масло, семена и растения подсолнечника с модифицированным распределением жирных кислот в молекуле триацилглицерина

Формула изобретения

1. Способ получения семян подсолнечника, которые содержат эндогенное масло, содержащее по меньшей мере 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, в котором содержание олеиновой кислоты выше содержания линолевой кислоты, и в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,28, включающий стадии:

a) получения семян, которые содержат масло, имеющее содержание стеариновой кислоты по меньшей мере 12% от общего содержания жирных кислот в масле, и в котором содержание олеиновой кислоты выше содержания линолевой кислоты;

b) получения семян, которые содержат масло с коэффициентом распределения в масле выше 0,38;

c) скрещивания растений из семян, полученных на стадии а) и b);

d) сбора урожая семенного потомства F1;

e) посева семян потомства F1 для выращивания растений;

f) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

g) тестирования семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты, более высокого содержания олеиновой кислоты по сравнению с содержанием линолевой кислоты и коэффициента распределения по меньшей мере 0,28;

h) посева семян с требуемыми уровнями содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислоты и коэффициентом распределения для выращивания растений;

i) самоопыления выращенных таким образом растений для получения семенного материала F3; и

j) если требуется, повторения стадий g), h) и i) до закрепления требуемых уровней содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот и коэффициента распределения .

2. Способ по п.1, в котором семена, которые содержат масло по меньшей мере с 12%-ным содержанием стеариновой кислоты, получают путем:

a) обработки семян подсолнечника с содержанием стеариновой кислоты менее 12% мутагенным агентом, в частности азидом натрия или алкилирующим агентом, более конкретно этилметансульфонатом;

b) получения из них растений, которые опыляются для получения семян;

c) тестирования семян на требуемое содержание стеариновой кислоты;

d) получения семян, которые содержат масло, в котором содержание олеиновой кислоты выше содержания линолевой кислоты;

e) скрещивания растений из семян, тестированных на стадии с), и из семян, полученных на стадии d);

f) сбора урожая семенного потомства F1;

g) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

h) тестирования семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты и более высокого содержания олеиновой кислоты по сравнению с содержанием линолевой кислоты;

i) посева семян, имеющих требуемые уровни содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот;

j) самоопыления выращенных таким образом растений для получения семенного материала F3; и

k) если требуется, повторения стадий h), i) и j) до закрепления требуемых уровней содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот.

3. Способ по п.1, в котором семена, содержащие масло, в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,38, получают путем:

a) обработки семян подсолнечника со значением коэффициента распределения меньше 0,38 мутагенным агентом, в частности азидом натрия или алкилирующим агентом, более конкретно этилметансульфонатом;

b) получения из них растений, которые опыляются для получения семян;

c) тестирования семян на требуемое значение коэффициента распределения ;

d) если требуется, повторение стадий b) и с).

4. Способ по п.1, в котором семена, содержащие масло с коэффициентом распределения выше 0,38, представляют собой семена линии CAS-36, представительский образец которой депонирован в коллекции АТСС с депозитарным номером РТА-5041.

5. Масло семян подсолнечника, полученных способом по любому из пп.1-4, имеющее по меньшей мере 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, более высокое содержание олеиновой кислоты, чем линолевой кислоты, и коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3, составляющий по меньшей мере 0,28.

6. Масло по п.5, в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,32.

7. Масло по п.5, в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,36.

8. Масло по любому из пп.5-7, в котором содержание стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот составляет по меньшей мере 20%.

9. Масло по любому из пп.5-8, пригодное для производства пищевого продукта.

10. Пищевой продукт, содержащий подсолнечное масло по п.9.

11. Способ получения растения подсолнечника, включающий получение его семени подсолнечника способом по любому из пп.1-4 и выращивание растения из этого семени.

12. Способ получения растения подсолнечника, образующего семена, содержащие эндогенное масло, содержащее по меньшей мере 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, и в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,38, включающий получение семени указанного растения способом, включающим стадии:

a) получения семян, которые содержат масло, имеющее содержание стеариновой кислоты по меньшей мере 12% от общего содержания жирных кислот в масле;

b) получения семян, которые содержат масло с коэффициентом распределения выше 0,38;

c) скрещивания растений из семян, полученных на стадии а) и b);

d) сбора урожая семенного потомства F1;

e) посева семян потомства F1 для выращивания растений;

f) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

g) тестирования семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты и коэффициента распределения по меньшей мере 0,38;

h) посева семян с требуемыми содержанием стеариновой кислоты и коэффициентом распределения для выращивания растений;

i) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F3; и

j) если требуется, повторения стадий g), h) и i) до получения семени с закрепленными требуемыми содержанием стеариновой кислоты и коэффициентом распределения , и выращивания растения из этого семени.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение касается подсолнечного масла, непосредственно полученного из семян подсолнечника с по меньшей мере 12%-ным содержанием стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот и с модифицированным распределением жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 в молекуле триацилглицерина (TAG) по сравнению с маслом, полученным из семян подсолнечника дикого типа. Изобретение также относится к подсолнечнику и семенам подсолнечника, содержащим эндогенное масло с упомянутыми характеристиками. Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ получения упомянутого подсолнечника и применения упомянутого подсолнечного масла.

Масло и жиры изготавливают в основном из триглицеридов, которые представляют собой молекулы, образованные основной цепью глицерина, этерифицированного по трем гидроксильным группам тремя жирными кислотами (Gunstone и др. 1994). Химические и физические, а также пищевые свойства масел определяются композицией жирных кислот, входящих в состав масел, и распределением таких жирных кислот в различных типах триглицеридов. Три стереохимических положения жирных кислот обозначаются как sn-1, sn-2 и sn-3. Тот факт, что масло представляет собой твердое вещество при определенной температуре или обладает хорошей стабильностью, соотносится с пониженным уровнем двойных связей в жирных кислотах. Основными жирными кислотами, обнаруженными в семенах масляничных культур, являются линолевая кислота (18:2) с 18 атомами углерода и двумя двойными связями и олеиновая кислота (18:1) только с одной двойной связью, делающие такие масла жидкими при комнатной температуре. Некоторые масла, подобные маслу соевых бобов и маслу канолы, также содержат линоленовую кислоту (18:3) с 18 атомами углерода и 3 двойными связями. Такие жирные кислоты являются ненасыщенными, потому что они содержат одну или более двойных связей. Растительные масла также содержат незначительные количества насыщенных жирных кислот без каких-либо двойных связей типа пальмитиновой кислоты, которая содержит 16 атомов углерода (16:0), стеариновой кислоты с 18 атомами углерода (18:0), арахиновой кислоты с 20 атомами углерода (20:0) и бегеновой кислоты (22:0) с 22 атомами углерода.

Ненасыщенные жирные кислоты полезны для здоровья, а насыщенные жирные кислоты нейтральны или вредны для здоровья в зависимости от жирной кислоты и положения в молекуле триглицерида. С другой стороны, некоторые масла тропических растений и животные жиры содержат насыщенные жирные кислоты с короткой и средней цепью, типа лауриновой кислоты с 12 атомами углерода (12:0) и миристиновой кислоты, насыщенной жирной кислоты с 14 атомами углерода (14:0), последняя из которых наиболее вредна для здоровья. Пальмитиновая кислота и стеариновая кислота являются обычными насыщенными жирными кислотами, обнаруженными в растительных маслах растений, выращиваемых в зоне умеренного климата (таблица 1). Считается, что пальмитиновая кислота наносит небольшой вред здоровью, а стеариновая кислота вообще считается нейтральной.

