фармацевтическая композиция, содержащая физиологически активные гептапептиды, обладающие противосудорожным, анксиолитическим, центральным противовоспалительным и анальгетическим, а также антиалкогольным действием

Формула изобретения

1. Применение гептапептида общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где Х это D-Pro или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин, в качестве противосудорожного, анксиолитического, центрального противовоспалительного или антиалкогольного средства.

2. Фармацевтическая композиция, применяемая в качестве противосудорожного, анксиолитического, центрального противовоспалительного или антиалкогольного средства, содержащая гептапептид общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где Х это D-Pro или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин, инкапсулированный в наночастицы и/или микрочастицы из фармацевтически пригодных, биосовместимых и биодеградируемых (со)полимер(ов) и/или полимерных матриц, и/или сорбированный, и/или адсорбированный на их поверхности, и/или инкапсулированный в липосомы.

3. Композиция по п.2, выполненная в виде одной из следующих лекарственных форм: раствор для инъекций, назальный спрей, назальные капли, сублингвальные таблетки, вагинальные и ректальные суппозитории, кишечно-растворимые таблетки и капсулы, трансдермальные системы для резорбтивного действия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к лекарственным препаратам, и может быть использовано для лечения ряда заболеваний, при которых необходимы средства, обладающие анксиолитическим, антиалкогольным, центральным противовоспалительным, противосудорожным и обезболивающим действием.

Известен гептапептид дерморфин (ДМ) общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH ₂, обладающий анальгетической, терморегуляторной активностью и влиянием на поведенческую реакцию испытуемого. (Emel'yanova T.G. et al, Effect of [Dermorphin of Thermoregulation in Rats at Selected Ambient Temperatures. - Peptides, 1996, V 17, N 2. P 241-245) [1], предлагаемый в качестве наиболее близкого аналога для заявленного вещества. К недостаткам известного природного гептапептида следует отнести то, что он не обладает эффектами, реализуемыми на центральном уровне.

Известен способ изменения физиологической активности дерморфина общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂ путем химической модификации входящего в его состав аминокислотного остатка. (Л.С.Гузеватых и др. Влияние структурных изменений Рrо6 в молекуле дерморфина на анальгетическую активность. Известия АН, серия биологическая 2002. - т.4, с.472-476). Однако данный природный гептапептид обладает физиологической активностью недостаточно высокого уровня в связи с быстрой биодеградацией в плазме крови и тканях под влиянием пептидаз.

Из патента РФ № 2134121 известен гептапептид, обладающий анальгетической активностью, сочетающейся с терморегуляторной и/или с сосудодвигательной активностью и/или с влиянием на поведенческую реакцию испытуемого, предложенный в качестве наиболее близкого аналога.

Задача, решаемая созданием настоящего изобретения, состоит в получении анксиолитического, противосудорожного, антиалкогольного, центрального противовоспалительного и обезболивающего средства, удобного и эффективного в применении, при этом технический результат, полученный при решении поставленной задачи, состоит в увеличении выраженности и продолжительности действия, возможности снижения действующей дозы и расширении спектра физиологической активности, реализуемой преимущественно на центральном уровне.

Для достижения поставленного результата предлагается использовать гептапептид общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂ [1], где X это D-Pro или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин, в качестве противосудорожного, анксиолитического, центрального противовоспалительного, анальгетического или антиалкогольного средства.

Кроме того, для достижения поставленного результата предлагается фармацевтическая композиция, содержащая гептапептид общей формулы [1], инкапсулированный в наночастицы и/или микрочастицы из фармацевтически пригодных, биосовместимых и биодеградируемых (со)полимер(ов) и/или полимерных матриц, и/или сорбированный и/или адсорбированный на их поверхности и/или инкапсулированный в липосомы. Варианты реализации композиции предполагают ее исполнение в виде одной из следующих лекарственных форм: раствор для инъекций, назальный спрей, назальные капли, сублингвальные таблетки, вагинальные и ректальные суппозитории, кишечнорастворимые таблетки и капсулы, трансдермальные системы для резорбтивного действия.

Возможность достижения поставленного результата при использовании наноформы гептапептида общей формулы [1] подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Влияние наноформы гептапептида общей формулы [1] на болевую чувствительность (анальгетическая активность).

Тест «отдергивания хвоста». Животное помещали в индивидуальную пластиковую камеру, хвост погружали на 5 см в воду с температурой 55±1°С. В тесте фиксировали латентный период избавления от болевого раздражителя - период времени (сек), в течение которого животное выдергивало хвост из воды полностью. Максимальное время предъявления болевого раздражителя 30 сек. Исходную болевую чувствительность определяли как среднее арифметическое из показателей, зафиксированных на 60, 40, и 20 минут до инъекции. Латентный период избавления от болевого раздражителя фиксировали через 20, 40 и 60 120 минут после введения. Анальгетическую активность оценивали по изменению латентного периода реакции по формуле А=ЛПоп-ЛПисх, где ЛПоп - латентный период избавления после введения вещества, Лписх - среднее арифметическое латентных периодов избавления до введения вещества.

