способ пороформирования в мембранах клеток печени с помощью обработки их гемолизином ii bacillus cereus

Формула изобретения

Способ пермебиализации мембран первичных гепатоцитов, включающий обработку клеток печени пороформирующим гемолизином Hlyll Bacillus cereus, увеличивающим эффективность проникновения внутрь клеток низкомолекулярных веществ, при котором воздействуют на гепатоциты Hlyll из В.cereus в диапазоне концентраций 0,1-1 мкг/мл.

Описание изобретения к патенту

Описание изобретения

Изобретение относится к молекулярной медицине, а именно к экспериментальной гепатологии, и может применяться как в диагностической практике, так и для исследовательских целей.

Уровень техники

Повышение проницаемости клеточных мембран, называемое термином "пермеабилизация", достигается за счет формирования в мембранном слое клеток поровых каналов. Эффективный транспорт различных веществ осуществляется через сформированные поровые каналы. Предлагаемый способ направлен на пермеабилизацию внешней цитоплазматической мембраны первичных гепатоцитов с целью повышения эффективности транспорта в них низкомолекулярных веществ с молекулярным весом менее 4 килодальтон и диаметром молекул менее 2 нанометров.

Первичными гепатоцитами являются гепатоциты, выделенные для исследования непосредственно из тканей печени. Гепатоциты - основной тип клеток, составляющий более 70% от всех клеток печени, к основным функциям которых относятся синтез и распад белков, дезаминирование и переаминирование аминокислот, синтез и окисление жирных кислот, кетогенез, различные превращения углеводов в процессах гликолиза, гликогенеза, гликогенолиза, глюконеогенеза, переработка токсичных соединений и ряд других процессов, протекающих в паренхиме печени. При изучении основных функций первичных гепатоцитов, а также культивируемых гепатоцитов перевиваемых клеточных линий применяют метод пермеабилизации их мембран с целью введения внутрь клеток печени широкого спектра низкомолекулярных соединений и ионов. Наиболее важными для медицинской практики функциями гепатоцитов, в частности их роли при развитии атеросклероза, являются регуляция в организме уровня холестерина, его синтез, этерификация, транспорт и выведение из печени, синтез и транспорт липопротеинов высокой, низкой и очень низкой плотности. К другим функциям гепатоцитов относится как регуляция синтеза желчных кислот и образование желчных камней, так и ожирение, возникновение различных типов фиброзов, циррозов, токсикация клеток печени лекарствеными препаратами, а также токсинами, в частности этанолом. Известны работы по транспорту через пермеабилизованные мембраны первичных гепатоцитов молекул глюкозы, глюкозо-6 фосфата, фруктозо-2,6 бифосфата, фруктозо-6 фосфата, трегалозы, молекул АТФ, ГТФ, цАМФ, ионов Са²⁺ , Mg²⁺ Mn²⁺, СГ, флуоресцентного красителя пропидиум иодида. В этих работах исследовались особенности метаболизма гепатоцитов на стадии гликолиза, гликогенеза, липогенеза, изучалась регуляция ионами Са²⁴ активности гидролаз, фосфатаз, нуклеаз, а также определялась степень повреждения клеточных мембран первичных гепатоцитов. Пермеабилизация мембран гепатоцитов использовалась при исследовании активностей аланин, аспартат, гамма-глутамил аминотрансфераз и щелочной фосфатазы, определение концентраций которых является основным стандартным тестом в диагностике патологий печени.

С применением пермеабилизации мембран гепатоцитов изучался эффект накопления в печени лекарственных препаратов, который наблюдается при длительном приеме этих лекарств. Также изучалось действие известных препаратов для терапии сердечно-сосудистой системы, таких как гликозиды дигидрокварцетин и ресвератрол, а также препарата уродезоксихолиевой кислоты уросан, применяющегося при лечении распространенных патологий печени. В связи с широким применением методов пермеабилизации мембран гепатоцитов в молекулярной медицине разработка новых способов их пермеабилизации является актуальной.

Известны несколько способов, применяющихся для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов путем образования в них поровых каналов различного размера. К способам, основанным на формировании поровых каналов нефиксированного размера, относятся электропермеабилизация [Gordon et al., 1982], а также пермеабилизация неионными детергентами, такими, как сапонин [Post et al., 1992], тритон Х-100 [Baker et al., 2004] и дигитонин [Gnoni et al., 2009].

Из всех используемых в настоящее время способов пермеабилизации наиболее широко применяется обработка мембран гепатоцитов неионным детергентом дигитонином. Данный способ пермеабилизации основан на формировании в клеточной мембране мицелл, состоящих из сорбирующихся на поверхности мембран молекул дигитонина. В зависимости от концентрации дигитонина изменяются свойства формируемых при этом поровых каналов. При концентрации дигитонина около 30-50 мкг/мл формируемые ионоселективные каналы диаметром около 1 нм, проницаемые только для одно- и двухвалентных ионов, заменяются неселективными перовыми каналами диаметром в несколько десятков нанометров.