Однако очень важно рассмотреть вторую характеристику, которая зависит от положения жирных кислот в молекуле триглицерида. Насыщенная жирная кислота с длинной цепью менее опасна для здоровья, если она не связана с глицерином в среднем положении (sn-2). Во время переваривания жира липаза поджелудочной железы гидролизует жирные кислоты, находящиеся в sn-1 и sn-3 положениях глицерина. В то время как жирная кислота в среднем положении сохраняет связь с молекулой глицерина, образуя моноглицерид, который обладает поверхностно-активными свойствами и идеально усваивается, жирные кислоты, освобождающиеся из положений sn-1 и sn-3, взаимодействуют с кальцием или магнием, образуя с указанными металлами нерастворимую соль, очень затрудняющую интестинальное поглощение. Таким образом, в результате они выводятся из организма. Как показано в таблице 1, все насыщенные жирные кислоты растительных масел, за исключением пальмового масла, не локализуются в положении sn-2, по этой причине указанные масла не воздействуют негативно на уровень холестерина, несмотря на то, что в них имеется высокое содержание пальмитиновой кислоты, подобно маслу какао, или среднее содержание пальмитиновой кислоты, подобно оливковому маслу.

Таблица 1
Композиция жирных кислот в пищевых жирах и маслах (Alvarez-Ortega и др. 1997; Chow 1992; Gunstone и др. 1994)
Жир или масло	Композиция жирных кислот (%)
	12:0	14:0	16:0	16:1	18:0	18:1	18:2	транс	насыщ. в sn-2
лярд		2	25	3	12	45	10	1	79
сливочное масло	12	10	26	2	12	28	3	3	84
пальмовое		1	45		5	39	9		18
оливковое			14	1	3	71	10		2
какао			26		35	35	3		4
подсолнечное			7		5	30	57		1
подсолнечное с высоким содержанием олеиновой кислоты (НО)			5		4	88	2		1

Для получения многих пищевых продуктов пищевой промышленности необходимы искусственные или твердые жиры (такие как животные жиры) с хорошей стабильностью. Для хлебопекарных изделий, кондитерских изделий и, конечно, для маргарина и паштетов требуется твердый жир, в то время как для промышленности, использующей глубокое прожаривание, желательно иметь жидкое масло, устойчивое к термоокислению. В восьмидесятые годы пищевая промышленность, следуя рекомендациям специалистов по вопросам питания и потребностям потребителя, перешла от животных жиров к растительным маслам. Такие масла не обладают надлежащими свойствами, необходимыми для получения указанных пищевых продуктов; их следует химически модифицировать посредством частичной гидрогенизации и/или транс-этерификации. При гидрогенизации с помощью водорода и тяжелого металла в роли катализатора в ненасыщенных жирных кислотах уменьшается количество двойных связей. Во время такого процесса насыщенность жирных кислот увеличивается, однако в то же самое время увеличивается число цис- и транс-изомеров искусственных жирных кислот. Физические свойства транс-изомеров, несмотря на то, что они представляют собой ненасыщенные жирные кислоты, подобны свойствам насыщенных жирных кислот. Основная проблема, связанная с такими жирными транс-кислотами, заключается в том, что в отношении уровней холестерина они еще хуже, чем животные насыщенные жирные кислоты, и они приводят к дефициту некоторых жизненно необходимых жирных кислот или к некоторым злокачественным опухолям, типа рака молочной железы у женщин.

Химическая транс-этерификация приводит к перераспределению всех жирных кислот в молекулах триглицеридов; позже путем фракционной перегонки можно получать фазу, обогащенную насыщенными триглицеридами. Благодаря такому способу полезное для здоровья растительное масло превращается во вредный для здоровья жир, типа лярда, с большим количеством насыщенных жирных кислот в положении sn-2. Такое масло будет способствовать увеличению холестерина низкой плотности (вредного для здоровья). В заключение необходимо отметить, что способы, применяемые для химической модификации растительных масел не особенно полезны для здоровья, так как изменяют свойства указанных масел таким образом, что новые масла менее полезны для здоровья. Принимая во внимание технологические и пищевые показатели, наилучшим маслом следует считать натуральное растительное масло с повышенным содержанием стеариновой кислоты в качестве насыщенной жирной кислоты, предпочтительно присоединяющейся к основной цепи глицерина в положениях sn-1 и sn-3, и олеиновой или линолевой кислот в качестве ненасыщенных жирных кислот, которые присоединяются в трех sn-положениях.

Селекцией было получено нескольких мутантных линий жирных кислот подсолнечника с закреплением мутантных линий после программы мутагенеза (Osorio и др. 1995). Некоторые из этих мутантов имели высокое содержание насыщенных жирных кислот в масле, полученном из семян: CAS-3 по меньшей мере с 26% стеариновой кислоты; CAS-4 и CAS-8 по меньшей мере со средними уровнями стеариновой кислоты (12-16%). Указанные материалы и другие материалы, типа CAS-29, 30 и 31, выбранные путем селекции после биохимических исследований и дополнительной рекомбинации, составили обширную коллекцию зародышевой плазмы (таблица 2).

Таблица 2
Композиция жирных кислот отдельных типов подсолнечника из коллекции подсолнечника института Instituto de la Grasa, CSIC, Seville, Испания
Тип масла	Линия	Композиция жирных кислот (мол.%)
		16:0	18:0	18:1	18:2	20:0	22:0
Среднее содержание 18:0	CAS-4	5,9	11,9	27,8	53	0,6	0,7
Высокое содержание 18:0	CAS-3	5,4	26,1	14,2	51,3	1,4	1,3
Высокое содержание 18:0	CAS-14	8,4	37,3	12,4	37,9	2,2	1,8
Высокое содержание 18:0	CAS-30	5,8	32,1	9,4	49,3	1,9	1,5
Высокое содержание 18:0	CAS-29	6,7	31,9	21,2	36,2	1,8	2,2
Высокое содержание 18:0	CAS-31	7,2	31,7	14,7	43,3	1,4	1,7
Высокое содержание 18:0	CAS-15	5,2	26,3	57,8	7,2	1,2	1,9
Высокое содержание 18:0	CAS-26	10,1	23,3	59,1	4,5	1,2	1,8
Высокое содержание 18:0	CAS-24	7,2	24,5	60,6	4,4	1,4	1,9

Определение генетических характеристик мутантов показало, что наследование измененных уровней жирных кислот является гаметофитным и контролируется аллелями при пониженном числе локусов, способствуя их переносу в целевые инбредные линии в несколько циклов обратного скрещивания. Исследование временной и пространственной экспрессии таких мутантных признаков показало, что мутантные признаки экспрессируются только в процессе формирования семян, мало зависят от температуры роста и не экспрессируются в тканях растений. Указанные мутантные линии подсолнечника не испытывают какого-либо коллатерального негативного воздействия, подобного воздействиям, обнаруженным у высокостеариновых мутантов арабидопсиса и канолы.

