новые пептиды для лечения и профилактики иммунопатологических заболеваний, включая лечение и профилактику инфекции посредством модулирования врожденного иммунитета

Формула изобретения

1. Средство для ингибирования дипептидилпептидазы IV (DPPIV), представляющее собой пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 7, 10, 14, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 32-35, 56, 58.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что пептид имеет модифицированный С-конец или модифицированный N-конец.

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что пептид имеет амидированный С-конец.

4. Средство по п.1, отличающееся тем, что пептид снижает активность DPPIV до приблизительно 75% или меньшего значения по сравнению с контролем в виде физиологического раствора.

5. Фармацевтическая композиция для ингибирования дипептидилпептидазы IV (DPPIV), содержащая средство по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, где композиция находится в форме, подходящей для перорального, парентерального, трансдермального, интраназального или внутрилегочного введения, или введения посредством осмотического насоса.

7. Применение пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 7, 10, 14, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 32-35, 56, 58, в качестве ингибитора дипептидилпептидазы IV (DPPIV).

8. Применение по п.7, где субъектом применения является носитель инфекции или подверженный риску инфицирования.

9. Применение по п.7, где пептид вводят перорально, парентерально, трансдермально, интраназально или внутрилегочно, или посредством осмотического насоса.

Описание изобретения к патенту

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЕ ЗАЯВКИ

Для настоящей заявки испрашивается приоритет на основании Предварительных патентных заявок США 60/722,962; 60/722,958 и 60/722,959, поданных 4 октября 2005 года и озаглавленных «Новые пептиды для лечения и профилактики инфекций посредством модулирования врожденного иммунитета», которые включены в настоящую заявку в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к пептидам для лечения и профилактики иммунопатологических заболеваний, включая лечение и профилактику инфекций посредством модулирования врожденного иммунитета. В одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям и их применениям для модулирования врожденного иммунитета. В другом аспекте изобретение предусматривает новые пептиды, обладающие эффектом снижения активности дипептидилпептидазы IV (DPPIV), а также их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Множество форм микроорганизмов, включая вирусы, бактерии, грибки и паразитов, могут вызывать заболевания. Клетки микробов отличаются от клеток животных и растений, которые не могут существовать самостоятельно в природе и существуют только как часть многоклеточных организмов. Клетки микробов могут быть патогенными или непатогенными, в зависимости, в частности, от вида микроорганизма и состояния носителя. Например, в носителе с ослабленным иммунитетом обычно безвредная бактерия может стать патогенной. Внедрение в клетки носителя является чрезвычайно важным для выживания патогенных бактерий, которые размножаются в межклеточной среде. Для организмов, которые размножаются во внеклеточном пространстве, важность внедрения бактерии в клетки носителя менее четко определена.

Резистентность микроорганизмов к лекарственным средствам остается серьезным препятствием в непрекращающихся попытках бороться с инфекцией. Например, пенициллин был эффективен при лечении Staphylococcus aureus до тех пор, пока бактерия не стала резистентной к нему. В течение второй половины XX века были разработаны новые антибиотики, такие как ванкомицин и метициллин, которые были эффективны при лечении инфекций 5. aureus. Однако в 70-х годах XX века появились резистентные к метициллину штаммы S. aureus, и с тех пор они являются источником проблем для больниц во всем мире. Позднее появились штаммы S. aureus устойчивые к ванкомицину.

В связи с возрастающей угрозой развития резистентности к противомикробным препаратам и возникновением новых инфекционных заболеваний существует постоянная необходимость разработки новых лекарственных соединений. Желательно создать препараты, которые воздействовали бы на носителя, но не на патоген, тем самым не способствуя развитию резистентности к препарату. В особенности перспективными являются препараты, которые воздействуют на носитель посредством влияния на систему врожденного иммунитета.

Защита носителя от микроорганизмов начинается с эпителиальных барьеров тела и врожденной иммунной системы и достигает высшей точки в момент развития адаптивного иммунного ответа. Врожденный иммунный ответ носителя включает несколько консервативных механизмов, которые распознают микробные инфекции и противостоят им. Элементы врожденной иммунной системы непрерывно поддерживаются на низких уровнях активности и очень быстро активизируются в момент стимуляции. Врожденный иммунный ответ начинается сразу же после появления микробного патогена в организме. Процессы, относящиеся к приобретенному иммунитету, такие как перегруппировка генов рецепторов иммуноглобулина, не являются частью врожденного иммунного ответа.

Существуют указания на то, что врожденный иммунный ответ эффективно противостоит большинству инфекций, а также способствует развитию воспалительных реакций. Известно, что воспалительные реакции, запущенные инфекцией, являются центральными этапами патогенеза заболеваний. Важная роль Toll-подобных рецепторов (TLR) во врожденном иммунном ответе была также подробно описана в литературе. TLR млекопитающих распознают законсервированные молекулы, многие из которых находятся на поверхности микробных патогенов или выделяются ими. Существует множество других механизмов, описанных не столь подробно, которые приводят в действие врожденную иммунную защиту носителя и/или способствуют ее функционированию.

Врожденная иммунная система обеспечивает целый ряд защитных механизмов, включая функцию эпителиального барьера и секрецию цитокинов и хемокинов. К настоящему времени были выделены четыре группы хемокинов, в зависимости от числа консервативных N-концевых фрагментов цистеина: С, СС, СХС, и СХ3С, где Х - это неконсервативный аминокислотный остаток. Известно, что СХС-хемокины хемотаксичны к клеткам, содержащим СХСР3-рецепторы, включая моноциты, активированные Т-клетки (Thi) и NK-клетки. Первичные человеческие эпителиальные клетки дыхательных путей и клетки линии 16-НВЕ нерегулируемо выполняют экспрессию CXCR3-рецептора и его лигандов, IP-10, I-TAC и MIG (Kelsen et al., The chemokine receptor CXCR3 and its splice variant are expressed in human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 287:L584, 2004). Более того, CXCR3-лиганды вызывают хемотаксический ответ и реорганизацию актина в клетках 16-НВЕ (Kelsen et al., The chemokine receptor CXCR3 and its splice variant are expressed in human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol: Physiol., 287:L584, 2004).

Далее, трансмембранная сывороточная протеаза II типа дипептидилпептидаза IV (DPPIV), также известная как CD26 или белок, связывающий аденозиндеаминазу, является важным регулятором различных физиологических процессов, включая иммунные функции. CD26/DPPIV представляет собой гликопротеин молекулярной массой в 110 кД, расположенный на поверхности клетки, экспрессия которого происходит главным образом в зрелых тимоцитах, активированных Т-клетках, В-клетках, NK-клетках, макрофагах и эпителиальных клетках. Он выполняет по меньшей мере две функции - функцию сигнальной трансдукции и протеолитическую функцию (Morimoto С, Schlossman SF. The structure and function of CD26 in.-. The T-cell immune response. Immunol. Review. 1998, 161: 55-70.). Одна из его функций в клетке включает в себя модуляцию активности хемокинов путем отщепления дипептидов с N-конца хемокина. Модуляция NHz-концов хемокинов является очень важной не только с точки зрения связывания с их рецепторами и последующих реакций, но также с точки зрения изменения рецепторной специфичности обработанного хемокина. Активность DPPIV связывают с определенным количеством состояний, связанных с иммунитетом.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что пептиды, содержащие аминокислотную последовательность одного из пептидов, перечисленных и описанных в Таблице 1, или ее аналог, производную или вариант, могут усиливать врожденный иммунитет носителя. В одном аспекте иммуномодулирующие пептиды согласно настоящему изобретению не обладают антимикробным эффектом, но демонстрируют способность повышать жизнеспособность инфицированного носителя. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает пептиды, модулирующие активность DPPIV. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает пептиды, которые снижают активность DPPIV. В еще одном аспекте изобретение предусматривает пептиды, которые могут быть использованы для диагностирования, лечения или профилактики иммунопатологических заболеваний, таких как заболевания, связанные с активностью DPPIV и/или врожденным иммунитетом.

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает изолированный пептид, который включает в себя любую аминокислотную последовательность согласно Таблице 1, или ее аналог, производную или вариант, или ее очевидный химический эквивалент, или пептид, включающий в себя данный пептид. В одном варианте выполнения настоящего изобретения пептид включает в себя до 10 аминокислот, составляющих данный пептид. В качестве примера изолированный пептид может иметь модифицированный С-конец (например, амидированный С-конец) и/или модифицированный N-конец. Изолированный пептид согласно настоящему изобретению может дополнительно включать в себя аминокислотную последовательность согласно Таблице 1, модифицированную путем, по меньшей мере, одной замены D-аминокислоты. Изолированный пептид согласно настоящему изобретению может дополнительно включать модифицированный скелет, например, в котором N-конец модифицирован из амида до N-метильной группы. В одном аспекте эти модифицированные пептиды, сохраняющие иммунологическую активность исходного пептида и его очевидного химического эквивалента, который также сохраняет данную активность, включены в объем настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно предусматривает агент, обладающий реакционной способностью по отношению к изолированному пептиду, который включает в себя аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную, или вариант. В одном варианте выполнения настоящего изобретения агент представляет собой неприродное антитело (например, поликлональное или моноклональное антитело). В одном варианте выполнения настоящего изобретения антитело создано с использованием MAPS антигена, присоединенного к пептиду согласно настоящему изобретению посредством 2 глициновых остатков, вставленных в С-конец пептида. Данная структура может быть введена животному, такому как кролик, после чего может быть получено антитело с использованием технологий, хорошо известных в данной области. В одном аспекте такие агенты могут быть помечены или использованы для маркировки пептидов согласно настоящему изобретению. В другом аспекте такие агенты могут быть использованы при выполнении способов диагностики и контроля для отслеживания агентов, способных модулировать активность пептида или для определения количества пептида.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую изолированный пептид, имеющий или содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант. Также предусматривается рекомбинантная структура нуклеиновой кислоты, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с вектором экспрессии.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает, по меньшей мере, одну клетку-носитель, включающую рекомбинантную структуру нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Также предусматривается способ производства пептида, имеющего или содержащего аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную, или вариант, причем способ содержит этапы, на которых: (а) культурируют по меньшей мере одну клетку-носитель в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии пептида; и (b) извлекают пептид, по меньшей мере, из одной клетки-носителя или культурной среды такой клетки.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая включает в себя изолированный пептид или пептид, имеющий или содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную, или вариант (включая фармацевтически приемлемую соль, аддитивную соль или сложный эфир любого из перечисленных выше веществ, или полиморф), в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или наполнителем.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения и/или профилактики инфекции (например, микробной инфекции) у субъекта, который предполагает введение субъекту пептида, имеющего или содержащего аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант, или очевидный химический эквивалент. В качестве примера, пациент может являться носителем инфекции или быть подверженным риску заражения инфекцией. В одном варианте выполнения настоящего изобретения пептид модулирует врожденный иммунитет субъекта, посредством чего осуществляют лечение и/или профилактику инфекции у субъекта. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ распознавания микробной инфекции, которую можно лечить пептидом согласно настоящему изобретению. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения или профилактики состояний или заболеваний, связанных с активностью DPPIV.