Поэтому основным недостатком, присущим для способа пермеабилизации мембран дигитонином, так же, как и для пермеабилизации всеми другими известными неионными детергентами, является формирование в клеточных мембранах поровых каналов неконтролируемого диаметра. Этот недостаток усложняет подбор условий пермеабилизации и анализ получаемых результатов, так как при данных способах пермеабилизации наблюдается транспорт через мембрану не только необходимых для исследования низкомолекулярных соединений, но и соединений других размеров. Также через поровые каналы диаметром несколько десятков нанометров может происходить выход из клетки белков, имеющих важное значение при проведении исследований.

Другим недостатком способов пермеабилизации с применением неионных детергентов является то, что неионные детергенты сами являются низкомолекулярными веществами и поэтому способны проникать через формируемые ими поровые каналы внутрь обрабатываемых клеток. Данный процесс приводит к повышению проницаемости не только внешней цитоплазматической мембраны, но и к нарушению целостности внутриклеточных мембран эндоплазматического ретикулума, лизосом, а также мембран митохондрий и ядра.

Указанные недостатки устраняются тем, что для пермеабилизации клеточных мембран используют пороформирующие гемолизины, такие как стрептолизин О из Streptococcus pyogenes [Houweling et al., 1996] и альфа-токсин из Staphylococcus aureus [Cascante et al., 2000], которые формируют в мембранах более сложные по строению поровые каналы фиксированных размеров.

Из недостатков способов пермеабилизации бактериальными токсинами отмечено, что через формируемые стрептолизином О поровые каналы диаметром около 30 нанометров также возможен выход из цитоплазмы обрабатываемых клеток крупных белковых молекул. Вместе с тем, через формируемые альфа-токсином поровые каналы диаметром около 2 нанометров как выход белковых молекул из клетки, так и вход молекул данного гемолизина внутрь клетки не происходит. Применение данного способа пермеабилизации исключает формирование поровых каналов на внутриклеточных мембранах. Учитывая преимущества данного способа, пермеабилизация мембран гепатоцитов альфа-токсином [McEwen et al., 1985; Stals et al., 1992; Cascante et al., 2000] принята за прототип заявляемого способа.

Основным недостатком выбранного способа прототипа для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов является применение высоких концентраций альфа-токсина в диапазоне от 10 мкг/мл [Cascante et al., 2000] до 100 мкг/мл [Stals et al., 1992; Geeraert et al., 1997], а также более 200 мкг/мл [Cheung et al., 1989]. Вместе с тем отмечено, что высокие концентрации этого токсина могут приводить к значительным нарушениям мембран гепатоцитов и в некоторых случаях не позволяют применять данный способ для пермеабилизации гепатоцитов альфа-токсином [Bladergroen et al., 1998].

Данный недостаток указывает на отсутствие к настоящему моменту способа пермеабилизации, удовлетворяющего всем требованиям для повышения проницаемости мембран первичных гепатоцитов, и предполагает поиск способов пермеабилизации мембран гепатоцитов другими бактериальными пороформирующими гемолизинами.

Указанный недостаток способа прототипа устраняется тем, что предлагается способ пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов, включающий их обработку препаратом гемолизина II из Bacillus cereus, проявляющим высокую пороформирующую активность при низких концентрациях данного токсина. Используемый в заявляемом способе гемолизин II из Bacillus cereus формирует стабильные поровые каналы диаметром 1,4-1,6 нанометров как в искусственных, так и в мембранах различных типов клеток [Andreeva et al., 2006; Andreeva et al., 2007; Sineva et al., 2009; Tran et al., 2011] при концентрациях не более 1 мкг/мл. Показано, что гемолизин II проявляет более высокую активность по сравнению с альфа-токсином при его действии на мембраны некоторых типов культивируемых клеток. Было отмечено, что в отличие от использования альфа-токсина в концентрациях более 10 мкг/мл [Riedinger et al., 2005] при обработке культур клеток препаратами HlyII в концентрациях менее 1 мкг/мл проницаемость мембран этих клеток для флуоресцентных красителей пропидиум иодида и JC-1 повышалась [Andreeva et al., 2006]. Также было показано, что HlyII имеет примерно в 15 раз более высокую пороформирующую активность в сравнении с альфа-токсином при действии на мембраны эритроцитов человека, что приводит к эффективному гемолизу этих клеток под действием гемолизина II [Miles et al., 2002; Andreeva et al., 2006].

В настоящее время нет сообщений, описывающих действие HlyII на мембраны первичных гепатоцитов, а также отсутствует определение условий для эффективного введения в обработанные этим гемолизином гепатоциты низкомолекулярных веществ.