Исследуемые образцы в дозах 0.01, 0.1, 1 и 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе самцам нелинейных белых крыс весом 200-300 г. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1
Испытуемый образец		Отдергивание хвоста (изменение чувствительности, сек)
		20 мин	40 мин	60 мин	90 мин	120 мин
Контроль		0.5±0.1	0.5±0.1	0.310.1	0.210.1	-0.1±0.1
Образец 1 (наноформа D-Pro)	0.1 мг/кг	3.5±10.4*	1.9±0.2	1.6±0.2	0.310.1	0.1±0.1
	1 мг/кг	2.9±0.3*	3.90±.3*	8.2±1.0*	5.110.3*	4.2±0.6*
Образец 2 (микроформа D-Рго)	0.01 мг/кг	2.7±0.6*	2.6±0.6*	1.6±0.3	0.610.2	0.1±0.1
	0.1 мг/кг	2.3±0.3*	4.7±0.5*	3.70±.3*	1.810.3	1±0.2
	1 мг/кг	5.8±0.9*	7.6±0.8*	5.4±0.5*	4.010.6*	0.2±0.1
	10 мг/кг	11±1.2*	12.4±1.6*	12.8±1.4*	6.710.7*	4.50±.3*
Образец 3 (липоформа D-Pro)	0.1 мг/кг	7.6±0.9*	7.3±0.7*	4.7±0.5*	1.610.2*	0.4±0.1
	1 мг/кг	5,7±0.7*	7.5±0.8*	5.3±0.6*	4.110.5*	4.3±0.4*
Образец 4 (наноформа Dh-L-Pro)	0.01 мг/кг	2.6±0.3	4.3±1.1*	3.7±0.6*	1.410.4	0.1±0.1
	0.1 мг/кг	4,7±0.9*	5.2±1.4*	4.30±0.7*	2.110.6	0.2±0.1
Гептапептид в субстанции	1 мг/кг	0±0.1	0.3±0.2	0.2±0.1	0.110.1	0±0.1
	10 мг/кг	4.5±0.5*	1.7±0.4	1.3±0.6	0.410.2	0.1±0.1
Аналог 1 гептапептида в субстанции	1 мг/кг	0.1±0.2	0.3±0.2	0.2±0.1	0.110.1	-0.1±0.1
	10 мг/кг	4.2±1.6*	3.9±1.2*	2.9±1.9	1.911.2	0.7±0.3
Аналог 2 гептапептида в субстанции	1 мг/кг	2.6±1.5	1.5±0.9	0.8±0.4	0.610.3	-0.1±0.2
	10 мг/кг	5.5±2.4*	4.9±2.2*	3.6±1.7*	1.310.8	0.8±0.4
* - достоверность по сравнению с контролем при Р<0,05.

Из представленных результатов следует, что применение соединений на основе наноформы гептапептида общей формулы [1] вызывает достоверное увеличение латентного периода реакции отдергивания хвоста в ответ на болевое раздражение. Возможность снижения дозы при увеличении выраженности и продолжительность обезболивающего действия иллюстрируется следующим результатами: образец 2 оказывает обезболивающее действие в дозах 0,1-10 мг/кг, действие сохранялось более 2 часов; образец 1 и 3 проявляют обезболивающее действие в дозах 1 и 10 мг/кг, действие также сохранялось более 2 часов; образец 4 вызывает обезболивающее действие в дозах 1-10 мг/кг, действие сохранялось 60 минут.

Пример 2. Влияние наноформы гептапептида общей формулы [1] на анальгетическую и противовоспалительную активность. Тест корчей, вызванных уксусной кислотой (Chernov et. al., 1967). Исследования проводились на самцах нелинейных белых мышей весом 20-30 г. Животных случайным образом разделяли на две группы по 10 мышей. Исследуемые образцы вводили за 20 минут до внутрибрюшинного введения 0,6% раствора уксусной кислоты. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду также за 20 минут до внутрибрюшинного введения 0,6% раствора уксусной кислоты. Животные помещались в индивидуальные боксы. Регистрировалось число корчей на протяжении 30 минут после внутрибрюшинного введения 0,6% раствора уксусной кислоты введения (из расчета 10 мл на 1 кг веса). Число корчей в контрольной группе принималось за 100%.

Исследуемые образцы в дозах 0.01, 0.1, 1 и 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе самцам нелинейных белых мышей весом 20-25 г. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2
Испытуемый образец		Уксусные корчи (% от контроля)
Контроль		100
Образец 1 (гептапептид)	0.01 мг/кг	47*
	0.1 мг/кг	21.7*
	1 мг/кг	20.4*
	10 мг/кг	0.3*
Образец 2 (микроформа)	0.01 мг/кг	70.4
	0.1 мг/кг	39.5*
	1 мг/кг	27.6*
	10 мг/кг	9.5*
Образец 3 (липоформа)	0.01 мг/кг	72
	0.1 мг/кг	58
	1 мг/кг	18.1*
	10 мг/кг	15.8*
Образец 4 (наноформа)	0.01 мг/кг	78
	0.1 мг/кг	61
	1 мг/кг	15.1*
	10 мг/кг	7.2*
Аналог 1 гептапептида в субстанции	0.1 мг/кг	85,8
	1 мг/кг	74,3
	10 мг/кг	39,8 *
Аналог 2 гептапептида в субстанции	0.1 мг/кг	89,2
	1 мг/кг	69,4
	10 мг/кг	45,9 *
* - достоверность по сравнению с контролем при Р<0,05.

Из таблицы 2 видно, что применение соединений на основе наноформы гептапептида общей формулы [1] вызывает достоверное снижение числа корчей в ответ на болевое раздражение уксусной кислотой. Кроме того, по сравнению с известной ранее неинкапсулированной формой соединения включение гептапептида в наноразмерную фармацевтическую композицию позволяет получить новый эффект - противовоспалительное действие.

Пример 3. Испытания наноформы гептапептида общей формулы [1] в тесте воспаления, вызванного конканавалином А.

Реакция воспаления на конканавалин А (Кон А) основана на способности пектинов растительного происхождения высвобождать медиаторы воспаления. Изучаемый образец или растворитель вводили в/б за 20 минут до Кон А. Кон А вводили субплантарно в дозе 100 мкг/20 г массы тела (20 мкл раствора в концентрации 5 мг/мл), в контрлатеральную конечность - тот же объем физиологического раствора. Через 1 час мышей забивали, определяли массу лап и подсчитывали индекс реакции воспаления (Ир) по формуле Ир=(Роп-Рк)*100/Рк, где Роп - масса стопы задней лапы, в подушечку которой вводили Кон А, Рк -физиологический раствор. Статистически достоверную разницу между данными опытных и контрольных групп, превышающую 20%, считали значимой (Любимов Б.И. и др. 2000).

