иммунологическая композиция

Формула изобретения

1. Адъювантная композиция, содержащая сульфолипо-циклодекстрин (SL-CD) и сапонин.

2. Адъювантная композиция по п.1, где SL-CD присутствует в конечной концентрации примерно 0,2 мл/мл.

3. Адъювантная композиция по п.1, где сапонин присутствует в конечной концентрации примерно 0,5 мг/мл.

4. Адъювантная композиция по п.1, где сапонин представляет собой Quil А.

5. Адъювантная композиция по п.4, где Quil А присутствует в конечной концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл.

6. Адъювантная композиция по п.4 или 5, где Quil А присутствует в конечной концентрации примерно 0,158 мг/мл.

7. Иммунологическая композиция, содержащая адъювантную композицию по п.1 и дополнительно содержащая по меньшей мере один антиген.

8. Иммунологическая композиция по п.7, где по меньшей мере один антиген выбран из бактерий, вирусов, пептидов, полипептидов, нуклеиновых кислот или их комбинации.

9. Иммунологическая композиция по п.8, где по меньшей мере один антиген представляет собой ветеринарный антиген.

10. Иммунологическая композиция по п.9, где по меньшей мере один антиген представляет собой антиген крупного рогатого скота.

11. Иммунологическая композиция по п.8, где по меньшей мере один антиген представляет собой вирусный антиген.

12. Иммунологическая композиция по п.11, где вирусный антиген представляет собой вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV); герпесвирус 1 крупного рогатого скота (IBR) или вирус катаральной лихорадки овец (BTV).

13. Способ индукции иммунного ответа у животного, нуждающегося в этом, включающий введение указанному животному иммунологической композиции по любому из пп.7-12 в эффективном количестве.

14. Иммунологическая композиция, полученная посредством

а) объединения Quil А и по меньшей мере одного вирусного антигена,

б) добавления SL-CD к композиции со стадии (а).

15. Иммунологическая композиция по п.14, дополнительно содержащая по меньшей мере один дополнительный адъювант.

16. Иммунологическая композиция по п.15, где по меньшей мере один дополнительный адъювант выбран из гидрата окиси алюминия, SP-масла или карбопола.

17. Иммунологическая композиция по п.16, где SL-CD присутствует в конечной концентрации примерно 0,2 мл/мл.

18. Иммунологическая композиция по п.14, где Quil А присутствует в конечной концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл.

19. Иммунологическая композиция по п.14, где Quil А присутствует в конечной концентрации примерно 0,158 мг/мл.

20. Иммунологическая композиция по п.14, где вирусный антиген представляет собой антиген крупного рогатого скота.

21. Иммунологическая композиция по любому из пп.14-20, где вирусный антиген выбран из BEFV, IBR и BTV.

22. Способ индукции иммунного ответа против BEFV у животного, включающий введение указанному животному композиции по п.21 в эффективном количестве.

23. Способ по п.22, где иммунный ответ индуцируется после введения одной дозы композиции.

24. Способ по п.22 или 23, где иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ.

25. Набор для индукции иммунного ответа у животного, содержащий SL-CD и сапонин.

26. Набор по п.25, где сапонин представляет собой Quil A.

27. Набор для индукции иммунного ответа у животного, содержащий SL-CD, сапонин и дополнительно содержащий по меньшей мере один антиген.

28. Набор по п.27, где по меньшей мере один антиген выбран из бактерий, вирусов, пептидов, полипептидов, нуклеиновых кислот или их комбинаций.

29. Набор по п.28, где по меньшей мере один антиген представляет собой вирусный антиген.

30. Набор по п.29, где вирусный антиген выбран из BEFV, IBR и BTV.

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В этой заявке заявлен приоритет в соответствии с 35 U.S.С. §119 (a) предварительной заявки Австралии № 2008904261, поданной 19 августа 2008 г., и в соответствии с 35 U.S.С. §119 (e) предварительной заявки США № 61/092091, поданной 27 августа 2008 г. Полное содержание этих заявок включено в данную заявку посредством ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к иммунологическим композициям, содержащим сульфолипо-циклодекстрин (SL-CD) и сапонин или Quil А и возможно по меньшей мере один антиген. Изобретение также относится к способам получения иммунологических композиций, содержащих SL-CD, сапонин или Quil А, и антиген. В настоящем изобретении также предложены способы применения иммуногенных композиций для индукции иммунного ответа на вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV), на герпесвирус 1 крупного рогатого скота (IBR) или вирус катаральной лихорадки овец (BTV). В настоящем изобретении предложены наборы, включающие иммунологическую композицию по изобретению.

Предшествующий уровень изобретения

Сапониновые адъюванты представляют собой известный класс адъювантов, которые были использованы в коммерческих вакцинах для животных. Сапонины представляют собой класс вторичных метаболитов, обнаруженных в различных видах растений. Они представляют собой амфипатические гликозиды, феноменологически сгруппированные по образованию мылоподобной пены, которую они производят при встряхивании в водных растворах. Структурно сапонины состоят из одной или более гидрофильных гликозидных группировок, объединенных с липофильным тритерпеновым производным. Коммерческие сапонины в основном выделяют из коры южноамериканского дерева Quillaja Saponaria Molina и растения Mohave Yucca, которое также называют Yucca schidigera. Сапонины доступны из нескольких источников, включая Berghausen Corporation (Cincinnati, ОН). Очищенная форма сапонина обычно называется Quil А и имеется в продаже из нескольких источников, включая Berghausen Corporation, Sergeant Chemical Company (Clifton, NJ), Superfos a/s (Vedbaek, Denmark) и Brenntag Biosector (Frederikssund, Denmark). Физические и химические характеристики Quil А изложены в доступном проспекте фирмы Superfos, озаглавленном "Очищенный сапониновый адъювант Quil-A". Quil-A характеризуется химически как углеводная группировка в гликозидной связи с тритерпеновой квилаевой (quillaic) кислотой.

Было опубликовано несколько патентов США, в которых обсуждался Quil А в качестве адъюванта. Например, патенты США № № 6,416,764 и 6,291,228 относятся к вакцинам с использованием Quil А в качестве адъюванта и содержащим нецитопатогенный штамм вируса бычьей вирусной диареи. Патент США № 4,432,969 относится к ингаляционной аллергенной композиции, содержащей ингаляционный аллерген и сапонин или адъювант Quil А.

В патенте США № 4,900,549 описан способ получения иммуногенных комплексов, содержащих Quil А.

Патент США № 6,165,995 относится к получению производных SL-CD. Патент США № 6,610,310 относится к полиионным полимерам, таким как SL-CD, в качестве адъювантов.

Эфемерная лихорадка крупного рогатого скота (BEF) представляет собой истощающее вирусное заболевание, влияющее как на молочный, так на и мясной скот, особенно в северной Австралии. BEF также выявлен в большинстве азиатских стран, где крупный рогатый скот выращивается в промышленных масштабах. BEF известна как "трехдневная болезнь" и может значительно повлиять на молочную продуктивность или вызвать заболеваемость мясного и молочного скота (Walker, P.J., 2005, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 292: 57-80).

Возбудителем BEF является вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV). Этот вирус представляет собой рабдовирус, который был отнесен к роду Ephemerovirus. Вирион BEFV имеет палочковидную или коническую форму и содержит отрицательный однонитевой РНК-геном. Геном BEFV кодирует нуклеопротеин, связанный с полимеразой белок, матриксный белок, большую РНК-зависимую РНК-полимеразу и два гликопротеина.

Модифицированная живая BEF-вакцина была доступна в Австралии в течение многих лет и дается с помощью ежегодной бустерной иммунизации перед сезоном BEF. Эта вакцина требует ветеринарного рецепта и представлена в лиофилизированной форме, требующей растворения перед введением разбавителем, содержащим адъювант.Не подвергнутые иммунизации животные требовали двух доз вакцины с последующей ежегодной ревакцинацией.

Публикация РСТ № WO/1994004685 относится к получению вакцины против BEFV, содержащей поверхностный гликопротеин BEFV.

Vanselow с соавт.(1995, Vet. Microbiol. 46:117-130) описывает испытание различных BEF вакцин.

Hsieh с соавт.(2006, J. Vet. Med. Sci. 68: 543-548) касается BEFV вакцин с использованем вирусных штаммов Тn88128 и Тn73. Эти вакцины получали путем инактивации вируса в результате добавления бинарного этиленимина и гидрата окиси алюминия или адъювантов типа вода:масло:вода.

Рекомбинантная вакцина, содержащая структурный гликопротеин BEFV, клонированный в вектор на основе вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота (тип SA-Neethling), был описана у Wallace D.B. и Viljoen G.J. (2005, Vaccine 23:3061-3067).

Chuang с соавт.(2007, J. Virol. Meth. 145:84-87) касается применения РНК интерференции и супрессии экспрессии гена поверхностного гликопротеина BEFV.

Герпесвирус-1 крупного рогатого скота также известен как инфекционный вирус ринотрахеита крупного рогатого скота. Его можно найти в виде аббревиатуры BHV или IBR. Герпесвирус-1 крупного рогатого скота представляет собой вирус семейства Herpesviridae, который вызывает заболевания у крупного рогатого скота, включая ринотрахеит, вагинит, баланопостит, аборт, конъюктивит и энтерит. BHV-1 также является фактором, способствующим возникновению "корабельной" лихорадки (shipping fever). Он передается половым путем, при искусственном осеменении и аэрозольным путем. Подобно другим герпесвирусам, BHV-1 вызывает пожизненную латентную инфекцию и вирусоносительство. Существует доступная вакцина, которая уменьшает тяжесть и распространенность заболевания. Респираторное заболевание, вызываемое BHV-1, широко известно как инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота.