Примеры инфекций, которые можно лечить и/или предотвращать способом согласно настоящему изобретению включают инфекцию, вызванную бактерией (например, грам-положительной или грам-отрицательной), инфекцию, вызванную грибком, инфекцию, вызванную паразитом, и инфекцию, вызванную вирусом. В одном варианте выполнения настоящего изобретения инфекция является бактериальной (например, инфекция, вызванная Е.coli, Klebsiella pneumonidae, Pseudomonas aeruglnosa, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. и ванкомицин-резистентного энтерококка). В другом варианте выполнения настоящего изобретения инфекция является грибковой инфекцией (например, инфекция, вызванная плесенным грибком, дрожжевым грибком или высшим грибом). В еще одном варианте выполнения изобретения инфекция вызвана паразитом (например, одноклеточным или многоклеточным паразитом, включая Giardia duodenal is, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis и Toxoplasma gondii). В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения инфекция является вирусной (например, вирусном, связанным со СПИД, птичьим гриппом, ветрянкой, обычной простудой, герпесом, гастроэнтеритом, мононуклеозом, гриппом, корью, свинкой, фарингитом, пневмонией, краснухой, атипичной пневмонией, инфекцией нижних и верхних дыхательных путей (например, респираторно-синцитиальным вирусом)).

Согласно способу в соответствии с настоящим изобретением, пептид, имеющий или содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант, может быть введен субъекту непосредственно (например, путем введения самого пептида) или опосредованно (например, путем введения субъекту последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид с обеспечением возможности экспрессии пептида у субъекта). Пептид согласно настоящему изобретению (или нуклеиновая кислота, кодирующая пептид) может быть введен субъекту перорально, парентерально (например, интрадермально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно), трансдермально, интраназально, внутрилегочно (например, интратрахеально) и/или посредством осмотического насоса.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ прогнозирования эффективности лечения субъекта пептидом, содержащим аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант, причем способ заключается в анализе диагностической пробы, взятой у субъекта, с целью определения активности дипептидилпептидазы IV (DPPIV), при этом модуляция, такая как снижение активности DPPIV, указывает на то, что лечение субъекта будет эффективным. В одном аспекте для субъекта установлено наличие состояния или заболевания, связанного с DPPIV, или имеется подозрение на наличие такого состояния или заболевания.

Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут подробно рассмотрены в нижеследующем описании. Следует, однако, понимать, что детальное описание и конкретные примеры, представляющие предпочтительные варианты выполнения настоящего изобретения, приведены лишь с целью иллюстрации, так как различные изменения и модификации в рамках сущности и объема настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области из данного подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Изобретение будет описано со ссылкой на фигуры, которые:

Фиг.1А и В иллюстрируют результаты эксперимента, описанного в Примере 2. % жизнеспособности = количество бактериального роста относительно контроля, представленного средой (Tris), для которого выживаемость бактерий принята за 100%, при применении соответствующих пептидов последовательности SEQ ID NO 5 и 47; Erythr. = эритромицин.

Фиг.2А-G иллюстрируют результаты эксперимента, описанного в Примере 3. На графике показаны колониеобразующие единицы на мл (КОЕ/мл) по оси Y и группа, получавшая пептид (контроль = без пептида; SEQ ID NO 1, 4, 5, 6, 45 и 47 = введение пептида, имеющего соответствующую аминокислотную последовательность) по оси X. Показано количество бактерий для отдельных мышей.

Фиг.3А и В иллюстрируют результаты эксперимента, описанного в Примере 4. На графике показаны колониеобразующие единицы на мл (КОЕ/мл) по оси Y и группа, получавшая пептид (контроль = без пептида; SEQ ID NO 1 и 5 = введение пептида, имеющего соответствующую аминокислотную последовательность) по оси X. Показано количество бактерий для отдельных мышей. ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Понятие «заболевание, связанное с DPPIV» или «состояние, связанное с DPPIV» в контексте данной заявки означает любое медицинское состояние, связанное с активностью DPPIV, и при котором модуляция этой активности может быть использована для лечения и/или профилактики или диагностирования данного состояния. Примеры таких состояний включают, не ограничиваясь, ВИЧ/СПИД, аутоиммунные состояния, такие как ревматоидный артрит, рассеянный склероз, рак (например, толстой кишки и легких), диабет и базедову болезнь.

Понятие «иммунопатологическое заболевание» означает состояние, связанное с иммунной системой субъекта, посредством либо активации, либо угнетения иммунной системы, или которое может быть вылечено, предотвращено или диагностировано посредством целенаправленного влияния на конкретный компонент иммунного ответа у субъекта, такого как врожденный иммунный ответ.

Понятие «иммунологически активный» в контексте данной заявки имеет отношение к врожденному иммунитету (например, способность модулировать врожденный иммунный ответ или его компонент у субъекта) или к способности модулировать активность DPPIV.

Понятие «модулировать» и «модулирующий» в контексте данной заявки, например, в словосочетании «модулирующий активность DPPIV или конкретный компонент ответа», подразумевает повышение или снижение активности или ответа в сравнении с уровнем активности в контроле, в норме или в сравнении с исходным уровнем активности или ответа в определенных условиях. Оно может также включать в себя поддержание уровня активности или ответа в условиях, при которых обычно происходит повышение или снижение активности пептида или ответа.

Понятие «фармацевтически приемлемые соли» относится к нетоксичным щелочным металлам, щелочноземельным металлам и солям аммония, широко используемым в фармацевтической промышленности, включая натрий, калий, литий, кальций, магний, барий, аммоний и протамин-цинковые соли, которые получают способами, хорошо известными в данной области. Понятие включает в себя также нетоксичные кислотно-аддитивные соли, которые обычно получают в результате реакции соединений согласно настоящему изобретению с подходящей органической или неорганической кислотой. Примерами солей могут служить гидрохлорид, гидробромид, сульфат, бисульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, напсилат, трифторацетат и т.п.

Понятие «фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль» относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и характеристики свободных оснований, и которые не являются биологически или по какой-либо другой причине неприемлемыми, и которые образованы с помощью неорганических кислот, таких как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, ортофосфорная кислота и им подобные; а также с помощью органических кислот, таких как трифторуксусная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, оксиянтарная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфокислота, этансульфокислота, р-толуолсульфокислота, салициловая кислота и им подобные. Описание фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей как пролекарств приведено в Bundgaard, H., ed., (1985) Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam.

Понятие «фармацевтически приемлемый сложный эфир» означает те сложные эфиры, которые при гидролизе эфирной связи сохраняют биологическую эффективность и свойства карбоновой кислоты или спирта и не становятся биологически или по какой-либо другой причине нежелательными. Описание фармацевтически приемлемых сложных эфиров как пролекарств приведено в публикации Bundgaard, H., ссылка на которую дана выше. Эти сложные эфиры обычно получают из соответствующей карбоновой кислоты и спирта. Как правило, сложный эфир получают общепринятыми методами синеза (см., например, March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York (1985) стр.1157 и список цитируемой там литературы, и Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980).) Спиртовая составляющая сложного эфира, как правило, содержит (i) С.₂-С.₁₂ . алифатический спирт, который может или не может содержать одну или более двойные связи, и может или не может содержать разветвленные углеродные цепочки или (ii) С.₇-C.₁₂ ароматический или гетероароматический спирты. Также настоящее изобретение предусматривает применение таких соединений, которые являются сложными эфирами, описанными в данном абзаце, и в то же время представляют собой фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные солями согласно настоящей заявке.

Понятие «фармацевтически приемлемый амид» означает те амиды, которые при гидролизе амидной связи, сохраняют биологическую эффективность и свойства карбоновой кислоты или амина, и не становятся биологически или по какой-либо другой причине нежелательными. Описание фармацевтически приемлемых амидов как пролекарств приведено в публикации Bundgaard, Н., ссылка на которую дана выше. Эти амиды обычно получают из соответствующей карбоновой кислоты и амина. Как правило, амид получают общепринятыми методами синтеза (см., например, March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York (1985) стр.1157 и список цитируемой там литературы, и Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980).) Также настоящее изобретение предусматривает применение таких соединений, которые являются амидами, описанными в данном абзаце, и в то же время представляют собой фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли согласно настоящей заявке.

Понятие «фармацевтически или терапевтически приемлемый носитель» означает среду-носитель, которая не влияет на эффективность биологического воздействия активных ингредиентов и которая не оказывает токсического воздействия на носитель или пациента.

Понятие «стереоизомер» означает химическое соединение, имеющее тот же молекулярный вес, химический состав и строение, как и другое химическое вещество, но, атомы которого сгруппированы иначе. То есть, определенные одинаковые химические компоненты имеют различное расположение в пространстве и поэтому в чистом виде обладают способностью вращать плоскость поляризованного света. Однако некоторые чистые стереоизомеры могут обладать характеристикой оптического вращения, которое настолько незначительно, что его невозможно зарегистрировать, используя существующую на настоящий момент измерительную аппаратуру. Соединения согласно настоящему изобретению могут иметь один или более асимметричные атомы углерода, и поэтому могут включать различные стереоизомеры. Все иммунологически активные стереоизомеры включены в объем настоящего изобретения.

Понятие «терапевтически или фармацевтически эффективное количество», используемое применительно к соединениям согласно настоящему изобретению, означает такое количество композиции, которого достаточно для того, чтобы получить желаемый биологический результат. Таким результатом может быть уменьшение выраженности признаков, симптомов или причин заболевания, или любое другое желаемое изменение биологической системы. Например, согласно настоящему изобретению результат обычно предполагает усиление врожденного иммунного ответа, снижение активности DPPIV и/или модуляцию (такую как подавление, снижение или отсутствие стимуляции) воспалительных реакций на инфекцию или повреждение ткани.

В настоящей заявке использованы следующие сокращения для обозначения аминокислотных остатков пептидов: фенилаланин - Phe или F; лейцин - Leu или L; изолейцин - Не или I; метионин - Met или М; валин - Val или V; серин - Ser или S; пролин - Pro или Р; треонин - Thr или Т; аланин - Ala или А; тирозин - Tyr или Y; гистидин - His или Н; глутамин - Gin или Q; аспарагин -Asn или N; лизин - Lys или К; аспарагиновая кислота - Asp или D; глутаминовая кислота - Glu или Е; цистеин Cys или С; триптофан - Trp или W; аргинин - Arg или R; и глицин - Gly или G. В качестве дополнения используются сокращения: Nal для обозначения 1-нафтилаланина; Orn или О - для орнитина; Cit -для цитруллина, Hci - для цитруллина с еще одной метиленовой группой, и Vx или Valine х, где «х» означает вариацию в скелете аминокислоты, где аминокислотное соединение является уже не амидной связью, а метилиованным амином; это также относится и к другим аминокислотам с обозначением «х». Также 2,4-диаминобутириновая кислота обозначается как Dab, 2,3-диаминопропионовая кислота - как Dpr или Dapa; N-(4-аминобутил)-глицин - Nlys; гомосерин - hSer; гидроксипролин - Hyp; гидроксивалин - Val(betaOH); 3,4-дегидропролин - D-Pro; пироглутамин (пролин с С=O в кольце) - Pyr; пролин с фтористыми замещениями в кольце; 1,3-тиазолидин-4-карбоновая кислота (пролин с S в кольце); бета-(2 тиенил)-аланин - Thi; 2-аминобутановая кислота - Abu; норвалин - Nva; норлейцин - Nie; гомолейцин - Hol и альфа-аминоизобутановая кислота - Aib.