Сущность изобретения

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение проницаемости внешних цитоплазматических мембран первичных гепатоцитов при проведении обработки их высокоочищенным препаратом HlyII, получаемым из условно патогенных почвенных бактерий Bacillus cereus и обладающим высокой мембранной пороформирующей активностью.

Поставленная цель достигается выделением и очисткой препарата гемолизина II из рекомбинантного штамма Escherihia coli и его инкубированием с первичными гепатоцитами из печени мыши, после чего пермеабилизованные первичные гепатоциты окрашиваются различными низкомолекулярными флуоресцентными красителями и на основе полученных результатов определяются оптимальные условия повышения проницаемости мембран обработанных гемолизином первичных гепатоцитов.

Сущность предлагаемого способа пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов при обработке их HlyII заключается в следующем: 1) из печени лабораторных животных выделяются гепатоциты, часть из которых, в качестве опытной пробы, инкубируется различное время при 20°С в растворе фосфатно-солевого буфера или в культуральной среде без сыворотки, содержащей различные концентрации препарата гемолизина II, после чего обработанные гепатоциты в опытной пробе инкубируются с флуоресцентными красителями; 2) другая часть выделенных гепатоцитов инкубируется в качестве контрольной пробы в том же растворе фосфатно-солевого буфера или в культуральной среде без сыворотки, содержащей флуоресцентные красители в тех же условиях, как в опытной пробе, но без добавления в контрольную пробу препарата гемолизина II;

3) проводится измерение интенсивности флуоресценции в соответствующих диапазонах длин волн для опытных и контрольных проб первичных гепатоцитов. По разности в интенсивности флуоресценции контрольных и опытных проб гепатоцитов, обработанных HlyII, определяются условия, необходимые для максимально эффективной пермеабилизации клеточных мембран первичных гепатоцитов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Приготовление и тестирование препарата HlyII.

Для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов используется препарат HlyII (источником гена гемолизина II является штамм Bacillus cereus, депонированный в ВКМ под номером В771), выделенный из рекомбинантного штамма Escherihia coli Z85 (PUJ2) как описано ранее [Andreeva et al., 2006]. Препарат белка HlyII имеет чистоту 99%, определенную электрофоретически и хранится в концентрации 20 мкг/мл в буфере, содержащем 20 мМ К-PO₄ рН 7,2, 40 мМ NaCl, 10% глицерина при минус 20°С. Препарат HlyII, используемый для пермеабилизации первичных гепатоцитов, имеет удельную активность примерно 400 ГЕ на мкг белка. Тестирование гемолитической активности проводится на эритроцитах человека с помощью методики, основанной на спектрофотометрической регистрации гемоглобина, высвобождающегося при лизисе эритроцитов. Определение гемолитической активности осуществляется как описано ранее [Andreeva et al., 2006]. Эритроциты отмываются в изотоническом растворе NaCl и ресуспендируются до конечной концентрации 1% в буфере ФСБ (74 мМ Na - фосфатный буфер (рН 6,8), содержащем 77 мМ NaCl). Исходный препарат гемолизина разводится в том же буфере, содержащем 1% суспензию эритроцитов, и инкубируется 30 мин при 37°С. Контролем служит проба с суспензией эритроцитов без гемолизина и проба, полученная осмотическим шоком суспензии эритроцитов при помощи добавления воды.

После инкубации пробы центрифугируются 1 мин и измеряется оптическая плотность супернатанта при длине волны 545 нм. За единицу гемолитической активности (ГЕ) принято количество гемолизина, вызывающего лизис половины клеток в 1 мл 0,5%-ной суспензии эритроцитов в ФСБ (рН 6,8) за 30 мин при 37°С. Препарат HlyII, используемый для обработки мембран первичных гепатоцитов, с исходным уровнем активности до 10000 ГЕ/мл, стабилен в течение не менее 6 месяцев хранения при температуре минус 20°С. Допускается уменьшение активности препарата на 10% при его хранении в данных условиях более года. При получении HlyII в концентрациях, превышающих 100 мкг/мл, препарат нестабилен и может агрегировать с уменьшением пороформирующей активности. При более высоких температурах, а именно, при инкубации препарата в течение 30 минут при 37°С его активность уменьшается примерно на 50%. Учитывая нестабильность используемого для пермеабилизации препарата HlyII при повышенных температурах все процедуры с ним проводятся в ледяной бане. При этом связывание HlyII с мембранами эритроцитов происходит очень быстро за несколько секунд при любой температуре и встроенный в эти мембраны гемолизин II стабилен [Andreeva et al., 2007]. При размораживании препарата и его добавлении к первичным гепатоцитам при комнатной температуре все процедуры проводятся по возможности в течение первых нескольких (3-5) минут после размораживания препарата.