Вирус катаральной лихорадки овец (BTV) представляет собой прототипный вирус рода Orbivirus, который принадлежит к семейству Reoviridae с двухцепочечной РНК. BTV вызывает серьезные заболевания у домашнего скота, такого как овцы, козы, крупный рогатый скот и олени. В литературе сообщается о 24 серотипах, являющихся причиной расстройств, варьирующих от невыраженной инфекции до острой прогрессирующей инфекции. Также исследовали крупный рогатый скот, выделяющий хронический, персистирующий вирус. Вакцины являются доступными для лечения катаральной лихорадки у домашнего скота.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем описании предложены иммунологические композиции, содержащие сульфолипо-циклодекстрин (SL-CD) и сапонин и возможно по меньшей один антиген. В некоторых воплощениях изобретения сапонин представляет собой Quil А. В некоторых воплощениях изобретения по меньшей мере один антиген выбран из бактерий, вирусов, пептидов, полипептидов, нуклеиновых кислот или их комбинации. В некоторых воплощениях изобретения по меньшей мере один антиген является ветеринарным антигеном. В некоторых воплощениях изобретения ветеринарный антиген представляет собой антиген крупного рогатого скота. В некоторых воплощениях изобретения антиген представляет собой вирусный антиген. В некоторых воплощениях изобретения вирусный антиген представляет собой герпесвирус 1 крупного рогатого скота (IBR), вирус катаральной лихорадки овец (BTV) или вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV). Вирусный антиген может быть живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. В некоторых воплощениях изобретения предложена иммуногенная композиция, где антиген представляет собой живой-ослабленный вирус. В некоторых воплощениях изобретения вирус представляет собой вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV). В различных воплощениях изобретения вирус происходит из замороженного концентрата, высушенного концентрата, лиофилизированного концентрата или свежего концентрата. В различных воплощениях сапонин присутствует в иммунологической композиции по изобретению в конечной концентрации примерно 0,5 мг/мл. В различных воплощениях Quil А присутствует в иммунологической композиции по изобретению в конечной концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл. В некоторых воплощениях Quil А присутствует в иммунологической композиции по изобретению в конечной концентрации примерно 0,158 мг/мл. В различных воплощениях в иммунологической композиции по изобретению SL-CD присутствует в конечной концентрации примерно 0,2 мл/мл. В некоторых воплощениях иммунологическая композиция по изобретению, содержащая сапонин и SL-CD или содержащая Quil А и SL-CD, содержит по меньшей мере один дополнительный адъювант. В различных воплощениях изобретения дополнительный адъювант выбран из гидрата окиси алюминия, SP-масла или карбопола. В некоторых воплощениях изобретения антиген представляет собой полипептид, который в некоторых воплощениях является вирусной субъединицой. В некоторых воплощениях изобретения вирусная субъединица выбрана из BEFV, IBR или BTV.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложен способ индукции иммунного ответа против ветеринарного антигена у животного, включающий введение указанному животному иммуногенной композиции, содержащей сапонин, SL-CD и по меньшей мере один ветеринарный антиген. В одном воплощении иммунный ответ индуцируется после введения одной дозы иммуногенной композиции. В одном воплощении в настоящем изобретении предложен способ индукции иммунного ответа против IBR у животного, включающий введение указанному животному иммуногенной композиции, содержащей сапонин, SL-CD и по меньшей мере IBR в качестве антигена. В одном воплощении в настоящем изобретении предложен способ индукции иммунного ответа против BTV у животного, включающий введение указанному животному иммуногенной композиции, содержащей сапонин, SL-CD и по меньшей мере BTV в качестве антигена.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложен способ индукции иммунного ответа против BEFV у животного, включающий введение указанному животному иммуногенной композиции, содержащей Quil A, SL-CD и антиген. В одном воплощении иммунный ответ индуцируется после введения одной дозы иммуногенной композиции. В одном воплощении в настоящем изобретении предложен способ индукции иммунного ответа против IBR у животного, включающий введение указанному животному иммуногенной композиции, содержащей сапонин, SL-CD и антиген. В одном воплощении в настоящем изобретении предложен способ индукции иммунного ответа против BTV у животного, включающий введение указанному животному иммуногенной композиции, содержащей сапонин, SL-CD и антиген. В некоторых воплощениях изобретения иммунный ответ, индуцированный после введения иммуногенной композиции по изобретению, представляет собой защитный иммунный ответ.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция, полученная путем объединения Quil А и вируса с помледующим добавлением SL-CD. Вирус может быть живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. В некоторых воплощениях изобретения Quil А и вирус объединяют при комнатной температуре. В некоторых воплощениях изобретения Quil А и вирус объединяют в течение по меньшей мере15 минут. В некоторых воплощениях изобретения Quil А и вирус объединяют в течение по меньшей мере 120 минут.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложен набор, содержащий иммуногенную композицию по изобретению для индукции иммунного ответа у животного.

В различных воплощениях в настоящем изобретении предложены способы стимуляции иммунного ответа у крупного рогатого скота против вирусной инфекции или эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, вызванной BEFV. Способы индукции иммунного ответа против BEFV включают введение крупному рогатому скоту композиции, содержащей BEFV, SL-CD и Quil А.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция или вакцина, содержащая иммунологически эффективное количество BEFV, SL-CD и Quil А.

В различных воплощениях в настоящем изобретении предложены способы индукции у крупного рогатого скота иммунного ответа против герпесвирусной инфекции или ринотрахеита крупного рогатого скота, вызванного IBR. Способы индукции иммунного ответа против IBR включают введение крупному рогатому скоту композиции, содержащей IBR, SL-CD и сапонин.

В различных воплощениях в настоящем изобретении предложены способы индукции у крупного рогатого скота иммунного ответа против вирусной инфекции или катаральной лихорадки овец, вызванной BTV. Способы индукции иммунного ответа против BTV включает введение крупному рогатому скоту композиции, содержащей BTV, SL-CD и сапонин.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция или вакцина, содержащая иммунологически эффективное количество IBR, SL-CD и сапонина.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция или вакцина, содержащая иммунологически эффективное количество BTV, SL-CD и сапонина.

Подробное описание изобретения

Настоящее описание основано, в частности, на открытии, что иммунологическая композиция, содержащая SL-CD и сапонин или Quil А, может увеличить иммуногенность по меньшей мере одного антигена. В различных воплощениях изобретения по меньшей мере один антиген может быть выбран из бактерий, вирусов, пептидов, полипептидов, нуклеиновых кислот или их комбинаций.

В некоторых воплощениях изобретения по меньшей мере один антиген представляет собой ветеринарный антиген. В различных воплощениях изобретения ветеринарный антиген может представлять собой антиген крупного рогатого скота.

В одном воплощении изобретения ветеринарный антиген может представлять собой вирусный антиген. В некоторых воплощениях изобретения вирусный антиген включает, но не ограничивается этим, штамм BEFV, IBR или BTV. BEFV представляет собой рабдовирус, который, как известно, вызывает эфемерную лихорадку крупного рогатого скота в Австралии, Африке, на Ближнем Востоке и Азии. Известны многие штаммы BEFV, такие как ВВ2271-919 и его родительский штамм (919), TN73, Тп88128, штаммы 1-11 BEFV2001 или штаммы 1-3 BEFV2004. Выбор штамма может варьироваться в зависимости от страны, где надлежит использовать иммуногенную композицию по изобретению. Герпесвирус-1 крупного рогатого скота, также упоминаемый как BHV или IBR, представляет собой вирус семейства Herpesviridae, который вызывает заболевания у крупного рогатого скота, включая ринотрахеит, вагинит, баланопостит, аборт, конъюктивит и энтерит.IBR является также фактором, способствующим возникновению "корабельной" лихорадки. Он передается половым путем, при искусственном осеменении и аэрозольным путем. Подобно другим герпесвирусам, IBR вызывает пожизненную латентную инфекцию и вирусоносительство. Респираторное заболевание, вызываемое IBR, широко известно как инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота.

Вирус катаральной лихорадки овец (BTV) представляет собой прототипный вирус рода Orbivirus, который принадлежит к семейству Reoviridae с двуцепочечной РНК. BTV вызывает серьезное заболевание у домашнего скота, такого как овцы, козы, крупный рогатый скот и олени. В литературе сообщается о 24 серотипах, являющихся причиной расстройств, варьирующих от невыраженных инфекции до острой прогрессирующей инфекции. Также исследовали крупный рогатый скот, выделяющий хронический, персистирующий вирус.Катаральная лихорадка овец наблюдалась в Австралии, Северной Америке, Африке, на Ближнем Востоке, Азии и Европе.

В различных воплощениях изобретения вирус в иммуногенной композиции может быть живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. Способы получения живого-ослабленного вируса хорошо известны в литературе. Например, вирус можно ослабить посредством пассирования вируса в чужеродном хозяине, таком как тканевая культура, яйца с развивающимися эмбрионами или живые животные. Ослабленный BEFV может быть выбран для предпочтительного роста в клетках, не являющихся клетками крупного рогатого скота, и в процессе селекции стать менее способным расти в клетках крупного рогатого скота. Поскольку эти ослабленные штаммы плохо реплицируются в хозяевах, представляющих собой крупный рогатый скот, они индуцируют иммунитет, но не заболевание, при введении крупному рогатому скоту. Вирус считается ослабленным, если он имеет пониженную вирулентность для нативного хозяина и увеличенную вирулентность для нового хозяина. Некоторые ослабленные вирусные штаммы могут появиться естественным путем. Генная инженерия может быть использована для ослабления вирусов определенными путями. Способы получения убитого или инактивированного вируса для применения в иммуногенных композициях, вакцинах и способах известны в данной области. В химическом процессе инактивации подходящий образец вируса или образец сыворотки, содержащей вирус, обрабатывают в течение достаточного периода времени достаточным количеством или достаточной концентрацией инактивирующего агента при достаточно высокой (или низкой, в зависимости от инактивирующего агента) температуре или pH для инактивации вируса. Например, вирус может быть обработан инактивирующими агентами, такими как формалин, бинарный этиленимин (BEI) или гидрофобные растворители, кислоты и т.д. Вирус можно инактивировать облучением ультрафиолетовым светом или рентгеновскими лучами, нагреванием и т.д. Инактивацию нагреванием проводят при температуре и в течение периода времени, достаточных для инактивации вируса. Инактивацию облучением осуществляют с использованием длины волны света или другого источника энергии в течение периода времени, достаточного для инактивации вируса. В некоторых воплощениях изобретения иммуногенная композиция содержит живой-ослабленный вирус.

В некоторых воплощениях изобретения иммуногенная композиция содержит антиген, полученный из замороженного концентрата, высушенного концентрата или свежего концентрата. Если антиген получен из высушенного концентрата, то он может быть получен из лиофилизированного концентрата. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по изобретению содержит антиген из замороженного концентрата.

Сапонины представляют собой стероидные или тритерпеновые гликозиды, широко распространенные в растениях и морских животных. Сапонины отличаются образованием коллоидных растворов в воде, которые пенятся при встряхивании, и осаждением холестерина. Когда сапонины находятся вблизи клеточных мембран, они образуют пороподобные структуры в мембране, которые вызывают ее разрыв. Сапонины используют в качестве адъювантов в вакцинах для животных. Адъювантная и гемолитическая активность отдельных сапонинов широко изучалась (Lacaille-Dubois and Wagner, 1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins" Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Сапонины представляют собой класс вторичных метаболитов, обнаруженных в различных видах растений. Они представляют собой амфипатические гликозиды, сгруппированные феноменологически по способности образовывать пену при встряхивании в водных растворах. Структурно они состоят из одной или более гидрофильных гликозидных группировок, объединенных с липофильными тритерпеновыми производными. Коммерческие сапонины, в основном, извлекают из Quillaja saponaria Molina и Yucca schidigera. "Quil А" относится к очищенной форме сапонина.

Сапонин может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл. Сапонин может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации примерно 0,5 мг/мл. Quil А может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл. Quil А может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации от примерно 0,12 мг/мл до примерно 0,18 мг/мл. Quil А может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации от примерно 0,14 мг/мл до примерно 0,16 мг/мл. Quil А может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации примерно 0,158 мг/мл. В одном воплощении Quil А присутствует в конечной концентрации примерно 0,158 мг/мл в иммуногенной композиции по изобретению.