В дополнение к пептидам, состоящим только из натуральных аминокислот, данная заявка предполагает петидомиметики или аналоги пептидов. Аналоги пептида широко используются в фармацевтике в качестве непептидных препаратов, обладающих теми же свойствами, что и пептид, взятый за образец. Эти виды непептидных соединений называют «пептидными миметиками» или «пептидомиметиками» (Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber и Freidinger, TINS стр.392 (1985); и Evans et al., J Med. Chern. 30:1229 (1987), которые включены в настоящую заявку в качестве ссылки). Пептидные миметики, имеющие такую же структуру, что и терапевтически применимые пептиды, могут использоваться для получения эквивалентного или усиленного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики структурно соответствуют пептиду, взятому за образец (т.е. пептиду, обладающему биологической или фармакологической активностью), такому, как натуральный пептид, связывающийся с рецептором, но имеют одну или более пептидных связей, факультативно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из: --CH ₂NH--, -CH₂.S--, --CH₂=CH₂ --, --CH=CH-- (cis и trans), --СОСН₂--, --СН(ОН)СН ₂--, и ~-CH₂SO-посредством способов, известных в данной области и дополнительно описанных в следующих источниках: Spatola, A.F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, стр.267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (март 1983), Vol.1, Issue 3, PEPTIDE BACKBONE MODIFICATIONS (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) стр.463-468 (general review); Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177 185 (1979): (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola et al., Life Sci 38:1243 1249 (1986): (--CH₂--S); Hann J.I Chern. Soc. Perkin Trans. I 307 314 (1982): (--CH--CH-, cis и trans); Almquist et al., J Med Chern 23:1392 1398 (1980): (-СОСН₂ -); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett 23:2533 (1982): (--COCH ₂--); Szeike et al., европейская заявка. ЕР 45665 CA: 97:39405 (1982) (-CH (ОН) СН₂.); Holladayet al., Tetrahedron Lett 24:4401 4404 (1983): (-C(ОН)СН₂--); and Hruby Life Sci 31: 189 199 (1982): (--CH₂--S--); каждая из этих публикаций включена в настоящую заявку в качестве ссылки. В одном аспекте непетидная связь является --CH₂NH--. Такие пептидные миметики могут иметь существенные преимущества перед полипептидными вариантами выполнения, включая, например, более экономичное производство, большую химическую стабильность, усиленные фармакологические свойства (период полувыведения, всасывание, активность, эффективность и т.д.), измененную специфичность (т.е. широкий спектр биологической активности), сниженную антигенность и другие. Маркирование пептидомиметиков обычно предполагает ковалентное присоединение одного или более маркеров, непосредственно или через спейсер (например, амидную группу), к непересекающейся(имея) части(-ям) пептидомиметика, которые определяются по количественным данным о их структуре и активности и/или способом молекулярного моделирования. Такие непересекающиеся части, как правило, являются частями, которые не образуют прямых связей с макромолекулами (например, молекулами иммуноглобулиновых суперсемейств), к которым присоединяется пептидомиметик для достижения терапевтического эффекта. Дериватизация (например, маркирование) пептидомиметиков не должна заметно влиять на желаемую биологическую или фармакологическую активность пептидомиметика. Как правило, пептидомиметики связывающихся с рецепторами пептидов связываются с рецептором с высокой степенью сходства и обладают регистрируемой биологической активностью (т.е. являются агонистами или антагонистами к одному или более передаваемым рецептором фенотипичным изменениям).

Систематическая замена одной или более аминокислот согласованной последовательности на D-аминокислоту того же типа (например, D-лизин вместо L-лизина) может использоваться для создания более устойчивых пептидов. Следует понимать, что при этих заменах D-аминокислоты должна сохраняться иммунологическая активность пептида.

Описание

Как описано в настоящей заявке, авторами изобретения были выявлены новые пептиды, имеющие и/или содержащие аминокислотные последовательности, которые представлены в Таблице 1, или аналоги, производные или варианты аминокислотных последовательностей, описанных в настоящей заявке. Авторами изобретения было также показано, что пептид, имеющий или содержащий одну из аминокислотных последовательностей, представленных в Таблице 1, и амидированный С-конец, обладает терапевтической применимостью благодаря усилению врожденного иммунитета. В частности, авторами изобретения было показано, что пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1, не обладал антимикробным действием по отношению к S.aureus, но тем не менее проявлял in vivo свойство защиты от S.aureus у инфицированных мышей. Пептид усиливал ответ носителя на инфекцию, что способствовало более эффективному уничтожению бактерий и выживанию носителя. Таким образом, новые пептиды, описанные в настоящем изобретении, могут быть использованы в качестве терапевтического средства для лечения инфекционного заболевания. В другом варианте выполнения изобретения было показано, что пептиды согласно настоящему изобретению снижают активность DPPIV, которая, как было показано, связана с некоторыми иммунопатологическими заболеваниями, такими, как развитие СПИД и ВИЧ (Blazquez et al. 1992; Vanham et al. 1993; Schols et al. 1998 Oravecz et al. 1995), базедова болезнь (Eguchi et al. 1989; Nishikawa et al. 1995), и рак, такой как рак легких и толстой кишки (Stecca et al. 1997), а также диабет (Hinke et al. 2000; Marguet et al. 2000). Дополнительно было показано, что активность DPPIV как индикатора активации Т-клеток изменяется параллельно развитию нескольких аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (Nakao et al., 1989) и аутоиммунный тиреоидит (Eguchi et al., 1989). Было показано, что DPPIV является маркером, который хорошо коррелирует с уровнем выраженности этих заболеваний. Более того, он был изучен как индикатор развития болезни при хроническом прогрессирующем рассеянном склерозе (Constantinescu et al., 1995). Пептиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы для лечения таких состояний.

Пептиды согласно настоящему изобретению

Соответственно, настоящее изобретение предусматривает изолированные пептиды, имеющие или содержащие аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее иммунологически активный аналог, производную или вариант. Также предусматриваются фармацевтически приемлемые соли, кислотно-аддитивные соли и сложные эфиры пептидов, аналогов, производных и вариантов согласно настоящему изобретению, включая полученные способами, описанными в настоящей заявке, такими как консервативное замещение, модификация N-конца, С-конца и скелета, как описано в настоящей заявке. В контексте настоящей заявки «изолированный» пептид - это пептид, который не имеет натурального аналога или который был выделен, или очищен от компонентов, которые сопутствуют ему в природе. Изолированный пептид согласно настоящему изобретению может быть получен, например, с помощью экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, либо путем химического синтеза. Так как химически синтезированный пептид по своей природе отделен от всех компонентов, которые его сопровождают в природе, такой синтетический пептид является «изолированным».

В одном аспекте изолированный пептид согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, имеющую формулу "X₁X ₂P" (SEQ ID NO 55), где X₁ выбрана из группы, состоящей из К, Н, R, S, Т, О, Cit, Hci, Dab, Dpr и соединений, основанных на глицине, с замещением основных функциональных групп на N-конце (например, Nlys), hSer, Val(betaOH); или в другом варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из K, R, S, О и Cit; или в другом варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из K, R и S; или является R; и где Х₂ выбрана из группы, состоящей из V, I, K, Р и Н. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид согласно изобретению имеет последовательность SEQ ID NO 55. В другом аспекте это пептид, включающий в себя до 10 аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 55. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид с последовательностью SEQ ID NO 55 содержит последовательности SEQ ID NO 8, 9, 26, 39, 40, 41 и 45-53 или является изолированным пептидом, включающим в себя до 10 аминокислот, содержащим указанные последовательности. В другом варианте выполнения изобретения изолированный пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO 55, содержит последовательность SEQ ID NO 44, включающую в себя до 13 аминокислот.

В другом варианте выполнения изобретения предусматривается изолированный пептид, содержащий формулу "X₁X₂X₃P" (SEQ ID NO 56), где X₁ выбрана из группы, состоящей из K, Н, R, S, Т, О, Cit, Hci, Dab, Dpr или соединений на основе глицина с замещением основных функциональных групп на N-конце (например, Nlys), hSer, Val(betaOH); или в другом варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из K, Н, R, S, Т и О; или в другом варианте выполнения изобретения из K, Н, R, S и Т; или в другом варианте выполнения изобретения из K, Н, R, S и О; или в другом варианте выполнения изобретения из R, Н, K и S; и где Х₂ выбрана из группы, состоящей из A, I, L, V, K, Р, G, Н, R, S, О, Dab, Dpr, Cit, Hci, Abu, Nva, Nie, и где X₂ может быть N-метилированной; или в другом варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из А, I, L, V, K, Р, G, Н и R, где она может быть N-метилированной; и где Х₃ выбрана из группы, состоящей из I, V, Р, в которой в одном из вариантов выполнения изобретения Х₃ не является N-метилированной. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид может представлять собой аминокислотную последовательность, включающую в себя до 10 аминокислот, содержащую SEQ ID NO 56, включая последовательности SEQ ID NO 1, 3-7, 10-16, 18, 21-25, 27, 28, 31-39, 42, 43 или 47; или изолированный пептид, включающий в себя до 11 аминокислот, содержащий SEQ ID NO 54. Однако в одном варианте выполнения изобретения, когда SEQ ID NO 56 является гексамером, пептид не имеет последовательность SEQ ID NO 2, или в одном варианте выполнения изобретения, когда он является пентамером, он не имеет последовательность SEQ ID NO 17. В одном из вариантов выполнения изобретения изолированный пептид согласно изобретению не содержит пептид, включающий последовательности SEQ ID NO 2 или 17.

В другом варианте выполнения изобретения предусмотрен изолированный пептид, содержащий пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO 56 в форме пентамера или гексамера. В одном варианте выполнения изобретения указанный пептид обладает иммунологической активностью.

В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид согласно изобретению содержит пептид, содержащий формулу «aX ₁X₂X₃P» (SEQ ID NO 57), где X₁, X₂ и Х₂ определяются как для последовательности SEQ ID NO 56, и где «а» выбрана из группы, состоящей из S, P, I, R, С, Т, L, V, A, G, K, Н, R, О, С, М и F; или в другом варианте выполнения изобретения «а» выбрана из группы, состоящей из S, P, I, R, С, Т, L, V, А, G, K, Н, R, О, С и М; или в другом варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из S, P, I, R и С; или в другом варианте выполнения изобретения является S. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид содержит последовательность SEQ ID NO 57 или представляет собой пептид, включающий в себя до 10 аминокислот, содержащий указанную последовательность. В другом варианте выполнения изобретения изолированный пептид содержит последовательности SEQ ID NO 4, 47, или если это гексамер, последовательность SEQ ID NO 39, или представляет собой изолированный пептид, включающий в себя до 10 аминокислот, содержащий указанные последовательности.

В другом варианте выполнения изобретения изолированный пептид согласно изобретению содержит пептид формулы «X ₁X₂Pb» (SEQ ID NO 58), где X₁ X₂X₃ определяется как для последовательности SEQ ID NO 56, и где «b» выбрана из группы, состоящей из А, А*, G, S, L, F, K, С, I, V, Т, Y, R, Н, О и М, но в одном варианте выполнения изобретения не является P; или в другом варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из А, А*, G, S, L, F и К; или в другом варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из А, А*, G, S, L, K и С; или в одном варианте выполнения изобретения выбрана из группы, состоящей из A, A*, G, S, L и K. Где А* означает D-аминокислоту аланин. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид представляет собой аминокислотную последовательность, включающую в себя до 10 аминокислот, содержащую последовательность SEQ ID NO 58. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид представляет собой или содержит последовательности SEQ ID NO 5-8, 10, 11, 13-16, 21-25, 27, 28, 31, 33-38 и 42-43. В другом варианте выполнения изобретения пептид имеет последовательность SEQ ID NO 58, где «b» не является Р или Y, или не является RIVPP (SEQ ID NO 17); или где Х₃ не является G или RIGPA, или Х₃ не является Vx или RIVxPA.