Пример 2. Выделение первичных гепатоцитов из печени лабораторных животных для последующей обработки их HlyII.

Выделение первичных гепатоцитов осуществляется по стандартной методике с некоторыми модификациями, которые определяются особенностями их дальнейшей обработки препаратом HlyII. Выделение первичных гепатоцитов реализуется следующим образом. Под эфирным наркозом у 3-месячных мышей самцов проводят вскрытие брюшной полости, извлекают печень, переносят ее на чашку Петри и промывают 1 мл фосфатно-солевого буфера ФБС. Печень измельчают на 3-5 мм кусочки шириной 1 мм и весом не более 1 г, которые переносят в 1,5 мл пробирки Eppendorf, содержащие по 1 мл среды DMEM в модификации Дульбекко с 1 мМ ЭДТА. Пробы перемешивают на мешалке в течение 5 минут при 60 об/мин. После суспендирования пробы центрифугируют при 1000 об/мин при температуре 20°С в течение 1-2 минут до появления на дне пробирок клеточного осадка. Полученный супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл свежей среды DMEM без сыворотки и осадок вновь суспендируют. Для полного удаления поврежденных клеток и клеточных обломков проводят трех-четырехкратную процедуру промывки гепатоцитов в 1 мл клеточной среды DMEM. Промытые пробы инкубируют 30 минут при 37°С в 0,2 мл раствора среды DMEM без Са²⁺ и Mg²⁺ с добавлением фермента коллагеназы IV (Sigma, США) в концентрации 50 мкг/мл и гиалуронидазы (Sigma, США) в концентрации 100 мкг/мл. После энзиматической обработки мембран гепатоцитов этими ферментами повторяют трехкратную процедуру промывки клеток 1 мл среды DMEM для полного удаления из проб этих ферментов. Промытые осадки ресуспендируют в минимальном объеме ростовой среды DMEM, часть полученной клеточной суспензии инкубируют в 1% растворе трипанового синего и переносят в камеру Горяева для стандартного определения количества жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток около 3×10⁶ кл./мл. Полученную клеточную суспензию гепатоцитов высевают в 96 луночные плашки (Nunc), дополнительно обработанные 0,2% раствором желатина (Sigma, США) из расчета плотности посева 6×10 клеток/см². Высеваемые клетки инкубируют в среде DMEM модификации Дульбекко без сыворотки, с добавлением до 10 мМ Hepes (Sigma, США) рН 6,8, а также 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл пенициллина. Плашки с засеянными гепатоцитами помещают в термостат для прикрепления клеток на поверхности плашек при температуре 37°С в течение 3,5-4 часов инкубирования. По окончании инкубирования лунки промывают избытком среды DMEM в модификации Дульбекко без ЭДТА с добавлением 2 мМ CaCl₂ с интенсивностью, определяемой степенью прикрепленности гепатоцитов к поверхности плашек. Промывку повторяют до полного удаления из лунок клеточного детрита, образованного из остатков первичных гепатоцитов, а также неприкрепившихся элементов крови, гемопоэтических клеток и фрагментов из нескольких клеток, оставшихся после гомогенизации исходных кусочков печени. Оценку промытых проб проводят под микроскопом с помощью окулярной морфометрической сетки, подсчитывая число прикрепившихся гепатоцитов при увеличении ×400, с учетом прикрепления к плашке не менее 100 клеток, наблюдаемых в поле объектива фотокамеры. Часть лунок используют для повторного определения целостности мембран, прикрепившихся к плашкам гепатоцитов, при помощи их окраски стандартным красителем трипановым синим.

Пример 3. Окрашивание проб первичных гепатоцитов флуоресцентным красителем пропидиум иодидом.

Для измерения интенсивности флуоресценции обрабатываемых проб гепатоцитов проводится предварительное определение условий линейной зависимости величины флуоресценции от числа клеток в исследуемых пробах. Для этого регистрируется контрольное фоновое окрашивание 0,2 мл раствора среды DMEM с 2-кратными разведениями проб суспендированных гепатоцитов. В пробах используются гепатоциты, полученные на стадии после энзиматической обработки мембран гепатоцитов ферментами коллагеназой и гиалуронидазой, как описано в примере 2. После трехкратной промывки клеток 1 мл среды DMEM и полного удаления этих ферментов из проб к разведенным 0,2 мл аликвотам суспензионной культуры первичных гепатоцитов в 1,5 мл пробирках Eppendorf добавляется раствор 100 мкг/мл красителя пропидиум иодида до конечной концентрации 1, 3, 5 и 10 мкг/мл, после чего пробы инкубируются в течение 1 часа. Окрашенные пробы центрифугируют при 1000 об/мин при температуре 20°С в течение 1-2 минут, добавляют 0,2 мл среды DMEM без сыворотки, осадок суспендируют и пробы переносят в 96 луночные плашки. Интенсивность флуоресценции окрашенных проб с максимальным уровнем фонового окрашивания пропидиум иодидом для клеток с ненарушенными мембранами исследуется при помощи флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия) при 100, 200 и 800-кратном увеличении. Обработка изображений проб гепатоцитов с флуоресценцией при 610 нм проводится с использованием программ Photoshop Adobe CS и Image J. Выбранные условия линейной зависимости интенсивности флуоресценции от количества окрашенных клеток используются для последующего определения условий пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов под действием HlyII.