Сульфолипо-циклодекстрин в эмульсии сквалана в воде (SL-CD/сквалан) использовали для приготовления различных вакцин. SL-CD/сквален можно готовить, как описано у Hilgers et al. (Sulfolipo-cyclodextrin in squalane in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine. 17 (1999), pp.219-228; Fort Dodge Animal Health Holland, Weesp, The Netherlands).

SL-CD может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации от примерно 0,09 мл/мл до примерно 0,3 мл/мл. SL-CD может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в конечной концентрации примерно 0,1 мл/мл, примерно 0,15 мл/мл, примерно 0,17 мл/мл, примерно 0,2 мл/мл или примерно 0,25 мл/мл. Иммуногенные композиции по изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере один адъювант в дополнение к Quil А и SL-CD. В качестве такого дополнительного адъюванта можно выбрать любой из адъювантов, известных в данной области, как обсуждается более подробно в настоящей заявке.

В некоторых воплощениях в изобретении предложен способ индукции иммунного ответа, включающий введение животному иммунологической композиции, содержащей сапонин и SL-CD. В некоторых воплощениях способ включает введение животному иммунологической композиции, содержащей сапонин, SL-CD и по меньшей мере один антиген. В некоторых воплощениях по меньшей мере один антиген представляет собой ветеринарный антиген. В некоторых воплощениях изобретения ветеринарный антиген представляет собой антиген крупного рогатого скота. В некоторых воплощениях изобретения ветеринарный антиген представляет собой вирусный антиген. В некоторых воплощениях вирусный антиген представляет собой BEHV, IBR или BTV. В некоторых воплощениях вирус является живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. В некоторых воплощениях вирус является убитым. В некоторых воплощениях антиген получен из замороженного концентрата, высушенного концентрата или свежего концентрата. Если антиген получен из высушенного концентрата, то он может быть получен из лиофилизированного концентрата. В некоторых воплощениях антиген получен из замороженного концентрата.

В некоторых воплощениях в изобретении предложен способ индукции иммунного ответа, включающий введение животному иммунологической композиции, содержащей Quil А и SL-CD. В некоторых воплощениях способ включает введение животному иммунологической композиции, содержащей Quil A, SL-CD и по меньшей мере один антиген. В некоторых воплощениях по меньшей мере один антиген, используемый в способе, представляет собой ветеринарный антиген. В некоторых воплощениях ветеринарный антиген, используемый в способе, представляет собой антиген крупного рогатого скота. В некоторых воплощениях антиген представляет собой вирусный антиген. В некоторых воплощениях вирусный антиген представляет собой IBR, BEFV или IBR. В некоторых воплощениях вирусный антиген является живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. В некоторых воплощениях вирус является живым-ослабленным. В некоторых воплощениях антиген получен из замороженного концентрата, высушенного концентрата или свежего концентрата. Если антиген получен из высушенного концентрата, то он может быть получен из лиофилизированного концентрата. В некоторых воплощениях антиген получен из замороженного концентрата.

Иммуногенные композиции по изобретению могут вызывать иммунный ответ после введения нескольких доз. В некоторых воплощениях иммуногенные композиции по изобретению могут вызывать иммунный ответ после введения двух доз. В некоторых воплощениях иммуногенные композиции по изобретению вызывают иммунный ответ после введения одной дозы. Иммунный ответ, вызванный иммуногенными композициями по изобретению, может представлять собой защитный иммунный ответ. После введения первоначальной дозы иммуногенной композиции по изобретению бустерную дозу можно вводить примерно через четыре недели для усиления иммуногенного ответа. Также можно вводить дополнительные бустерные дозы.

В одном воплощении в изобретении предложен набор для индукции иммунного ответа у животного. В некоторых воплощениях набор включает иммуногенную композицию, содержащую сапонин и SL-CD и возможно по меньшей мере один антиген. В некоторых воплощениях сапонин в наборе представляет собой Quil А. В некоторых воплощениях по меньшей мере один антиген в наборе представляет собой ветеринарный антиген. В некоторых воплощениях ветеринарный антиген в наборе представляет собой антиген крупного рогатого скота. В некоторых воплощениях ветеринарный антиген в наборе представляет собой вирусный антиген. В некоторых воплощениях вирусный антиген в наборе представляет собой BEFV, IBR или BTV. В некоторых воплощениях антиген в наборе может быть живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. В некоторых воплощениях антиген в наборе является живым-ослабленным. В некоторых воплощениях антиген в наборе является убитым. В некоторых воплощениях антиген в наборе получен из замороженного концентрата, высушенного концентрата или свежего концентрата. В некоторых воплощениях антиген в наборе получен из замороженного концентрата.

В изобретении предложены наборы, иммунологические композиции и вакцины, содержащие SL-CD и сапонин и/или Quil А, которые могут содержать по меньшей мере один дополнительный адъювант. Среди адъювантов, которые могут быть использованы, могут быть упомянуты в качестве примера гидрат окиси алюминия, авридин, диметилдиоктадециламмония бромид (также известный как DDAB или DODAB), полифосфазены, эмульсии масло-в-воде на основе минерального масла, такие как SPT эмульсия (см, например Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, edited by Michael F. Powel and Mark J. Newman, Plennum Press, New York and London, pages 147-204), эмульсии вода-в-масле на основе метаболизируемого масла, как описано в патенте США № 6,368,601, а также эмульсии, описанные в патенте США № 5,422,109. Другие примеры подходящих адъювантов включают сквалан и сквален (или другие масла животного происхождения); блок-сополимеры, такие как pluronic® (L121) сапонин; детергенты, такие как Tween-80, минеральные масла, такие как DRAKEOL® или Marcol®; растительные масла, такие как арахисовое масло; адъюванты, происходящие из коринебактерий, таких как corynebacterium parvum; адъюванты, происходящие из пропионовокислых бактерий; Mycobacterium bovis (бацилла Кальметта-Герена, или BCG); интерлейкины, такие как интерлейкин-2 и интерлейкин-12; монокины, такие как интерлейкин 1; фактор некроза опухоли; интерфероны, такие как гамма-интерферон; липосомы; адъювант iscom; экстракт микобактериальных клеточных стенок; синтетические гликопептиды, такие как мурамилдипептиды, или другие производные; Авридин; Липид А; декстрансульфат; DEAE-Декстран или DEAE-Декстран с фосфатом алюминия; карбоксиполиметилен, такой как Carbopol®; ЕМА; эмульсии акриловых сополимеров, такие как Neocryl® А640 (см. патент США № 5,047,238); белки вакцинии или поксвирусов животных; адъюванты на основе субвирусных частиц, такие как орбивирус; холерный токсин; диметилдиоктадециламмония бромид; или их смеси. Другие адъюванты могут быть выбраны из поверхостно-активных веществ (например гексадециламина, октадециламина, лизолецитина, диметилдиоктадециламмония бромида, N,N-диоктадецил-n'-N-бис(2-гидроксиэтилпропандиамина), метоксигексадецилглицерина и pluronic полиолов); полианионов (например пирана, декстрансульфата, поли-IC, полиакриловой кислоты, карбопола), пептидов (например мурамилдипептида, диметилглицина, тафтсина), масляных эмульсий, квасцов и их смесей. Кроме того, можно выбрать комбинации адъювантов.

В одном воплощении в изобретении предложена иммуногенная композиция, полученная путем объединения Quil А и антигена и последующего добавления дополнительного антигена, такого как SL-CD. Специалистам в данной области слудет понимать, что объединение вируса с Quil А снизит эффективный титр вируса (Walker, P.J., 2005, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 292:57-80). Комбинирование Quil А и антигена и последующее добавление по меньшей мере одного другого ингредиента к иммуногенной композиции может быть осуществлено в течение любого периода времени. Специалист в данной области легко поймет, что иммуногенная композиция по изобретению может быть приготовлена путем объединения Quil А и антигена и последующеего добавления по меньшей мере одного другого ингредиента к иммуногенной композиции в течение различных периодов времени. Например, Quil А и антиген могут быть объединены в течение периода от по меньшей мере 5 минут до по меньшей мере 200 минут. В некоторых воплощениях Quil А и антиген объединяют в течение различных периодов времени, включающих от по меньшей мере 10 минут до по меньшей мере 190 минут.В некоторых воплощениях Quil А и антиген объединяют в течение по меньшей мере 15 минут. Специалистам в данной области следует понимать, что иммуногенную композицию по изобретению можно приготовить путем объединения Quil А и антигена при любой из многих температур. Объединение Quil А и антигена можно выполнить при температурах ниже или выше комнатной температуры до тех пор, пока полученная композиция является иммуногенной. Quil А и антиген могут быть объединены при комнатной температуре. В некоторых воплощениях антиген в иммуногенной композиции, полученной путем объединения Quil А и антигена перед добавлением SL-CD, представляет собой вирус. В некоторых воплощениях вирус представляет собой BEFV. В некоторых воплощениях вирус может быть живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. В некоторых воплощениях антиген является живым-ослабленным. В некоторых воплощениях антиген может быть получен из замороженного концентрата, высушенного концентрата или свежего концентрата. В некоторых воплощениях антиген получен из замороженного концентрата.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция, вызывающая иммунный ответ и содержащая сапонин и SL-CD. В некоторых воплощениях изобретения иммуногенная композиция, вызывающая иммунный ответ, содержит сапонин и SL-CD; и по меньшей мере один антиген. В некоторых воплощениях изобретения сапонин в иммуногенной композиции, вызывающей иммунный ответ, представляет собой Quil А. В некоторых воплощениях изобретения по меньшей мере один антиген в иммуногенной композиции, вызывающей иммунный ответ, можно выбрать из бактерий, вирусов, пептидов, полипептидов, нуклеиновых кислот или их комбинаций. В некоторых воплощениях в иммуногенной композиции по изобретению по меньшей мере один антиген представляет собой ветеринарный антиген. В некоторых воплощениях в иммуногенной композиции по изобретению ветеринарный антиген представляет собой антиген крупного рогатого скота. В некоторых воплощениях в иммуногенной композиции по изобретению антиген представляет собой вирусный антиген. В некоторых воплощениях изобретения вирусный антиген представляет собой по меньшей мере штамм BEFV, BTV или IBR. В некоторых воплощениях сапонин или Quil А добавляют к вирусному антигену перед добавлением SL-CD. В некоторых воплощениях антиген может быть живым-ослабленным, рекомбинантным, убитым или инактивированным. В некоторых воплощениях антиген является живым-ослабленным. В некоторых воплощениях антиген является убитым. В некоторых воплощениях антиген может быть получен из замороженного концентрата, высушенного концентрата или свежего концентрата. В некоторых воплощениях антиген получен из замороженного концентрата.

