способ качественного и количественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной днк

Формула изобретения

Способ количественного и качественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК, включающий стадии выделения из клеток геномной ДНК, связанной с липидами, детергентным способом, гидролиза ДНК гидролизующим ферментом, выделения липидов в смеси хлороформ-метанол-вода при 37 С, выпаривания растворителя, стабилизации липидов 2,6-ди-трет-бутил-п-крезолом, смешивания липидов с TMSH, хроматографии с помощью газового хроматографа с последующей масс-спектрометрией.

Описание изобретения к патенту

Заявленное техническое решение относится к области молекулярной биологии и генетики и может найти применение для определения жирнокислотного состава фракций липидов, прочносвязанных с ДНК. Такой результат является важнейшим фактором расшифровки липидного кода геномной ДНК, т.е. для определения участков локализации прочносвязанных липидов в геномной ДНК.

В настоящее время известен ряд биохимических методов выделения природных надмолекулярных комплексов ДНК-липиды (далее по тексту нкДНК) из различных источников, а именно:

- фенольный метод с использованием экстракции примесей насыщенным водным раствором фенола (Struchkov et al., 2002),

- детергентный метод выделения фракции липидов, прочносвязанных с ДНК, без использования фенола (Zhdanov et al., 2006, FEMS Microbiol. Lett.).

О свойствах таких надмолекулярных комплексов геномной ДНК известно, что ДНК в них характеризуется высокой молекулярной массой, и состоят они, по крайней мере, из 4 типов биомакромолекул: РНК (10-15 весовых%), белков (1-3%), липидов (1-3%), остальное представляет собой ДНК (Стручков, Стражевская, 2000). В состав белковой компоненты такого комплекса могут входить три-четыре небольших ДНК-связывающих белка массой 40-60 кДа (Стручков и соавт., 1990). По сравнению с детергентным, фенольный метод имеет существенный недостаток, заключающийся в возможности солюбилизации мембранных липидов во фракции ДНК и их обмене с фракцией ДНК-связанных липидов. Детергентный метод может приводить к уменьшению выхода надмолекулярного комплекса ДНК. Про липидную компоненту нкДНК известен только жирнокислотный состав двух фракций ДНК-связанных липидов: спирторастворимой и прочносвязанной (Жданов и соавт., 2006 а,б).

О свойствах и функционировании таких многокомпонентных биомакромолекулярных комплексов в клетке известно очень мало, хотя они безусловно важны для функционирования организмов. Основными проблемами являются: выяснение природы взаимодействия липидов с ДНК и взаимоотношения четырех типов биомакромолекул - липидов, ДНК, РНК и белков.

Известно техническое решение по патенту РФ № 2439580, способ определения фракций липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца с помощью электрофореза в геле агарозы путем обработки пробы сыворотки крови пациента в течение 1 ч раствором красителя Судана Б в темном термостате при 40°С, прогретую смесь вносят в лунку геля агарозы объемом 4×20×10 мм с последующей фиксацией электрофореграмм, их высушиванием и денситометрией, отличающийся тем, что дополнительно перед обработкой Суданом Б к 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента добавляют 0,1 мл 0,1%-ного раствора тритона Х-100 и инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин и проводят дезинтеграцию липопротеинов.

Данное изобретение относится к области медицинской биохимии, в работе экстрагировали и разделяли на фракции клеточные липопротеины у больных ишемической болезнью сердца. Авторы описанного выше изобретения не ставили перед собой цели исследовать взаимодействие липидов и липопротеинов клетки с геномной ДНК или с олиго- или полинуклеотидами ДНК, поэтому в известном изобретении не содержатся сведения о взаимодействии компонентов липидома и липопротеинов с ДНК.

Предметом в заявленном техническом решении является исследование природы взаимодействия комплексов липидов и ДНК.

Мы выделили фракции липидов, связанные с прокариотической ДНК, а именно - фракцию слабо- и фракцию прочносвязанных с ДНК липидов, и исследовали жирнокислотный состав прочносвязанной фракции липидов.