Пример 4. Определение оптимальных условий пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов.

Пробы первичных гепатоцитов, культивируемые на стадии рассева в плашки, как описано в примере 2, обрабатываются различными концентрациями очищенного HlyII. Препарат HlyII, полученный и охарактеризованный, как описано в примере 1, инкубируется с первичными гепатоцитами, прикрепившимися к поверхности плашек, в объеме 0,2 мл среды DMEM модификации Дульбекко без сыворотки с добавлением до 10 мМ Hepes. В каждую лунку с клетками добавляется препарат HlyII до конечной концентрации 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл HlyII. Продолжительность обработки гепатоцитов пороформирующим агентом составляет 2, 5, 10, 30 и 60 минут инкубации при 20°С. После обработки проб гепатоцитов препаратом HlyII лунки плашек 3-кратно промываются 0,2 мл среды DMEM модификации Дульбекко без сыворотки с 10 мМ Hepes, после чего добавляются аликвоты красителя пропидиум иодида до конечной концентрации 1, 3, 5 и 10 мкг/мл, как определено в примере 3. Регистрация интенсивности флуоресценции проб при 610 нм осуществляется через 2-3 минутные интервалы времени в течение 1-1,5 часов в условиях, определенных на стадии, описанной в примере 3. Обработка изображений проб гепатоцитов проводится с использованием программ Photoshop Adobe CS и Image J.

Количественная оценка эффективности пермеабилизации первичных гепатоцитов (П) препаратами HlyII в опытных пробах расчитывается по формуле:

П=[(Ф1-Ф0)/К1]/[(Ф2-Ф0)/К2]×100

где Ф0 - фоновое значение флуоресценции,

Ф1 - интенсивность флуоресценции тестируемой пробы,

Ф2 - интенсивность флуоресценции пробы, принятой за максимально пермеабилизованную, полученную обработкой 6×10⁴ гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 10 мкг/мл в объеме 1 мл ростовой среды при температуре 20°С в течение 1 часа инкубации.

К1 и К2 - число гепатоцитов в пробах Ф1 и Ф2, соответственно.

Статистическая обработка данных проводится с помощью пакета программ Microsoft Excel.

При обработке первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 минут величина флуоресценции включенного в гепатоциты пропидиум иодида составляет 25%, а при инкубации в течение 1 часа - 80% максимально возможного. Наблюдается зависимость увеличения пермеабилизации мембран гепатоцитов от их обработки различными концентрациями очищенного HlyII. При обработке гепатоцитов увеличенной до 10 мкг/мл концентрацией HlyII та же величина флуоресценции включенного в гепатоциты пропидиум иодида достигается за 2 и 10 минут инкубации клеток с HlyII соответственно.

Пример 5. Повышение проницаемости мембран первичных гепатоцитов при обработке их минимальными концентрациями HlyII. Определение условий обратимой пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов.

При обработке мембран первичных гепатоцитов низкими концентрациями HlyII также детектируется увеличение проницаемости мембран гепатоцитов для транспорта молекул пропидиум иодида внутрь обрабатываемых клеток. При инкубации первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 10 минут величина флуоресценции включенного в гепатоциты пропидиум иодида достоверно детектируется, составляя 5%, а при инкубации в течение 1 часа достигая 20% максимально возможного. Эти результаты указывают на высокоэффективную пороформирующую активность препарата гемолизина II (HlyII) из бактерий Bacillus cereus на мембранах первичных гепатоцитов. Наблюдаемое образование поровых каналов в мембранах гепатоцитов под действием HlyII в концентрации около 0,1 мкг/мл носит временный характер, то есть является обратимой пермеабилизацией мембран. Тестирование стабильности поровых каналов, обработанных низкими концентрациями HlyII, показывает уменьшение проницаемости мембран гепатоцитов для пропидиум иодида в течение нескольких часов после их обработки гемолизином. При контрольной обработке первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 часа и последующей окраске клеток пропидиум иодидом пермеабилизация мембран гепатоцитов составляет около 20% максимально возможной. Обработка первичных гепатоцитов препаратом HlyII в этих же условиях, но с отложенным на 4-12 часов окрашиванием клеток пропидиум иодидом, уменьшает интенсивность флуоресценции включенного внутрь клеток красителя, что указывает на уменьшение числа поровых каналов, образованных HlyII в мембранах гепатоцитов. При обработке первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 часа и последующем культивировании обработанных в таких условиях клеток в 1 мл ростовой среды DMEM в модификации Дульбекко с добавлением 1% сыворотки и 0,2% соды в течение 12 часов при 37°С с последующей окраской клеток пропидиум иодидом, флуоресценция красителя, включаемого в такие гепатоциты, не детектируется, составляя менее 1% максимально возможного.