Иммунологические композиции по изобретению можно приготовить из вирусных культур способами, которые являются стандартными в данной области. Например, вирус можно размножать в клетках культуры ткани, таких как эпителиальные клетки почек африканских зеленых мартышек (клетки Vera), человеческие диплоидные фибробласты, MDBK (почки быка Мадин-Дарби) или другие клетки крупного рогатого скота. Рост вируса контролируют стандартными способами (наблюдение за цитопатическим эффектом, иммунофлюоресценция или другие анализы на основе антител) и вирус собирают при достижении достаточно высокого вирусного титра (такого как 106 ТСЮ50/мл). Вирусные концентраты можно дополнительно концентрировать или лиофилизировать обычными способами перед включением в вакцинный препарат.Можно использовать другие способы получения вирусного концентрата, такие как способы, описанные Thomas, et al. (1986, Agri-Practice, 7 (5):26-30).

Иммунологические композиции по изобретению можно давать отдельно или в виде компонента поливалентной иммунологической композиции, т.е. в комбинации с другими иммунологическими композициями. Вирус в иммуногенном препарате может быть живым или убитым; живой или убитый вирус может быть лиофилизирован и возможно восстановлен известными в данной области способами. Иммуногенные композиции могут быть предложены в наборах, которые также могут включать соответствующую маркировку и инструкции по введению иммуногенной композиции субъекту-животному (например, домашнему скоту, копытным, домашнему животному) или птице (например, домашней птице).

Иммуногенные композиции, содержащие SL-CD и сапонин или Quil А; и по меньшей мере один вирусный антиген, также могут содержать фармацевтически и ветеринарно приемлемые носители. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области и включают крупные, медленно метаболизирующие макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и неактивные вирусные частицы. Фармацевтически и ветеринарно приемлемые соли также можно использовать в вакцине, например, минеральные соли, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты или сульфаты, а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты или бензоаты. Вакцины также могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол, а также вещества, такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты или pH буферные агенты. Липосомы также можно использовать в качестве носителей для убитых вирусов (см., например, патент США № 5,422,120, публикация РСТ № WO 95/13796, публикация РСТ № WO 91/14445 или европейский патент № 524,968 B1.)

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить внутримышечным или подкожным путями или интраназальным, внутрибрюшинным, внутривенным, интрадермальным, внутрибронхиальным или пероральноым путями. Иммуногенные композиции по изобретению можно вводить с помощью спрея, инокуляции в глаз или скарификации. Другой удобный способ доставки иммуногенной композиции по изобретению млекопитающим (таким как домашний скот, копытные или домашние животные) осуществляется посредством перорального введения (например, в пище или питьевой воде или в приманке). Это особенно удобно для подкармливания или смешивания корма с иммуногенной композицией. Как правило, крупные животные (например, домашний скот/копытные, такие как крупный рогатый скот) получают дозу примерно 10⁶ ТСID₅₀/мл (средняя цитопатогенная доза, инфицирующая 50% клеток), может быть от 10^6,5 до 10⁷, TCID₅₀ на дозу иммуногенной композиции.

При введении однократной дозы иммуногенная композиция должна содержать количество BEFV, соответствующее от примерно 10⁴ до примерно 10⁷ TCID₅₀/мл, предпочтительно 10⁶ ТСID₅₀/мл. Примерно от одного до пяти мл иммуногенной композиции, предпочтительно 2 мл, можно вводить животному внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно.

Иммуногенная композиция должна содержать количество IBR, соответствующее примерно 6,8 log/мл. Примерно от одного до пяти мл иммуногенной композиции, содержащей IBR, предпочтительно 2 мл, можно вводить животному внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно.

Иммуногенная композиция должна содержать количество BTV, соответствующее примерно 10^6,7 TCID₅₀ BTV серотипа 1 и/или примерно 10^7,6 TCID₅₀ BTV серотипа 8. Примерно от одного до пяти мл иммуногенной композиции, содержащей BTV, предпочтительно 2 мл, можно вводить животному внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно.

Получение иммуногенных композиций можно найти в литературе, например, в "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", упомянутой выше, и "Vaccines" (2008, fifth edition, Plotkin, S.A. et al., editors, Saunders Elsevier).

В настоящем изобретении предложены иммунологические композиции, которые особенно полезны для профилактики и лечения BEF-, IBR- или BTV-инфекций у животных. Поэтому еще один аспект настоящего изобретения относится к способам профилактики и лечения BEF-, IBR- или BTV-инфекций у животных, отличающийся тем, что иммуногенную композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят животному, нуждающемуся в такой профилактике или лечении. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить посредством внутримышечной или подкожной инъекции или посредством интраназального, внутритрахеального, перорального, накожного, подкожного или внутрикожного введения. Предпочтительно, для BEFV-, IBR- или BTV-вакцин вакцинация является подкожной или внутримышечной, где внутримышечная является наиболее предпочтительной. Живые вакцины для BEFV, IBR или BTV предпочтительно вводят, начиная с 6-месячного возраста.

В изобретении также предложен способ иммунизации животных, в частности крупного рогатого скота, против одного или различных инфекционных агентов одновременно, что включает пероральное, интраназальное, подкожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутримышечное или аэрозольное введение (или их комбинацию) вакцины, которая содержит иммунологически эффективное количество композиции, предложенной в данном изобретении.

Определения

Термины, используемые в данной заявке, имеют значения, понятные и известные специалистам в данной области, однако для удобства и полноты, основные термины и их значения приведены ниже.

Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения единственные формы включают множественные ссылки, если контекст ясно не диктует иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" включают один или более способов, и/или стадий типа, описанного в данной заявке, и/или которые будут очевидны специалистам в данной области при чтении данного описания и так далее.

Термин "примерно" или "приблизительно" означает статистически значимый диапазон значения. Такой диапазон может находиться в пределах порядка величины, как правило, в пределах 50%, более типично в пределах 20%, еще более типично в пределах 10% и еще в большей мере в пределах 5% заданного значения или диапазона. Допустимое изменение, охватываемое термином "примерно" или "приблизительно", зависит от конкретно рассматриваемой системы и может быть легко оценено специалистом в данной области.

"Инфекционную единицу" BEFV определяют как количество вируса, необходимое для заражения или убийства 50% клеток культуры ткани. Это можно выразить как дозу, инфицирующую 50% тканевой культуры, или ТСID₅₀.

Вирус считают ослабленным, если он обладает пониженной вирулентностью для нативного хозяина. Вирус считают инактивированным, если он не способен размножаться в клетке, чувствительной к инфекции вирусом.

Термин "антиген" означает молекулу, которая иногда стимулирует иммунный ответ. Антиген представляет собой любое вещество, которое распознается адаптивной иммунной системой. Антигены обычно представляют собой белки или полисахариды. Антиген может представлять собой часть бактерии, вируса или другого микроорганизма, такую как оболочка, капсула, клеточная стенка, жгутики, фимбрии или токсин. Антиген также может представлять собой липид или нуклеиновую кислоту. Антиген, используемый в композиции, можно получить из свежей культуры, замороженного концентрата, лиофилизированного концентрата или любого другого, обычно имеющегося концентрата. Если антиген представляет собой вирус, то он может быть живым-инактивированным или ослабленным.

"Адъювант" означает одно или более веществ, которые усиливают антигенность композиции, как правило, вакцинной композиции. Адъювант может служить тканевым депо, которое медленно высвобождает антиген, а также активатором лимфоидной системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood, et al., Immunology, Second Ed., Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. p.384). Часто первичная вакцинация одним антигеном в отсутствие адъюванта не сможет вызвать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Также, в зависимости от условий, первичное заражение одним антигеном, в отсутствие адъюванта, не сможет вызвать достаточный гуморальный или клеточный иммунный ответ.Было показано, что многие цитокины или лимфокины обладают иммуномодулирующей активностью и, таким образом, являются полезными в качестве адъювантов, включая интерлейкины 1- , 1-3, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (см, например, патент США № 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы); интерфероны - , - и - ; фактор, стимулирующий образований колоний гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) (см., например, патент США № 5,078,996); фактор, стимулирующий образований колоний макрофагов (M-CSF); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF); и факторы некроза опухоли и . Еще одни адъюванты, которые полезны в иммуногенных композициях, описанных в данной заявке, включают хемокины, в том числе, без ограничения, моноцитарный хемотактический белок-1 (МСР-1), воспалительные белки макрофагов (MIP), например МIP-1 и MIP-1 , также известные как CCL-3 и CCL-4; и цитокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками при активации (RANTES); молекулы адгезии, такие как селектин, например L-селектин, Р-селектин и Е-селектин; муцин-подобные молекулы, например CD34 (также известные как сиалофорин, лейкосиалин или SPN), GlyCAM-1 и MadCAM-1; член семейства интегринов, такой как лимфоцит-ассоциированный антиген LFA-1, 2 и 3, VLA-1, Мас-1 и р150.95; член суперсемейства иммуноглобулинов, такой как молекула адгезии тромбоцит-эндотелиальных клеток (РЕСАМ), фактор межклеточной адгезии, например ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4 и ICAM-5, CD2 и LFA-3; костимулирующие молекулы, такие как CD40 и CD40L; ростовые факторы, включающие сосудистый фактор роста, фактор роста нервов, фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, В7.2, PDGF, BL-1 и фактор роста сосудистого эндотелия; рецепторные молекулы, включающие Fas, TNF-рецептор, Fit, Аро-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Аро-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 и DR6; и каспазу (ICE).

Подходящие адъюванты, используемые для усиления иммунного ответа, дополнительно включают, без ограничения, MPL (3-О-деацилированный монофосфориллипид A, Corixa, Hamilton, МТ), который описан в патенте США № 4,912,094. Также подходящими для использования в качестве адъювантов являются аналоги синтетического липида А или аминоалкилглюкозаминфосфатные соединения (AGP) или их производные или аналоги, которые доступны в Corixa (Hamilton, МТ) и которые описаны в патенте США № 6,113,918. Один такой AGP представляет собой 2-[(R)-3-тeтpaдeкaнoилoкcитeтpaдeкaнoилaминo]этил-2-дeзoкcи-4-0-фocфoнo-3-0-[(R)-3-тeтpaдeкaнoилoкcитeтpaдeкaнoил]-2-[(R)-3-тeтpaдeкaнoилoкcитeтpaдeкaнoил-амино]-b-D-глкжопиранозид, который известен как 529 (ранее известный как RC529). Этот адъювант 529 приготовлен в водной форме (AF) или в виде стабильной эмульсии (SE).

Другие адъюванты включают мурамилпептиды, такие как N-ацетилмурамил-L-треонин-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-зп-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ); эмульсии масло-в-воде, такие как MF59 (Международная публикация РСТ № WO 90/14837) (содержащие 5% сквалена, 0,5% Tween® 80 и 0,5% Span 85 (возможно содержащий различные количества МТР-РЕ), приготовленные в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA)) и SAF (содержащий 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блоксополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена L121 и thr-MDP, либо превращенные с помощью микрофлюидизатора в субмикронную эмульсию или подвергнутые встряхиванию для образования эмульсии с более крупными частицами); неполный адъювант Фрейнда (IFA); соли алюминия (квасцы), такие как гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия; амфиген; авридин; L121/сквален; D-лактид-полилактид/гликозид; pluronic полиолы; убитая Bordetella; сапонины, такие как Stimulon QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), описанные в патенте США № 5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанный в патенте США № 5,254,339, и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS); Mycobacterium tuberculosis; бактериальные липополисахариды; синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотив (например, патент США № 6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), описанные в Европейских патентах № № 1,296,713 и 1,326,634; коклюшный токсин (РТ) или его мутант, холерный токсин или его мутант (например, Международная публикация РСТ № № WO 00/18434, WO 02/098368 и WO 02/098369); или термолабильный токсин Е. coli (LT), в частности LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; см., например, Международную публикацию РСТ № № WO 93/13302 и WO 92/19265.