Исследуемые образцы (1,2,3) и гептапептид и его аналоги (1 и 2) в субстанции вводили в дозах 0.1, 1 и 10 мг/кг внутрибрюшинно в водном растворе самцам мышей линии СВА весом 20-25 г. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3
Испытуемый образец		Воспаление, вызванное конканавалином А (индекс реакции)
Контроль		16,4±1,5
Образец 1 (наноформа)	0.1 мг/кг	10,6±1,7*
	1 мг/кг	10,8±0,8*
	10 мг/кг	9,2±1,Г
Образец 2 (микроформа)	0.1 мг/кг	13,8±1,9*
	1 мг/кг	10,9±1,9*
	10 мг/кг	13,1±2,4*
Образец 3 (липоформа)	0.1 мг/кг	13,7±1,9*
	1 мг/кг	12,7±1,7*
	10 мг/кг	8,7±2,2*
Гептапептид в субстанции	0.1 мг/кг	16,2±1,2
	1 мг/кг	15,5±1,6
	10 мг/кг	14,6±1,7
Аналог 1 гептапептида в субстанции	0.1 мг/кг	15,8±1,7
	1 мг/кг	14,5±1,3
	10 мг/кг	13,8±1,7*
Аналог 2 гептапептида в субстанции	0.1 мг/кг	16,1±1,8
	1 мг/кг	13,7±1,6*
	10 мг/кг	15,7±1,8
* - достоверность по сравнению с контролем при Р<0,05.

Полученные результаты показывают, что применение наноформы гептапептида общей формулы [1] вызывает достоверное снижение индекса воспалительной реакции в ответ на введение конканавалина А. По сравнению с известной ранее неинкапсулированной формой соединения включение пептида в наноразмерную систему доставки позволяет усилить противовоспалительное действие и снизить в 10 раз эффективные дозы.

Пример 4. Влияние наноформы гептапептида общей формулы [1] на уровень тревожности (анксиолитический эффект).

Тест приподнятого крестообразного лабиринта. Самцов беспородных крыс помещали в центр лабиринта экспериментальной камеры, которая представляла собой крестообразный лабиринт (Pellow et al., 1985). Установка приподнятого крестообразного лабиринта имела 4 рукава длиной 30 см и шириной 6 см, скрепленных друг с другом под прямым углом. Два противоположных рукава имели с двух сторон стенки высотой 30 см на всю их длину, а два других были открыты и освещены. Лабиринт был поднят над уровнем пола на высоту 40 см. Два противоположных рукава затемнены; два других освещены рассеянным комнатным светом и открыты с торцов. Визуально регистрировали в течение 3 мин время нахождения в светлом отсеке. Критерием анксиолитического эффекта считали увеличение времени пребывания в открытом рукаве. Изучаемые образцы или растворитель вводили за 20 мин до тестирования.

Исследуемые образцы (Образцы 1, 2, 3) и гептапептид и его аналоги (1, 2) в субстанции вводили в дозах 0.1, 1 и 10 мг/кг внутрибрюшинно в водном растворе самцам нелинейных белых крыс весом 200-250 г. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4
Испытуемый образец		Время пребывания в открытом отсеке (сек)
Контроль		20,7±6,3
Образец 1 (микроформа)	0.1 мг/кг	24,5±7,3
	1 мг/кг	27,5±6,8*
	10 мг/кг	30,6±9,1*
Образец 2 (липоформа)	0.1 мг/кг	34,5±12,6*
	1 мг/кг	27,6±7,3*
	10 мг/кг	38,5±16,4*
Образец 3 (наноформа)	0.1 мг/кг	19,5±8,4
	1 мг/кг	27,6±8,7*
	10 мг/кг	79,4±21,7*
Гептапептид в субстанции	0.1 мг/кг	21,6±8,2
	1 мг/кг	18,4±7,3
	10 мг/кг	19,4±8,7
Аналог 1 гептапептида в субстанции	0.1 мг/кг	22,3±8,1
	1 мг/кг	21,9±9,3
	10 мг/кг	16,4±9,7
Аналог 2 гептапептида в субстанции	0.1 мг/кг	20,1±7,9
	1 мг/кг	22,8±8,3
	10 мг/кг	19,8±9,9
* - достоверность по сравнению с контролем при Р<0,05.

Полученные результаты показывают, что применение наноформы гептапептида общей формулы [1] вызывает достоверное увеличение пребывания животных в открытом отсеке.

Пример 5. Противосудорожное действие наноформы гептапептида общей формулы [1].

Тесты максимального электрошока и коразоловых судорог. Судороги, вызываемые коразолом у самцов мышей линии C57/black, моделируют «малые, petit mal» судорожные припадки. Основной компонент - клонические судороги. Изучаемый образец или растворитель вводили за 20 мин до коразола, вводимого подкожно в область шейного отдела спины в дозе 90 мг/кг (доза вызывающая судороги у 90% животных, может колебаться от 50 до 120 мг/кг, поэтому подбирается для каждого эксперимента). У контрольных животных судорожные проявления развивались в следующей последовательности: 1) одно и более миоклонических подергиваний всего тела; 2) повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 сек без потери рефлекса переворачивания; 3) генерализованные клонические судороги передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания; 4) тоническая экстензия передних конечностей с потерей рефлекса переворачивания; 5) тоническая экстензия передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания. У 90-100% контрольных животных после введения коразола наблюдались судорожные проявления, описанные выше в примерах 1-3. Эффект оценивали как противосудорожный, если после введения вещества, а затем коразола не наблюдали судорог, описанных выше в примерах 2-5, в течение 30 минут (Воронина Т.А, Неробкова Л.Н., 2005).

Судороги, вызываемые максимальным электрошоком у беспородных мышей, моделируют «большие, Grant mal» судорожные припадки. Основным компонентом судорог является тоническая экстензия задних конечностей. Изучаемые образцы или растворитель вводили самцам беспородных мышей за 20 мин до эксперимента. Животные получали через корнеальные электроды электрические стимулы (50 Hz, 50 mA) длительностью 0.2 мс. Используемый показатель - максимальная тоническая экстензия конечностей возникала у 100% животных. Оценивали способность исследуемого вещества предупреждать развитие тонической экстензии. Критерием противосудорожного действия считали снижение числа погибших животных (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н., 2005).