Растительные триглицериды образуются в цикле глицерин-3-P (цикла Кеннеди). Вначале (см. Фиг.1) происходит два ацилирования глицерин-3-фосфата в положениях sn-1 и sn-2 с помощью сложных эфиров ацил-CoA с получением фосфатидата с помощью ферментов глицерин-3-фосфатацилтрансферазы (GPAT) и лизофосфатидатацилтрансферазы (LPAAT), соответственно. Затем фосфатидат гидролизуется до диглицерида фосфатидатфосфогидролазой и затем диглицерид может дополнительно ацилироваться ацил-CoA с получением триглицерида (реакция, катализируемая диглицеридацилтрансферазой DAGAT). Последний фермент является специфическим для биосинтеза триглицерида. Указанные ацилтрансферазы регулируют стереохимическое распределение жирных кислот.

Во время анализа состава мутантных триглицеридов подсолнечника было обнаружено 38 различных молекулярных типов (Fernandez-Moya и др. 2000). Однако неожиданно было обнаружено, что триглицериды, синтезированные с помощью высокостеариновых линий, не имели случайного распределения в положениях sn-1 и sn-3, как предполагалось в теории Вандер Вала (1960), которая, казалось, должна подходить для всех масел. Ферментами, ответственными за такое необычное распределение, являются ацилтрансферазы, которые синтезируют триглицериды из пула ацил-CoA и глицерин-3-P (фосфата). Принимая в расчет, что при синтезе триглицеридов в растительных системах подразумевается, что ненасыщенная жирная кислота будет присоединяться в положение sn-2 глицерина (Alvarez-Ortega и др., 1997), специфические ферменты, ответственные за такой результат, должны представлять собой глицерин-3P-ацилтрансферазу и/или диглицеридацилтрансферазу.

В исследовании, которое привело к изобретению, выведен математический коэффициент альфа S ( S), который определяет относительное распределение насыщенных жирных кислот в положениях sn-1 и sn-3 TAG. Значение S меняется от 0, означающего, что в одном из положений нет какой-либо насыщенной жирной кислоты, до 0,5, при котором в обоих положениях одно и то же содержание насыщенных жирных кислот. Если распределение в триглицериде происходит согласно теории Вандер Вала, то =0,5 и различные жирные кислоты одинаково распределяются в триглицериде. Это очень важно в случае распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3, так как если в одном из указанных положений находится больше насыщенных жирных кислот, то меньше 0,5 и количество динасыщенных триглицеридов будет меньше теоретически ожидаемого. То есть, именно то, что авторы изобретения обнаружили в подсолнечных маслах, в основном в подсолнечных маслах с содержанием стеариновой кислоты выше 12%. Максимальное количество динасыщенных триглицеридов, которые предпочтительны для изготовления искусственных жиров для паштетов, маргаринов, шортенинга, хлебопекарных изделий, кондитерских изделий и т.д., получается, когда =0,5; меньшее значение означает, что при распределении насыщенных жирных кислот в положениях sn-1 и sn-3 молекулы триглицерида получается масло, наиболее неподходящее для указанных конкретных пищевых целей. Таким образом, для конкретных применений на основе расчета значения можно селекционировать мутантные подсолнечники, которые имеют предпочтительное относительное распределение насыщенной жирной кислоты в положениях sn-1 и sn-3 TAG.

Указанный коэффициент рассчитывали, располагая сведениями об общей насыщенной жирнокислотной композиции триглицерида (S), композиции насыщенной жирной кислоты в положении sn-2 (S2), оба из которых можно рассчитать согласно публикации Alvarez-Ortega и др. (1997), и композиции молекулярных типов триглицерида, который можно рассчитать согласно публикации Fernandez-Moya и др. (2000).

Таблица 3

Процентное соотношение насыщенной и ненасыщенной жирных кислот в каждом из положений TAG (S₁, S ₂ и S₃) в зависимости от S, S₂ и S: общее содержание насыщенной жирной кислоты; S₂ : содержание насыщенной жирной кислоты в положении sn-2; : коэффициент распределения насыщенной жирной кислоты между положениями sn-1 и sn-3

	Положения в TAG
	1	2	3
	(3S-S2)		(3S-S2)(1- )
Насыщенные (S)		S2
	(S1)		(S3)
Ненасыщенные	100-[(3S-S2) ]	100-S2	100-[(3S-S2)(1- )]
(U)	(U1)	(U2)	(U3)

Процентные соотношения различных подклассов TAG (тринасыщенного SSS; динасыщенного SUS; мононасыщенного SUU; и триненасыщенного UUU) обычно рассчитывают с помощью следующих формул:

SSS(%)=S1S2S 3/1000	(i)
SUS(%)=(U1S2S3+S1 U2S3+S1S2U3 )/10000	(ii)
SUU(%)=(S1U2U3+U1 S2U3+U1U2S3 )/1000	(iii)
UUU(%)=U1U2U3/10000	(iv)

Применяя значения, приведенные для S_l, S₂, S₃, U₁ , U₂ и U₃ в таблице 3, путем следующего умозаключения можно рассчитать значение коэффициентa распределения для различных TAG:

a) для тринасыщенных типов TAG (SSS):

SSS (%)=S₁S₂ S₃/10000 (i)

Подставляя значения для S₁, S₂ и S₃ из таблицы 3, получаем:

S₁S₂S₃=[(2S-S ₂) ]×S₂×[(3S-S₂)(1- )]=

(3S -S₂ )×S₂×(3S-3S -S₂-S₂ )=

3SS₂ -S₂ ² )×(3S-3S -S₂-S₂ )=

9S²S₂ -9S²S₂ ²-3SS₂ ² +3SS₂ ^{2 2}-3SS₂ ² +3SS₂ ^{2 2}+S₂ ³ -S₂ ^{3 2}=

(-9S²S₂ +6SS₂ ²-S₂ ³) ²+(9S²S₂+6SS₂ ²+S₂ ³) (v)

Путем перестановки членов в уравнении (i) получаем

S₁S₂S₃ -10000SSS(%)=0

Подставляя значения для S₁ S₂S₃ из уравнения (v)

(-9S ²S₂+6SS₂ ²-S₂ ³) ²+(9S²S₂-6SS₂ ²+S₂ ³) -10000SSS(%)=0

Значение получаем из решения квадратного уравнения

(ах ²+bх+с=0), которое можно упростить, так как а=-b,

где а=-9S²S₂+6SS₂ ²-S₂ ³; b=9S²S₂-6SS₂ ²+S₂ ³ и

с=10000SSS(%), SSS(%) представляет собой общее количество тризамещенных TAG в семенах/масле.

b) для динасыщенных типов TAG (SUS):

SUS(%)=(U₁S₂S₃+S_l U₂S₃+S₁S₂U₃ )/10000 (ii)

Подставляя значения для S₁ , S₂, S₃, U₁, U₂ и U₃ из таблицы 3, получаем:

U ₁S₂S₃={100-[(3S-S ₂) ]}×S₂×[(3S-S₂)(1- )]=

300SS₂-300SS₂ -100S₂ ²+100S₂ ² -9S²S₂ +9S²S₂ ²+3SS₂ ² -

3SS₂ ^{2 2}+3SS₂ ² -3SS₂ ^{2 2}-S₂ ³ +S₂ ^{3 2} (vi)

