфейса макромолекулярного комплекса фермент-матричная нуклеиновая кислота макрополициклическим соединением с инкапсулированным ионом переходного металла доказывают традиционным методом на примере РНК-полимеразы как модельного фермента, включающим предварительное инкубирование ингибитора с отдельными компонентами транскрипционной системы при 37°C в течение 15 минут, инкубирование транскрипционной системы в присутствии ингибитора при 37°C в течение 1 часа (ч) с последующим разделением продуктов при помощи электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле и определение количества синтезированной РНК по интенсивности свечения соответствующей полосы. Концентрацию ингибитора (IC₅₀), приводящую к 50%-ной потере активности РНК-полимеразы, определяют путем анализа зависимости выхода синтезированной РНК от концентрации ингибитора по сравнению с контрольной реакцией, проводимой в отсутствие ингибитора. Для каждого ингибитора проводят несколько независимых экспериментов при каждой концентрации ингибитора.

Ингибирование активности фермента РНК-полимеразы с помощью предлагаемого способа доказывают следующие примеры.

Пример 1

В 20 микролитрах (мкл) дистиллированной деионизированной воды готовят раствор, содержащий хлорид магния с концентрацией 6 ммоль/л (мМ), хлорид натрия с концентрацией 2 мМ, спермидин с концентрацией 2 мМ, дитиотреитол с концентрацией 2 мМ, каждый из четырех рибонуклеозидтрифосфатов с концентрацией 2 ммоль/л (мМ) и трис-HCl с концентрацией 40 мМ при значении pH 7,9. К полученному раствору прибавляют 0.5 микрограмма (мкг) матричной ДНК (линеаризованная плазмида pTZ19R), ингибитор рибонуклеазы RiboLock (10 единиц активности (ед. акт.)), РНК-полимеразу бактериофага Т7 (12 ед. акт.) и 0.5 мкл раствора ингибитора макробициклического комплекса с инкапсулированным ионом железа(II) 1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-диамино-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺) в диметилсульфоксиде с финальной концентрацией ингибитора в реакционной смеси 1 микромоль/литр (мкМ) и полученную смесь затем инкубируют при 37°C в течение 1 часа. Реакцию останавливают путем быстрого охлаждения до -20°C и продукты разделяют при помощи электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле в трис-боратной буферной смеси (трис с концентрацией 8.9 мМ, борная кислота с концентрацией 8.9 мМ, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты с концентрацией 0.2 мМ) с добавленным 0.5 мкг/мл бромистого этидия, необходимого для окрашивания электрофореграммы. Полученную электрофореграмму фотографируют при облучении длинноволновым ультрафиолетом (365 нм) и полученные изображения анализируют стандартным способом. Дополнительно проводят 4 эксперимента при следущих концентрациях ингибитора: 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ и 30 мкМ с пятикратным повторением каждого эксперимента для повышения точности измерения. Значение IC₅₀ определяют при помощи анализа зависимости процента синтезированной матричной РНК от концентрации ингибитора по сравнению с контрольной реакцией, проводимой в отсутствие ингибитора. Полученное значение IC ₅₀ составляет 2.5 мкМ, что свидетельствует о практически полном ингибировании фермента РНК-полимеразы при микромолярной концентрации ингибитора.

Пример 2

Опыт проводят аналогично описанному в Примере 1, однако вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli, а в качестве ингибитора используют макробициклический комплекс с инкапсулированным ионом кобальта(II) 1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-диметил-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) кобальт(²⁺) (D.R. Boston and N.J. Rose, Encapsulation reactions. Synthesis and study of clathro chelates derived from dimethylglyoxime, cobalt, and Lewis acids, J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, p.4163-4168). Полученное значение IC ₅₀ составляет 8,2 мкМ.

Пример 3

Опыт проводят аналогично описанному в Примере 1, однако вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S. aureus, а в качестве ингибитора используют макробициклический комплекс с инкапсулированным ионом рутения(II) 1,8-бис(2-фенилбора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12,17,18-гекса(метилтио)-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) рутений(²⁺) (Y.Z. Voloshin, О.А. Varzatskii, Т.Е. Kron, V.K. Belsky, V.E. Zavodnik, N.G. Strizhakova, V.A. Nadtochenko, V.A. Smirnov, Encapsulation of ruthenium(II) with macrobicyclic dioxime-functionalized ligands: on the way to new types of DNA-cleaving agents and probes, J. Chem. Soc, Dalton Trans., 2002, P.1203-1211). Полученное значение IC₅₀ составляет 9,5 мкМ.