Указанные свойства и неполнота описания указанного выше изобретения по патенту № 2439580 обусловлены тем, что его техническое решение предназначено для реализации диагностики заболеваний на основе анализа состава клеточных липидов. Важно отметить, что основным методом был хроматографический анализ, а в заявленном техническом решении использован анализ жирнокислотного состава липидов методом газового хроматографа и масс-спектрометрии.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлено техническое решение по патенту РФ № 2062468, способ экстракции и разделения клеточных липидов путем обработки клеток смесью неполярного растворителя и полярного спирта с последующим проведением тонкослойной хроматографии, отличающийся тем, что с целью повышения эффективности и точности определения внутриклеточных липидов целые клетки предварительно наносят на покрытые силикагелем пластины и затем проводят экстракцию и разделение липидов в восходящем токе растворителя следующего состава: хлороформ: метанол: 7М аммиак: вода в соотношении 65:25:1:3 соответственно.

Известное техническое решение относится к области биохимии и, по мнению заявителя, является наиболее близким к заявленному по технической сущности и достигаемому результату. Однако по мнению заявителя, оно не может быть выбрано в качестве наиболее близкого аналога вследствие того, что там авторы проводили экстракцию и разделение клеточных липидов, а в нашей работе мы определяли жирнокислотный состав ДНК-связанных липидов.

Авторы известного описанного выше технического решения не ставили перед собой цели исследовать взаимодействие липидов и липопротеинов клетки с геномной ДНК или с олиго- или полинуклеотидами ДНК, поэтому и в их описании к патенту не содержатся сведения по взаимодействию липидов и липопротеинов с дезоксирибонуклеиновой кислотой. Так же как и в предыдущем патенте, в заявленном техническом решении основным методом исследования был хроматографический анализ.

Основываясь на вышеизложенном можно сделать выводы об отсутствии аналогов по заявленному техническому решению, так как выявленные из известного на дату подачи уровня техники известные технические решения не предназначены для разрешения поставленных целей и не позволяют разрешить задачи по качественному и количественному анализу липидов, прочносвязанных с геномной ДНК.

Заявителем в заявленном техническом решении предлагается биохимический подход к ответу на этот вопрос, а именно обработка препарата нкДНК, выделенного из Pseudomonas aurantiaca, параллельно с различными ферментами, гидролизующими или ДНК, или РНК, или белки (протеиназа К).

Анализируя изменения в жирнокислотном составе комплекса после обработки ферментами, заявителем делаются выводы о том, какая из обработок привела к тем или иным изменениям в жирнокислотном составе и к какой модели мы склоняемся при анализе и идентификации структуры надмолекулярного комплекса ДНК.

В заявленном техническом решении показано, в частности, что основными компонентами жирнокислотного состава ДНК-связанных липидов препарата геномной ДНК, выделенного детергентным методом, являются кислоты - 16:0, 18:0 и 10:0, а 11:0 2OH, 13:1 и 13:0 2OH кислоты содержатся в меньшем количестве (Фиг.1). Из данных, представленных на Фиг.1-4, видно, что гидроксикислоты 11:02OH и 13:02OH входят в состав липидов, связанных с белками; 14:1 5c - связаных с белками и РНК, а 15:1 8c - связанных с ДНК.

Исследования в данном направлении, по мнению заявителя, не проводились ни в одной из университетских или академических лабораторий мира.

Полученные результаты впоследствии могут быть использованы при разработке новых методов диагностики заболеваний по липидному коду ДНК пациента или при разработке новых типов лекарственных средств. Таким образом, целью заявленного технического решения является разработка способа анализа строения надмолекулярного комплекса ДНК путем его обработки различными гидролизующими ферментами с последующим жирнокислотным анализом остающихся прочносвязанных с ДНК липидов.

Сущность заявленного технического решения состоит в том, что способ количественного и качественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК, включает стадии:

- выделения из клеток геномной ДНК, связанной с липидами, детергентным способом;

- гидролиза ДНК гидролизующим ферментом;

- выделения липидов в смеси хлороформ-метанол-вода при 37°C;

- выпаривания растворителя;

- стабилизации липидов 2,6-ди-трет-бутил-п-крезолом;

- смешивания липидов с TMSH;

- хромотографии с помощью газового хроматографа с последующей масс-спектрометрией.

Заявленное техническое решение поясняется чертежами, представленными на Фиг.1-5 и примерами.

На Фиг.1 представлен способ качественного и количественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК (содержание жирных кислот в необработанном ферментами образце комплексов ДНК с белками, РНК и липидами).

