способ получения форм картофеля сорта скороплодный in vitro, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза

Формула изобретения

Способ получения форм картофеля сорта Скороплодный in vitro, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза, заключающийся в том, что стеблевые и листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений сорта «Скороплодный», помещают в чашки Петри с жидкой средой следующего состава:

Макросоли по Мурасиге-Скугу (МС)	50,0 мл/л
Микросоли по МС	1,0 мл/л
CaCl2	348,5 мг/л
Fe - хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Нафтилуксусная кислота (НУК)	5,0 мг/л
Бензиламинопурин	0,2 мг/л
Дистиллированная вода	до 1 л среды
рН	5,8

и прединкубируют в течение 18-24 часов и температуре 22-24° С, затем вносят пипеткой 300 мкл на одну чашку ночной суспензионной культуры агробактерии, несущей плазмиду с геном ацил-липидной 9-десатуразы из цианобактерии Synechococcus vulcanus, кокультивируют с агробактериальной суспензией в течение 15-30 минут при периодическом встряхивании, обсушивают между листами стерильной фильтровальной бумаги и помещают на другие чашки Петри с аналогичной средой и посткокультивируют в течение 18-24 часов при температуре 22-24°С на рассеянном свету, затем экспланты таким же образом обсушивают и переносят в чашки Петри с аналогичной средой с добавлением 7 г/л агара и 800 мг/л цефотаксим сульфата и инкубируют в течение 5-7 суток на рассеянном свету при 22-24°С, затем переносят на регенерационные среды состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л
Микросоли по МС	1,0 мл/л
CaCl2	348,5 мг/л
Fe - хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Биотин	1,0 мг/л
Кальций пантетонат	5,0 мг/л
Аденинсульфат	40,0 мг/л
НУК	0,1 мг/л
Зеатин	2,0 мг/л*
Цефотаксим	800,0 мг/л*
Агар	7,0 г/л
Дистиллированная вода	до 1 л среды
рН	5,8

* Добавлять после автоклавирования

и культивируют в течение 10-14 суток при 22-25°С и освещенности 6000-10000 лк, затем культивируют на аналогичной среде с цефотаксимом 500 мг/л и канамицин сульфатом 15 мг/л 3 пассажа по 21 дню, затем 1 пассаж без канамицина сульфата и снова 3 пассажа с канамицин сульфатом, при появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на селективную среду состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л
Микросоли по МС	1,0 мл/л
CaCl2	348,5 мг/л
Fe - хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Сахароза	20,0 г/л
Канамицин сульфат	50,0 мг/л*
Цефотаксим	200,0 мг/л*
Агар	7,0 г/л
Дистиллированная вода	до 1 л среды
рН	5,8

*Добавлять после автоклавирования,

затем проводят первый этап отбора форм, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза: срезанные регенеранты культивируют на среде МС с 50 мг/л канамицин сульфатом в течение 30-45 дней при 22-25°С и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде, далее отбирают укрепившиеся регенеранты картофеля с зелеными листьями и стеблями, потом проводят второй этап отбора форм, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза: укоренившиеся растения проверяют методом ПЦР на наличие вставки целевой ДНК и регенеранты с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК размножают микрочеренкованием.

Описание изобретения к патенту

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии, в частности к способам получения трансгенных форм картофеля сорта Скороплодный in vitro, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза, и может быть использовано для создания новых форм сортов картофеля, способных давать стабильный урожай в разных почвенно-климатических зонах.

Уровень техники

Известен способ получения раннеспелого сорта картофеля Скороплодный, который был получен традиционным способом селекции (Каталог Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха, стр.28).

Недостатком этого способа является то, что сорт картофеля Скороплодный является среднечувствительным к низким отрицательным, повышенным положительным температурам и фитофторозу. Кроме того, высокая устойчивость к возбудителю фитофтороза коррелирует с низкой клубневой продуктивностью. Очень трудно получить формы картофеля, сочетающие все три признака методом традиционной селекции. Кроме того, метод традиционной селекции трудоемок и ведет к большим затратам времени (10-15 лет).

Задача изобретения

Задачей изобретения является создание нового способа получения форм картофеля сорта Скороплодный in vitro, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза, позволяющего преодолеть недостатки традиционной селекции при сохранении его сортовых признаков.

Решение задачи

Поставленная задача решается созданием нового способа получения форм картофеля сорта Скороплодный in vitro, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза, заключающегося в том, что стеблевые и листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходного сорта, помещают в чашки Петри с жидкой средой следующего состава:

Макросоли по Мурасиге-Скугу (МС)	50,0 мл/л,
Микросоли по МС	1,0 мл/л,
CaCl 2	348,5 мг/л
Fe - хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Нафтилуксусная кислота (НУК)	5,0 мг/л
Бензиламинопурин	0,2 мг/л
Дистиллированная вода	до 1 л среды
рН	5,8