Пример 4

Опыт проводят аналогично описанному в Примере 1, однако в качестве ингибитора используют эквимолярную смесь ингибитора из Примера 1 и макротрициклического комплекса с инкапсулированным ионом железа(II) 1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-циклогександимеркаптилбицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺) (Y.Z. Voloshin, О.А. Varzatskii, A.S. Belov, Z.A. Starikova, N.G. Strizhakova, A.V. Dolganov, D.I. Kochubey, Y.N. Bubnov, Synthesis, X-ray structure and redox properties of the macrobicyclic iron(II) N2- and S2-containing vic-dioximates, Inorg. Chim. Acta, 2010, 363, p.134-146). Полученное значение IC₅₀ составляет 4,4 мкМ.

Пример 5

Опыт проводят аналогично описанному в Примере 1, однако в качестве ингибитора используют эквимолярную смесь ингибиторов из Примеров 1, 2 и макропентациклического комплекса с инкапсулированным ионом железа(II) 1,12-бис-(трет-бутилбора)-2,11,13,22,23,32-гексаокса-3,10,14,21,24,31-гексазапентацикло[11,11.11.0 ^4.90^15,200^25.30]дитри-аконта-3,9,14,20,24,30-гексаен( ^2-)железо(²⁺) (Я.З. Волошин, О.А. Варзацкий, З.А. Старикова, М.Ю. Антипин, А.Ю. Лебедев, А.С. Белов. Супрамолекулярная организация кристаллов аллилсульфидного клатрохелата: влияние природы сольватных молекул. Изв. АН. Сер. хим., 2004, 53, С.1439-1444). Полученное значение IC₅₀ составляет 5,3 мкМ.

Пример 6

Опыт проводят аналогично Примеру 1, однако в качестве ингибитора используют упомянутый в примере 4 макротрициклический комплекс с инкапсулированным ионом железа(II) 1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-циклогександимеркаптилбицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺), а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli. Полученное значение IC₅₀ составляет 5,9 мкМ.

Пример 7

Опыт проводят аналогично Примеру 1, однако в качестве ингибитора используют упомянутый в примере 5 макропентациклический комплекс с инкапсулированным ионом железа(II) 1,12-бис-(трет-бутилбора)-2,11,13,22,23,32-гексаокса-3,10,14,21,24,31-гексазапентацикло[11,11.11.0 ^4.90^15,200^25.30]дитри-аконта-3,9,14,20,24,30-гексаен( ^2-) железо(²⁺), а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S. aureus. Полученное значение IC₅₀ составляет 2,7 мкМ.

Возможность связывания макрополициклических комплексов с РНК-полимеразой доказывают следующие примеры.

Пример 8

В 20 микролитрах (мкл) дистиллированной деионизированной воды готовят раствор, содержащий хлорид магния с концентрацией 6 ммоль/л (мМ), хлорид натрия с концентрацией 2 мМ, спермидин с концентрацией 2 мМ, дитиотреитол с концентрацией 2 мМ, каждый из четырех рибонуклеозидтрифосфатов с концентрацией 2 ммоль/л (мМ) и трис-HCl с концентрацией 40 мМ при значении pH 7,9. К полученному раствору прибавляют 0.5 микрограмма (мкг) матричной ДНК (линеаризованная плазмида pTZ19R) и 0.5 мкл раствора ингибитора макробициклического комплекса с инкапсулированным ионом железа(II) 1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-диамино-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺) в диметилсульфоксиде с финальной концентрацией ингибитора в реакционной смеси 1 микромоль/литр (мкМ) и полученную смесь затем инкубируют при 37°C в течение 15 минут. Затем прибавляют ингибитор рибонуклеазы RiboLock (10 единиц активности (ед. акт.)) и РНК-полимеразу бактериофага Т7 (12 ед. акт.) и полученную смесь затем инкубируют при 37°C в течение 1 часа. Затем опыт завершают аналогично описанному в Примере 1. Полученное значение IC₅₀ составляет 10.2 мкМ, что свидетельствует о значительном снижении активности ингибитора при предварительной инкубации его с матричной ДНК за счет неспецифического связывания ингибитора с нетранскрибируемыми участками матричной ДНК.