Исследуемые образцы (Образцы 1, 2, 3) и гептапептид и его аналоги (1, 2) в субстанции вводили внутрибрюшинно в водном растворе в дозах 0.1, 1 и 10 мг/кг самцам мышей весом 20-25 г. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5
Испытуемый образец		Максимальный электрошок (% погибших животных)	Коразоловые судороги (% погибших животных)
Контроль		100	83,3
Образец 1 (микрофор ма)	0.1 мг/кг	66,7	50
	1 мг/кг	50	33*
	10 мг/кг	33*	25*
Образец 2 (липоформа)	0.1 мг/кг	83,3	66,7
	1 мг/кг	66,7	50
	10 мг/кг	33,3*	33*
Образец 3 (нанофор ма)	0.1 мг/кг	66,7	83,3
	1 мг/кг	50	66,7
	10 мг/кг	33*	33,3*
Гептапептид в субстанции	0.1 мг/кг	100	83,3
	1 мг/кг	100	100
	10 мг/кг	100	83,3
Аналог 1 гептапепти да в субстанции	0.1 мг/кг	100	83,3
	1 мг/кг	100	83,3
	10 мг/кг	100	100
Аналог 2 гептапепти да в субстанции	0.1 мг/кг	100	100
	1 мг/кг	100	100
	10 мг/кг	100	83,3
* - достоверность по сравнению с контролем при Р<0,05.

Полученные результаты показывают, что применение наноформы гептапептида общей формулы [1] вызывает достоверное снижение гибели животных в тестах максимального электрошока и коразоловых судорог. Следует отметить, что гептапептид и его аналоги (1, 2) в субстанции в дозах 0,1-1,0 мг/кг не обладают противосудорожной активностью в тестах максимального электрошока и антагонизма с коразолом.

Пример 6. Исследование наноформы гептапептида общей формулы [1] в качестве средства центрального противовоспалительного действия.

Тест, моделирующий центральное нейровоспаление.

Эксперименты проводили на белых аутбредных самцах крыс массой 380-420 г. Оценку влияния гептапептида и его аналогов на нейровоспаление проводили на модели центрального нейровоспаления, вызванного внутримозговым введением провоспалительного агента - бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС) (Escherichia Coli, Serotype 0, SIL2630, Sigma) (Castaco A., Herrera A, Cano J., A. Machado. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry, vol. 70, no. 4, pp.1584-1592, 1998). ЛПС (10 мкг в 2 мкл раствора Рингера) вводили в черную субстанцию левого полушария наркотизированных нембуталом (45 мг/кг, внб) крыс по следующим стереотаксическим координатам: АР - 4.0 мм, ML - 2.0 мм, DV - 8.0 мм.

Животные были разделены на группы: 1. Пассивный контроль (ложнооперированные, ЛО); 2. Активный контроль (введение нейротоксина ЛПС); 3. Гептапептид в субстанции 10 мг/кг+ЛПС.4 и 5 группы: Гептапептид и его аналоги общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂, где X - D-Pro, или Dh-L-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин, инкапсулированные в наночастицы и/или микрочастицы в дозе 10 мг/кг+ЛПС (Образцы 1 и 2).

Гептапептид в субстанции и гептапептид, инкапсулированный в наночастицы и/или микрочастицы (Образцы 1 и 2) вводили внутрибрюшинно предварительно за день до операции, непосредственно перед операцией, а затем ежедневно в течение 8 дней. Животным контрольной группы вводили раствор Рингера в эквивалентном объеме.

На протяжении всего эксперимента определяли динамику массы тела крыс. На седьмые сутки после операции оценивали неврологический дефицит по возникновению у животных акинезии передних конечностей (Schallert с соавторами 1993), для чего крысу помещали в прозрачный цилиндр диаметром 18 см и высотой 45 см и затем регистрировали касания каждой передней лапкой крысы стенок цилиндра в течение двух минут наблюдения, после чего подсчитывали процент касаний лапы контралатеральной повреждению стороны относительно общего количества контактов.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica v. 6.0 с использованием критериев Стьюдента, Манна-Уитни и ч2.

Установлено, что у ложно оперированных крыс после проведения процедуры операции не наблюдалось отрицательной динамики массы тела. В таблице 6 представлено влияние гептапептида и его аналогов, инкапсулированных в наночастицы и/или микрочастицы - образцы 1 и 2, и гептапептида в субстанции на массу тела крыс с нейровоспалением, вызванным внутримозговым введением нейротоксина ЛПС (Mean+SEM)

Таблица 6
	Изменение массы тела крыс, г
Группы животных	3-и сутки после операции относительно фона	8-е сутки после операции относительно 3-х суток
Контроль Ложнооперирован ные	+4,4±1,2	+1,1±0,9
Контроль Внутримозговое введение нейротоксина ЛПС	-13,7±2,2*	-9,1±2,3*
Образец 1,10 мг/кг+ЛПС	-8,5±1,2#	-4,1±1,1#
Образец 2, 10 мг/кг+ЛПС	-6,6±2,1#	-3,1±0,8#
Гептапептид в субстанции, 10 мг/кг+ЛПС	-10,6±3,2	-8,5±2,1
* - р<0,05 по сравнению с контролем ложно оперированных животных, критерий Стьюдента. * - р<0,05 по сравнению с контролем с нейровоспалением (введение ЛПС),критерий Стьюдента.

При нейровоспалении, вызванном унилатеральным интранигральным введением ЛПС, наблюдалась значительная потеря массы тела животных как в первые дни после операции, так и на протяжении последующих дней наблюдения (Таблица 6).

Гептапептид в субстанции в дозе 10 мг/кг не оказывал влияния на индуцированную нейротоксином ЛПС потерю массы тела животных (Таблица 6).

На фоне гептапептида и его аналогов, инкапсулированных в наночастицы и/или микрочастицы - образцы 1 и 2 в дозе 10 мг/кг уменьшение массы тела животных, индуцированное введением ЛПС, было значительно менее выраженным по сравнению с показателями контрольных животных, получивших только ЛПС. На седьмой день после операции у животных с нейровоспалением, получившим нейротоксин, наблюдалось уменьшение (на 15,1% по сравнению с показателями ложнооперированных крыс) касаний правой лапой стенок цилиндра в тесте оценки неврологического дефицита, что свидетельствовало об акинезии передней конечности, контралатеральной стороне введения ЛПС. Соответствующие результаты представлены в таблице 7, показывающей влияние гептапептида и его аналогов, инкапсулированных в наночастицы и/или микрочастицы - образцы 1 и 2 и гептапептида в субстанции на массу тела крыс с нейровоспалением, вызванным внутримозговым введением нейротоксина ЛПС (Mean+SEM).