и прединкубируют в течение 18-24 часов и температуре 22-24°С, затем вносят пипеткой 300 мкл на одну чашку ночной суспензионной культуры агробактерии, несущей плазмиду с геном ацил-липидной 9-десатуразы из цианобактерии Synechococcus vulcanus, кокультивируют с агробактериальной суспензией в течение 15-30 минут при периодическом встряхивании, обсушивают между листами стерильной фильтровальной бумаги и помещают в другие чашки Петри с аналогичной средой и посткокультивируют в течение 18-24 часов при температуре 22-24°С на рассеянном свету, затем экспланты таким же образом обсушивают и переносят в чашки Петри с аналогичной средой с добавлением 7 г/л агара и 800 мг/л цефотаксима и инкубируют в течение 5-7 суток на рассеянном свету при 22-24°С, затем переносят на регенерационные среды состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л
Микросоли по МС	1,0 мл/л
CaCl2	348,5 мг/л
Fe - хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Глюкоза	16,0 г/л
Гидролизат козеина	1,0 г/л
Мезоинозит	100,0 мг/л
Биотин	1,0 мг/л
Кальций пантетонат	5,0 мг/л
Аденинсульфат	40,0 мг/л
НУК	0,1 мг/л
Зеатин	2,0 мг/л*
Цефотаксим	800,0 мг/л*
Агар	7,0 г/л
Дистиллированная вода	до 1 л среды
рН	5,8

* Добавлять после автоклавирования (холодной стерилизации)

и культивируют в течение 10-14 суток при 22-25°С и освещенности 6000-10000 лк, затем культивируют на аналогичной среде с цефотаксимом 500 мг/л и канамицин сульфатом 15 мг/л 3 пассажа по 21 дню, затем культивируют 1 пассаж без канамицина сульфата и снова 3 пассажа с канамицин сульфатом, при появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на среду состава:

Макросоли по МС	50,0 мл/л
Микросоли по МС	1,0 мл/л
CaCl2	348,5 мг/л
Fe - хеллат по МС	5,0 мл/л
Тиамин	1,0 мг/л
Пиридоксин	1,0 мг/л
Сахароза	20,0 г/л
Канамицин сульфат	50,0 мг/л*
Цефотаксим	200,0 мг/л*
Агар	7,0 г/л
Дистиллированная вода	до 1 л среды
рН	5,8

*Добавлять после автоклавирования;

затем проводят первый этап отбора: срезанные регенеранты культивируют на среде МС с 50 мг/л канамицин сульфатом в течение 30-45 дней при 22-25°С и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде, далее отбирают укоренившиеся регенеранты картофеля с зелеными листьями и стеблями, потом проводят второй этап отбора: укоренившиеся растения проверяют методом ПЦР (Метод создания конструкций, метод ПЦР-анализа: «Генная инженерия растений», лабораторное руководство, Москва, «Мир», 1991, под редакцией Дж.Дрейпера, Р.Скотта, Ф.Армитиджа, Р.Уолдена, стр.304-383) на наличие вставки целевой ДНК и регенеранты с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК размножают микрочеренкованием для проведения дальнейших исследований.

Сущность изобретения

Сущность изобретения заключается в том, что встройка плазмиды с вектором экспрессии, содержащим ген ацил-липидной 9-десатуразы из цианобактерии Synechococcus vulcanus, в экспланты картофеля сорта Скороплодный обеспечивает повышение устойчивости картофеля одновременно к низким отрицательным, повышенным положительным температурам и к возбудителю фитофтороза.

Новизна изобретения

Новизной изобретения является весь процесс получения заявляемых форм картофеля. При получении трансгенных форм картофеля сорта Скороплодный заявляемым способом происходит повышение общего адаптационного потенциала растения картофеля.

Выход за заявленные пределы

При прединкубации эксплантов менее 18 часов не накапливается достаточного числа клеток на нужной стадии клеточного цикла, способных акцептировать целевую ДНК. Увеличение длительности прединкубации более 24 часов ведет к гибели эксплантов. Температура прединкубации ниже 22°С и выше 24°С ведет к уменьшению числа клеток, способных акцептировать целевую ДНК.

При кокультивации с агробактериальной суспензией менее 15 минут частота встройки целевой ДНК очень низка. При кокультивации свыше 30 минут происходит гибель эксплантов вследствие избыточного заражения агробактерией.

При посткокультивации менее 18 часов частота встроек низка, а более 24 часов приводит к гибели эксплантов вследствие избыточного заражения агробактерией, что приводит к загниванию тканей. При посткокультивации при температуре менее 22°С уменьшается число клеточных делений и частота встроек низка. Посткокультивация при температуре выше 24°С приводит к гибели эксплантов вследствие избыточного заражения агробактерией. Добавление цефотаксима необходимо для того, чтобы подавить рост агробактерии, чтобы предотвратить гибель эксплантов.

При инкубировании на рассеянном свету менее 5 суток не удается получить достаточное число клеток, готовых к морфогенезу. Инкубирование более 7 суток приводит к обильному каллусообразованию, что, в свою очередь, приводит к повышению самоклональной вариабельности, что затрудняет выявление форм картофеля с целевой ДНК. Температура 22-24°С оптимальна для процесса клеточных делений.