S₁ U₂S₃=(3S-S₂) ×(100-S₂)×[(3S-S₂)(1- )]=

900S² -300SS₂ -9S²S₂ +3SS₂ ² -900S^{2 2}+300SS₂ ²+9S²S₂ ²-3SS₂ ^{2 2}-300SS₂ +100S₂ ² +3SS₂ ² -S₂ ³ +300SS₂ ²-100S₂ ^{2 2}-3SS₂ ^{2 2}+S₂ ^{3 2} (vii)

S₁ S₂U₃=[(3S-S₂) ]×S₂×{100-[(3S-S₂)(1- )]}=

300SS₂ -9S²S₂ +9S²S₂ ²+3SS₂ ² -3SS₂ ^{2 2}-100S₂ ² +

3SS₂ ² -3SS₂ ^{2 2}-S₂ ³ +S₂ ^{3 2} (viii)

Путем перестановки членов в уравнении (ii) получаем

(U₁S ₂S₃+S_lU₂S₃+S ₁S₂U₃)-10000SUS(%)=0

Подставляя значения для U₁S₂S₃ , S₁U₂S₃ и S_lS ₂U₃ из уравнений (vi), (vii) и (viii) соответственно, и группируя относительно :

(600SS₂-18SS₂ ²+27S²S₂-900S² -100S₂ ²+3S₂ ³) ²+(-600SS₂+18SS₂ ²-27S²S₂+900S² +100S₂ ²-3S₂ ³) +300SS₂-100S₂ ²-10000SUS (%)=0

значение рассчитывают из квадратного уравнения, которое можно упростить, так как a=-b

где a=600SS₂-18SS₂ ²+27S²S₂-900S² -100S₂ ²+3S₂ ³ и

c=300SS₂-100S ₂ ²-10000SUS (%),

SUS(%)представляет собой общее количество дизамещенных TAG в семенах/масле.

c) Для мононенасыщенных типов TAG (SUU):

SUU(%)=(S _lU₂U₃+U₁S₂U ₃+U₁U₂S₃)/10000 (iii)

Подставляя значения для S₁, S₂ , S₃, U₁, U₂ и U₃ из таблицы 3, получаем:

S₁ U₂U₃=30000S -900S² +900S^{2 2}+300SS₂ -300SS₂ ²-10000S₂ +300SS₂ -300SS₂ ²-100S₂ ² +100S₂ ^{2 2}-300SS₂ +9S²S₂ -9S²S₂ ²-3S₂ ² +3SS₂ ^{2 2}+100S₂ ² -3SS₂ ² +3SS₂ ^{2 2}+S₂ ³ -S₂ ^{3 2} (ix)

U₁ S₂U₃=10000S₂-300SS ₂+300SS₂ +100S₂ ²-100S₂ ² -300SS₂ +9S²S₂ -9S²S₂ ²-3SS₂ ² +3SS₂ ^{2 2}+100S₂ ² -3SS₂ ² +3SS₂ ^{2 2}+S₂ ³ -S₂ ^{3 2} (x)

U₁ U₂S₃=30000S-10000S₂ -30000S +10000S₂ -300SS₂+100S₂ ²+300SS₂ -100S₂ ² -900S² +300SS₂ +900S^{2 2}-300SS₂ ²+9S²S₂ -3SS₂ ² -9S²S₂ ²+3SS₂ ^{2 2}+300SS₂ -100S₂ ² -300SS₂ ²+100S₂ ^{2 2}-

3SS₂ ² +S₂ ³ +3SS₂ ^{2 2}-S₂ ^{3 2} (xi)

Путем перестановки членов в уравнении (iii) получаем:

(S₁U ₂U₃+U_lS₂U₃+U ₁U₂S₃)-10000SUU (%)=0

Подставляя значения для S₁U₂U₃ , U₁S₂U₃ и U_lU ₂S₃ из уравнений (ix), (x) и (xi) соответственно и группируя относительно , получаем:

(-1200SS₂+18SS ₂ ²-27S²S₂+1800S² +200S₂ ²-3S₂ ³) ²+

(1200SS₂-18SS ₂ ²+27S²S₂-1800S² -200S₂ ²+3S₂ ³) -

600SS₂+200S₂ ²+30000S-10000SUU(%)=0

Значение рассчитывают из квадратного уравнения, которое можно упростить, так как a=-b

где a=-1200SS₂+18SS ₂ ²-27S²S₂+1800S² +200S₂ ²-3S₂ ³ и

с=-600SS₂+200S ₂ ²+30000S-10000SUU(%), SUS(%) представляет собой общее количество монозамещенных TAG в семенах/масле

d) Для триненасыщенных типов TAG:

UUU(%)=U ₁U₂U₃/10000 (iv)

Подставляя значения для U₁, U₂, U₃ из таблицы 3, получаем

U₁U₂ U₃=(600SS₂-6SS₂ ²-9S²S₂-900S² -100S₂ ²+S₂ ³) ²+

(-600SS₂-6SS ₂ ²-9S²S₂+900S² +100S₂ ²-S₂ ³) +300SS₂-

100S₂ ²-30000S+1000000 (xii)

Путем перестановки членов в уравнении (iv) получаем

U₁U₂U₃-10000UUU(%)=0

Подставляя значения для U₁U₂U₃ из уравнения (хii) и группируя относительно , получаем:

(600SS₂-6SS₂ ²+9S²S₂-900S² -100S₂ ²+S₂ ³) ²+

(-600SS₂+6SS ₂ ²-9S²S₂+900S² +100S₂ ²-S₂ ³) +300SS₂-

100S₂ ²-30000S+1000000-10000UUU(%)=0

Значение рассчитывают из квадратного уравнения, которое можно упростить, так как a=-b

где a=600SS₂-6SS₂ ²+9S²S₂-900S² -100S₂ ²+S₂ ³, и

c=300SS₂-100S ₂ ²-30000S+1000000-10000UUU(%), UUU(%) представляет собой общее количество тринезамещенных TAG в семенах/масле.

Во избежание отклонений, связанных с экспериментальными ошибками в определении GLC типов TAG, S определяли как взвешенное среднее значение значений , рассчитанное из SSS( SSS), SUS( SUS), SUU( SUU) и UUU( UUU).

При случайном распределении насыщенной жирной кислоты между положениями sn-1 и sn-3 в молекуле триглицерида в каждом из положений должно находиться 50% каждой из насыщенных жирных кислот, оптимальное значение достигается при максимальном распределении SUS в молекулах триглицерида, где соответственно S представляет собой насыщенную и U представляет собой ненасыщенную жирную кислоту. На Фиг.2 показано соотношение различных типов TAG в подсолнечном масле с повышенным содержанием насыщенной жирной кислоты при случайном распределении между положениями sn-1 и sn-3. Приведенные кривые получены для коэффициента замещения 0,5 при содержании в положении sn-2 насыщенных жирных кислот подсолнечника (Alvarez-Ortega и др., 1997) и повышенных значениях общего содержания насыщенных жирных кислот в формулах (i),(ii), (iii) и (iv).