Пример 6. Обработка проб первичных гепатоцитов препаратом HlyII и окрашивание красителем флуоресцеином.

Условия обработки первичных гепатоцитов HlyII для оценки эффективности пермеабилизации их мембран при помощи окраски флуоресцеином повторяются, как описано в примере 4. Флуоресцеин натрия также используется в качестве низкомолекулярного красителя, который не способен проходить через неповрежденные мембраны и проникает только в клетки с поврежденной цитоплазматической мембраной. При облучении флуоресцеина синим светом (абсорбция от 465 до 490 нм), наблюдается желто-зеленая флуоресценция с длиной волны от 520 до 530 нм. После обработки первичных гепатоцитов препаратом HlyII в условиях, аналогичных описанным в примере 4, обработанные гепатоциты окрашиваются инкубацией их в насыщенном растворе флуоресцеина натрия в фосфатно-солевом буфере в течение 30 минут. После окрашивания раствором флуоресцеина обработанные клетки интенсивно отмываются в фосфатно-солевом растворе с 3-кратной сменой буфера в течение 3 минут. При обработке гепатоцитов препаратом HlyII в концентрациях 1 мкг/мл и 10 мкг/мл в течение от 2 до 60 минут происходит эффективное окрашивание гепатоцитов флуоресцеином, достигающее 90% максимально возможной эффективности. Окраска первичных гепатоцитов флуоресцеином после их обработки очищенным препаратом HlyII более чувствительна по сравнению с окраской пермеабилизованных HlyII гепатоцитов пропидиум иодидом на 30-50%. В результате обработки первичных гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 часа величина флуоресценции включенного в клетки флуоресцеина превышает на 30%, а при инкубации в течение 2 минут на 50% величину максимальной флуоресценции пропидиум иодида, включенного в обработанные в тех же условиях первичные гепатоциты.

Пример 7. Проведение контрольных измерений при тестировании пороформирующей активности HlyII.

Контрольные измерения пороформирующей активности препаратов HlyII при подавлении данной активности в результате инкубации первичных гепатоцитов с препаратами ПЭГ 6000 проводятся в условиях, как описано в примере 4. При обработке гепатоцитов препаратом HlyII в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 минут эффективность пермеабилизации их мембран составляет 25% максимально возможной. При инкубации HlyII пермеабилизованных гепатоцитов с 10 мМ ПЭГ 6000 эффективность последующего проникновения пропидиум иодида внутрь клеток уменьшается до значений фоновой интенсивности флуоресценции первичных гепатоцитов и составляет менее 1% максимально возможного уровня флуоресценции. Данные результаты блокирования транспорта пропидиум иодида в клетки подтверждают, что при обработке мембран гепатоцитов препаратом HlyII происходит повышение их проницаемости для транспорта внутрь клетки низкомолекулярных соединений, который эффективно блокируется молекулами ПЭГ 6000. Также контрольное измерение уменьшения пороформирующей активности HlyII при предварительном нагревании препарата белка HlyII косвенно подтверждает, что повышение проницаемости мембран гепатоцитов определяется действием на мембраны гепатоцитов белка HlyII. Показано подавление пороформирующей активности HlyII в результате инкубации препарата гемолизина в течение нескольких минут при 60°С. При обработке первичных гепатоцитов 10 мкг/мл HlyII, предварительно прогретым в течение 10 минут при 60°С, в условиях эффективного порообразования, как описано в примере 4, пермеабилизация мембран гепатоцитов не детектируется (менее 1% максимально возможного уровня флуоресценции).

Пример 8. Сравнение эффективности пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов при обработке проб препаратами HlyII и неионным детергентом дигитонином.

Оценка максимально высокого уровня пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов, которая может быть достигнута при обработке гепатоцитов препаратами HlyII и неионным детергентом дигитонином, проводится как описано в примере 4. Для определения максимального уровня пермеабилизации мембран гепатоцитов используются условия, описанные в примере 4, за исключением того, что вместо HlyII мембраны гепатоцитов обрабатываются наиболее часто применяемыми для данных целей неионными детергентами дигитонином, сапонином, эсцином и тритоном Х-100.

Сравнительная количественная оценка эффективности пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов (П), которая достигается в результате их обработки препаратами HlyII и неионными детергентами, также расчитывается по формуле:

П=[(Ф1-Ф0)/К1]/[(Ф2-Ф0)/К2]×100.

