способ введения в культуру клеток льна многолетнего

Формула изобретения

Способ введения в культуру клеток льна многолетнего, заключающийся в получении каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в исследованиях в области физиологии растений, общей и городской экологии.

Известны работы по льну-долгунцу, который используется в сельском хозяйстве и в животноводстве, а так же в других отраслях промышленности (Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна: Монография. - Тверь, 2000, с.139; Белоногова М.А. Генетическая трансформация льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) с использованием семядольных эксплантов. Автореферат дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук, Москва, 2006, с.4).

Наиболее близким является способ введения в культуру клеток льна, заключающийся в получении каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа (Гончарук Е.А., Калашникова Е.А., Дубравина Г.А., Загоскина Н.В. Влияние кадмия на морфологические и биохимические характеристики каллусных клеток чайного растения и льна-долгунца. С.-х. биотехнология. - М.: Воскресенье, Т.2, 2001, с.101). Для получения стерильных проростков использовали семена льна-долгунца (Linum usitatissimum L.). Семена стерилизовали 0,1% раствором сулемы в течение 10-12 мин, промывали в трех порциях стерильной дистиллированной воды, после чего культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга без регуляторов роста. Каллусную культуру получали из сегментов гипокотилей. Для этого гипокотили культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Пересадку каллусной ткани осуществляли один раз в месяц. Для регенерации использовали питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина.

Однако в известных способах используется другой вид льна - лен-долгунец (Linum usitatissimum L.) и применение этого способа оказалось неэффективным для льна многолетнего (Linum perenne L.).

Среди недостатков способа-прототипа можно отметить получение каллусной ткани из сегментов гипокотилей, что затрудняло и увеличивало продолжительность культивирования. На этапах стерилизации семян не использован спирт, соответственно не было проведено обезжиривание семян, что в последующем уменьшает эффективность стерилизующего агента (сулемы). Использование 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты на этапе каллусообразования было неэффективным для льна многолетнего (процент каллусообразования - 9,4%), регенерация на среде Мурасиге-Скуга с 1 мг/л 6-бензиламинопурина была низкой (процент регенерации - 18,4%). Растения льна многолетнего с корневой системой получить не удалось.

Задачей метода было разработать способ введения в культуру клеток, регенерации и укоренения растений льна многолетнего.

Поставленная задача решается тем, что согласно изобретению на питательную среду Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего (Linum perenne L.) в течение одного пассажа, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют -нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей.

Таким образом, сущность изобретения состоит в том, что в качестве первичных эксплантов использовали семена льна многолетнего (Linum perenne L.), процесс каллусообразования происходил на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрациях 4-8 мг/л в течение 1 пассажа, затем регенерация на питательной среде Гамборга с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) с концентрацией 1-2 мг/л и -нафтилуксусной кислоты (НУК) с концентрацией 0,1-0,5 мг/л, в течение 2-4 пассажей, укоренение растений на питательной среде Мурасиге-Скуга, с концентрацией всех компонентов 50%, с добавлением НУК с концентрацией 0,1-0,5 мг/л, в течение 2-4 пассажей.

Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации 2,4-Д менее 4 мг/л - процент каллусообразования незначительный и большая часть семян образует побеги; при увеличении концентрации 2,4-Д в питательной среде более 8 мг/л происходит уменьшение каллусообразования и существенное снижение морфогенетической активности в дальнейших пассажах. При концентрации БАП ниже 1 мг/л культивирование каллусов сопровождалось повышенным процессом ризогенеза у каллусных тканей и существенным снижением регенерационной способности; выше 2 мг/л - также происходило существенное снижение регенерационной способности. При концентрации НУК ниже 0,1 мг/л не образовывались морфогенные каллусы; культивирование на среде с 0,5 мг/л НУК сопровождалось снижением регенерационной способностью и повышенным процессом ризогенеза у каллусных тканей. На этапе укоренения на концентрациях выше или ниже 0,1-0,5 мг/л практически не образовывались растения с корневой системой.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам представлены в таблицах.