Таблица 7
Группы животных	% касаний правой передней лапой стенок цилиндра относительно общего количества контактов верхних конечностей
Контроль Ложнооперированные	60,0
Контроль Внутримозговое введение нейротоксина ЛПС	33,3*
Образец 1,10 мг/кг+ЛПС	50,0#
Образец 2, 10 мг/кг+ЛПС	60,0#
Гептапептид в субстанции, 10 мг/кг+ЛПС	30,0
* - р<0,05 по сравнению с контролем ложнооперированных животных, критерий ч2. * - р<0,05 по сравнению с контролем с нейровоспалением (введение ЛПС), критерий ч2.

Гептапептид в субстанции в дозе 10 мг/кг не оказывал влияния на индуцированную нейротоксином ЛПС акинезию передней лапы крысы (Таблица 7).

Гептапептид и его аналоги, инкапсулированные в наночастицы в дозе 10 мг/кг - образцы 1 и 2,вызывали снижение активности передней конечности, контралатеральной стороне поражения, что выражалось в достоверном уменьшении числа касаний лапой стенок цилиндра по сравнению с животными, получившими нейротоксин ЛПС (Таблица 7).

Таким образом, изучение гептапептида и его аналогов общей формулы Туг-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X - D-Pro, или Dh-L-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro -3,4-дегидропролин, инкапсулированный в наночастицы и/или микрочастицы из фармацевтически пригодных, биосовместимых и биодеградируемых (со)полимер(ов) и/или полимерных матриц, и/или сорбированный и/или адсорбированный на их поверхности, и/или инкапсулированный в липосомы в тесте, моделирующем центральное нейровоспаление, вызванное внутримозговым введением провоспалительного агента - бактериального эндотоксина липополисахарида (Escherichia Coli, Serotype О, SIL2630), показало выраженное центральное противовоспалительное действие.

В противоположность гептапептиду и его аналогам, инкапсулированным в наночастицы и/или микрочастицы, гептапептид в субстанции не оказывал центрального противовоспалительного действия.

Пример 7. Антиалкогольное действия гептапептида и его аналогов общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X - D-Pro или Dh-L-Pro или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин, инкапсулированный в наночастицы и/или микрочастицы.

Исследования проводили в опытах на самцах мышей линии С57bl массой 26-28 г в условиях их длительной алкоголизации (Майский А.И., Салимов P.M. Методические указания по изучению препаратов для лечения алкоголизма. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Москва, 2005, 342-356). Животные были разделены на группы: 1 - контрольная, потребляющая этанол (в виде 15% раствора +0,1% сахарин) и получавшая инъекцию растворителя; 2 - опытная, потребляющая этанол (в виде 15% раствора +0,1% сахарин) и получавшая инъекцию лекарственного средства (10 мг/кг/день). Через 3 месяца для оценки индивидуального потребления жидкости животных помещали в индивидуальные боксы и предлагали выбор между подслащенным этанолом и подслащенной водой и регистрировали потребление жидкости на протяжении 3 дней. Каждые 24 часа регистрировали вес животного, количество выпитой воды и спирта.

Полученные результаты приведены в таблице 8.

Таблица 8
Испытуемый образец	Среднесуточное потребление алкоголя (мл/сутки) в пересчете на абсолютный спирт
Контроль	0.71±0.29
Образец 1, микроформа (10 мг/кг)	0.37±0.15*
Образец 3, липоформа (10 мг/кг)	0.32±0.18*
Образец 4, наноформа (10 мг/кг)	0.44±0.29*
Гептапептид в субстанции (10 мг/кг)	0.67±0.36
Аналог 1 гептапептида в субстанции	0.62±0.41
(10 мг/кг)
Аналог 2 гептапептида в субстанции	0.72±0.39
(10 мг/кг)
* - р<0,05 по сравнению с контролем ложно оперированных животных, критерий ч2.

Из таблицы видно, что образцы 1-4 при их внутрибрюшинном введении снижают потребление алкоголя. Гептапептид и его аналоги (1, 2) в субстанции не оказывают влияния на потребление алкоголя.

Подытоживая, настоящее изобретение является эффективным обезболивающим, центральным противовоспалительным, анксиолитическим, противосудорожным и антиалкогольным средством, в том числе с адресным способом доставки, позволяющим осуществить подбор оптимальной дозы для проявления необходимого действия.

Пример 8. HCl·H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-D-Pro-Ser-NH ₂ синтезировали конденсацией фрагментами DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly и 2HCl·H-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe. Фрагменты синтезировали с применением тетрабутиламмонийных солей (ТБА) и пивалоил хлорида (PivCL). Для синтеза использовали производные D; L; DL аминокислот.Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Контроль за синтезом и индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем фирмы Silufol при опрыскивании раствором нингидрина в системах растворителей:

1 - гексан: ацетон (3:2);

2 - этилацетат:ацетон: 50% уксусная кислота (2:1:1);

3 - бензол:этанол (8:2);

4 - хлороформ:метанол:аммиак (7:2.5:0.5);

5 - хлороформ:метанол:аммиак (6:4:1);

6 - хлороформ:метанол:уксусная кислота (42:7:1);

7 - ацетон:бензол:уксусная кислота (2:1:1);

8 - хлороформ:метанол:аммиак (8:1.75:0.25);

9 - хлороформ:метанол (9:1);

10 - этанол:аммиак (7:3).11 - изо-пропанол:муравьиная кислота:вода (20:1:5).

Далее по тексту в скобках после Rf указана система растворителей. Все растворители абсолютировали соответствующим образом. Точки плавления не корректировали. Колоночную хроматографию проводили с использованием носителей Силикагель L-40/100 m и Silasorb 600 [LC] фирмы Chemapol (ЧСФР).