В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид согласно изобретению представляет собой или содержит пептид, подобный последовательности SEQ ID NO 58, но где X₁ выбрана из группы, состоящей из G, GG или Cit; или где «b» является А, Х₂ является I, Х₃ является V, Xi является G, GG или Cit; или пептид содержит последовательность SEQ ID NO 19, 20 и 36. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид содержит последовательность SEQ ID NO 31. В другом варианте выполнения изобретения изолированный пептид содержит обратную последовательность SEQ ID NO 58 или содержит последовательность SEQ ID NO 30.

В одном варианте выполнения изобретения пептид согласно изобретению представляет собой или содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 29.

Пептид согласно настоящему изобретению также предусматривает изолированный пептид, содержащий формулу «a₁a₂ Х₁Х₂Х ₃Р» (SEQ ID NO 59), где X₁, Х₂ и Х₃ определяются как в последовательности SEQ ID NO 56, и a₁ выбрана из группы, состоящей из K, I, R, Н, О, L, V, А и G, или в одном варианте выполнения изобретения из K и I, или в одном варианте выполнения изобретения из К, и a₂ выбрана из группы, состоящей из S, Р, R, Т, Н, K, О, L, V, A, G, S и I, или в одном варианте выполнения изобретения из S, Р и R, или в другом варианте выполнения изобретения из S и Р, или в другом варианте выполнения изобретения Р. В одном варианте выполнения изобретения a₁ не ацетилирована, или если a₁ является K, то K не ацетилирована или не содержит последовательность SEQ ID NO 2. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид представляет собой или содержит последовательность SEQ ID NO 1 и 47, или пептид, включающий в себя до 10 аминокислот, содержащий последовательность SEQ ID NO 59.

В другом варианте выполнения изобретения изолированный пептид согласно изобретению представляет собой или содержит пептид формулы «a X₁X₂ X₃Pb» (SEQ ID NO 60), где X₁, X ₂ и Х₃ определяются как в последовательности SEQ ID NO 56, и где «а» выбрана из группы, состоящей из S, R, K, Н, О, Т, I, L, V, А, G, или в другом варианте выполнения изобретения из S, R и I, или в другом варианте выполнения изобретения из S и R; и где «b» выбрана из группы, состоящей из А, V, I, L, G, K, Н, R, О, S, Т, F или в другом варианте выполнения изобретения из А. В другом варианте выполнения изобретения пептид последовательности SEQ ID NO 60 содержит последовательности SEQ. ID. NO 3, 12 и 39, или представляет собой пептид, включающий в себя до 10 аминокислот, содержащий последовательности SEQ ID NO 60, или SEQ ID NO 3, 12 или 39.

В контексте настоящей заявки понятие «пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно последовательности согласно Таблице I» или «пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно последовательности согласно Таблице 1» включает сам пептид, его очевидные химические эквиваленты, его изомеры (например, изомеры, стереоизомеры, ретроизомеры, ретроинверсоизомеры, изомеры со всеми [D]-аминокислотами, изомеры со всеми [L]-аминокислотами, или смешанные [L] - и [D]-изомеры), их консервативные заместители, их формы-предшественники, эндопротеолитически обработанные формы, такие как формы, обработанные путем отщепления отдельных аминокислот с N- или С-конца, или иммунологически активные метаболиты пептида согласно настоящему изобретению, их фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры и другие формы, полученные в результате посттрансляционной модификации. Также в понятие включена любая исходная последовательность, длина которой составляет до 10, 9, 8, 7, 6, 5 и 4 аминокислот (циклированных или линейных, или разветвленных от центральной исходной последовательности), для которых заданная последовательность является субпоследовательностью. Специалисты в данной области должны понимать, что там, где пептид в таблице является гримером, он может представлять собой последовательность из 10, 9, 8, 7, 6, 5 и 4 мономеров, тогда как если пептид, указанный в Таблице 1, является гексамером, он может представлять собой последовательность из 10, 9, 8 и 7 мономеров, но не из 5 или 4 мономеров. В качестве дополнения, изобретение включает в себя последовательности, состоящие из более чем 10 мономеров, такие как последовательности SEQ ID NO 44 и 54. Такие модифицированные пептиды, сохраняющие иммунологическую активность пептидов согласно настоящему изобретению, включены в объем настоящего изобретения.

Понятие «очевидный химический эквивалент» в контексте настоящей заявки далее будет означать молекулу, которая обладает той же желаемой активностью, например, иммунологической активностью, что и пептиды согласно настоящей заявке, и имеет незначительные химические различия; или молекулу, которая в умеренных условиях преобразуется в пептид согласно настоящему изобретению (например, сложные эфиры, эфиры, продукты восстановления и комплексы пептидов согласно настоящему изобретению).

В качестве дополнения, в контексте настоящей заявки понятие «консервативные замещения» означает те аминокислотные замещения, которые функционально эквивалентны замещенному аминокислотному остатку, поскольку они либо имеют такую же полярность или пространственное расположение, либо относятся к тому же классу, что и замещенный остаток (например, к классу гидрофобных, кислотных или основных). Понятие «консервативные замещения» в контексте настоящей заявки включает в себя замещения, оказывающие незначительный эффект на способность пептида согласно изобретению усиливать врожденный иммунитет. Примеры консервативных замещений включают в себя замещение полярного (гидрофильного) остатка на другой (например, аргинин/лизин, глутамин/аспарагин или треонин/серин); замещение неполярного (гидрофобного) остатка (например, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, тирозина или валина) на другой; замещение кислотного остатка (например, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты) на другой; или замещение основного остатка (например, аргинина, гистидина, лизина или орнитина) на другой.

Понятие «аналог» в контексте настоящей заявки включает в себя любой пептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности, описанной в настоящей заявке, в которой, по меньшей мере, один остаток был консервативно замещен на функционально аналогичный остаток. «Аналог» на 60% и более (в предпочтительном варианте выполнения изобретения на 70% и более, 80% и более, 90% и более, 95% и более, или 99%) гомологичен аминокислотной последовательности согласно Таблице 1, и является ее функциональным вариантом. Понятие «функциональный вариант» в контексте настоящей заявки далее будет относиться к активности пептида, который обладает способностью усиливать врожденный иммунитет или снижать активность DPPIV, как описано в настоящей заявке. Понятие «аналог» включает в себя вариант аминокислоты согласно Таблице 1 с гомологичной трехмерной структурой. Дополнительно понятие «аналог» включает любую фармацевтически приемлемую соль аналога, описанного в настоящей заявке. Понятие «вариант» дополнительно включает в себя любую фармацевтически приемлемую соль варианта, описанного в настоящей заявке.

Понятие «производная» в контексте настоящей заявки относится к пептиду согласно изобретению, содержащему одну или более аминокислоту, дериватизированную химически в результате реакции с функциональной боковой группой. Примеры дериватизированных молекул включают, не ограничиваясь, пептидные молекулы, в которых свободные аминогруппы были дериватизированы из солей или амидов путем добавления ацетильных групп, амингидрохлоридов, карбобензокси-групп, хлороацетильных групп, формильных групп, р-толуолсульфонил-групп или t-бутилоксикарбонил-групп. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы из O-ацил- или O-алкил-производных. Кроме того, свободные карбоксильные группы могут быть дериватизированы из солей, сложных эфиров (например, метилового или этилового эфиров), или гидразидов. Таким образом, понятие «производная» дополнительно включает в себя любую фармацевтически приемлемую соль производной, как описано в настоящей заявке.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения изолированный пептид согласно изобретению содержит модифицированный С-конец и/или модифицированный N-конец. Например, изолированный пептид может содержать амидированный С-конец. Например, амино-конец может быть ацетилирован (Ас), или карбоксильный конец может быть амидирован (NH2). Однако в одном варианте выполнения настоящего изобретения предпочтительно, чтобы пептиды согласно изобретению не были ацетилированы в случае, если такая модификация может привести к потере желаемой иммунологической активности. Модификации амино-конца включают в себя метилирование (т.е. -NHCH₃ или NH(СН₃)₂), ацетилирование, добавление карбобензоильной группы или блокирование амино-конца любой блокирующей группой, содержащей карбоксилатную функциональную группу, определяемую RCOO--, где R выбрана из группы, состоящей из нафтила, акридинила, стероидила и подобных групп. Модификации карбокси-конца включают в себя замещение свободной кислоты карбоксамидной группой или формирование циклического лактама на карбокси-конце для ограничения структуры.

В одном варианте выполнения изобретения может быть произведена замена скелета молекулы, такая как замена NH на NCH₃. Изолированный пептид может также представлять собой модификацию (например, путем точечной мутации, такой как включение или удаление или усечение) аминокислотной последовательности согласно Таблице 1, либо содержать аминокислотную последовательность согласно Таблице 1. В качестве примера, пептид может содержать аминокислотную последовательность согласно Таблице 1, модифицированную, по меньшей мере, одним включением D-аминокислоты до тех пор, пока сохраняется желаемая иммунологическая активность. В частности, могут быть использованы аналоги пролина, у которых размер кольца пролинового остатка изменен с 5 членов на 4, 6 или 7 членов. Циклические группы могут быть насыщенными и ненасыщенными, и в случае, если они ненасыщенные, они могут быть ароматическими или неароматическими.

Естественные боковые цепочки 20 генетически закодированных аминокислот (или D-аминокислот) могут быть замещены другими боковыми цепочками, обладающими такими же свойствами, например, группами, такими как алкил, низший алкил, циклический 4-, 5-, 6-, 7-членный алкил, амид, амид низшего алкила, амид ди(низшего алкила), низшая алкокси-, гидрокси- и карбокси- и их производные в форме низших сложных эфиров, а также 4-, 5-, 6-, 7-членными гетероциклическими группами.

Такие замещения могут включать, не обязательно ограничиваясь, (1) нестандартные положительно заряженные аминокислоты, такие как: орнитин. Dab; 2,4-диаминомасляная кислота, которая имеет такое же строение, что и орнитин, но без метиленовой группы (или лизин минус две метиленовые группы), Dpr или Dapa; 2,3-диаминопропионовая кислота, которая имеет такое же строение, что и орнитин, но без двух метиленовых групп (или лизин минус три метиленовые группы, или серин с аминогруппой вместо гидроксила), Nlys; N-(4-аминобутил)-глицин, который содержит боковую цепочку лизина, присоединенную к «N-концу», и соединения с аминопропиловыми или аминоэтильными группами, присоединенными к аминогруппе глицина. (2) неприродные аминокислоты, такие как арганин, незаряженные, такие как Cit; цитруллин и Hci; цитруллин с еще одной метиленовой группой; (3) нестандартные неприродные аминокислоты с ОН (например, серин), такие как hSer - гомосерин (с еще одной метиленовой группой). Hyp; гидроксипролин, Val(betaOH); гидроксивалин. Pen; пеницилламин, (Val(betaSH); (4) производные пролина, такие как D-Pro, такие как 3,4-дегидропролин, Pyr; пироглутамин (пролин с С=O в кольце), пролин с фторовыми замещениями в кольце, 1,3-тиазолидин-4-карбоксильная кислота (пролин с S в кольце); (5) производные гистидина, такие как Thi; бета-(2 тиенил)-аланин; или (6) производные алкила, такие как Abu; 2-аминомасляная кислота (этиловая группа на Calpha), Nva; норвалин (пропиловая группа на Calpha), Nie; норлейцин (бутиловая группа на Calpha), Hoi; гомолейцин (пропиловая группа на Calpha), Aib, альфа-аминоизобутириновая кислота (валин без метиленовой группы). Специалисту в данной области должно быть понятно, что данные замены позволяют сохранить иммунологическую активность исходного пептида/последовательности.