Пример 1

Для введения в культуру клеток льна многолетнего (Linum perenne L.) использовались семена растений. Предварительно семена стерилизовали однократной обработкой спиртом с последующей стерилизацией раствором, содержащим гипохлорит натрия (с содержанием активного хлора 75-95 г/дм³) в течение 15-20 мин. Затем их три раза промывали стерильной дистиллированной водой. Стерилизация семян в растворе, содержащим гипохлорит натрия, менее 15 мин была неэффективной, наблюдалась высокая зараженность семян при культивировании на питательной среде; более 20 мин - семена обесцвечивались и теряли жизнеспособность. Семена культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга видоизмененной добавлением 2,4-Д, каллус получали в течение одного пассажа.

Пример 2

Эмбриогенный каллус формировался с высокой частотой на семенах при концентрации 2,4-Д: 4; 6 и 8 мг/л (таблица 1) на питательной среде Мурасиге-Скуга в течение одного пассажа.

Таблица 1
Частота каллусообразования (%) льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций 2,4-Д в питательной среде Мурасиге-Скуга
Концентрация 2,4-Д, мг/л	Частота каллусообразования (%)
1	9,4±0,6
2	38,0±2,7
4	56,8±4,0
6	63,3±6,5
8	67,4±8,1
10	45,0±3,6

Пример 3

Культивирование каллуса на средах с высоким содержанием 2,4-Д (10 мг/л) приводило к существенному снижению способности к морфогенезу. Образовавшиеся каллусы пересаживают на питательную среду Гамборга видоизмененную добавлением БАП - 1-2 мг/л и НУК - 0,1-0,5 мг/л для культивирования морфогенных каллусов и регенерации в течение 2-4 пассажей. При культивировании более 4 пассажей существенно снижалась регенерационная способность, менее 2 пассажей прирост каллусной ткани был незначительный. Полученные регенеранты для укоренения помещали в пробирки на мостики из фильтровальной бумагой, с жидкой питательной средой Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% видоизмененную добавлением НУК - 0,1-0,5 мг/л.

Пример 4

Регенерацию льна многолетнего проводят на питательной среде Гамборга. В качестве фитогормонов используют БАП (1-2 мг/л) и НУК (0,1-0,5 мг/л). Использование среды Мурасиге-Скуга было менее эффективным, так как процент морфогенных каллусов был ниже, чем на среде Гамборга. Например, при концентрации 1 мг/л БАЛ и 0,1 мг/л НУК максимальный процент морфогенных каллусов на среде Гамборга составлял 63,5%, а на среде Мурасиге-Скуга - 42,1% (таблица 2).

Таблица 2
Доля каллусов с побегами (%) льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций БАП и НУК в питательной среде
Концентрация БАЛ+НУК, мг/л	Доля каллусов с побегами (%) на среде Мурасиге-Скуга	Доля каллусов с побегами (%) на среде Гамборга
1+0	18,4±2,1	34,2±3,8
1+0,1	42,1±2,7	63,5±4,9
1+0,5	36,4±3,9	50,8±5,2
1+1,0	11,2±1,6	14,2±1,6
2+0,1	32,5±3,7	46,0±4,5
2+0,5	24,9±2,8	30,7±2,8

Пример 5

Укоренение проводят на жидкой питательной среды Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% и видоизмененную добавлением НУК с концентрациями 0,1-0,5 мг/л в течение 2-4 пассажей. При культивировании в течение 1 пассажа корни практически не образовывались, а культивирование более 4 пассажей не приводило к увеличение количества укореняемых растений.

Таблица 3
Доля растений-регенерантов с корнями (%) у льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций НУК в жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50%
Концентрация НУК, мг/л	Доля растений-регенерантов (%)
0	28,1±1,4
0,1	63,8±7,2
0,5	52,4±6,3
1	36,2±2,9
6	0

Техническим результатом изобретения является то, что частота каллусообразования составляет от 56,1% до 67,4%, регенерационная способность от 30,7% до 63,5%, укоренение от 52,4% до 63,8%. Результаты изобретения показывают высокую эффективность данного метода, который позволил получить высокий процент регенерации и укоренения растений.

Результаты показывают, что данный метод является эффективным, так как каллус образуется с высокой частотой, процент регенерации и укоренения in vitro высокий. Процесс получения растений из семян занимает 7-8 месяцев.

Все перечисленное выше позволяют рекомендовать данный метод для введения в культуру клеток льна многолетнего (Linum perenne L.).

Поставленная задача достигнута существенным повышением частоты каллусообразования и регенерации льна многолетнего.