Коэффициент для масла также следует рассчитывать с помощью химического анализа состава жирных кислот в трех sn-положениях молекулы TAG. Такой анализ следует проводить, следуя способам, предлагаемым в публикациях Laakso и Christie (1990) или Takagi и Ando (1991). Указанные способы дают возможность узнать содержание жирных кислот в трех sn-положениях, однако при этом требуется образец большого размера и способ нельзя применять для небольшого образца, типа половинки семечки, как в способе согласно изобретению. В таком случае формула является следующей, где S представляет собой наименьшее из указанных двух значений, за исключением того случая, когда оба значения составляют 0,5. В таком случае =0,5.

Авторы настоящего изобретения исследовали указанное распределение в TAG для существующих подсолнечных масел. Как и следовало ожидать, полученные данные показали, что в обычных и высоко насыщенных подсолнечных маслах насыщенные жирные кислоты (S) в основном локализуются в положениях sn-1 и sn-3 молекулы глицерина и в очень низком количестве в положении sn-2. Как и следовало ожидать в соответствии с данными Alvarez-Ortega и др. (1997), жирные кислоты в указанном положении в основном представляют собой олеиновую и линолевую кислоты. Однако ацильные группы не распределяются согласно статистической теории случайным образом в положениях 1,3 и положении 2 (Вандер Вал, 1960). Насыщенные жирные кислоты, пальмитиновая и стеариновая, распределяются неодинаково. Такие результаты находятся в согласии с предшествующими данными (Reske и др., 1997), которые указывают на предпочтение положения sn-3 перед положением sn-1 для насыщенных жирных кислот, в основном, когда содержание стеариновой кислоты в подсолнечнике повышено (11%) по сравнению с товарным подсолнечником, в котором содержание стеариновой кислоты составляет 4,8%. На Фиг.3 показано распределение в TAG подсолнечных масел от высокоолеиновых до высоколинолевых, отличающихся по содержанию стеариновой кислоты и по соотношению олеиновая кислота/линолевая кислота. Было обнаружено, что теоретические значения для групп (SSS, SUS, SUU и UUU) в различных типах TAG подсолнечника, ожидаемые для различного содержания насыщенных жирных кислот, исходя из наблюдаемого состава в положении sn-2 и общего содержания жирных кислот, согласно теории случайного распределения в положениях 1,3 и положении 2, отличаются от составов TAG, обнаруженных в анализируемых семенах. Состав TAG был определен с помощью GLC и данных в отношении указанных типов TAG, сгруппированных по уровню ненасыщенности (Fernandez-Moya и др., 2000).

Как показано на Фиг.3, насыщенные жирные кислоты подсолнечника описываются асимметричным распределением в TAG, полученные значения SUU всегда выше ожидаемых значений, а значения SUS и UUU ниже значений, ожидаемых при неспецифическом распределении в положениях sn-1 и sn-3.

Такие результаты также согласуются с предыдущими результатами в отношении высокостеариновых мутантных типов TAG подсолнечника, содержащих две молекулы линолевой кислоты и одну молекулу насыщенной жирной кислоты, которые встречаются более часто, чем ожидается согласно теории случайного распределения в положениях 1,3 и положении 2 (Fernandez-Moya и др., 2000). Увеличение SUU и уменьшение UUU в типах TAG непосредственно соотносится с общим содержанием стеариновой кислоты в масле.

Был рассчитан коэффициент распределения насыщенных жирных кислот ( ) между положениями sn-1 и sn-3 в контроле и высокостеариновых мутантных линиях (таблица 4). Когда содержание линолевой кислоты выше содержания олеиновой кислоты, значение указанного коэффициента всегда находится между 0,19 и 0,37, а когда содержание олеиновой кислоты выше содержания линолевой кислоты, между 0,15 и 0,27,

Таблица 4

Показано содержание стеариновой кислоты (18:0), общее содержание насыщенных жирных кислот (S), различные группы TAG (SUS, SUU и UUU) и значение коэффициента распределения в некоторых нормальных и мутантных линиях подсолнечника. RHA-274 представляет собой линию, полученную от USDA-ARS, Northerm Crop Science Lab, Fargo, ND. Другие линии получены из коллекции подсолнечника института Instituto de la Grasa, CSIC, Seville, Spain. Содержание различных жирных кислот в линиях представлено в следующем виде: HS - высокостеариновая; MS - среднестеариновая; HL - высоколинолевая и HO - высокоолеиновая.

Линия	Тип	18:0	S	SUS	SUU	UUU
RHA-274	нормальный	5	11,7	2,9	29,5	67,7	0,31
CAS-3	HSHL	25,6	37	28,6	48,9	21,6	0,33
CAS-29	HSHL	33,2	42	28,9	55,8	14,7	0,37
CAS-4	MSHL	12,9	20,3	8,3	44,5	47,3	0,29
G-8	HO	4,9	9,4	1,1	22,7	76,2	0,19
CAS-15	HSHO	23,4	33,5	19,3	61,9	18,8	0,23
DG-9	MSHO	19,1	29,8	16,8	55,6	27,5	0,27

Следовательно, до сих пор существует потребность в подсолнечном масле с коэффициентом распределения выше 0,38.

Задача настоящего изобретения является получение подсолнечного масла, непосредственно полученного из семян подсолнечника по меньшей мере с 12%, предпочтительно по меньшей мере с 20% стеариновой кислоты относительно общего содержания жирных кислот, и с коэффициентом распределения насыщенных жирных кислот в упомянутом масле между положениями sn-1 и sn-3 молекулы TAG, составляющим по меньшей мере 0,38, предпочтительно по меньшей мере 0,42 и наиболее предпочтительно 0,46.

Когда содержание олеиновой кислоты в масле выше, чем содержание линолевой кислоты и содержание стеариновой кислоты составляет по меньшей мере 12%, предпочтительно по меньшей мере, 20% от общего содержания жирных кислот, коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 в молекуле TAG составляет по меньшей мере 0,28, предпочтительно 0,32, наиболее предпочтительно 0,36.

Настоящее изобретение дополнительно относится к подсолнечникам, которые образуют семена, содержащие эндогенное масло, полученное из упомянутых семян подсолнечника с указанными выше характеристиками, и к семенам подсолнечника, образуемым упомянутым подсолнечником.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения растения, которое образует семена, содержащие эндогенное масло по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот и коэффициентом распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3, составляющим по меньшей мере 0,38 или 0,28, когда содержание олеиновой кислоты выше, чем содержание линолевой кислоты.

Еще одной задачей настоящего изобретения является получение гибридных растений и их потомства, которое имеет описанное выше распределение насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 и другие требуемые характеристики.

Таким образом, изобретение относится к подсолнечному маслу, непосредственно полученному из семян подсолнечника по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, характеризующемуся тем, что коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,38, и семена для которого получают способом, предусматривающим стадии:

a) получения семян, которые содержат масло с содержанием стеариновой кислоты по меньшей мере 12% от общего содержания жирных кислот в масле;

b) получения семян, которые содержат масло с коэффициентом распределения выше 0,38;

c) скрещивания растений из семян, полученных на стадии a) и b);

d) сбора урожая семян потомства F1;

e) посева семян потомства F1 для выращивания растений;

f) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

g) тестирования семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты и коэффициента распределения , составляющего по меньшей мере 0,38;

h) посева семян с требуемыми уровнями содержания стеариновой кислоты и коэффициента распределения для выращивания растений;

i) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F3; и

j) повторения стадий g), h) и i) до закрепления требуемых уровней содержания стеариновой кислоты и коэффициента распределения .

Коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 предпочтительно составляет по меньшей мере 0,42, более предпочтительно по меньшей мере 0,46.

Изобретение дополнительно относится к подсолнечному маслу, непосредственно полученному из семян подсолнечника по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, характеризующемуся тем, что коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3, составляет по меньшей мере 0,28, когда содержание олеиновой кислоты выше, чем содержание линолевой кислоты в масле, семена для которого получают способом, предусматривающим стадии:

a) получения семян, которые содержат масло с содержанием стеариновой кислоты по меньшей мере 12% от общего содержания жирных кислот в масле и в котором содержание олеиновой кислоты выше, чем содержание линолевой кислоты;

b) получения семян, которые содержат масло с коэффициентом распределения в масле выше 0,38;

c) выращивания растений из семян, полученных на стадиях a) и b) и их скрещивание;

d) сбора урожая семян потомства F1;

e) посева семян потомства F1 для выращивания растений;

f) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

g) тестирования семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты, более высокого содержания олеиновой кислоты по сравнению с содержанием линолевой кислоты и коэффициента распределения , составляющего по меньшей мере 0,28;

h) посева семян с требуемыми уровнями содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот и коэффициента распределения для выращивания растений;

i) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F3; и

j) возможно, повторения стадий g), h) и i) до закрепления требуемых уровней содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот и коэффициента распределения .

Коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 предпочтительно составляет по меньшей мере 0,32, более предпочтительно по меньшей мере 0,36.

Изобретение также относится к подсолнечникам, которые образуют семена, содержащие эндогенное масло, как указано выше, и к семенам, продуцируемым такими растениями.

Кроме того, изобретение предлагает способ получения растения, которое образует семена, содержащие эндогенное масло по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,38, предусматривающий:

a) получение семян, которые содержат масло по меньшей мере с 12%-ным содержанием стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот в масле;

b) получение семян, которые содержат масло с коэффициентом распределения выше 0,38;

c) выращивание растений из семян, полученных на стадиях a) и b) и их скрещивание;

d) сбор урожая семян потомства F1;

e) посев семян потомства F1 для выращивания растений;

f) самоопыление растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

g) тестирование семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты и коэффициента распределения , составляющего по меньшей мере 0,28;

h) посев семян с требуемыми уровнями содержания стеариновой кислоты и коэффициента распределения для выращивания растений;

i) самоопыление растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F3; и

j) возможно, повторение стадий g), h) и i) до закрепления требуемых уровней содержания стеариновой кислоты и коэффициента распределения .

Семена, которые содержат масло по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты, получают путем:

a) обработки семян подсолнечника с содержанием стеариновой кислоты менее 12% мутагенным агентом, в частности, азидом натрия или алкилирующим агентом, более конкретно, этилметансульфонатом;

b) получения из них растений, которые опыляются для получения семян;

c) тестирования семян на требуемое содержание стеариновой кислоты;

d) возможно, повторения стадий b) и c).

Семена, которые содержат масло, где коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,38, получают путем:

a) обработки семян подсолнечника со значением коэффициента распределения меньше 0,38 мутагенным агентом, в частности, азидом натрия или алкилирующим агентом, более конкретно этилметансульфонатом;

b) получения из них растений, которые опыляются для получения семян;

c) тестирования семян на значение требуемого коэффициента распределения ;

d) возможно, повторения стадий b) и c).

В альтернативном варианте, изобретение предлагает способ получения растения, которое образует семена, содержащие эндогенное масло по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, где содержание олеиновой кислоты выше, чем содержание линолевой кислоты и в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,28, предусматривающий:

a) получение семян, которые содержат масло с содержанием стеариновой кислоты по меньшей мере 12% от общего содержания жирных кислот в масле и в котором содержание олеиновой кислоты выше, чем содержание линолевой кислоты;

b) получение семян, которые содержат масло с коэффициентом распределения в масле выше 0,28;

c) скрещивание растений из семян, полученных на стадиях a) и b);

d) сбор урожая семян потомства F1;

e) посев семян потомства F1 для выращивания растений;

f) самоопыление растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

g) тестирование семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты, более высокого содержания олеиновой кислоты по сравнению с содержанием линолевой кислоты и коэффициента распределения , составляющего по меньшей мере 0,28;

h) посев семян с требуемыми уровнями содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот и коэффициента распределения для выращивания растений;

i) самоопыление растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F3; и

j) возможно, повторение стадий g), h) и i) до закрепления требуемых уровней содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот и коэффициента распределения .

Семена, которые содержат масло по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты получают путем:

a) обработки семян подсолнечника с содержанием стеариновой кислоты менее 12% мутагенным агентом, в частности, азидом натрия или алкилирующим агентом, более конкретно, этилметансульфонатом;

b) получения их них растений, которые опыляются для получения семян;

c) тестирования семян на требуемое содержание стеариновой кислоты;

d) получения семян, которые содержат масло, где содержание олеиновой кислоты выше, чем содержание линолевой кислоты;

e) скрещивания растений из семян, протестированных на стадии

c) и из семян, полученных на стадии d);

f) сбора урожая семян потомства Fl;

g) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F2;

h) тестирования семян на наличие по меньшей мере 12%-ного содержания стеариновой кислоты и более высокого содержания олеиновой кислоты по сравнению с содержанием линолевой кислоты

i) посева семян с требуемыми уровнями содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот;

j) самоопыления растений, выращенных таким образом, для получения семенного материала F3; и

k) возможно, повторения стадий h), i) и j) до закрепления требуемых уровней содержания стеариновой, олеиновой и линолевой кислот.

Семена, которые содержат масло, в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,38 получают путем:

a) обработки семян подсолнечника со значением коэффициента распределения меньше 0,38 мутагенным агентом, в частности, азидом натрия или алкилирующим агентом, более конкретно, этилметансульфонатом;

b) получения из них растений, которые опыляются для получения семян;

c) тестирования семян на значение требуемого коэффициента распределения ;

d) возможно, повторения стадий b) и c).

Изобретение также относится к гибридным растениям, полученным скрещиванием первого исходного растения, полученного описанными выше способами, и второго исходного растения с требуемыми характеристиками, для получения потомства гибридного растения. Второе исходное растение также может представлять собой растение, полученное описанным выше способом.

Изобретение также относится к применению масла в производстве пищевых продуктов и к пищевым продуктам, полученным с таким маслом или содержащим такое масло.

Более конкретно, изобретение относится к новому типу мутантного подсолнечника, который имеет улучшенный коэффициент распределения , чем предыдущие линии подсолнечника. Следовательно, такой мутант обладает улучшенными свойствами для производства маргарина, паштетов и т.д., чем доступные в настоящее время линии (Фиг.3). Самые лучшие триглицериды для маргарина представляют собой типы с распределением насыщенная-ненасыщенная-насыщенная кислота (SUS), предпочтительно триглицерид типа насыщенная-олеиновая-насыщенная кислота (SOS).