Адъюванты, которые можно добавить в композиции по изобретению, могут включать SL-CD, гидрат окиси алюминия, SP-масло или карбопол, или метаболизируемое масло, такое как один или более ненасыщенных терпеновых углеводород(ов), например сквален или сквалан, и полиоксиэтилен-полипропиленовый блок-сополимер, такой как Pluronic®.

Термин "млекопитающие" включают однопроходных (например утконоса), сумчатых (например кенгуру) и плацентарных, которые включают домашний скот (домашние животные, используемые для получения пищи, молока или волокна, таких как свиньи, овцы, крупный рогатый скот и лошади) и животных-компаньонов (например собак, кошек). "Копытные" включают, но ограничиваются этим, крупный рогатый скот (быки, коровы), буйволов, бизонов, овец, свиней, оленей, слонов и яков. Каждый из них включает как взрослое, так и развивающееся животное (например телят, поросят, ягнят и т.д.). Иммуногенную композицию по изобретению можно вводить как взрослым, так и развивающимся млекопитающим, предпочтительно домашнему скоту.

"Иммунологически эффективное количество" представляет собой количество антигена, которое будет вызывать иммунный ответ. Иммунологически эффективное количество вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV) представляет собой количество BEFV, которое будет вызывать иммунный ответ против вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота. Иммунологически эффективное количество герпесвируса 1 крупного рогатого скота (IBR) представляет собой количество IBR, которое будет вызывать иммунный ответ против IBR-инфекции. Иммунологически эффективное количество вируса катаральной лихорадки овец (BTV) представляет собой количество BTV, которое будет вызывать иммунный ответ против BTV-инфекци. "Иммунологически эффективное количество" будет зависеть от вида, породы, возраста, размера и состояния здоровья животного-реципиента. "Иммунологически эффективное количество" будет зависеть от предыдущего воздействия на животное одним или более антигенами штамма независимо от того, являлся ли один или более чем один штамм вирулентным штаммом или авирулентным вирусным штаммом. Используемое в данной заявке "иммунологически эффективное количество" вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV), при использовании в комбинации с по меньшей мере одним подходящим адъювантом, представляет собой такое количество BEFV, которое является достаточным для усиления, иммуногенности вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота и, таким образом, обеспечивает защитный иммунитет против заражения вирулентным штаммом вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота. В одном воплощении иммунологически эффективное количество BEFV составляет примерно 106,20ТСЮ5она мл композиции.

Используемое в данной заявке "иммунологически эффективное количество" герпесвируса 1 крупного рогатого скота (IBR), при использовании в комбинации с по меньшей мере одним подходящим адъювантом, представляет собой такое количество, которое является достаточным для усиления иммуногенности герпесвируса крупного рогатого скота и, таким образом, обеспечивает защитный иммунитет против заражения вирулентным штаммом герпесвируса крупного рогатого скота. В одном воплощении иммунологически эффективное количество IBR составляет примерно 6,8 log на мл композиции.

Используемое в данной заявке "иммунологически эффективное количество" вируса катаральной лихорадки овец (BTV), при использовании в комбинации с по меньшей мере одним подходящим адъювантом, представляет собой такое количество, которое является достаточным для усиления иммуногенности вируса катаральной лихорадки овец и, таким образом, обеспечивает защитный иммунитет против заражения вирулентным штаммом вируса катаральной лихорадки овец. В одном воплощении иммунологически эффективное количество BTV составляет примерно 10^6,7 TCID₅₀ BTV серотипа 1 и/или примерно 10^7,3 TCID₅₀ BTV серотипа 8 на мл композиции.

В некоторых воплощениях изобретения вирусный антиген может представлять собой по меньшей мере штамм инфекционного герпесвируса 1 крупного рогатого скота (также называемого вирусом ринотрахеита крупного рогатого скота или IBR), вируса парагриппа, респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота, вируса бычьей вирусной диареи, вируса ящура, вируса катаральной лихорадки овец, вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, парвовируса собак, вируса чумы плотоядных, аденовируса собак, вируса парагриппа собак, коронавируса собак, вируса бешенства, вируса панлейкопении кошек, кальцивируса кошек, вируса кошачьего вирусного ринотрахеита, вируса кошачьего инфекционного перитонита, вируса лейкоза кошек, вируса иммунодефицита кошек, вируса Западного Нила, вируса энцефаломиелита лошадей, вируса гриппа лошадей, герпесвируса лошадей (ринопневмония), вируса артериита лошадей, парвовируса свиней, цирковируса свиней, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, ротавируса свиней, вируса гриппа свиней, вируса псевдобешенства, вируса инфекционного бурсита, вируса болезни Марека, вируса болезни Ньюкасла, вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного ларинготрахеита, вируса птичьего энцефаломиелита, птичьего реовируса, вируса птичьего гриппа.

Используемый в данной заявке, термин "вирусная субъединица" означает часть вириона. Например, субъединица вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEFV) может представлять собой по меньшей мере часть вириона BEFV, по меньшей мере часть генома BEFV, по меньшей мере часть BEFV-кодируемого белка, такого как нуклеопротеин BEFV, белка, ассоциированного с полимеразой BEFV, матриксного белка BEFV, РНК-зависимой РНК-полимеразы BEFV или гликопротеина BEFV.

Используемый в данной заявке термин "иммуногенный" означает, что композиция способна вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.Иммуногенный штамм также является антигенным. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при введении животному.

Термин "иммуногенная композиция" относится к любой фармацевтической композиции, содержащей антиген, например микроорганизм, композицию которой можно использовать для индукции иммунного ответа у животного. Иммунный ответ может включать Т-клеточный ответ, В-клеточный ответ или и Т-клеточный, и В-клеточный ответ. Композиция может служить для сенсибилизации млекопитающего посредством презентации антигена в ассоциации с молекулой МНС на поверхности клетки. Кроме того, антиген-специфические Т-лимфоциты или антитела могут образовываться для обеспечения будущей защиты иммунизированного хозяина. "Иммуногенная композиция" может содержать живой-ослабленнный или убитый/инактивированный антиген. Антиген может представлять собой целый микроорганизм или иммуногенную часть, происходящую из него, которая индуцирует иммунный ответ. Иммуногенная композиция может защищать животное от одного или более симптомов, ассоциированных с инфекцией, вызванной микроорганизмом, или может защищать животное от смерти в результате заражения микроорганизмом.

Термин "парентеральное введение", используемый в данной заявке, означает введение некоторыми иными способами, чем через желудочно-кишечный тракт, в частности путем введения веществ в организм внутривенной, подкожной, внутримышечной или интрамедуллярной инъекцией, но также другие не пероральные и не интраназальные пути введения, такие как внутрибрюшинная инъекция или местное применение.

Термины "вакцина" или "вакцинная композиция" являются взаимозаменяемыми в данной заявке и относятся к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одну иммуногенную композицию, которая индуцирует иммунный ответ у животного. Вакцина или вакцинная композиция может защитить животное от заболевания или возможной смерти, вызванной инфекцией, и может включать или может не включать один или более дополнительных компонентов, которые усиливают иммунологическую активность активного компонента. Вакцина или вакцинная композиция может дополнительно содержать дополнительные компоненты, характерные для фармацевтических композиций. Дополнительные компоненты могут включать, например, один или более адъювантов или иммуномодуляторов. Иммуногенно активный компонент вакцины может содержать целые живые организмы либо в их первоначальной форме, либо в виде ослабленных организмов в модифицированной живой вакцине, либо организмов, инактивированных соответствующими способами в убитой или инактивированной вакцине, или субъединичные вакцины, содержащие один или более иммуногенных компонентов вируса, либо генетически сконструированные, мутантные или клонированные вакцины, полученные способами, известными специалистам в данной области. Вакцина или вакцинная композиция может содержать один или одновременно более чем один из элементов, описанных выше.

Соответственно, в настоящей заявке могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии и иммунологии в пределах данной области. Такие методы полностью описаны в литературе. См, например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Примеры

Пpимер 1

ПОЛУЧЕНИЕ СМЕСИ ВИРУСА ЭФЕМЕРНОЙ ЛИХОРАДКИ КРУПНОГО РОГАТОГО CKOTA/QUIL А

Живой вирусный антиген эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (BEF) получали в виде замороженного концентрата. После оттаивания при комнатной температуре вирус объединяли с Quil А с последующим добавлением остальных ингредиентов для вакцины.

Порошок Quil А, произведенный Brenntag, получали из APS (A division of Nuplex Industies, Australia) в виде продукта с кодовым № 04307503.

Раствор концентрата Quil А готовили путем разбавления водой до 10 мг/мл.

Кратко, 149,96 мл концентрата живого антигена BEF (1,38×10⁷ ТCID₅₀/мл) разбавляли с помощью 36,34 мл 9,643 г/мл NaCl и добавляли 20,70 мл 10 мг/мл Quil А до 1 мг/мл. Смесь перемешивали в течение 2,5 часов при комнатной температуре.

Пример 2

ПОЛУЧЕНИЕ BEFV ВАКЦИНЫ

Для получения BEFV вакцины добавляли по порядку следующие ингредиенты с перемешиванием по 5 минут между добавлениями. 384,3 мл 8,5 г/мл NaCl

94,87 г BEFV/QUIL А смеси, полученной, как в Примере 1

120,00 мл 10 мг/мл концентрата SL-CD* для получения 20% (объем/объем)

1,36 г 9,9% (масс/об.) тиомерсала

*SL-CD готовили, как описано Hilgers с соавт.(Sulpholipo-cyclodextrin in squalene-in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine 17 (1999), pp219-228.)

После добавления всех ингредиентов вакцину перемешивали в течение 30 минут и pH доводили до 7,18.

Вакцину перемешивали в течение дополнительных 30 минут и использовали для заполнения маркированных упаковок типа "подушка".

Пример 3

ТЕСТИРОВАНИЕ BEFV ВАКЦИНЫ НА ЖИВОТНЫХ:

Испытания безопасности вакцины проводили в Fort Dodge Австралия, местечко Penrith. Безопасность вакцины тестировали на крупном рогатом скоте в соответствии с рекомендациями ЕР2002:0062.