В другом альтернативном варианте выполнения изобретения С-концевую карбоксильную группу или С-концевой сложный эфир можно циклировать внутренним замещением --ОН или сложного эфира (-OR) карбоксильной группы или сложного эфира соответственно на N-концевую аминогруппу для формирования циклического пептида. Например, после синтеза и расщепления с целью получить пептидную кислоту, свободная кислота превращается в активированный сложный эфир с помощью соответствующего активатора карбоксильной группы, такого как дициклогексилкарбодиимид (DCC) в растворе, например, в смесях метиленхлорида (CH₂ Cl₂), диметилформамида (DMF). Затем получается циклический пептид путем внутреннего замещения активированного сложного эфира N-концевым амином. Внутренняя циклизация в противопоставление полимеризации может быть усилена при помощи использования очень разбавленных растворов. Такие методы хорошо известны в данной области.

Пептиды согласно данному изобретению возможно циклировать, или к концу пептида возможно присоединить дезамино- или дезкарбокси-остаток, чтобы не осталось концевых амино- или карбоксильных групп, для повышения восприимчивости к протеазам или чтобы ограничить структуру пептида. Перечень функциональных групп С-конца соединений согласно настоящему изобретению включает в себя амид, амид низшего алкила, амид ди(низшего алкила), низшую алокси-, низшую гидрокси-, карбокси-, их производные в форме сложных эфиров и их фармацевтически приемлемые соли.

Пептид возможно циклировать путем добавления N- и/или С-конечного цистеина и циклизации пептида через дисульфидные связи или другие взаимодействия боковых цепочек.

К концам пептида возможно присоединить дезамино- или дезкарбокси-остаток, так, чтобы не осталось концевых амино- или карбоксильных групп, чтобы повысить восприимчивость к протеазам или чтобы ограничить структуру пептида.

Способ получения пептидов

Настоящее изобретение предусматривает пептиды, включая аналоги, производные и варианты пептидов, которые производят путем синтеза, создают рекомбинантно или изолируют из нативных клеток. Пептид согласно настоящему изобретению может быть синтезирован способами, хорошо известными специалистам в данной области (например, описанными в Modern Techniques of Peptide and Amino Acid Analysis (New York: John Wiley & Sons, 1981; и Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis (New York: Springer-Verlag N.Y., Inc., 1984). Примеры способов, которые могут быть использованы для синтеза пептидов согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь, способ синтеза пептидов в твердой фазе, способ синтеза в растворе или синтеза пептидов в жидкой фазе, и синтез с использованием любого из доступных для приобретения пептидных синтезаторов. В одном варианте выполнения пептид согласно изобретению синтезируют -in vitro, например, химическими средствами, или in vitro трансляцией мРНК. В другом варианте выполнения изобретения пептид согласно изобретению может быть получен рекомбинантно с использованием обычных методик и кДНК, кодирующей пептид. Аминокислотные последовательности согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать связывающие агенты и защитные группы, которые используются для синтеза пептидных последовательностей и которые хорошо известны специалистам в данной области.

Аналоги, производные и варианты пептидов согласно настоящему изобретению могут быть получены путем использования большого количества разнообразных методик мутагенеза, хорошо известных специалистам в данной области. Описание этих методик можно найти в любом руководстве по биохимии, включая, например, Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2^nd ed. (Plainview, NY: Cold Spring Harbor Press, 1989); или Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Наборы реактивов для проведения мутагенеза предлагаются на рынке многими поставщиками. Доступные способы позволяют провести сайт-специфический, регио-специфический или произвольный мутагенез в исходной аминокислотной последовательности. После того, как аналоги, производные и варианты пептида получены, они могут быть исследованы на предмет наличия желаемой способности усиливать врожденный иммунитет, как описано в настоящей заявке.

Агенты, обладающие реакционной способностью по отношению к пептиду

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает агент, обладающий реакционной способностью по отношению к пептиду, содержащему аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант. Понятие «обладающий реакционной способностью» в контексте настоящей заявки означает, что агент обладает сродством, способностью связываться или направлен против пептида согласно настоящему изобретению. Понятие «агент» в контексте настоящей заявки далее будет включать в себя протеин, полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (включая ДНК или РНК), неприродное антитело, Fab-фрагмент, F(ab )₂-фрагмент, молекулу, соединение, антибиотик, препарат и любую(ые) их комбинацию(и). Fab-фрагмент - это одновалентный антигенсвязывающий фрагмент антитела, получаемый путем расщепления папаином. F(ab )₂-фрагмент - это двухвалентный антигенсвязывающий фрагмент антитела, получаемый путем расщепления пепсином. В предпочтительном варианте выполнения изобретения агент согласно настоящему изобретению маркирован различимым маркером или меткой. Неприродное антитело означает антитело, которое получено в результате соединения пептида с другим соединением, таким как С-терминальный глициновый остаток и MAPS. MAPS антиген присоединяется к пептиду согласно настоящему изобретению через 2 глициновых остатка вставленных в С-конец пептида. Эта структура затем может быть введена животному (такому как кролик), и путем процедур, известных в данной области, может быть выращено антитело.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения агент, обладающий реакционной способностью по отношению к пептиду согласно настоящему изобретению, является антителом. В контексте настоящей заявки антитело может быть поликлональным или моноклональным. Кроме того, антитело согласно настоящему изобретению может быть получено с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области. Поликлональное антитело, например, может быть получено путем иммунизации мыши, кролика или крысы очищенным пептидом согласно настоящему изобретению. После этого может быть получено моноклональное антитело путем удаления селезенки у иммунизированного животного и слияния клеток селезенки с клетками миеломы с целью получения гибридомы, которая после инкубации в питательной среде продуцирует моноклональное антитело. См., например, J.G.R. Hurrel, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (Boco Raton, FL: CRC Press Inc., 1982).

Антитело согласно изобретению может маркировано различимым маркером или меткой. Маркирование антитела может быть произведено с использованием одной из множества различных методик маркировки, включая маркирование пероксидазой, хемилюминисцентными и радиоактивными маркерами, известными в данной области. Обнаруживаемый маркер или метка согласно настоящему исследованию может быть, например, нерадиоактивным или флуоресцентным маркером, таким как биотин, флуоресцеин (FITC), акридин, холестерин или карбокси-Х-родамин, которые могут быть выявлены методом флуоресценции или другими методами визуализации, известными в данной области. В качестве альтернативы, обнаруживаемый маркер или метка могут представлять собой радиоактивный маркер, включая, например, радиоизотоп. Радиоизотоп может быть изотопом, который выделяет регистрируемую радиацию, таким как изотоп ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I, ³H или ¹⁴С. Радиоактивность, выделенная радиоизотопом, может быть зарегистрирована с использованием методик, известных в данной области. Например, гамма-излучение радиоизотопа может быть зарегистрировано методом гамма-визуализации, а именно, методом сцинтиграфии. В предпочтительном варианте выполнения изобретения агент согласно настоящему изобретению является антителом с высокой степенью аффинности, маркированным обнаруживаемым маркером или меткой.

Молекулы изолированной нуклеиновой кислоты

В качестве дополнения, настоящее изобретение предусматривает молекулу изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант, включая конъюгированный пептид (например, структуру носитель-пептид) или другой пептид, или про-пептид, который метаболизируется или расщепляется до иммунологически активного пептида согласно Таблице 1. Вследствие вырождения генетического кода, молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включает в себя множество замещений нуклеиновых кислот, которые также будут кодировать пептид согласно данному изобретению. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется до молекулы изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант.

Молекулами нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть ДНК или РНК. Они могут быть получены с использованием различных методик, известных специалистам в данной области, включая, не ограничиваясь, автоматизированный синтез олигонуклеотидов с использованием коммерчески доступных синтезаторов, таких как ДНК/РНК синтезатор Applied Biosystems Model 392. В качестве дополнения, молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть маркированы одним или несколькими маркерами или метками. Маркирование молекул нуклеиновой кислоты может быть выполнено различными способами, известными в данной области, например, «ник»-трансляцией, маркированием конца, маркированием заполненного конца, реакцией замены полинуклеотидкиназы, случайным примированием или SP6 полимеразой (для получения рибопробного препарата), наряду с использованием одного из множества возможных маркеров, например, радиоактивных маркеров, таких как ³⁵ S, ³²P или ³H; или нерадиоактивных маркеров, таких как биотин, флуоресцеин (FITC), акридин, холестерин или карбокси-Х-родамин (ROX).

Настоящее изобретение предусматривает также рекомбинантную структуру нуклеиновой кислоты, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, функционально соединенную с вектором экспрессии. В контексте настоящей заявки «вектор экспрессии» - это конструкция ДНК, содержащая последовательность ДНК, функционально соединенную с подходящей контрольной последовательностью, обладающей способностью влиять на экспрессию ДНК в подходящем носителе. Вектором может быть, например, плазмида, бактериофаг или потенциальная геномная вставка. Понятие «функционально соединенный» в контексте настоящей заявки далее будет обозначать функциональные отношения между двумя областями ДНК. Векторы экспрессии, подходящие для использования согласно настоящему изобретению, содержат, по меньшей мере, один элемент для контроля экспрессии (например, оператор, промоутер, lac систему, лидерную последовательность, кодон терминации и/или сигнал полиаденилирования), функционально соединенный с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно изобретению. В одном варианте выполнения изобретения вектор экспрессии представляет собой эукариотический вектор экспрессии, функционирующий в клетках-эукариотах (например, ретровирусный вектор, вектор вируса вакцины, вектор аденовируса, вектор вируса герпеса или вектор вируса оспы птиц).

Функционально соединенный с молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вектор экспрессии может быть введен в клетку-реципиент любым средством in vivo или ex. vivo, приемлемым для переноса нуклеиновой кислоты, включая, но не ограничиваясь, электропорацию, трансфекцию с DEAE-декстраном (диэтиламиноэтил-декстраном); трансфекцию с фосфатом кальция; липофекцию; монокатионное слияние с липосомой; поликатионное слияние с липосомой; слияние с протопластом; создание электрического поля in vivo; бомбардировку микрочастицами, покрытыми ДНК; инъекцию рекомбинантных вирусов с дефективной репликацией; гомологическую рекомбинацию; вирусные векторы; перенос «голой» ДНК, или любое сочетание вышеперечисленных процедур. В число рекомбинантных вирусных векторов, подходящих для генной терапии, входят, не ограничиваясь, векторы, являющиеся производными геномов вирусов, такие, как ретровирус, HSV, аденовирус, аденосателлитный вирус, вирус Semiliki Forest, цитомегаловирус и вирус вакцины.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает, по меньшей мере, одну клетку-носитель, содержащую рекомбинантную структуру нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетка-носитель согласно настоящему изобретению подвергается трансформации нуклеиновой кислотой, описанной выше. Клетка-носитель может быть эукариотической (например, клетка животного, растения, насекомого или дрожжевого грибка) или прокариотической (например, E.coli).