Такая новая мутантная линия, обозначенная CAS-36 и полученная технологическими способами, депонирована в ATCC и получила инвентарный номер PTA-5041. Указанный мутант имеет самое лучшее распределение TAG согласно статистической теории. В таблице 5 показаны данные для масла, полученного из образца семян некоторых растений CAS-36.

Таблица 5

Приведено содержание стеариновой кислоты, общее содержание насыщенных жирных кислот(S), отношение олеиновая/линоленовая кислота (O/L), различные группы TAG и значение коэффициента распределения в некоторых мутантных растениях CAS-36.

Растение	18:0	S	O/L	группы TAG
				SUS	SUU	UUU
CAS-36-A	28,5	37,7	0,95	32,4	41,8	23,7	0,5
CAS-36-B	28,4	38,8	0,15	35,1	46,2	18,7	0,5
CAS-36-D	31,2	39,7	0,93	35,8	44,8	18,4	0,5
CAS-36-E	38,2	47,7	0,06	49,3	44,7	6,1	0,45

В патенте США 6,475,548 приведены сравнительные характеристики эталонного паштетного продукта, изготавливаемого с необработанным маслом согласно заявке WO 95/20313, и маргарина, изготавливаемого со стеариновой фракцией масла согласно заявке WO 95/20313. Паштет, изготовленный со стеариновой фракцией, явно обладал хорошей растекаемостью при температурах, близких к температуре холодильника, надлежащим таянием во рту и стабильностью. Эксплуатационные характеристики такой жировой смеси явно были аналогичны эксплуатационным характеристикам известных высококачественных жировых составов без ненатуральных компонентов, типа гидрогенизированного жира.

Хорошо известно, что стеариновые фракции жиров можно применять в жировой фазе паштетов для решения проблем при изготовлении паштетов. Например, в патенте США 4,438,149 паштеты готовили с жировой фазой, содержащей менее 70% жира сливочного масла. Такой продукт имел слишком мягкую консистенцию. Однако когда применяли стеариновую фракцию жира, получался менее дорогостоящий и

более легко намазывающийся продукт. В патенте США 6,475,548 описан способ получения триглицеридного жира, пригодного для структуризации жидкого растительного масла или паштетов. Способ получения триглицеридного жира заключался в применении высокостеаринового, высокоолеинового подсолнечного масла (HSHOSF) по меньшей мере с 12 вес.% остатков стеариновой кислоты и по меньшей мере 40 вес.% остатков олеиновой кислоты, который подвергали мокрой фракционной перегонке или сухой фракционной перегонке и собирали стеариновую фракцию. Дополнительно в указанном выше патенте описано, что стеариновую фракцию жировой смеси получали путем обработки исходного масла HSHOSF в стандартных условиях фракционной перегонки, либо мокрой, либо сухой фракционной перегонки. Фракцию, содержащую триглицериды с >30 вес.% SUS и <40 вес.% SUU, собирали и затем, когда первые 25 вес.% твердого жира затвердевали, фракционную перегонку прекращали.

Настоящее изобретение таким же образом можно было бы использовать в способе получения триглицеридного жира с высокостеариновым, высокоолеиновым подсолнечным маслом (HSHOSF) путем мокрой фракционной перегонки или сухой фракционной перегонки и последующего сбора стеариновой фракции. Более конкретно, композицию триглицеридного жира с высокостеариновым, высокоолеиновым подсолнечным маслом (HSHOSF) по меньшей мере с 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, характеризующемуся тем, что коэффициент распределения насыщенных жирных кислот между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,28, подвергают мокрой фракционной перегонке или сухой фракционной перегонке и собирают стеариновую фракцию.

На чертежах:

Фиг.1 - цикл биосинтеза триглицерида.

Фиг.2 - теоретическое распределение типов TAG подсолнечника относительно повышенного содержания насыщенных жирных кислот, когда значение коэффициента составляет 0,5. См. надписи на фигуре, поясняющие номенклатуру TAG.

Фиг.3 - распределение триглицеридов (TAG) в семенах, демонстрирующих высокое содержание олеиновой и стеариновой кислот против содержания насыщенных жирных кислот. Теоретическое распределение, в качестве контроля, представлено в виде линий, а распределение в образцах различного масла представлено символами. См. надписи на фигуре, поясняющие номенклатуру TAG.

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано нижеследующими примерами, не ограничивающими изобретения.

ПРИМЕРЫ

Введение

Изобретение предлагает способ получения семян подсолнечника с улучшенным распределением насыщенных жирных кислот в различных типах молекул триглицеридов по сравнению с семенами дикого типа. Указанный способ предусматривает стадию обработки исходных семян мутагенным агентом в течение периода времени и в концентрации, достаточных для индуцирования одной или более мутаций генного признака, вовлеченного в биосинтез триглицеридов. Такой способ приводит к повышенному производству триглицеридов типа SUS и более низкому содержанию SUU. Указанные мутагенные агенты включают такие агенты, как азид натрия или алкилирующий агент, типа этилметансульфоната, однако также можно применять любой другой мутагенный агент с аналогичным или похожим действием. Обработанные семена будут содержать наследственные генетические изменения.

Полученные мутантные семена затем проращивали и получали из них растения потомства. Для увеличения признаков в линиях потомство можно скрещивать или подвергать самоопылению. Семена потомства собирают и анализируют. Семена с близким к случайному распределением или со случайным распределением признака триглицерида затем можно скрещивать с любой другой линией и переносить признак. Необязательно можно осуществлять дополнительные циклы проращивания, культивирования и самоопыления для закрепления гомозиготности признаков в линии, скрещивания и сбора урожая семян.

В примере 1 в качестве мутагенного агента применяли этилметансульфонат. Была получена линия подсолнечника со значением выше 0,4. Исходная линия мутагенизированного оригинального подсолнечника представляла собой CAS-10 (Sunflower Collection of Instituto de la Grasa, CSIC, Seville, Spain). Масло, полученное из такой линии, имело значение меньше 0,38. Применяемый здесь высокоолеиновый материал получен из экспериментальных русских олеиновых линий (Soldatov, 1976) со значением , находящимся между 0,15 и 0,27.

Применяемый высокоолеиновый, высокостеариновый материал получали из скрещиваний высокоолеиновой линии с мутантом CAS-3, депонированным в ATCC под инвентарным номером 75968, и селекции высокоолеиновых, высокостеариновых семян, как описано в заявке WO-0074470 «High oleic high stearic plants, seeds and oils» (Высокоолеиновые, высокостеариновые растения, семена и масла). Способы получения растения с высоким значением , с более высоким содержанием линолевой кислоты, по сравнению с содержанием олеиновой кислоты и наоборот, описаны в следующих примерах.

ПРИМЕР 1

Семена подвергали мутагенезу путем обработки раствором 70 мM этилметансульфоната (EMS) в воде. Обработку осуществляли при комнатной температуре в течение 2 часов при перемешивании (60 об/мин). После мутагенеза раствор EMS удаляли и промывали семена в течение 16 часов под струей водопроводной воды.