Пример 9

В 20 микролитрах (мкл) дистиллированной деионизированной воды готовят раствор, содержащий хлорид магния с концентрацией 6 ммоль/л (мМ), хлорид натрия с концентрацией 2 мМ, спермидин с концентрацией 2 мМ, дитиотреитол с концентрацией 2 мМ, каждый из четырех рибонуклеозидтрифосфатов с концентрацией 2 ммоль/л (мМ) и трис-HCl с концентрацией 40 мМ при значении pH 7,9. К полученному раствору прибавляют РНК-полимеразу бактериофага Т7 (12 ед. акт.), ингибитор рибонуклеазы RiboLock (10 единиц активности (ед. акт.)) и 0.5 мкл раствора ингибитора макробициклического комплекса с инкапсулированным ионом железа(II) 1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-диамино-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺) в диметилсульфоксиде с финальной концентрацией ингибитора в реакционной смеси 1 микромоль/литр (мкМ) и полученную смесь затем инкубируют при 37°C в течение 15 минут. Затем прибавляют 0.5 микрограмма (мкг) матричной ДНК (линеаризованная плазмида pTZ19R) и полученную смесь затем инкубируют при 37°C в течение 1 часа. Затем опыт завершают аналогично описанному в Примере 1. Полученное значение IC₅₀ составляет 1.8 мкМ, что свидетельствует о значительном повышении активности ингибитора при предварительной инкубации его с РНК-полимеразой бактериофага Т7.

Пример 10

В 20 микролитрах (мкл) дистиллированной деионизированной воды готовят раствор, содержащий хлорид магния с концентрацией 6 ммоль/л (мМ), хлорид натрия с концентрацией 2 мМ, спермидин с концентрацией 2 мМ, дитиотреитол с концентрацией 2 мМ и трис-HCl с концентрацией 40 мМ при значении pH 7,9. К полученному раствору прибавляют РНК-полимеразу бактериофага Т7 (12 ед. акт.), ингибитор рибонуклеазы RiboLock (10 единиц активности (ед. акт.)), 0.5 микрограмма (мкг) матричной ДНК (линеаризованная плазмида pTZ19R) и 0.5 мкл раствора ингибитора макробициклического комплекса с инкапсулированным ионом железа(II) 1,8-бис(2-фторобора)-2,7,9,14,15,20-гексаокса-3,6,10,13,16,19-гексааза-4,5,11,12-тетрафенил-17,18-диамино-бицикло[6.6.6]эйкоза-3,5,10,12,16,18-гексаен( ^2-) железо(²⁺) в диметилсульфоксиде с финальной концентрацией ингибитора в реакционной смеси 1 микромоль/литр (мкМ) и полученную смесь затем инкубируют при 37°C в течение 15 минут. Затем прибавляют каждый из четырех рибонуклеозидтрифосфатов с финальной концентрацией в реакционной смеси 2 ммоль/л (мМ) и полученную смесь затем инкубируют при 37°C в течение 1 часа. Затем опыт завершают аналогично описанному в Примере 1. Полученное значение IC₅₀ составляет 1.4 мкМ, что свидетельствует о еще большем повышении активности ингибитора при предварительной инкубации его со смесью РНК-полимеразы бактериофага Т7 и матричной ДНК.

Пример 11

Опыт проводят аналогично Примеру 8, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 2, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli. Полученное значение IC₅₀ составляет 17,4 мкМ.

Пример 12

Опыт проводят аналогично Примеру 9, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 2, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli. Полученное значение IC₅₀ составляет 6,1 мкМ.

Пример 13

Опыт проводят аналогично Примеру 10, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 2, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli. Полученное значение IC₅₀ составляет 5,9 мкМ.

Пример 14

Опыт проводят аналогично Примеру 8, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 3, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S.aureus. Полученное значение IC₅₀ составляет 11,2 мкМ.

Пример 15

Опыт проводят аналогично Примеру 9, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 3, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S. aureus. Полученное значение IC ₅₀ составляет 8,1 мкМ.

Пример 16

Опыт проводят аналогично Примеру 10, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 3, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S. aureus. Полученное значение IC₅₀ составляет 8,0 мкМ.

Пример 17

Опыт проводят аналогично Примеру 8, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 6, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli. Полученное значение IC₅₀ составляет 9,4 мкМ.

Пример 18

Опыт проводят аналогично Примеру 9, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 6, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli. Полученное значение IC₅₀ составляет 5,2 мкМ.

Пример 19

Опыт проводят аналогично Примеру 10, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 6, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу Е.coli. Полученное значение IC₅₀ составляет 5,2 мкМ.

Пример 20

Опыт проводят аналогично Примеру 8, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 7, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S. aureus. Полученное значение IC₅₀ составляет 4,9 мкМ.

Пример 21

Опыт проводят аналогично Примеру 9, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 7, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S. aureus. Полученное значение IC₅₀ составляет 2,1 мкМ.

Пример 22

Опыт проводят аналогично Примеру 10, однако в качестве ингибитора используют соединение из Примера 7, а вместо РНК-полимеразы бактериофага Т7 используют бактериальную полимеразу S. aureus. Полученное значение IC₅₀ составляет 2,1 мкМ.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ ингибирования фермента РНК-полимеразы действительно расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для ингибирования активности фермента РНК-полимеразы, и обеспечивает ингибирование фермента РНК-полимеразы даже при микромолярной концентрации ингибитора.