В качестве дополнения, настоящее изобретение предусматривает способ производства пептида, содержащего аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант. Способ содержит этапы, на которых: (а) культурируют по меньшей мере одну клетку-носитель, содержащую рекомбинантную структуру нуклеиновой кислоты, в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии пептида; и (b) извлекают пептид, по меньшей мере, из одной клетки-носителя или культурной среды такой клетки. Рекомбинантный пептид может быть восстановлен как неочищенный лизат, он может быть также очищен методами стандартной очистки белков, известными в данной области, включая, но, не ограничиваясь, аффинную и иммуноаффинную хроматографию, дифференциальную преципитацию, гелевый электрофорез, ионообменную хроматографию, изоэлектрическое фокусирование, гель-проникающую хроматографию и т.п.

Фармацевтическая композиция

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или SEQ ID NO 1, 3-16, 18-60, или ее аналог, производную или вариант (включая фармацевтически приемлемую соль, кислотно-аддитивную соль и их сложные эфиры), в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или наполнителем. Фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель должен быть «приемлемым» с точки зрения совместимости с другими ингредиентами композиции и отсутствия вредного воздействия на реципиента. Перечень примеров приемлемого фармацевтического носителя, растворителя и наполнителя включает, не ограничиваясь, карбоксиметилцеллюлозу, кристаллическую целлюлозу, глицерин, гуммиарабик, лактозу, стеарат магния, метилцеллюлозу, порошки, физиологический раствор, альгинат натрия, сахарозу, крахмал, тальк и воду помимо прочих веществ. Лекарственные формы, имеющие фармацевтическую композицию согласно изобретению, описанному в настоящей заявке, могут быть представлены в удобной форме дозировки.

Применения

Авторами изобретения было также показано, что пептиды согласно изобретению обладают терапевтической применимостью благодаря способности усиливать врожденный иммунитет. Усиление врожденного иммунитета иллюстрируется отсутствием антимикробной активности (Пример 2) и защитой от инфекции в моделях in vivo (Примеры 3 и 4), а также анализами активности DPPIV (Пример 5). Соответственно, настоящее изобретение предусматривает также способ лечения и/или профилактики инфекции у субъекта. В контексте настоящей заявки понятие «субъект» означает птицу (например, цыпленка, индейку и т.д.) или млекопитающее (например, корову, собаку, человека, обезьяну, мышь, свинью, крысу и т.д.). В одном варианте выполнения изобретения субъектом является человек. У субъекта может быть инфекционное заболевание, или он может быть подвержен риску инфицирования. Например, инфекцией может быть микробная инфекция. Лечение микробных инфекций может осуществляться способом согласно настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь, инфекцию, вызванную бактерией, инфекцию, вызванную грибком, инфекцию, вызванную паразитом, и инфекцию, вызванную вирусом.

Большинство патогенных бактерий существуют в окружающей среде, или в нормальной бактериальной флоре носителя. В процессе эволюции бактерии приобрели свойство вызывать серьезные заболевания, обладая различными механизмами (называемыми факторами вирулентности), которые позволяют им образовывать колонии, распространяться и проникать в ткани носителя. Когда эти болезнетворные факторы подавляются, бактерии теряют возможность сохранять жизнедеятельность в тканях носителя и таким образом теряют способность вызывать заболевания. В качестве примера бактерий, которые вызывают заболевания, лечение которых может осуществляться способом согласно настоящему изобретению, были выбраны, не ограничиваясь, Е.coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp.(например. Salmonella typhimurium), Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., и ванкомицин-резистентный энтерококк.

Pseudomonas aeruginosa - это вездесущая грам-отрицательная бактерия, особенностями которой являются ее эвритопность, способность вызывать заболевания у восприимчивых субъектов и резистентность к антибиотикам. Это - разнообразный организм, обитающий в почве, болотах и в прибрежных морских средах, на растениях и тканях животных. Р.aeruginosa вызывает одно из наиболее серьезных осложнений муковисцидоза - инфекционное заболевание дыхательных путей. Больные с онкологическими заболеваниями и ожеговыми поражениями тканей также страдают серьезными инфекционными заболеваниями, вызванными этим организмом, также как и некоторые пациенты с недостаточностью иммунной системы. В отличие от многих других бактерий, обитающих в окружающей среде, Р.aeruglnosa отличается способностью вызывать заболевания у восприимчивых носителей.

Staphylococcus aureus - это грам-положительная шаровидная бактерия, около 1 микрометра в диаметре, которая разрастается в форме микроскопических гроздьев. Это один из наиболее важных человеческих патогенов, вызывающих и бытовые, и нозокомиальные инфекции, от эндокардита до пневмоний. Несмотря на то, что S.aureus, как правило, классифицируют как внеклеточный патоген, данные последних исследований показали, что эта бактерия способна инфицировать различные клетки, например, фагоциты и нефагоцитные клетки, включая эндотелиальные клетки, фибробласты и другие. Эта инвазия начинается с прикрепления S.aureus к поверхности клетки - процесса, в ходе которого играют важную роль стафилококковые фибронектин-связывающие белки. Подверженный фагоцитозу S.aureus может либо привести к апоптозу клетки-носителя, либо выжить в течение нескольких дней в цитоплазме, которая, как предполагается, лишена антистафилококковых эффекторных механизмов.

S.aureus образует колонии в носовых ходах, на поверхности кожи, слизистых оболочек и в зонах вокруг рта, гениталий и заднего прохода. S.aureus может вызывать поверхностные поражения кожи, такие как фурункулы, ячмень и чирей. К более серьезным инфекционным заболеваниям, вызываемым S.aureus, относятся пневмония, мастит, менингит, инфекции мочевыводящих путей; к глубоко расположенным инфекциям относятся остеомиелит и эндокардит.

Пример грибов, которые вызывают заболевания, которые возможно лечить способом согласно настоящему изобретению, включает, не ограничиваясь, плесенные грибки, дрожжевые грибки и высшие грибы. Все грибы являются эукариотами и содержат в клеточных мембранах стерины, но не пептидогликан. Грибковые инфекции, или микозы, классифицируются по глубине их проникновения в пораженные ткани носителя и способу проникновения. У носителя с пониженным иммунитетом множество непатогенных грибков, или грибки, которые обычно неагрессивны, могут вызвать инфекционные заболевания, которые потенциально могут привести к летальному исходу.

Паразиты - это организмы, которые получают питание и защиту от других живых организмов (известных как носители). Они могут передаваться от животных людям, от людей людям или от людей животным. Некоторые паразиты вызывают заболевания, передающиеся через пищу и воду. Они могут передаваться от носителя к носителю через зараженную еду и воду или путем заглатывания вещества, контактировавшего с экскрементами (фекалиями) зараженного человека или животного. Паразиты живут и размножаются в тканях и органах зараженного человека или животного-носителя и часто выделяются с фекалиями. Существуют различные типы паразитов, в зависимости от размера, начиная с очень маленьких, одноклеточных, микроскопических организмов (простейших), заканчивая большими, многоклеточными червями (гельминтами), которых можно увидеть без микроскопа. Примеры обычных паразитов, вызывающих заболевания, лечение которых может осуществляться способом согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь, Giardia duodenalis, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis и Toxoplasma gondii.

У вирусов, в отличие от грибов и бактерий, отсутствуют многие отличительные черты свободно живущих клеток. Отдельная вирусная частица представляет собой статическую структуру, довольно стабильную и неспособную менять или заменять свои части. Только будучи связанным с клеткой, вирус приобретает способность размножаться и приобретать некоторые отличительные черты систем живых клеток. Вирусы вызывают большое количество заболеваний, включая такие инфекционные заболевания верхних дыхательных путей, как обычная простуда и фарингит (ангина). Другие примеры вирусных заболеваний, которые возможно лечить способом согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь, заболевания, вызванные вирусами, связанными со СПИД, птичьим гриппом, ветряной оспой, простым герпесом, простудными заболеваниями, гастроэнтеритом (особенно у детей), инфекционным мононуклеозом, гриппом, корью, свинкой, фарингитом, пневмонией, краснухой, атипичной пневмонией и инфекцией нижних дыхательных путей (например, респираторно-синцитиальным вирусом или RSV)).

В настоящей заявке авторами изобретения было показано, что пептиды, содержащие аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или SEQ ID NO 1, 3-16, 18-60, или ее аналог, производную или вариант, или ее очевидный химический эквивалент, обладают эффективностью при профилактике и/или лечении инфекции. Соответственно, настоящий способ лечения и/или профилактики инфекции у субъекта содержит этап, на котором субъекту вводят пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или SEQ ID NO 1, 3-16, 18-60, или ее аналог, производную или вариант, или ее очевидный химический эквивалент. Именно в рамках объема настоящего изобретения пептид согласно изобретению может быть соединен с другим агентом или введен в сочетании с другим агентом, таким как антибиотик (например, пенициллин, метициллин или ванкомицин) с целью повышения эффективности лечения и/или профилактики инфекции, и/или повышения эффективности определения направления необходимого терапевтического воздействия.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения пептид согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или SEQ ID NO 1, 3-16, 18-60 или ее аналог, производную или вариант, или ее очевидный химический эквивалент. В другом варианте выполнения изобретения пептид согласно изобретению модулирует врожденный иммунитет субъекта, посредством чего осуществляют лечение и/или профилактику инфекции у субъекта. Врожденный иммунный ответ является первым ответом на воздействие патогенного фактора. Он содержит множество механизмов, предназначенных для предотвращения развития инфекционного заболевания. Один из таких механизмов включает в себя активацию и усиление клеток-иммунных эффекторов.

В одном варианте выполнения изобретения пептиды согласно изобретению обладают возможностью усиления врожденного иммунитета или врожденного иммунного ответа, одновременно ограничивая процесс воспаления.

В другом варианте выполнения изобретения показано, что пептиды согласно изобретению являются модуляторами активности дипептидилпептидазы IV (DPPIV). Показано, что они снижают активность DPPIV. Благодаря этому они могут быть полезными при определении субъектов, у которых введение пептидов может оказать положительное воздействие при лечении определенного иммунологического состояния; при этом берут пробу у субъекта, который предположительно или фактически находится в состоянии, связанном с DPPIV, выполняют инкубацию пробы вместе с пептидом и субстратом DPPIV и затем определяют эффект пептида на активность DPPIV по сравнению с контролем, причем снижение активности указывает на потенциальный положительный эффект введения пептида субъекту с целью лечения состояния, связанного с DPPIV. В другом варианте выполнения изобретения модуляция активности DPPIV в присутствии пептида по сравнению с контролем может указывать на наличие состояния, связанного с DPPIV. В данном варианте выполнения изобретения пептиды могут быть использованы при диагностике состояний, связанных с DPPIV. В другом аспекте пептиды согласно изобретению могут быть полезными при лечении определенного числа иммунопатологических заболеваний, таких как заболевания, связанные с DPPIV, например: ВИЧ/СПИД, базедова болезнь, рак (например, рак легкого или толстой кишки), диабет, а также аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит или рассеянный склероз.