Обработанные семена проращивали в поле, где растения самоопылялись. Собранные от таких растений семена применяли для селекции новой линии подсолнечника с модификациями распределения в триглицериде. С помощью способа, описанного в публикации Garces R. и Mancha M. (1993), определяли состав жирных кислот в семенах и с помощью способа, описанного в публикации Fernandez-Moya и др. (2000), методом газо-жидкостной хроматографии определяли состав триглицеридов.

Селекционировали первое растение со значением , составляющим 0,42. Потомство культивировали для пяти генераций, в которых повышенное значение и новый генетический признак закреплялись

в генетическом материале семян. В полученной линии, названной CAS-36, содержание линолевой кислоты было выше, чем содержание олеиновой кислоты. Минимальное и максимальное значение линии составили соответственно 0,38 и 0,5.

В таблице 6 приведены некоторые данные, полученные при анализе семян некоторых растений CAS-36, и данные, необходимые для расчета значений согласно предлагаемой формуле.

Таблица 6

Состав жирных кислот, общее содержание насыщенных кислот (S) и насыщенных кислот в положении sn-2 (S2) TAG, состав TAG и коэффициент насыщен, рассчитанный, исходя из формулы для некоторых масел CAS-36.

ПРИМЕР 2

Растения подсолнечника выращивали из семян подсолнечника высокоолеиновой, высокостеариновой линии, типа линии, приведенной в таблице 2. Растения подсолнечника также выращивали из семян подсолнечника CAS-36. Линии скрещивали. Растения подвергались искусственному опылению, чтобы гарантировать получение семенного материала, отвечающего требованиям. Семенной материал F1 получали на высокоолеиновой, высокостеариновой линии или наоборот, и собирали урожай. Путем селекции отбирали семенной материал F2 со значением более 0,28, высоким содержанием стеариновой кислоты и более высоким содержанием олеиновой кислоты по сравнению с содержанием линолевой кислоты. Несмотря на такое получение масла согласно настоящему изобретению, уровень производства ограничен. Следовательно, требуются закрепленные инбредные линии, подтверждающие наличие семян с указанными значениями .

Такие гомозиготные закрепленные инбредные высокоолеиновые, высокостеариновые линии затем можно скрещивать для образования гибридного семенного материала, который будет образовывать семенной материал F2 с подтвержденным наличием требуемых признаков масла согласно настоящему изобретению. С этой целью семена F1 сажали и полученные растения подвергали самоопылению в изолированных условиях, получая семенной материал F2. В семенном материале F2 определяли значение . Остальную часть семян с подтвержденным наличием признака использовали для выращивания растений, чтобы образовать семенной материал F3. Способ, предусматривающий самоопыление, скрининг и селекцию повторяют до создания закрепленной гомозиготной линии со значением выше 0,28, имеющей все из значений 0,5 или около 0,5.

Как показано в таблице 7, однажды закрепленный признак, типа высокоолеиновой линии, можно скрещивать для образования гибридного семенного материала с таким признаком. Согласно изобретению растения подсолнечника и семена, из которых можно экстрагировать упомянутое масло, получали посредством биотехнологического способа. Величина значения представляет собой наследственный признак и объективно не зависит от условий выращивания.

Таблица 7

Приведено содержание стеариновой кислоты (18:0), общее содержание насыщенных жирных кислот (S), отношение олеиновая/линоленовая кислота (O/L), различные группы TAG и значение коэффициента распределения для линий, полученных от скрещиваний мутантной линии CAS-36 и высокостеариновой линии CAS-15 или CAS-24 (таблица 2). Отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию линолевой кислоты представлены в виде O/L и составляют >1, так как в отобранных путем селекции линиях содержание олеиновой кислоты выше, чем содержание линолевой кислоты.

ПРИМЕР 3

Растения подсолнечника выращивали из семян подсолнечника высоколинолевой, высокостеариновой линии типа CAS-3, CAS-30 или любой другой высоколинолевой, высокостеариновой линии, приведенных в таблице 2. Растения подсолнечника также выращивали из семян подсолнечника CAS-36. Линии скрещивали. Растения подвергались искусственному опылению, чтобы гарантировать получение семенного материала, отвечающего требованиям. Семенной материал F1 получали на высоколинолевой, высокостеариновой линии или наоборот, и собирали урожай. Путем селекции отбирали семена F2 со значением выше 0,38, высоким содержанием стеариновой кислоты и более высоким содержанием линолевой кислоты по сравнению с олеиновой кислотой.

Несмотря на такое получение масла согласно настоящему изобретению, уровень производства ограничен. Следовательно, требуются закрепленные инбредные линии, подтверждающие наличие семян с указанными значениями . Такие гомозиготные закрепленные инбредные высокоолеиновые, высокостеариновые линии затем можно скрещивать для образования гибридного семенного материала, который будет образовывать семенной материал F2 с подтвержденным наличием требуемых признаков масла согласно настоящему изобретению. С этой целью семена F1 сажали и полученные растения подвергали самоопылению в изолированных условиях, получая семенной материал F2. В семенном материале F2 определяли значение .

Остальную часть семян с подтвержденным наличием признака использовали для выращивания растений, чтобы образовать семенной материал F3. Способ, предусматривающий самоопыление, скрининг и селекцию повторяли до создания закрепленной гомозиготной линии с высоким содержанием линолевой и стеариновой кислот и значением выше 0,38, имеющей все из значений 0,5 или около 0,5. Как показано в таблице 8, однажды закрепленный признак, подобный высоко линолевой, высоко стеариновой линиям, можно скрещивать для образования гибридного семенного материала с таким признаком. Согласно изобретению растения подсолнечника и семена, из которых можно экстрагировать упомянутое масло, получали посредством биотехнологического способа. Величина значения представляет собой наследственный признак и объективно не зависит от условий выращивания.

Таблица 8

Приведено содержание стеариновой кислоты (18:0), общее содержание насыщенных жирных кислот (S), отношение олеиновая/линоленовая кислота (O/L), различные группы TAG и значение коэффициента распределения для линий, полученных от скрещиваний мутантной линии CAS-36 и любой из высоколинолевой, высокостеариновой линий, указанных в таблице 2, типа CAS-3 или CAS-30 (таблица 2). Отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию линолевой кислоты представлены в виде O/L и составляют <1, так как в отобранных путем селекции линиях содержание олеиновой кислоты ниже, чем содержание линолевой кислоты.

Линии подсолнечника	18:0	S	O/L	SUS	SUU	UUU	насыщ
HL1	31,1	36,7	0,75	31,7	46,6	21,7	0,5
HL2	31,1	39	0,42	34,8	47,5	17,8	0,49
HL3	21,1	25	0,35	15,5	43,9	40,5	0,5
HL4	14,3	23,6	0,15	13,3	44,1	42,6	0,5
HL5	30,3	43,5	0,05	41,4	45,7	12,2	0,47
HL6	32,4	44,5	0,09	41,7	47,9	9,7	0,44
HL7	36,9	47,9	0,28	47,8	43,4	7,2	0,46
HL8	31,2	40,9	0,12	36,4	49,7	13,8	0,43
HL9	30,4	42	0,29	38,2	49,6	12,2	0,43