Десять морских свинок и двух коров инокулировалиприготовленной выше вакциной для определения серологического ответа на антигенную фракцию BEF. Каждую из десяти морских свинок массой от 250 г до 400 г подкожно инокулировали 2,0 мл вакцины. Через шесть недель после инокуляции у морских свинок брали кровь. Двух коров в возрасте до 1 года инокулировали подкожно 4 мл вакцины. У коров брали кровь на 14-е сутки после инокуляции. Сыворотку, полученную от этих животных, тестировали путем нейтрализации вируса (VN) в соответствии с протоколом Biosecurity Sciences Laboratory, Department of Primary Industries and Fisheries Animal Research Institute, Queensland (Australia). Тест на нейтрализацию вируса использовали в соответствии с "Австралийскими стандартными диагностическими процедурами".

Результаты испытаний для двух партий вакцины показаны в Таблице 1, ниже:

Таблица 1
РЕЗУЛЬТАТЫ ПО БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ОДНОЙ ДОЗЫ BEF ВАКЦИНЫ
Тест	Описание	Результаты
		20% SL-CD
Стерильность	Бактерии или грибки не обнаружены	Прошли
pH водной фазы	6,5-7,5	7,25
Титр BEF в сыворотке	Не анализировали	Морская свинка=32 Крупный рогатый скот=отрицательный
Безопасность крупного рогатого скота	Никакой значительной местной или системной реакции	Никакой значительной местной реакции после вакцинации, но затем появление уплотнения в месте инъекции к 14 суткам

На основе экспериментов с использованием инактивированной BEF вакцины при испытаниях на крупном рогатом скоте и кроликах получено доказательство корреляции между серологией лабораторного животного и защитой крупного рогатого скота от BEFV. Таким образом, результаты на морских свинках, представленные в Таблице 1, подтверждают, что иммуногенная композиция по изобретению будет обеспечивать защиту крупного рогатого скота от BEFV.

Однократная доза BEF вакцинного препарата, полученного, как описано выше, образует стабильную эмульсию. Эту вакцину тестировали на безопасность, и первоначально она не давала никаких побочных реакций в тесте на безопасность на крупном рогатом скоте. Несмотря на отсутствие каких-либо системных и поведенческих реакций, вакцина вызывала некоторые локальные реакции в месте инъекции к концу периода наблюдения.

В Таблице 2 ниже представлены симптомы, появляющиеся у крупного рогатого скота после вакцинации однократной дозой в 4 мл вакцинного препарата, представленного выше.

Таблица 2
СИСТЕМНЫЕ И ЛОКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ
	Сутки после инокуляции	054.6 (20% SLCD)
		Корова #1	Корова #2
Системные реакции	1	Отсутствует	Отсутствует
	3	Отсутствует	Отсутствует
	5	Отсутствует	Отсутствует
	7	Отсутствует	Отсутствует
	10	Отсутствует	Отсутствует
	14	Отсутствует	Отсутствует
Локальные (местные) реакции - см	1	0	0
	3	Не измеряли	Не измеряли
	7	0	0
	14	2×9	2,5×13
Есть ли какая-либо значительная локальная или системная реакция?		Нет

Таким образом, применение иммуногенной композиции, содержащей сапонин (Quil А) и SL-CD в качестве адъювантов в композиции, содержащей BEFV, дает эффективную BEFV вакцину, которая полезна в качестве однодозовой вакцины.

Пример 4

ПОЛУЧЕНИЕ СМЕСЕЙ IBR ВАКЦИНЫ

Для того чтобы выбрать правильный адъювант для будущих вакцин, убитый рекомбинантный герпесвирус-1 крупного рогатого скота, также известный как вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR), используемый для вакцины, готовили путем смешивания с различными адъювантами и оценивали. Вакцины с тремя различными комбинациями адъювантов готовили с 1Х титром 6,04 log/мл 1 ВР(ЕЦ)(единицы эндотоксина). Вакцина А содержала АЮН (15%) и сапонин; вакцина В содержала 5% SP-масла; и вакцина С содержала 20% SL-CD и сапонин. Сапонин получали из Berghausen кат. № # 603013.

Таблица 3
МОНОВАЛЕНТНАЯ rIBR (ЕШ ВАКЦИНА А С ALOH (15%) И САПОНИНОМ В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТА
Компонент	Коэффициент концентрирования концентрата	Количество/Доза	Конц./Доза	Общий объем на 200 мл
rIBR Lot #rIBREU-02	9,8Х=7,03 log10/мл	6,8 log10s	30,00%	60,000 мл
Стерильный гель	2%; с тимеросалом		15,00%	30,000 мл
Раствор сапонина (100 мг/мл)	100 мг/мл	1 мг	0,50%	1,000 мл
20% NZ Amine AS	20%	н/а	5,00%	10,000 мл
5% тимеросал	5%	н/а	0,19%	0,370 мл
Смешивание разбавителя с Hepes без фенолового красного			49,32%	98,630 мл
20% HCl				мл
н/а - не анализировали

Таблица 4
МОНОВАЛЕНТНАЯ RIBR (EU) ВАКЦИНА В С 5% SP-МАСЛА В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТА
Компонент	Коэффициент концентрирования концентрата	Количество/Доза	Конц./Доза	Общий объем на 200 мл
rIBR Lot # riBREU-02	9,8Х=7,03 log10 /мл	6,8 log10s	30,00%	60,000 мл
20% NZ Amine AS	20%	н/а	5,00%	10,000 мл
SP-масло		5%	5,00%	10,000 мл
5% тимеросал	5%	н/а	0,19%	0,375 мл
Смешивание разбавителя с Hepes без фенолового красного			59,81%	119,625 мл
20% HCl				мл

Таблица 5
МОНОВАЛЕНТНАЯ rIBR (EU) ВАКЦИНА С: с 20%SL-CD И САПОНИНОМ В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТОВ
Компонент	Коэффициент концентрирования концентрата	Количество/Доза	Конц./Доза	Общий объем на 200 мл
rIBR Lot # rlBREU-02	9,8X=7,03 log10 /мл	6,8 log10s	30,00%	60,000
SL-CD*			20,00%	40,000
Раствор сапонина (100 мг/мл)	100 мг/мл	1 мг	0,50%	1,000
20% NZ Amine AS	20%	н/а	5,00%	10,000
5% тимеросал	5%	н/а	0,20%	0,400
Смешивание разбавителя с Hepes без фенолового красного			44,30%	88,600
20% HCl
*SL-CD/сквалан получен, как описано Hilgers с соавт.(Sulpholipocyclodextrin in squalene-in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine 17 (1999), pp219-228.)

Пример 5

ТЕСТИРОВАНИЕ IBR ВАКЦИН НА ЖИВОТНЫХ

Испытания вакцин проводились в Айове. В общей сложности 27 телят в возрасте 5-6 месяцев рандомизировали в группы, как показано на Таблице 6 ниже:

Таблица 6
ЖИВОТНЫЕ, ПРОТЕСТИРОВАННЫЕ С IBR ВАКЦИНАМИ
Группа		# Животные	Вакцина		# Вакцинация
1		5	rIBR, Al(OH)2/Сапонин		2
2		5	rIBR, SP-масло		2
3		5	rIBR, SL-CD/Сапонин		2
4	5		rIBR, SL-CD/Сапонин	1
5	5		нет	нет
6	2		нет	нет

За исключением телят из Групп 4-6, телят вакцинировали дважды подкожно, с интервалом в 3 недели. Через две недели после второй вакцинации (три недели после вакцинации для Группы 4), всех телят (за исключением двух телят из Группы 6) заражали вирулентным вирусом IBR интраназально. Всех телят контролировали ежесуточно в течение 14 суток после заражения в отношении клинических признаков заболевания. Клинические признаки включали, но не ограничивались этим, слизисто-гнойные выделения из носа, выделения из глаз, одышка, плохой аппетит (потеря аппетита) и депрессия. Ректальные температуры также определяли ежесуточно в течение 14 суток после заражения. У животных периодически брали кровь на сыворотку на протяжении исследования и антитела против IBR определяли с использованием анализа нейтрализации сыворотки. Мазки из носа собирали ежесуточно для выделения вируса от двух суток до заражения до 14 суток после заражения. Определяли титр вируса, выделенного из каждого теленка ежесуточно. Одно животное из Группы 2 устранили от исследования из-за плохого состояния здоровья.

Наблюдаемые клинические признаки, ассоциированные с IBR-заражением, просуммированы в Таблице 7 ниже, и результаты вирусоносительства представлены в Таблице 8. Титры антител, нейтрализующих IBR сыворотку, перечислены в Таблице 9.

Таблица 7
СРЕДНЕЕ ЧИСЛО КЛИНИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ, НАБЛЮДАЕМЫХ У ЖИВОТНЫХ, ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУЛЕНТНЫМ IBR
Группа	Лихорадка13	Слизисто-гнойные выделения из носа	Кашель
rIBR, Al(OH)2/Сапонин	1,8±1,5	0,4±0,5	1,2±0,8
rIBR, SP-масло	3,0±2,9	0,5±0,6	1,0±2,0
rIBR, SL-CD/Сапонин, две дозы	2,8±3,4	0,6±0,9	0,6±0,9
rIBR, SL-CD/Сапонин, одна доза	4,0±3,2	0,8±0,8	0,6±0,5
Контроль заражения	5,2±1,8	1,0±1,0	2,2±3,3
Контроль окружения	0	0	0
а3начение выражается как среднее±стандартное отклонение.
bРектальная температура не менее 103.5°F и 1°F выше базового уровня.

В связи с малым размером группы, различия, наблюдаемые между вакцинированными животными и контролями, не являются статистически достоверными. Однако численные различия действительно указывают на эффект вакцинации, особенно для первых трех групп.

Заболеваемость и титр вирусоносительства приведены в Таблице 8 ниже:

Таблица 8
СРЕДНИЕ ТИТРЫa ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВА И ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ b У ЖИВОТНЫХ, ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУЛЕНТНЫМ IBR
Группа	Титр	Заболеваемость
rIBR, Al(OH)2/Сапонин	6,1±0,6*	7,2±1,5*
rIBR, SP-масло	5,9±0,8*	7,3±0,5*
rIBR, SL-CD/Сапонин, две дозы	4,2±2,1	4,6±2,7
rIBR, SL-CD/Сапонин, одна доза	6,1±0,5*	6,2±1,1*
Контроль заражения	6,6±0,4*	8,2±1,8*
Контроль окружения	0	0
aЗначение выражается как средний log10 TCID50 титр ± стандартное отклонение.
bЗначение выражается как среднее±стандартное отклонение
*Указанная величина значительно отличается от группы, вакцинированной двумя дозами rIBR с адъювантом SL-CD/Сапонин, p<0,05.