Принятые сокращения:

Ас - ацетат;

Воc - трет-бутилоксикарбонильная группа;

ОБТ - l-оксибензтриазол;

ДМФА - диметилформамид;

ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид;

PivCl - пивалоил хлорид;

ТБА - тетрабутиламмоний;

ТЭА - триэтиламин;

OSu - N-оксисукцинимидный эфир;

ДЦГК - N,N-дициклогексикарбодиимид;

ОМе - метиловый эфир;

DiBoc - трет-бутилоксикарбонил;ТСХ - тонкослойная хроматография.

I. Получение трипептида

HCl·H-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe.

DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro.

1. К 3,4-dehydro-DL-Pro 150 мг (1.326 ммоль) добавляли 2.83 мл (1.326 моль) 13% ТБА, упаривали 1 раз с этанолом, 1 раз с изо-пропанолом, 1 раз с бензолом, охлаждали до 0°С.

2. К охлажденному раствору ТБА 3,4-dehydro-DL-Pro в 10 мл абс. этилацетата при охлаждении добавляли в сухом виде Di-Boc-Tyr-OSu 634.5 мг (1.326 моль), перемешивали 1 час при комнатной температуре на магнитной мешалке, за ходом реакции следили по ТСХ в системе (7). По окончании реакции растворитель упаривали, добавляли воду, подкисляли NaHSО ₄ (пятикратный избыток), до рН 3, экстрагировали 5 раз по 50 мл этилацетатом. Объединенные фракции этилацетата промывали водой, 10% раствором KHSО₄, водой, сушили над MgSО ₄, упаривали, высаждали из эфира гексаном (дважды). Осадок в виде порошка сушили в вакууме.

Выход 1.32 г (2.76 ммоль).

Rf=0.382 (7).

DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe.

DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro 1,32 г (2.76 ммоль) растворяли в 20 мл ацетонитрила, добавляли избыток (1.3) N-гидроксисукцинимида 412.8 мг (3.59 ммоль), охлаждали до 0^оС и добавляли избыток (1.3) ДЦГК 810.88 мг (3.59 ммоль). Перемешивали на магнитной мешалке 1 час, охлаждали до 0^оС, добавляли избыток (1.3) HCl H-Ser-OMe 558.22 мг (3.59 ммоль) и избыток (1.3) ТЭА 0.5 мл (3.59 ммоль), перемешивали 1 час при охлаждении и двое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 100 мл этилацетата, экстрагировали водой, 10% раствором KHSО₄, водой, 5% раствором NаНСО ₃, водой, насыщ. раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили над MgSO₄, отфильтровывали, упаривали. Переосаждали дважды из ацетона гексаном.

Полученный осадок сушили в вакууме.

Выход 1.38 г (2.38 ммоль) - 86.56%.

Rf=0.238 (7),

Rf=0.812(8).

Удаление Вос-защит с DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe. К 1.38 г (2.38 ммоль) DiBoc-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe добавляли 7.14 мл 1 н. HCI/CH3COOH и 2% анизола (0.14 мл анизола). Выдерживали 45 минут при комнатной температуре, упаривали, высаждали из метанола эфиром. Выход: 860 мг (1.93 ммоль). Rf=0.512 (8).

II. Получение тетрапептида DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-GlyDiBoc-Tyr-D-Ala.

1. D-Ala избыток (1.3) - 1.52 г (17.0 ммоль) растворяли в 13 мл воды, 8.8 мл ацетонитрила, прибавляли избыток (1.3) ТЭА - 2.38 мл (17.0 ммоль). Охлаждали до -20^оС и прибавляли к раствору № 2.

2. DiBoc-Tyr - 5 г (13.1 ммоль) растворяли в 40 мл ацетонитрила, прибавляли избыток (1.1) ТЭА - 2.02 мл (14.4 ммоль). Охлаждали до -10°С и прибавляли избыток (1.1) PivCl - 1.77 мл (14.4 ммоль). Реакционную смесь выдерживали 20 минут при -10°С и затем прибавляли раствор № 1. Реакционную смесь выдерживали на магнитной мешалке, постепенно повышая температуру до +10°С, и 1 час при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 10 мл Н₂O, подкисляли 3-кратным избытком KHSO ₄ до рН 3. Водный раствор экстрагировали 3 раза по 50 мл этилацетата. Объединенные фракции этилацетата промывали 10% раствором KHSO₄, водой, насыщенным раствором NaCl, сушили над MgSО₄ упаривали, высаждали из этилацетата гексаном, сушили в вакууме. Выход: 4.8 г (10.6 ммоль) - 80.9%. Rf=0.363 (7), Rf=0.571 (8), Rf=0.512 (9). Boc-Phe-Gly.

1. К 1.8 г Gly (24 ммоль) в 20 мл Н₂О и 20 мл ацетонитрила добавляли 3.36 мл ТЭА (24 ммоль), охлаждали до -20°С и добавляли к раствору № 2.

2. 5.3 г Boc-Phe (20 ммоль) растворяли в 70 мл ацетонитрила, добавляли 3.08 мл ТЭА (22 ммоль). Охлаждали до -20°С и прибавляли 2.71 мл PivCl (22 ммоль). Смесь выдерживали при -10°С 20 мин и затем прибавляли раствор № 1, выдерживали 1 час при -20°С и 2 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, добавляли 10 мл воды, подкисляли 5-кратным избытком NaHSO₄ до рН 3 экстрагировали 3 раза по 50 мл этилацетатом. Фракции этилацетата объединяли, промывали водой, 10% раствором KHSO4, водой, насыщенным раствором NaCl, сушили над MgSO₄. Отфильтрованный раствор упаривали, при упаривании выпадал осадок, заливали эфиром, отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход: 4.27 r (13.25 ммоль) - 66%. Rf=0.415 (3), Rf=0.214 (7), Rf=0.390 (1).

Удаление Вос-защиты с Boc-Phe-Gly.