По оси абсцисс - жирные кислоты, по оси ординат - содержание жирной кислоты (в %), номера по порядку: 1 - 10:0, 2 - 11:0 2OH, 3 - 13:1 (12, 13), 4 - 13:0 2OH, 5 - 16:0,6 - 18:0.

На Фиг.2 представлен способ качественного и количественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК (содержание жирных кислот в обработанном ферментом ДНКазой образце комплексов ДНК с белками, РНК и липидами).

По оси абсцисс - жирные кислоты, по оси ординат - содержание жирной кислоты (в %), номера по порядку: 1 - 10:0, 2 - 11:0 2OH, 3 - 14:0, 4 - 14:1 5c, 5 - 16:0, 6 - 18:0.

На Фиг.3 представлен способ качественного и количественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК (содержание жирных кислот в обработанном ферментом РНКазой образце комплексов ДНК с белками, РНК и липидами).

По оси абсцисс - жирные кислоты, по оси ординат - содержание жирной кислоты (в %), номера по порядку: 1 - 10:0, 2 - 13:0 2OH, 3 - 14:0, 4 - 15:1 8c, 5 - 16:0, 6 - 18:0.

На Фиг.4 представлен способ качественного и количественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК (содержание жирных кислот в обработанном ферментом протеиназой К образце комплексов ДНК с белками, РНК и липидами).

По оси абсцисс - жирные кислоты, по оси ординат - содержание жирной кислоты (в %), номера по порядку: 1 - 10:0, 2 - 14:0, 3 - 15:1 8c, 4 - 16:0, 5 - 18:0, 6 - 18:3 6c (6,9,12).

На Фиг.5 представлен способ качественного и количественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК (блок-схема получения прочно- и слабосвязанных с ДНК липидов).

Пример

Заявленное техническое решение поясняется следующим примером, который не является исчерпывающим, однако дает общее представление о возможности практической реализации заявленного технического решения.

Сущность реализации заявленного решения заключается в следующем: одинаковые образцы надмолекулярного комплекса геномной ДНК клетки подвергаются гидролизу тремя различными ферментами с последующим диализом:

или ДНКазой,

или РНКазой,

или протеиназой.

Из полученных образцов экстрагируют липиды, которые анализируют методом газовой хроматографии для получения жирнокислотных профилей (см. Фиг.5).

В результате определяются жирнокислотные маркеры (биомаркеры) ДНК-связанных липидов, что обеспечивает возможность разработки лекарственных средств нового типа.

Заявленное техническое решение обеспечивает возможность определить жирнокислотный состав липидной фракции, прочносвязанной с ДНК, которая остается после обработки нкДНК различными гидролизующими ферментами для разработки лекарственных средств нового типа.

Для подтверждения возможности идентификации и анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК, проводили эксперименты, изложенные в нижеприведенном примере, основываясь на том, что прочносвязанные липиды не растворяются в детергенте и спирте в отличие от непрочносвязанных, которые спирторастворимы.

Идентификация и анализ липидов, прочносвязанных с геномной ДНК, проводилась следующим образом (Фиг.5).

Геномная ДНК выделяется из клеток методом, основанным на применении детергентов.

- Клетки лизируются (разрушение мембраны клетки) детергентно-солевым методом с обработкой лизоцимом в 20% сахарозе.

- Клетки осаждаются центрифугированием при 3000 rpm в течение 5 мин и ресуспендируются в 9.5 мл 50 мМ Tris-HCl, pH=8.0, 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA.

- Затем к суспензии добавляется 1,5 мл раствора лизоцима 50 мг/мл и инкубируется в течение часа при 37°С.

- Затем к суспензии добавляется 1,5 мл 10% раствора додецилсульфата натрия для обработки клеток по методу, описанному Cunha et al., 2001.

- Затем фракция растворимых в этаноле липидов экстрагируется 35% водным раствором этанола при 37°С в течение 24 часов. ДНК осаждается этанолом и осадок дважды промывается 70% водным раствором этанола.

- Полученные экстракты объединяются и затем осушаются при пониженном давлении для получения спирторастворимой фракции ДНК-связанных липидов.