Результаты вирусоносительства показывают, что SL-CD+Сапонин обеспечивал лучшую защиту за счет уменьшения числа (по меньшей мере в 100 раз) и частоты вирусоносительства. Это продемонстрировало, что защита, по-видимому, связана со значительно более высоким титром антител во время экспериментального заражения, как показано на Таблице 9 ниже:

Таблица 9
ТИТРЫa СЫВОРОТОЧНЫХ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ-IBR У ЖИВОТНЫХ, ВАКЦИНИРОВАННЫХ УБИТОЙ rIBR ВАКЦИНОЙ С РАЗЛИЧНЫМИ АДЪЮВАНТАМИ
	Группа	Титр
	rIBR, Al(OH)2/Сапонин	25±2*
	rIBR, SP-масло	32±2*
	rIBR, SL-CD/Сапонин, две дозы	63±4
	rIBR, SL-CD/Сапонин, одна доза	4±3*
а Значения выражаются как средний геометрический титр±стандартное отклонение. Образцы сыворотки собирали в сутки заражения.
* Указанное значение значительно отличается от значения из группы, вакцинированной двумя дозами rIBR с адъювантом SL-CD/Сапонин, p<0,05.

Результаты этого исследования показывают, что среди трех оцененных адъювантов комбинация SL-CD/Сапонин обеспечивает лучшие характеристики.

Пример 6

ПОЛУЧЕНИЕ ВАКЦИН К ВИРУСУ КАТАРАЛЬНОЙ ЛИХОРАДКИ ОВЕЦ

Приготовили пять различных инактивированных вакцин против серотипа 1 и 8 вируса катаральной лихорадки овец с различной концентрацией антигена BTV8 и с различной композицией адъювантов. Титр BTV серотипа 1 (10^6,7 TCID₅₀ ) оставался постоянным во всех протестированных вакцинах. Телята получили две инокуляции с интервалом в две недели. Композиция вакцин Е-43, Е-44, Е-45, Е-47 и Е-48 приведена в Таблицах 10-14 ниже:

Таблица 10
КОМПОЗИЦИЯ BTV ВАКЦИНЫ Е-43*
КОМПОНЕНТ	КОЛИЧЕСТВО
BTV инактивированный серотип 1, штамм ALG2006/01 Е1	106,7 TCID50
BTV инактивированный серотип 8, штамм BEL2006/02	107,3 TCID50
3% гель гидрата окиси алюминия	4 мг Al 3+
Сапонин	0,4 мг
Солевой раствор	сколько нужно до 2,0 мл
Тиомерсал	0,2 мг
*Партия Е-43 Zulvac® 1+8 Bovis вакцины представляет собой вакцину зарегистрированную в Испании (Срочная лицензия).

Таблица 11
КОМПОЗИЦИЯ BTV ВАКЦИНЫ Е-44
КОМПОНЕНТ	КОЛИЧЕСТВО
BTV инактивированный серотип 1, штамм ALG2006/01 Е1	106,7TCID50
BTV инактивированный серотип 8, штамм BEL2006/02	107,3 TCID50
3% гель гидрата окиси алюминия	4 мг Al 3+
Сапонин	0,4 мг
Солевой раствор	сколько нужно до 2,0 мл
Тиомерсал	0,2 мг

Таблица 12
КОМПОЗИЦИЯ BTV ВАКЦИНЫ Е-45
КОМПОНЕНТ	КОЛИЧЕСТВО
BTV инактивированный серотип 1, штамм ALG2006/01 Е1	106,7 TCID50
BTV инактивированный серотип 8, штамм BEL2006/02	107,3 TCID50
3% гель гидрата окиси алюминия	4 мгА13+
Сапонин	1,0 мг
Солевой раствор	сколько нужно до 2,0 мл
Тиомерсал	0,2 мг

Таблица 13
КОМПОЗИЦИЯ BTV ВАКЦИНЫ Е-47
КОМПОНЕНТ	КОЛИЧЕСТВО
BTV инактивированный серотип 1, штамм ALG2006/01 Е1	106,7 TCID50
BTV инактивированный серотип 8, штамм BEL2006/02	107,3 TCID50
SL-CD*	20%
Сапонин**	1,0 мг
Солевой раствор	сколько нужно до 2,0 мл
Тиомерсал	0,2 мг
* DL-CD/cквaлaн, полученный, как описано Hilgers с соавт.(выше).
**Brenntag № в каталоге 27031012600

Таблица 14
КОМПОЗИЦИЯ BTV ВАКЦИНЫ е-48
КОМПОНЕНТ	КОЛИЧЕСТВО
BTV инактивированный серотип 1, штамм ALG2006/01 E1	106,7 TCID50
BTV инактивированный серотип 8, штамм BEL2006/02	107,3 TCID50
SLCD	20%
Сапонин	1,0 мг
Солевой раствор	сколько нужно до 2,0 мл
Тиомерсал	0,2 мг

Пример 7

РЕЗУЛЬТАТЫ ПО НЕЙТРАЛИЗАЦИИ СЫВОРОТКИ

Титры нейтрализующих антител измеряли у всех телят через одну неделю (+28) и две недели (+35) после вакцинации. Результаты по нейтрализации сыворотки представлены в таблицах 15-20 ниже. Присутствие нейтрализующих антител свидетельствует о защите, но животные без нейтрализующих антител могут также быть защищены благодаря клеточно-опосредованному иммунному ответу.

Таблица 15
РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ВАКЦИНОЙ Е-43
BTV-1=10exp6,7 BTV-8=10ex=10exp7,3
	+28		+35
Теленок	BTV 1	BTV 8	BTV 1	BTV 8
79	1,4	1,4	4	4
243	1	2	16	5,7
349	4	2,8	32	11,3
365	2	1	16	2,8
524	1,4	5,7	22,6	4
638	1,4	2,8	22,6	22,6
660	11,3	1	22,6	5,7
695	8	2,8	22,6	8
720	4	1,4	16	4
841	8	1,4	32	5,7
893	16	11,3	22,6	16
922	32	4	64	32
1027	11,3	4	45,3	11,3
1324	8	8	45,3	11,3
1327	8	4	64	22,6
1608	45,3	11,3	45,3	8
2039	11,3	16	128	16
2996	2	5,7	4	5,7
5371	5,7	8	8	8
6352	2,8	1,4	16	16
GM	5,4	3,4	23,4	8,9

Таблица 16
РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ВАКЦИНОЙ Е-44
Теленок	+28		+35
	BTV 1	BTV8	BTV 1	BTV8
287	2	1,4	4	2
332	22,6	8	128	11,3
346	45,3	32	32	16
502	8	2,8	16	16
539	11,3	4	90,5	8
608	4	1,4	16	1
628	16	2	32	16
630	2,8	1,4	22,6	1,4
647	45,3	16	128	32
887	22,6	2,8	128	5,7
1046	11,3	2	45,3	1,4
2881	45,3	4	16	32
3035	16	8	22,6	11,3
3046	16	5,7	16	8
3824	2,8	2	11,3	1
4341	22,6	4	11,3	4
4656	22,6	5,7	22,6	8
6927	8	1	8	4
6997	5,7	8	22,6	2
8097	1	5,7	2,8	5,7
GM	10,5	3,9	23,0	5,7

Таблица 17
РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ВАКЦИНОЙ Е-45
Теленок	+28		+35
	BTV1	BTV8	BTV1	BTV8
87	8	2	16	8
296	4	4	11,3	5,7
520	11,3	11,3	64	11,3
607	8	8	90,5	11,3
612	11,3	16	64	16
623	11,3	8	8	11,3
717	16	4	45,3	4
731	16	16	128	16
789	8	11,3	16	8
871	64	8	90,5	16
886	11,3	2,8	128	5,7
914	4	1	64	2
977	11,3	8	45,3	32
1024	32	8	90,5	32
1542	4	1,4	22,6	5,7
2654	4	2	16	5,7
2843	16	5,7	45,3	16
6772	11,3	5,7	45,3	4
8004	5,7	4	8	8
8327	4	4	22,6	32.
GM	9,7	5,1	36,8	9,7

Таблица 18
РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ВАКЦИНОЙ Е-47
Теленок	+28		+35
	BTV1	BTV8	BTV1	BTV8
22	2	1,4	4	16
345	32	8	181	22,6
422	2,8	5,7	4	8
501	8	4	32	8
535	8	16	22,6	8
536	4	1	5,7	1,4
551	1	2	11,3	8
617	8	8	32	16
735	1	1	16	2
748	16	4	64	16
817	4	2,8	11,3	16
894	4	4	16	4
982	5,7	2	16	16
1009	1	4	11,3	11,3
1157	16	8	128	22,6
1187	5,7	8	45,3	11,3
5515	8	2,8	64	4
5982	5,7	2,8	11,3	2
6776	16	8	22,6	11,3
7797	4	1	32	8
GM	5,1	3,5	21,5	8,3

Таблица 19
РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ВАКЦИНОЙ Е-48
Теленок	+28		+35
	BTV1	BTV8	BTV1	BTV8
130	4,0	2	45,3	2
316	5,7	2	16	4
344	2,8	1	16	2,8
428	5,7	2,8	8	2,8
442	1,4	2,8	16	1
514	22,6	2,8	64	8
645	64,0	5,7	128	4
740	32,0	5,7	181	5,7
787	1,0	2,8	45,3	8
790	5,7	2	32	1
836	2,8	1
890	8,0	2,8	32	5,7
1278	16,0	4	32	8
1789	11,3	4	90,5	16
3654	1,4	1,4	1,4	4
6783	4,0	1	16	1,4
7085	32,0	4	22,6	4
9872	16,0	1,4	32	4
40552	5,7	2,8	8	1
80552	8	1,4	5,7	2
GM	7,0	2,3	24,3	3,4

Таблица 20
КОНТРОЛИ
Теленок	+28		+35
	BTV1	BTV8	BTV1	BTV8
295	1	1	1	1
377	1	1	1	1
537	1	1	1	1
548	1	1	1	1
643	1	1	1	1
659	1	1	1	1
671	1	1	1	1
679	1	1	1	1
724	1	1	1	1
733	1	1	1	1
778	1	1	1	1
1079	1	1	1	1
1221	1	1	1	1
1791	1	1	1	1
2117	1	1	1	1
2568	1	1	1	1
3659	1	1	1	1
3931	1	1	1	1
5523	1	1	1	1
8287	1	1	1	1
GM	1,0		1,0	1,0

Наличие виремии для BTV1 и BTV8 определяли на 4-е, 5-е и 8-е сутки после заражения у животных, вакцинированных вакцинами Е-43: ZULVAC 1+8 (BTV1: 106.7+BTV8: 107.3) (Al³⁺+Сапонин: существующий препарат) и Е-47: ZULVAC 1+8 (BTV1:10^6,7+BTV8:10^7,3) (SLCD+2,5хСапонин: новый адъювант).

Вакцина Е-43: ZULVAC 1+8 (BTV1: 10^6,7+BTV8: 10^7,3) (Al3++Сапонин: существующий препарат)

100%-ное предотвращение виремии для BTV1 (0/8)

87,5%-ное предотвращение виремии для BTV8 (1/8)

Вакцина Е-44: ZULVAC 1+8 (BTV1 10 ^6,7+BTV8: 10^7,5) (Al³⁺+Сапонин: 1,58 больше антигена BTV8, чем в существующем препарате)

100%-ное предотвращение виремии для BTV1 (0/8)

87,5%-ное предотвращение виремия для BTV8 (1/8)

Результаты, представленные непосредственно выше, показывают, что увеличение BTV серотипа 8 в вакцине на 1,58X не индуцирует лучшую защиту.