К 2 г пептида (6.2 ммоль) добавляли 9.3 мл 1 н. раствора HCl/CH₃ COOH и выдерживали 45 минут при комнатной температуре. Затем заливали эфиром, растирали (эфир меняют 3 раза), сушили в вакууме. Выход 4.42 г (17.2 ммоль), Rf=0.633 (10), Rf=0.835 (5). Обессоливание HCl·H-Phe-Gly. Количество смолы Амберлист (АсО форма) брали в 2-кратном избытке - 58.5 мл (17.2 ммоль 2=34.4 ммоль). К 4.42 г (17.2 ммоль) пептида прибавляли 58.5 мл смолы Амберлист (АсО форма) в 40% этаноле, перемешивали 20 минут на магнитной мешалке, переносили на стеклянный фильтр, отмывали 40% этанолом, упаривали. При упаривании выпадал осадок, который промывали на фильтре эфиром. Осадок сушили в вакууме.

Выход: 1.32 г (5.93 ммоль). Rf=0.701 (3), Rf=0.687 (5), Rf=0.013 (8), Rf=0.375 (2). DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly.

1. К 2.85 г H-Phe-Gly (12.82 ммоль) в 44 мл ацетонитрила и 6,5 мл воды добавляли 1.79 мл ТЭА (12.82 ммоль), охлаждали до -20°С.

2. 4.83 г DiBoc-Tyr-D-Ala (10.68 ммоль) растворяли в 44 мл ацетонитрила, добавляли 1.64 мл ТЭА (избыток 1.1 - 11.75 ммоль), охлаждали до -20°С и прибавляли 1.445 мл PivCI (11.75 ммоль). Смесь выдерживали при -10°С 20 минут и охлаждали до -20^о С, прибавляли раствор № 1. Реакционную смесь перемешивали 1 час при -20°С, 2 часа - при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, подкисляли водный раствор 5-кратным избытком NaHSO₄ . Экстрагировали 5 раз этилацетатом по 60 мл, объединенные фракции этилацетата, промывали водой, 10% раствором KHSO₄, водой; сушили над MgSO₄, упаривали.

Переосаждали из эфира, сушили в вакууме.

Выход: 5.71 г (8.69 ммоль). Rf=0.352 (7).

III. Получение гептапептида DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe.

670 мг (1.02 ммоль) DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly растворяли в ДМФА, прибавляли избыток (1.1) БТ 151.5 мг (1.12 ммоль), охлаждали до 0°С, прибавляли избыток (1.1) ДЦГК 253.4 мг (1.12 ммоль), перемешивали 30 минут на магнитной мешалке, прибавляли избыток (1.2) - 546.6 мг (1.22 ммоль) 2HCl·H-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-OMe и избыток (2.4) - 0.34 мл (2.45 ммоль) ТЭА в ДМФА. Реакционную смесь перемешивали 1 час при охлаждении и двое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 100 мл этилацетата, экстрагировали водой, 10% раствором KHSO ₄, водой, 5% раствором NaHCO₃, водой, насыщ. раствором NaCL. Сушили над MgSO₄. Отфильтровывали, упаривали. Переосаждали из этилацетата гексаном, откачивали в вакууме. Выход: 410 мг (0.41 ммоль). Тпл=142-145°С. Rf=0.77 (6), Rf=0.88 (8), Rf=0.8 (9). Rf=0.263 (10).

DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-NH₂ .

410 мг (0.41 ммоль) полученного пептида заливали метанолом, насыщенным аммиаком, и оставляли на двое суток при Т=37°С. Затем реакционную смесь упаривали 2 раза с этилацетатом, 2 раза с абс .метанолом; высаждали из абс. метанола эфиром.

Выход: 208.5 мг (0.212 ммоль). Rf=0.693 (5), Rf=0.088 (9).

Удаление Вос-защит с DiBoc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-NH ₂.

К 208.5 мг (0.212 ммоль) пептида прибавляли 2% анизола, 0.64 мл 1 н. раствора HCl/СН₃СООН, выдерживали при Ткомн, упаривали. Переосаждали из абс.метанола этилацетатом.

Выход: 190 мг (0.193 ммоль). Rf=0.786 (11), Rf=0.926 (5), Rf=0.202 (4), Rf=0.057 (8). Выделение HCl·H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-D-Pro-Ser-NH ₂ из HCl·H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-3,4-dehydro-DL-Pro-Ser-NH ₂ методом колоночной хроматографии. 120 мг полученного пептида растворяли в 1 мл метанола, сажали на 2 г силикагеля марки L-40/100, предварительно обработанного хлороформом, насыщенным аммиаком. Деление проводили на колонке диаметром 19 мм (носитель - Silasorb 600 [LC]), приготовленной в гексане. При делении использовали ступенчатый градиент (хлороформ, насыщенный аммиаком: метанол). Выделенный пептид упаривали, растворяли в метаноле, добавляли HCl, высаждали абс. этилацетатом, осадок отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход: 40 мг; Rf=0.233 (4).

Пример 9

Получение липосомальной формы.

На 100 мл: 30 г фосфатидилхолина растворяют в 1000 мл хлороформа, затем упаривают на роторном испарителе при температуре 40°С до получения тонкой липидной пленки, полученную пленку суспендируют в растворе вещества пептидной структуры общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Рго, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин, с концентрацией с=10 мг/мл в течение 30-40 мин, после чего раствор пропускают через экструдер и разливают в флаконы, после чего проводят лиофильную сушку при температуре -80°С.

Пример 10

Получение наносомальной формы.

В 5 мл дихлорэтана растворяют 250 мл полимера ПЛГА (75:25, М=100000 Да) и 10 мг раствора вещества пептидной структуры общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин. Органическую фазу вливают в 25 мл водного раствора, содержащего 0,5% поливинилового спирта и эмульгируют смесь на ультразвуковой мешалке в течение 2 мин при 15000 об/мин, полученную эмульсию дополнительно гомогенизировали на гомогенизаторе высокого давления, при давлении 400 бар. При пониженном давлении испаряют дихлорметан на роторно-выпарительном аппарате, после чего наносуспензию фильтруют через фильтр, добавляют 5 мас./об.% маннитола в качестве криопротектора и подвергают лиофильной сушке.

Пример 11

Получение микросомальной формы.

В 5 мл дихлорэтана растворяют 250 мл полимера ПБЦА и 10 мг раствора вещества пептидной структуры общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂, где X-D-Рrо, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин. Органическую фазу вливают в 25 мл водного раствора, содержащего 0,5% поливинилового спирта, и эмульгируют смесь на ультразвуковой мешалке в течение 2 мин при 10000 об/мин. При пониженном давлении испаряют дихлорметан на роторно-выпарительном аппарате, после чего микросуспензию фильтруют через фильтр, добавляют 5 мас./об.% маннитола в качестве криопротектора и подвергают лиофильной сушке.