В отличие от определений эффективности HlyII пермеабилизации, описанной в примере 4, при расчете эффективности пермеабилизации неионными детергентами значение Ф2 означает максимальную пермеабилизацию гепатоцитов препаратом 0,2% тритона Х-100, принятую за 100%.

В данном примере проводится определение эффективности пороформирования мембран гепатоцитов с использованием неионного детергента дигитонина в концентрации 80 мкг/мл, принимаемого за стандартный положительный контроль пороформирования.

Также проводится определение эффективности пороформирования при действии на мембраны гепатоцитов неионного детергента сапонина в концентрации 30 мкг/мл, используемого в качестве другого стандартного положительного контроля пороформирования.

Определение максимальной эффективности пороформирования проводится с использованием неионного детергента тритона Х-100 в концентрации 0,2%, при применении которого наблюдается полное разрушение мембран первичных гепатоцитов.

Сравнительная оценка пороформирующей активности препаратов HlyII и неионных детергентов проводится при обработке гепатоцитов во всех пробах в течение 1 часа. При данной обработке первичных гепатоцитов достигается высокая эффективность пермеабилизации HlyII мембран гепатоцитов, которая составляет 90% активности дигитонина при условии использования дигитонина в концентрациях не более 80 мкг/мл, не приводящих к полному разрушению внешней мембраны обрабатываемых гепатоцитов. При сравнении пороформирующей активности HlyII и дигитонина также отмечается, что при низких концентрациях гемолизина и дигитонина пороформирующее действие HlyII в сравнении с дигитонином более эффективно, что может способствовать практическому использованию гемолизина II Bacillus cereus для пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов.

Пример 9. Оценка влияния гликокаликсного слоя мембран первичных гепатоцитов на эффективность их пермеабилизации препаратом HlyII.

Высокая пороформирующая активность HlyII тестируется, как описано в примерах 4-8, на мембранах гепатоцитов с обработанным слоем гликокаликса, являющимся защитным барьером на внешней стороне плазмолеммы, образованным полимерами на основе гиалуроновой кислоты с погруженными в них молекулами различных белков. При определении активности препаратов HlyII на мембранах первичных гепатоцитов, необработанных мембраноактивными ферментами коллагеназой и гиалуронидазой также детектируется эффективное HlyII пороформирование в мембранах несуспендированных гепатоцитов в составе фрагментов ткани печени, поверхность которых доступна для белка HlyII. После трех-четырехкратной процедуры промывки гепатоцитов в 1 мл клеточной среды DMEM, как описано в примере 2, и обработки промытых проб препаратом HlyII в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 минут, величина флуоресценции включенного в энзиматически не обработанные гепатоциты красителя пропидиум иодида составляет 15%, а при инкубации в течение 1 часа - 40% максимально возможного.

Также наблюдается возрастание пороформирующей активности HlyII на первичных гепатоцитах, выделенных без энзиматической обработки, при последующей инкубации их в течение 10 минут отдельно с ферментом гиалуронидазой (100 мкг/мл) и коллагеназой IV (50 мкг/мл) до 70% и 50% соответственно в сравнении с максимальным уровнем пермеабилизации, описанным в примере 4. Обработка мембран гепатоцитов этими концентрациями ферментов в течение 1 часа повышает эффективность пороформирующей активности HlyII до 90% и 70% соответственно от максимального уровня пермеабилизации гепатоцитов, описанного в примере 4.

Таким образом, как показано в примерах 4-9, предлагаемый способ пермеабилизации мембран первичных гепатоцитов позволяет увеличивать проницаемость мембран гепатоцитов для низкомолекулярных соединений путем обработки их 0,1-1 мкг/мл концентрациями HlyII из бактерий Bacillus cereus до 90% максимально возможного уровня пермеабилизации данных клеток.

В связи с тем, что использование существенных признаков предлагаемого способа, включающих пермеабилизацию мембран первичных гепатоцитов низкими концентрациями HlyII из Bacillus cereus, в научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данный способ отвечает критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".

ТАБЛИЦА

Пояснение к таблице.

В таблице представлены данные по повышению проницаемости мембран первичных гепатоцитов после обработки их препаратами HlyII Bacillus cereus и неионными детергентами, как описано в примерах 4-8.