Вакцина Е-47: ZULVAC 1+8 (BTV1 10^6,7+BTV8: 10^7,3) (SLCD+2,5X Сапонин: новый адъювант)

100%-ное предотвращение виремии для BTV1 (0/8)

100%-ное предотвращение виремии для BTV8 (0/8)

Вакцина Е-45: ZULVAC 1+8 (BTV1 10^6,7+BTV8: 10^7,3) (Al³⁺+2X Сапонин: 2х больше сапонина, чем в существующем препарате)

100%-ное предотвращение виремии для BTV1 (0/8)

100%-ное предотвращение виремии для BTV8 (0/8)

Пример 8

ПРОДУКЦИЯ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА

Bovigam ТВ тест (Prionics) использовали для определения гамма-интерферона в образцах крови. Кратко, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) собирали и стимулировали, частично с помощью VP7 и частично с помощью VP2. Продукцию гамма-интерферона детектировали только после стимуляции клеток крови с помощью VP7.

Результаты оценки специфической продукции у животных,

вакцинированных вакцинами Е-43 и Е-47 следующие. 1-я вакцинация (D+0); 2-я вакцинация (D+21); Заражение (D+45)

В общей сложности 30 3-месячных Фризских телят без антител против BTV включили в исследование. Пол телят не учитывали. Только нормальных и здоровых животных включали в исследование. Состояние их здоровья определяли по прибытии. Животных индивидуально идентифицировали с помощью ушных бирок. 30 серонегативных Фризских телят распределяли случайным образом на четыре группы (с использованием программы Microsoft Excel) следующим образом:

Группа 1: 10 телят, вакцинированных и ревакцинированных вакциной Е-43

Группа 2: 10 телят, вакцинированных и ревакцинированных вакциной Е-47

Группа 3: 10 контрольных телят, невакцинированных

Вакцинации проводили внутримышечно (в/м), наиболее распространенным способом введения вакцины крупному рогатому скоту, используя 2 мл вакцины.

Телят в группах 1 и 2 вакцинировали в 0-е сутки (D+0) и ревакцинировали через 3 недели (D+21).

Телят в группе 3 оставляли в качестве невакцинированных контролей.

Кровь у телят брали в 0-е сутки (D+0), перед первой вакцинацией; перед ревакцинацией (или 2-й вакцинацией) через три недели (D+21); и в 42-е сутки, перед заражением (D+42). Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали из отдельных образцов.

Через двадцать четыре дня после 2-й вакцинации телят перемещали в Fort Dodge ветеринарное хозяйство для контрольного заражения № 3, где через 24 дня после ревакцинации (D+45) 8 животных из каждой группы заражали BTV-1 или BTV- 8. Кровь брали у животных через 5 суток после заражения для оценки специфической продукции -IFN против VP7 и VP2.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ -IFN

Кровь, собранную в присутствии гепарина, брали у всех экспериментальных животных в сутки каждой вакцинации, за сутки до заражения и через 5 суток после заражения. РВМС извлекали в градиенте плотности (Histopaque 1077), промывали и ресуспендировали до конечной концентрации 5×10⁶ клеток/мл в среде RPMI 1640 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки высевали на 96-луночных планшетах с любым из рекомбинантных белков VP2 и VP7 (1 мг/мл). Конканавалин А (5 мг/мл) использовали в качестве положительного контроля. Планшеты инкубировали при 37°C в течение 16-й ночи. Анализы -IFN проводили в супернатантах с использованием теста на интерферон крупного рогатого скота (Bovigam ТВ, Prionics). Результаты выражали в единицах А450 после вычитания нестимулированных значений для каждого животного.

Только рекомбинантный белок VP7 оказался способным индуцировать специфическую продукцию -IFN у вакцинированных животных после второй вакцинации.

В сутки заражения, 3 из 10 (30%) телят, вакцинированных вакциной Е-47, продемонстрировали продукцию -IFN против VP7. Через пять суток после заражения доля положительных животных увеличилась до 63%. Животные, вакцинированные вакциной Е-43, продемонстрировали положительную продукцию -IFN против VP7 через пять суток после заражения (2 из 8, 25%), но не в сутки заражение.

Результаты, представленные в Таблице 21, выражены в виде единиц А450 и в виде процентных соотношений положительной продукции y-IFN (>0,065).

Таблица 21
СТАТИСТИКА ДЛЯ КАЖДОЙ ГРУППЫ ЛЕЧЕНИЯ В СУТКИ КАЖДОЙ ВАКЦИНАЦИИ, В СУТКИ ЗАРАЖЕНИЯ И ЧЕРЕЗ 5 СУТОК ПОСЛЕ ЗАРАЖЕНИЯ
Лечение		VP2_D0V1	VP7_D0V1	VP2_D0V2	VP7_D0V2	VP2D0Ch	VP7D0Ch	VP2D5Ch	VP7D5Ch
Е-43	Среднее	,00180	,00060	,00156	,00600	,00130	,00980	,00200	,04400
	N	10	10	9	9	10	10	8	8
	Ст. отклонение	,004467	,001265	,002555	,010235	,002406	,020596	,002976	,078258
	Минимальное	,000	,000	,000	,000	,000	,000	,000	,000
	Максимальное	,014	,003	,007	,029	,007	,068	,007	,207
	Медиана	,00000	,00000	,00000	,00000	,00000	,00300	,00000	,00550
Е-47	Среднее	,00300	,00100	,00911	,00489	,00220	,13830	,00800	,35600
	N	10	10	9	9	10	10	8	8
	Ст. отклонение	,009487	,003162	,012354	,007061	,002658	,267033	,015501	,356680
	Минимальное	,000	,000	,000	,000	,000	,001	,000	,003
	Максимальное	,030	,010	,033	,020	,008	,816	,045	,831
	Медиана	,00000	,00000	,00400	,00200	,00150	,00550	,00150	,30800
Контроль	Среднее	,00520	,00320	,00322	,01189	,00310	,00160	,00233	,00944
	N	10	10	9	9	10	10	9	9
	Ст. отклонение	,011124	,007315	,006320	,023385	,005195	,002221	,004000	,011727
	Минимальное	,000	,000	,000	,000	,000	,000	,000	,000
	Максимальное	,030	,022	,019	,069	,017	,007	,012	,031
	Медиана	,00000	,00000	,00000	,00000	,00150	,00100	,00000	,00400
В сутки заражения, при применении критерия Манна-Уитни, обнаружили значительные различия между группам, вакцинированными Е-43 и Е-47, и контрольной группой: Е-43 относительно контролей: р=0,035; Е-47 относительно контролей: P=0,003
Через 5 суток после заражения, при применении критерия Манна-Уитни, обнаружили значительные различия между группами, вакцинированными Е-43 и Е-47, и контрольной группой: Е-43 относительно Е-47: р=0,021; Е-47 относительно контролей: p=0,006

Таблица 22
КРОСС-ТАБЛИЦА МЕЖДУ ДВУМЯ ВАКЦИНАМИ В СУТКИ ЗАРАЖЕНИЯ
			Обработка
			Е-43	Е-47	Всего
VP7D+0Ch	Отрицательное	Количество	10	7	17
		% во время обработки	100,0%	70,0%	85,0%
	Положительное	Количество	0	3	3
		% во время обработки	,0%	30,0%	15,0%
	Всего	Количество	10	10	20
		% во время обработки	100,0%	100,0%	100,0%
Нет значительных различий: р=0,105

Таблица 23
КРОСС-ТАБЛИЦА МЕЖДУ ДВУМЯ ВАКЦИНАМИ ЧЕРЕЗ 5 СУТОК ПОСЛЕ ЗАРАЖЕНИЯ
			Обработка
			Е-43	Е-47	Всего
VP7D+5Ch	Отрицательное	Количество	6	3	9
		% во время обработки	75,0%	37,5%	56,3%
		Количество	2	5	7
	Положительное	% во время обработки	25,0%	62,5%	43,8%
	Всего	Количество	8	8	16
		% во время обработки	100,0%	100,0%	100,0%
Нет значительных различий: р=0,157

Таблица 24
КРОСС-ТАБЛИЦА МЕЖДУ ВАКЦИНОЙ Е-47 И КОНТРОЛЯМИ В СУТКИ ЗАРАЖЕНИЯ
			Обработка
			Е-47	Контроль	Всего
VP7D+0Ch	Отрицательное	Количество	7	10	17
		% во время обработки	70,0%	100,0%	85,0%
	Положительное	Количество	3	0	3
		% во время обработки	30,0%	,0%	15,0%
	Всего	Количество	10	10	20
		% во время обработки	100,0%	100,0%	100,0%
Нет значительных различий: р=0,105

Таблица 25
КРОСС-ТАБЛИЦА МЕЖДУ ВАКЦИНОЙ Е-47 И КОНТРОЛЯМИ ЧЕРЕЗ 5 СУТОК ПОСЛЕ ЗАРАЖЕНИЯ
			Обработка
			Е-47	Контроль	Всего
VP7D+5Ch	Отрицательное	Количество	3	9	12
		% во время обработки	37,5%	100,0%	70,6%
	Положительное	Количество	5	0	5
		% во время обработки	62,5%	,0%	29,4%
	Всего	Количество	8	9	17
		% во время обработки	100,0%	100,0%	100,0%

Значительные различия: р=0,009

Таблица 26
КРОСС-ТАБЛИЦА МЕЖДУ ВАКЦИНОЙ Е-43 И КОНТРОЛЯМИ ЧЕРЕЗ 5 СУТОК ПОСЛЕ ЗАРАЖЕНИЯ
			Обработка
			Е-43	Контроль	Всего
VP7D+5Ch	Отрицательное	Количество	6	9	15
		% во время обработки	75,0%	100,0%	88,2%
	Положительное	Количество	2	0	2
		% во время обработки	25,0%	,0%	11,8%
	Всего	Количество	8	9	17
		% во время обработки	100,0%	100,0%	100,0%

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

- Телята, вакцинированные ZULVAC 1+8, партия Е-47 (BTV1: 10^6,7 +BTV8: 10^7,3) (SLCD+2,5×Сапонин: новый адъювант), показали более высокое количество -IFN в сутки заражения (через 3 недели после 2-й вакцинации) и через 5 суток после заражения, чем контроли и чем телята, вакцинированные ZULVAC 1+8 (BTV1: 10^6,7+BTV8: 10^7,3) (Al ³⁺+Сапонин: существующий препарат).

- Телята, вакцинированные вакциной Е-43 (существующий препарат), не показали продукции -IFN против VP7 вплоть до 5 суток после заражение. Ее значения были значительно ниже (р=0,021), чем значения, индуцированнные вакциной Е-47 (новый адъювант).

- Только рекомбинантный белок VP7 смог индуцировать выявляемые количества -IFN, поэтому VP7 может быть усилителем клеточного иммунитета.