Пример 12

На 100 суппозиториев: 3 мл раствора микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин с концентрацией с=10 мг/мл или нативное вещество вводят в 55,0 г расплава смеси ПЭГ 1500 и ПЭГ 400 с 5,0 г эмульгатора, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют 275 г, предварительно расплавленной гидрофобной основы (витепсол) с 15,0 г стабилизатора (нипагин) и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 30 мг вещества пептидной природы, общей формулой H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂, где X-D-Рrо, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.

Пример 13

На 100 суппозиториев: 3 мл раствора микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂ , где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин с концентрацией с=10 мг/мл или нативное вещество постепенно прибавляют к 275 г предварительно расплавленной дифильной основы (Supposire АР) с 15,0 г стабилизатора (нипагин) и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве вагинальных суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 30 мг вещества пептидной природы общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.

Пример 14

На 100 мл раствора для инъекций: 500 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество, 250 мг натрия гидрофосфат, 500 мг натрия дигидрофосфат, 10 мг бензалкония хлорид растворяют в воде для инъекций и тщательноперемешивают. После растворения объем полученного раствора доводят до 100 мл и фильтруют через антибактериальный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. В 1 мл раствора содержится 5 мг вещества пептидной природы общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.

Пример 15

На 100 мл назального спрея: 5 мг раствора микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество, 0,5 мг натрия гидрофосфата, 5,0 мг натрия дигидрофосфата, 15,0 мг сорбитола, 0,5 мг бензалкония хлорида растворяют в воде очищенной, тщательно перемешивают в течение 10 минут, доводят объем полученного раствора до 100 мл и заправляют в полипропиленовый флакон с дозирующим насосом и насадкой. Препарат используют в виде назального спрея, в котором содержится 5 мг вещества пептидной природы общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.

Пример 16

На 100 мл назальных капель: 1 мг раствора микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-x-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество, 0,5 мг натрия гидрофосфата, 5,0 мг натрия дигидрофосфата, 15,0 мг сорбитола, 0,5 мг бензалкония хлорида, 15,0 мг масла лавандового растворяют в воде очищенной, тщательно перемешивают в течение 10 минут, доводят объем полученного раствора до 100 мл и заправляют в полипропиленовый флакон, с насадкой. Препарат используют в виде назальных капель, в котором содержится 5 мг вещества пептидной природы общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.

Пример 17

На 100 пластырей: 5 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество, вводят в смесь, состоящую из 190 мг поли(DL-лактид) и/или поли(DL-лактид-согликолид) с молекулярной массой 30 кДа и соотношением 50:50 с 10 мг стабилизатора (бензоат натрия) в 600 мл хлороформа. Смесь тщательно перемешивают и разливают тонким слоем, после чего сушат теплым воздухом до полного удаления органического растворителя. Полученную пленку соединяют с тканой основой. Препарат используют в виде пластыря, в котором содержится 5 мг вещества пептидной природы общей формулы H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин.

Пример 18

На 100 сублингвальных таблеток:

таблетки получали методом прямого прессования на таблеточном прессе смеси, содержащей 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество и 0,2 мг комбинированного наполнителя "Ludiflash".

Пример 19

На 100 сублингвальных таблеток:

таблетки получали методом влажной грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂ , где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество и 0,2 г комбинированного наполнителя "Ludiflash".

Пример 20

На 100 сублингвальных таблеток:

таблетки получали методом сухой грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество и 0,2 г комбинированного наполнителя "Ludiflash".

Пример 21

На 100 кишечно-растворимых таблеток:

таблетки получали методом прямого прессования на таблеточном прессе смеси, содержащей 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество и 0,35 мг комбинированного наполнителя "Ludiflash". Таблетки покрывали кишечно- растворимой оболочкой, состоящей из 20,0 г этилметакрилата и 30,0 г двуокиси титана в коаторе.

Пример 22

На 100 кишечно-растворимых таблеток:

таблетки получали методом влажной грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂ , где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество и 0,35 г комбинированного наполнителя "Ludiflash". Таблетки покрывали кишечно-растворимой оболочкой, состоящей из 20,0 г этилметакрилата и 30,0 г двуокиси титана в коаторе.

Пример 23

На 100 кишечно-растворимых таблеток:

таблетки получали методом сухой грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы, общей формулой Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-x-Ser-NH2, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество и 0,35 г комбинированного наполнителя "Ludiflash". Таблетки покрывали кишечнорастворимой оболочкой состоящей из 20,0 г этилметакрилата и 30,0 г двуокиси титана в коаторе.

Пример 24

На 100 кишечно-растворимых твердых капсул:

капсулы получали методом макания; 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество, 10 мг маннита, 1 мг нипагина засыпали на капсульной машине в твердую капсульную оболочку, состоящую из 40,0 мг этилметакрилата, 30,0 г желатина, 10,0 г глицерина, 20,0 г двуокиси титана.

Пример 25

На 100 кишечно-растворимых твердых капсул:

капсулы получали методом штампования; 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество, 10 мг маннита, 1 мг нипагина засыпали на капсульной машине в твердую капсульную оболочку, состоящую из 40,0 мг этилметакрилата, 30,0 г желатина, 10,0 г глицерина, 20,0 г двуокиси титана.

Пример 26

На 100 кишечно-растворимых твердых капсул:

капсулы получали капельным методом; 1 мг микро-/нано-/липосомальной формы вещества пептидной природы общей формулы Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-X-Ser-NH ₂, где X-D-Pro, или Dh-Pro, или Dh-D-Pro, где Dh-Pro - 3,4-дегидропролин или нативное вещество, 10 мг маннита, 1 мг нипагина засыпали на капсульной машине в твердую капсульную оболочку, состоящую из 40,0 мг этилметакрилата, 30,0 г желатина, 10,0 г глицерина, 20,0 г двуокиси титана.