Эффективность пороформирования в мембранах первичных гепатоцитов,определяемая по величине внутриклеточной флуоресценции пропидиум иодида
Пороформирующий агент	Концентрация пороформирующего агента	Время обработки гепатоцитов пороформирующим агентом	Эффективность флуоресценции пропидиум иодида (%)
Гемолизин II	0,1 мкг/мл	10 мин	5
Гемолизин II	0,1 мкг/мл	60 мин	20
Гемолизин II	1 мкг/мл	10 мин	25
Гемолизин II	1 мкг/мл	60 мин	80
Гемолизин II	10 мкг/мл	2 мин	30
Гемолизин II	10 мкг/мл	10 мин	80
Сапонин	50 мкг/мл	60 мин	90
Дигитонин	80 мкг/мл	60 мин	90
Тритон Х-100	0,2%	10 мин	100
Гемолизин II	1 мкг/мл	10 мин	Менее 1
ПЭГ 6000	10 мМ
Инактивация HlyII нагреванием 10 мин при 60°С	10 мкг/мл	60 мин	Менее 0,1

Литературные источники:

Andreeva ZI, Nesterenko VF, Yurkov IS, Budarina ZI, Sineva EV, Solonin AS. Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II // Protein Expr Purif. 2006 V.47(l) P. 186-93.

Andreeva ZI, Nesterenko VF, Fomkina MG, Ternovsky VI, Suzina NE, Bakulina AY, Solonin AS, Sineva EV. The properties of Bacillus cereus hemolysin II pores depend on environmental conditions // Biochim Biophys Acta. 2007 V.I 768(2) P.253-63.

Baker PR, Cramer SD, Kennedy M, Assimos DG, Holmes RP. Glycolate and glyoxylate metabolism in HepG2 cells // Am J Physiol Cell Physiol. 2004 V.287 (5) P.C 1359-65.

Bladergroen BA, Geelen MJ, Reddy AC, Declercq PE, Van Golde LM. Channelling of intermediates in the biosynthesis of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells // Biochem J. 1998 V.334 (Pt 3), P.511-7.

Cascante M, Centelles JJ, Agius L. Use of alpha-toxin from Staphylococcus aureus to test for channelling of intermediates of glycolysis between glucokinase and aldolase in hepatocytes // Biochem J. 2000 V.352 (Pt 3), P.899-905.

Cheung CW, Cohen NS, Raijman L. Channeling of urea cycle intermediates in situ in permeabilized hepatocytes // J Biol Chem. 1989 V.264(7) P.4038-44.

Geeraert L, Mannaerts GP, van Veldhoven PP. Conversion of dihydroceramide into ceramide: involvement of a desaturase // Biochem J. 1997 V.327 (Pt 1) P.125-32.

Gnoni GV, Paglialonga G, Siculella L. Quercetin inhibits fatty acid and triacylglycerol synthesis in rat-liver cells // Eur J Clin Invest. 2009 V.39(9) P.761-8.

Gordon PB, Seglen PO. Autophagic sequestration of [14C] sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization // Exp Cell Res. 1982 V.142(1) P.1-14.

Houweling M, Cui Z, Anfuso CD, Bussiere M, Chen MH, Vance DE. GTP: phosphocholine cytidylyltransferase is both a nuclear and cytoplasmic protein in primary hepatocytes // Eur J Cell Biol. 1996 V.69(l) P.55-63.

McEwen BF, Arion WJ. Permeabilization of rat hepatocytes with Staphylococcus aureus alpha-toxin // J Cell Biol. 1985 V.I 00(6) P.1922-9.

Miles G, Bayley H, Cheley S. Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore // Protein Sci. 2002 V 7 P.1813-24.

Post SR, Miyazaki H, Tager HS. Identification of a Mg(2+)- and guanyl nucleotide-dependent glucagon receptor cycle by use of permeabilized canine hepatocytes // J Biol Chem. 1992 V.267(36) P.25776-85.

Riedinger HJ, Eger F, Trummler K, Probst H. Replication of simian virus 40 (SV40) DNA in virus-infected CV1 cells selectively permeabilized for small molecules by Staphylococcus aureus alpha-toxin // Biochem J. 2005 V.386 (Pt 3), P.557-66.

Sineva EV, Andreeva-Kovalevskaya ZI, Shadrin AM, Gerasimov YL, Ternovsky VI, Teplova VV, Yurkova TV, Solonin AS. Expression of Bacillus cereus hemolysin II in Bacillus subtilis renders the bacteria pathogenic for the crustacean Daphnia magna II FEMS Microbiol Lett. 2009 V.299(1)P.110-9.

Stals HK, Mannaerts GP, Declercq PE. Factors influencing triacylglycerol synthesis in permeabilized rat hepatocytes // Biochem J. 1992 V.283 (Pt 3) P.719-25.

Tran SL, Guillemet E, Ngo-Camus M, Clybouw C, Puhar A, Moris A, Gohar M, Lereclus D, Ramarao N. Haemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages // Cell Microbiol. 2011 V.13 (1) P.92-108.

Tran SL, Puha A, Ngo-Camus M, Ramarao N. Trypan Blue Dye Enters Viable Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII of Bacillus cereus II. PLoS ONE 2011 V.6, Issue 9,| e22876.