При культивировании менее 10 суток не все клетки со встройкой успевают перейти к регенерации, что удлиняет процесс получения регенерантов. Удлинение же этого периода более 14 суток приводит к снижению уровня цитокинина (зеатина) в среде и гибели эксплантов. Данный температурный интервал 22-24°С и световой режим - освещенность 6000-10000 лк и 16-часовой фотопериод являются оптимальным для регенерации растений картофеля. Культивирование на регенерационной среде с цефотаксимом менее 500 мг/л приводит к обильному росту агробактерии и гибели эксплантов, а более высокие концентрации цефотаксима токсичны для регенерирующих тканей. При концентрации канамицин сульфата ниже 15 мг/л (1/3 летальной дозы для сорта Скороплодный) регенерируют клетки в том числе и без целевой встройки. При культивировании в течение более трех пассажей накапливается предельное содержание канамицин сульфата в тканях, которое может привести к гибели эксплантов, а культивирование в течение 1 пассажа без канамицина сульфата (в течение 21 дня) приводит к снижению концентрации канамицин сульфата в тканях, что позволяет более интенсивно размножаться клеткам со встройкой целевого гена.

При срезании и перенесении регенерантов размером менее 10 мм на среду для укоренения с канамицин сульфатом происходит замедление укоренения, роста и гибель побега.

Результаты исследования полученных растений представлены в таблицах 1, 2, 3, 4.

Таблица 1
Состояние трансгенных растений картофеля сорта Скороплодный через 2-е суток после 2-часовой экспозиции при -10°С (оценено 40 трансгенных линий по 5 растений на вариант)
Степень повреждения	Характер повреждения	Число линий	% линий
Отсутствует	Отсутствует	16	40,0
Низкая	Потеря тургора 1/ 4 листьев	5	12,5
Средняя - на уровне исходного сорта Скороплодный	Потеря тургора >1 /3 листьев	4	10,0
Высокая	Потеря тургора и мацерация 1/4 листьев и стеблей растений	15	37,5

Таблица 2
Состояние побега 16 трансгенных линий растений картофеля сорта Скороплодный, выделившихся по устойчивости к замораживанию, после их выращивания при +28-+32°С в течение 102 дней на среде МС при освещенности 10000 люкс
Длина побега	Число линий	% линий
2 раза больше, чем у исходного сорта	5	31,25
1,5 раза больше, чем у исходного сорта	9	56,25

Длина побега у растений исходного сорта уменьшилась почти в 2 раза после температурного стресса, по сравнению с выращиванием при оптимальной температуре (+23-+25°С).

Таблица 3
Состояние корня 16 трансгенных линий растений картофеля сорта Скороплодный, выделившихся по устойчивости к замораживанию, после их выращивания при +28-+32°С в течение 102 дней на среде МС при освещенности 10000 люкс
Состояние корня (балл)	Число линий (шт.)	% линий
Очень хорошее развитие корня (9 баллов)	1	6,25
Хорошее развитие корня (7 баллов)	4	25,0
Среднее развитие корня (5 баллов)	7	43,75
Развитие корня ниже среднего (3 балла) на уровне исходного сорта Скороплодный	2	12,5
Отсутствие корня (1 балл)	2	12,5

Таблица 4
Показатели устойчивости к фитофторозу 16-ти выделившихся трансгенных линий растений картофеля сорта Скороплодный, которые были высажены в теплицу и оценены на устойчивость к возбудителю фитофтороза (Phytophthora infestans) с использованием традиционного метода искусственного заражения отделенных листьев (Методика ВНИИКХ) 2009 год
Выделившиеся трансгенные линии	Показатель устойчивости (балл)
8771(1)	6,8*
8172(2)	6,3*
8418(1a)	6,7*
8418(1)	6,2*
8593(4)	5,9*
9100(5)	5,9*
9100(6)	6,1*
8593(2)	6,0
9026(2)	5,5
8594(1)	6,3
8347(2)	5,6
8891(4)	5,9
9099(14)	4,9
9026(3)	5,2
8309(1)	6,1
Сорт Скороплодный (исходный сорт)	5,2
Восприимчивый стандарт сорт Жуковский ранний	4,2
Стандарт с высокой устойчивостью сорт Никулинский	7,0
*линии, выделившиеся по устойчивости к экстремальным температурам

Результаты изобретения

Как следует из результатов таблиц 1, 2, 3 и 4, заявленный способ получения трансгенных форм картофеля in vitro сорта Скороплодный, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза, позволяет повысить устойчивость к низким отрицательным температурам (-10°С) у 52,5% трансгенных линий (почти полное отсутствие повреждений), а также у 56,25% трансгенных линий повысилась устойчивость к жаре (+28-+32°С). Кроме того, 17,5% трансгенных линий показали устойчивость как к температурным стрессам, так и к возбудителю фитофтороза при сохранении его сортовых признаков. Заявленный способ менее трудоемок, чем традиционная селекция и снижает затраты времени с 10-15 лет до 4-6 лет до получения форм, которые в дальнейшем могут быть переданы на государственное сортоиспытание.