Способы введения

Согласно способу в соответствии с настоящим изобретением, пептид согласно настоящему изобретению, описанный в настоящей заявке, может быть непосредственно введен субъекту в количестве, достаточно эффективном для лечения и/или профилактики инфекции у субъекта и/или для лечения или профилактики состояния, связанного с DPPIV, например, в терапевтически эффективном количестве. Также пептид, описанный в настоящей заявке, может быть опосредованно введен субъекту путем введения субъекту последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, с обеспечением возможности экспрессии пептида у субъекта и в количестве, достаточно эффективном для лечения и/или профилактики инфекции.

Далее, пептид согласно настоящему изобретению или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, могут быть введены субъекту в количестве, достаточном для эффективного лечения инфекции у субъекта. В контексте настоящей заявки понятие «достаточно эффективное для лечения инфекции» означает количество, достаточно эффективное для компенсации или сведения к минимуму ухудшения клинической картины или симптомов, вызванных инфекцией (бактерией, грибком, паразитом, вирусом и т.д.). Например, в случае, если субъект подвержен инфекции, вызванной микробом, количество пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид), которое достаточно эффективно для лечения инфекции, вызванной микробом, является тем количеством, которое достаточно для компенсации или сведения к минимуму симптомов инфекции, вызванной микробом, включая, но не ограничиваясь, головную боль, ригидность затылочных мышц, анорексию, тошноту, рвоту, диарею, неприятные ощущения в области брюшной полости, острую почечную недостаточность, изменяющиеся проявления ишемического поражения множества органов, лихорадку и тромбоцитопению. Количество пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид), достаточно эффективное для лечения инфекции у субъекта, будет различным в зависимости от определенных факторов в каждом случае, включая массу тела субъекта и степень тяжести его состояния. Надлежащее количество пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид) может быть без труда определено специалистом в данной области. Количество, достаточно эффективное для лечения состояния, связанного с DPPIV, может также быть различным в зависимости от определенного числа подобных факторов, известных специалисту в данной области.

Таким же образом, в соответствии со способом согласно настоящему изобретению пептид согласно настоящему изобретению или нуклеиновая кислота, кодирующая пептид, также могут быть введены субъекту, подверженному риску развития инфекции, в количестве, достаточно эффективном для профилактики инфекции у субъекта. В контексте настоящей заявки понятие «достаточно эффективное для профилактики инфекции» включает в себя количество, достаточно эффективное для предотвращения развития или проявления ухудшения клинической картины или симптомов, вызванных инфекцией (вызванной бактерией, грибком, паразитом, вирусом и т.д.). Количество пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид), достаточно эффективное для профилактики инфекции у субъекта, будет различным в зависимости от конкретных факторов в каждом случае, включая пол субъекта, массу тела и степень тяжести состояния субъекта, природу состояния, расположение очага инфекции и режим введения. Надлежащее количество пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид) может быть без труда определено специалистом в данной области.

Пептид согласно настоящему изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, как описано в настоящей заявке, могут быть введены субъекту человеку или животному - посредством известных процедур, включая, но не ограничиваясь, пероральное введение, парентеральное введение (например, эпифасциальное, интракапсулярное, внутрикожное, интрадермальное, внутримышечное, интраорбитальное, внутрибрюшинное, интраспинальное, интраваскулярное, внутривенное, паренхиматозное или подкожное введение), трансдермальное введение, интраназальное введение, внутрилегочное введение (например, интратрахеальное введение), и введение посредством осмотического насоса. В одном варианте выполнения изобретения способ введения представляет собой парентеральное введение, путем внутривенной или подкожной инъекции.

Для перорального введения лекарственная форма пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид) может быть представлена в виде капсул, таблеток, порошков, гранул, или в виде суспензии или жидкости. Лекарственная форма может включать различные добавки, такие как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал. Также в лекарственную форму могут быть включены связующие вещества, такие как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатины. В качестве дополнения в состав лекарственной формы могут быть включены дезинтеграторы, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или натриевая карбоксиметилцеллюлоза. Лекарственная форма может дополнительно быть представлена с содержанием двухосновного фосфата кальция безводного или гликолата натриевого крахмала. Наконец, лекарственная форма может быть представлена с содержанием смазывающих веществ, таких как тальк или стеарат магния.

Для парентерального введения пептид (или нуклеиновая кислота, кодирующая пептид) могут быть выполнены в сочетании со стерильным водным раствором, который в предпочтительном варианте выполнения изобретения изотоничен с кровью субъекта. Такая лекарственная форма может быть приготовлена путем растворения твердого активного ингредиента в воде, содержащей физиологически совместимые вещества, такие как хлорид натрия, глицин и тому подобные, и имеющей буферный уровень рН, совместимый с физиологическими условиями, таким образом, чтобы сначала приготовить водный раствор, а затем стерилизовать его. Данная лекарственная форма может быть представлена в упаковках на одну или несколько доз, таких, как герметичные ампулы или флаконы. Также лекарственная форма может быть введена посредством любого типа инъекции, включая любой тип из описанных в настоящей заявке.

Для трансдермального введения пептид (или нуклеиновая кислота, кодирующая пептид) может быть представлен в сочетании с веществами, способствующими впитыванию через кожу, такими как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, изопропанол, этанол, олеиновая кислота, N-метилпирролидон и им подобные, которые повышают проницаемость кожи по отношению к пептиду или нуклеиновой кислоте и позволяют пептиду или нуклеиновой кислоте проникать через кожу в систему кровообращения. Сочетание веществ, повышающих проницаемость кожи, и пептида или нуклеиновой кислоты может также дополнительно сочетаться с полимерным веществом, таким как этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, этилен/винилацетат, поливинилпирролидон и им подобные, для создания композиции в форме геля, который может быть растворен растворителем, таким как метиленхлорид, подвержен испарению до достижения желаемой вязкости, после чего нанесен на материал-подложку с целью создания пластыря. Пептид или нуклеиновая кислота могут быть трансдермально введены в то место или около того места, где может находиться очаг инфекции у субъекта. В качестве альтернативы, пептид или нуклеиновая кислота могут быть трансдермально введены на другом участке тела, отличном от очага поражения, для обеспечения системного введения.

Для интраназального введения (например, в виде назальных спреев) и/или внутрилегочного введения (введения путем ингаляции) лекарственные формы пептида или нуклеиновой кислоты, в том числе аэрозольные лекарственные формы, могут быть приготовлены в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам в данной области. Аэрозольные лекарственные формы могут включать в себя твердые частицы или растворы (водные или безводные). Для получения аэрозолей из растворов (например, приготовленных с использованием растворителя, такого как этанол) могут быть использованы распылители (например, струйные распылители, ультразвуковые распылители) и пульверизаторы; для создания аэрозолей с мелкими частицами могут быть использованы устройства дозированной ингаляции и ингаляторы с сухим порошком. Частицы аэрозоля желаемого размера можно получить путем использования любого из многочисленных способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь, размол на струйной мельнице, сушку распылением и конденсацию в точке превращения.

Фармацевтические композиции для интраназального введения могут быть выполнены в виде твердых лекарственных форм (например, крупного порошка) и могут содержать наполнитель (например, лактозу). Твердые лекарственные формы могут быть введены из контейнера с порошком, прижатого вплотную к носу, путем быстрого вдыхания через носовые ходы. Композиции для интраназального введения могут также содержать водные или масляные растворы назального спрея или капель в нос. Для применения с распылителем лекарственная форма пептида или нуклеиновой кислоты может содержать водный раствор и дополнительные агенты, включая, например, наполнитель, буферный раствор, изотонический агент, консервант или сурфактант. Выработка назального спрея может быть произведена, например, путем пропуска суспензии или раствора пептида или нуклеиновой кислоты под давлением через выпускное отверстие.

Лекарственные формы пептида или нуклеиновой кислоты для внутрилегочного введения могут быть представлены в виде, подходящем для введения посредством ингаляционного устройства, и могут обладать размером частиц, оптимальным для эффективного проникновения в нижние дыхательные пути легких или в пазухи. Для обеспечения возможности всасывания через поверхности слизистой оболочки, включая слизистую оболочку легких, лекарственная форма согласно настоящему изобретению может содержать эмульсию, включающую в себя, например, биоактивный пептид, множество субмикронных частиц, мукоадгезивную макромолекулу и/или диспергирующее вещество на водной основе. Всасывание через поверхности слизистой оболочки может осуществляться путем мукоадгезии частиц эмульсии.

Фармацевтические композиции, предназначенные для применения с устройством дозированной ингаляции, могут содержать тонкоизмельченный порошок, включающий в себя пептид или нуклеиновую кислоту, в виде суспензии в безводной среде. Например, пептид или нуклеиновая кислота могут быть суспендированы в пропелленте при помощи сурфактанта (например, сорбитан триолеата, соевого лецитина или олеиновой кислоты). В устройствах дозированной ингаляции обычно используется газ-пропеллент (например, хлорофлюорокарбон, гидрохлорофлюорокарбон или гидрокарбон), содержащийся в контейнере (например, в баллоне) в виде смеси (например, в виде сжиженного, сжатого газа). Использование ингаляторов подразумевает их приведение в действие при вдыхании. Например, путем приведения в действие дозирующего клапана можно выпустить смесь в виде аэрозоля. Ингаляторы с сухим порошком приводятся в действие вдыханием порошковой смеси.

Пептид или нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению также могут быть выпущены или введены посредством осмотического мини-насоса или другого выпускного устройства с временным регулированием. Скорость выпуска из простого осмотического мини-насоса можно модулировать посредством микропористого быстрореагирующего геля, находящегося в выпускном отверстии. Осмотический мини-насос может быть полезен для управления выпуском или направленного введения пептида или нуклеиновой кислоты.

В соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, пептид согласно изобретению может быть введен субъекту как таковой или в составе нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид с возможностью экспрессии указанного пептида. Соответственно, в одном варианте выполнения изобретения предоставляется возможность лечения или профилактики инфекции у субъекта путем введения субъекту некоторого количества пептида согласно изобретению. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предоставляется возможность лечения или профилактики инфекции у субъекта путем введения субъекту последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно изобретению с возможностью экспрессии пептида у субъекта.

Пептиды согласно настоящему изобретению могут быть введены субъекту посредством известных процедур, используемых для введения протеинов и других препаратов, например, посредством инъекции и трансфузии. В случае, если очаг инфекции находится в конкретной части тела субъекта, может быть желательным введение препарата непосредственно в эту область путем инъекции или каким-либо другим образом (например, путем введения пептида в кровь или какую-либо другую физиологическую жидкость). Количество пептида, которое следует применить, представляет собой количество, достаточное для эффективного лечения и/или профилактики инфекции у субъекта, как указано выше, и может быть без труда определено специалистом в данной области.

В соответствии со способом согласно настоящему изобретению пептид также может быть введен субъекту путем внесения в достаточное число клеток субъекта нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид с обеспечением возможности экспрессии пептида. Количество нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтически применяемый пептид, представляет собой то количество, которое обеспечит выработку пептида в количестве, достаточно эффективном для лечения и/или профилактики инфекции у субъекта, как указано выше. Это количество может быть без труда определено специалистом в данной области.

Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид согласно настоящему изобретению, может быть введена субъекту путем обычных процедур, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь, электропорацию, трансфекцию с DEAE-декстраном (диэтиламиноэтил-декстраном); трансфекцию с фосфатом кальция; липофекцию; монокатионное слияние с липосомой; поликатионное слияние с липосомой; слияние с протопластом; создание электрического поля in vivo; бомбардировку микрочастицами, покрытыми ДНК; инъекцию рекомбинантных вирусов с дефективной репликацией; гомологическую рекомбинацию; генную терапию in vivo; генную терапию ex vivo; вирусные векторы; перенос «голой» ДНК, или любое сочетание вышеперечисленных процедур. В число рекомбинантных вирусных векторов, подходящих для генной терапии, входят, не ограничиваясь, векторы, являющиеся производными геномов вирусов, такие, как ретровирус, HSV, аденовирус, аденосателлитный вирус, вирус Semiliki Forest, цитомегаловирус и вирус вакцины.