- Оставшийся осадок подготавливается и обрабатывается в зависимости от гидролизующего фермента следующим образом:

- или для ДНКазы I:

Получившийся осадок растворяется в 5 мкл буферного раствора (20 мМ Трис-НСl (pH 8,4), 2 мМ MgCl₂, 50 мМ КСl) и обрабатывается 1 ед. ДНКазы I в 5 мкл 10 мМ р-ра хлорида магния. После инкубации в течение 2 часов ДНКаза I термически инактивируется в течение 20 минут при 95°С.

- или для РНКазы А:

Получившейся осадок растворяется в 20 мкл рабочего буфера РНКазы А (10 мМ Трис-НСl, 15 мМ NaCl, pH 7.5) и к нему добавляется 1 мкл раствора 1 ед./мкл РНКазы А. После двухчасовой инкубации при 37°С проводится термическая инактивация РНКазы в течение 5 мин при 95°С.

- или для протеиназы К:

Осадок растворяется в 20 мкл 6 М гуанидин-гидрохлорида, 50 мМ трис-гидрохлорида, 5 мМ ДТТ, pH=7,5. Раствор нагревается при 95°С 20 мин. После денатурации белков смесь охлаждается до комнатной температуры. Добавляется 50 мкл 50 мМ Трис-НСl pH=7,5. Далее добавляется 20 мкг протеиназы К и инкубируется 90 мин при 37°С. Для ингибирования действия протеиназы образцы помещаются на кипящую водяную баню на 20 мин.

После двухчасовой инкубации смеси при 37°С прочносвязанные с ДНК липиды выделяются с использованием смеси хлороформ-метанол-вода по методу, описанному Bligh&Dyer, 1959. Растворитель удаляется выпариванием при пониженном давлении. Для предотвращения старения образцы липидов стабилизируются 2,6-ди-трет-бутил-п-крезолом и хранятся в атмосфере азота в кельвинаторе при -80°С. Жирные кислоты во всех образцах анализируются в виде их производных метиловых эфиров с помощью газового хроматографа, связанного с масс-спектрометром. После добавления TMSH к образцу липидов все остатки жирных кислот переводятся в четвертичные сульфониевые соли, которые пиролизуются до метиловых эфиров при горячем впрыске в газовый хроматограф.

Потери короткоцепочечных жирных кислот избегаются переэтерификацией, происходящей при комнатной температуре, и отсутствием шага экстракции после химической модификации жирных кислот.

Хроматографическое разделение проводится с использованием капиллярной колонки из кварцевого стекла, как описано ранее.

В заявке показано, что основными компонентами жирнокислотного состава ДНК-связанных липидов препарата геномной ДНК, выделенного детергентным методом (Фиг.5), являются кислоты: 16:0, 18:0 и 10:0, а 11:0 20Н, 13:1 и 13:0 2ОН кислоты содержатся в меньшем количестве (Фиг.1). Из данных, представленных на Фиг.1-4, видно, что гидроксикислоты - 11:02ОН и 13:02ОН входят в состав липидов, связанных с белками; 14:1 5с - связаных с белками и РНК, а 15:1 8с - связанных с ДНК.

Заявленное техническое решение обеспечивает возможность определить жирнокислотный состав липидной фракции, прочносвязанной с ДНК, которая остается после обработки нкДНК различными гидролизующими ферментами для разработки лекарственных средств нового типа

Реализовать данные цели ранее не представлялось возможным, так как не был разработан способ определения жирнокислотного состава липидов, связанных с компонентами хромосомы: или ДНК, или РНК, или белков.

Основываясь на изложенном выше, заявленный способ обеспечивает возможность реализации поставленной цели - обеспечивает возможность определить жирнокислотный состав липидной фракции, остающейся после обработки нкДНК различными гидролизующими ферментами, что будет важно для разработки лекарственных средств нового типа.

Реализация возможности определения жирнокислотного состава липидной фракции, остающейся после обработки нкДНК различными гидролизующими ферментами, обеспечивает разработку новых методов диагностики заболеваний по липидному коду ДНК пациента или может быть применена при разработке новых типов лекарственных средств. Таким образом, заявленное техническое решение обеспечивает разработку способа анализа строения надмолекулярного комплекса ДНК путем его обработки различными гидролизующими ферментами с последующим жирнокислотным анализом остающихся прочносвязанных с ДНК липидов.