В рамках объема настоящего изобретения также предусматривается возможность введения нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно изобретению, в подходящие клетки in vitro путем обычных процедур с целью достижения экспрессии терапевтически применяемого пептида в клетках. Клетки, в которых происходит экспрессия пептида, могут затем быть введены субъекту с целью лечения и/или профилактики инфекции in vivo. При такой схеме генной терапии ех vivo в предпочтительном варианте выполнения изобретения клетки забирают у субъекта, проводят с ними процедуры с использованием технологий ДНК, направленные на присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтически применяемый пептид, и затем клетки обратно вводят субъекту.

Также в рамках объема настоящего изобретения дополнительно предусмотрено объединение лекарственной формы, содержащей пептид согласно изобретению или нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или наполнителем, в результате чего образуется фармацевтическая композиция. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, а также примеры носителей, растворителей и наполнителей описаны выше.

Лекарственные формы согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены способами, хорошо известными в области фармацевтики. Например, пептид согласно настоящему изобретению или нуклеиновая кислота, кодирующая пептид, могут быть объединены с носителем, растворителем или наполнителем в виде суспензии или раствора. В качестве альтернативы можно добавить также один или более вспомогательных компонентов (например, буферные растворы, ароматизаторы, поверхностно-активные вещества и тому подобное). Выбор носителя зависит от пути введения. Фармацевтическая композиция может быть полезна для введения пептида согласно настоящему изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, субъекту с целью лечения и/или профилактики инфекции. Пептид или нуклеиновую кислоту применяют в количестве, достаточно эффективном для лечения и/или профилактики инфекции у субъекта, которому вводят фармацевтическую композицию. Это количество может быть без труда определено специалистом в данной области, как описано выше.

Диагностика и контрольные анализы

В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ диагностирования субъекта с подозрением на состояние, связанное с врожденным иммунитетом или состояние, связанное с DPPIV, для прогнозирования потенциальной эффективности лечения пептидом согласно настоящему изобретению, таким как пептиды, перечисленные в Таблице 1, или его аналогом, производной или вариантом, и для определения наличия агентов, способных модулировать (например, усилить, ингибировать или воспроизвести) иммунологический эффект пептидов согласно настоящему изобретению. В другом варианте выполнения изобретения предусмотрены способы определения иммунологически активных аналогов, производных и вариантов пептидов согласно изобретению или тех, что перечислены в Таблице 1, или их иммунологически активных модификаций.

В одном варианте выполнения изобретения способ прогнозирования эффективности лечения пациента с иммунопатологическим заболеванием, таким как состояние, связанное с врожденным иммунитетом, пептидом согласно настоящему изобретению включает в себя этапы, на которых получают у субъекта биологическую пробу, вводят пептид согласно изобретению в указанную пробу и отслеживают значения уровня заранее определенного маркера, который указывает на состояние, такого как DPPIV в случае состояния, связанного с DPPIV или биомаркер воспаления в случае инфекции, а также жизнеспособность клеток или бактериальную нагрузку, по сравнению с положительным и/или отрицательным контролем. В качестве положительного контроля может быть использована проба, взятая у субъекта, для которого известно наличие иммунологического состояния. В качестве отрицательного контроля может быть использована проба, взятая у диагностируемого субъекта, в которую не вводят пептид. Если пептид модулирует активность, уровень маркера или жизнеспособность клеток по сравнению с контролем, можно предположить наличие у субъекта такого иммунопатологического заболевания и потенциальный положительный эффект лечения пептидом.

В более частном случае, согласно одному аспекту изобретения если у субъекта подтверждено или предполагается наличие состояния, связанного с DPPIV, то может быть целесообразным отслеживание активности DPPIV в качестве маркера состояния. В одном аспекте снижение активности DPPIV по сравнению с контролем может указывать на то, что лечение субъекта пептидом может быть эффективным. В качестве альтернативы, если субъект является носителем инфекции или имеется подозрение на ее наличие у субъекта, то у пациента берут пробу и отслеживают показатели патогенной нагрузки или жизнеспособности клеток для данной пробы по сравнению с пробой, взятой у пациента после введения пептида, причем уменьшение патогенной нагрузки и повышение жизнеспособности клеток у пациента после введения пептида указывают на то, что лечение субъекта пептидом может вызвать положительный эффект, или на наличие у субъекта иммунопатологического заболевания.

В другом варианте выполнения изобретения, если необходимо определить, будет ли пептид или модификация пептида согласно Таблице 1 или другой агент обладать такой же иммунологической активностью, что и пептид согласно изобретению, предоставляется возможность отслеживать эффект пептида на активность DPPIV по сравнению с контрольным пептидом, модулирующий эффект которого известен, посредством пробы (взятой или у мыши, зараженной каким-либо агентом или у субъекта, для которого установлено наличие состояния, связанного с DPPIV), или отслеживать профилактический эффект путем введения пептида или агента в пробу, вызывания указанной инфекции или состояния, связанного с DPPIV, в указанной пробе и последующего отслеживания того, модулировал или ингибировал ли пептид развитие указанной инфекции или состояния, связанного с DPPIV, или иммунную реакцию. Указанная проба может представлять собой экспериментальную модель на животном, причем индуцирование состояния или инфекции осуществляют в принятой экспериментальной модели на животном в соответствии с этическими нормами, а затем животное или соответствующую биологическую пробу, взятую у животного, контролируют с целью определения эффекта пептида.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ прогнозирования эффективности лечения субъекта по поводу микробной инфекции; при этом лечение содержит этапы, на которых субъекту вводят пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно Таблице 1 или ее аналог, производную или вариант. Способ включает в себя этап, на котором выполняют анализ диагностической пробы, взятой у субъекта, с целью определения одного или более биомаркеров (таких как биомаркер воспаления); при этом наличие, по меньшей мере, одного биомаркера (такого как биомаркер воспаления) указывает на то, что лечение субъекта может быть эффективным.

В контексте настоящей заявки понятие «биомаркер» или «маркер» означает любой подходящий биомаркер, для которого известно или определено, что он имеет отношение к состоянию (например, состоянию, связанному с иммунитетом; инфекции; состоянию, связанному с воспалением; состоянию, связанному с DPPIV; состоянию, связанному с врожденным иммунитетом) и включает в себя какую-либо молекулу, являющуюся производной гена (например, транскриптом гена), смысловую (кодирующую) или антисмысловую (не кодирующую) последовательность зонда, являющуюся производной гена, или продукт трансляции гена, представляющий собой часть общей длины или полную общую длину, или антитело к ним, которые могут быть использованы для отслеживания состояния, заболевания или болезни, связанных с иммунным ответом, врожденным иммунным ответом, воспалением, и/или состоянием, связанным с DPPIV.

В соответствии со способом согласно настоящему изобретению анализ диагностической пробы у субъекта может производиться in vitro или in vivo. Если анализ производят in vitro, то диагностическая проба может быть взята у субъекта посредством стандартных процедур. Диагностическая проба может представлять собой ткань, включая какую-либо мышечную ткань, кожную ткань или мягкую ткань, которая может быть извлечена путем стандартной биопсии. В качестве дополнения, диагностическая проба может представлять собой какую-либо физиологическую жидкость, включая кровь, слюну, сыворотку или мочу. Для субъекта или пациента может быть установлен факт наличия микробной инфекции или другого иммунопатологического заболевания, такого как состояние, связанное с DPPIV, либо может иметься подозрение на наличие микробной инфекции или другого иммунологического состояния, такого как состояние, связанное с врожденным иммунитетом или состояние, связанное с DPPIV, либо может предполагаться отсутствие у субъекта микробной инфекции или другого иммунологического состояния, такого как состояние, связанное с врожденным иммунитетом или состояние, связанное с DPPIV.

Согласно способу в соответствии с настоящим изобретением диагностическая проба, взятая у субъекта, может быть подвергнута анализу с целью определения экспрессии одного или более желаемых маркеров. В контексте настоящей заявки понятие «экспрессия» означает транскрипцию гена маркера воспаления по меньшей мере в один транскрипт мРНК или трансляцию по меньшей мере одной мРНК в протеин-маркер. Соответственно, диагностическая проба может быть подвергнута анализу с целью определения экспрессии маркеров путем проведения анализа на протеин-маркер, кДНК-маркер или мРНК-маркер. Подходящая форма маркера может быть определена на основании конкретных методик, описанных в настоящей заявке.

Протеин, уровень которого необходимо определить путем анализа, может быть извлечен из диагностической пробы субъекта или пациента путем изоляции и очистки с применением стандартных способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь, экстракцию из ткани (например, с использованием детергента, который делает протеин растворимым) по необходимости, после которой следует аффинная очистка на колонке, хроматография (например, ЖХБР и ВЭЖХ), иммунопреципитация (например, с использованием изопропанола и реагента, такого как Тризол). За изоляцией и очисткой протеина может следовать электрофорез (например, на SDS-полиакриламидном геле). Представляется, что может быть произведен анализ диагностической пробы с целью определения экспрессии любых или всех форм протеина-маркера (включая прекурсор, формы, подверженные эндопротеолитическому процессингу, а также другие формы, представляющие собой результат посттрансляционной модификации). Нуклеиновая кислота может быть выделена из диагностической пробы посредством стандартных методик, известных специалисту в данной области.

В соответствии со способом согласно настоящему изобретению диагностическая проба, взятая у субъекта, может быть подвергнута анализу на экспрессию маркера, и экспрессия маркера может быть выявлена в диагностической пробе с использованием анализов и способов обнаружения, которые может без труда подобрать специалист в данной области (например, иммунологические методики, анализ гибридизации, методики флюоресцентного изображения и/или обнаружения радиоактивного излучения), а также любые анализы и способы обнаружения, описанные в настоящей заявке (например, иммунопреципитация, вестерн-блоттинг, и так далее). Например, диагностическая проба, взятая у субъекта, может быть подвергнута анализу с целью определения экспрессии маркера с применением агента, обладающего реакционной способностью по отношению к маркеру воспаления. Понятие «обладающий реакционной способностью» в контексте настоящей заявки означает, что агент обладает сродством, способностью связываться с маркером или направлен против маркера. Понятие «агент» в контексте настоящей заявки далее будет включать в себя протеин, полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (включая ДНК или РНК), антитело, Fab-фрагмент, F(ab )₂-фрагмент, молекулу, соединение, антибиотик, препарат и любую(ые) их комбинацию(и). В предпочтительном варианте выполнения изобретения агент согласно настоящему изобретению помечают обнаружимым маркером или меткой в соответствии с методиками, описанными в настоящей заявке. В одном варианте выполнения настоящего изобретения агент обладает реакционной способностью по отношению к маркеру, который является антителом.

В случае, если агент согласно настоящему изобретению является антителом, которое обладает реакционной способностью по отношению к желаемому маркеру, диагностическая проба, взятая у субъекта, может быть очищена путем пропускания через колонку для аффинной хроматографии, содержащую антитело к маркеру, прикрепленное в качестве лиганда к твердой основе (например, к нерастворимому органическому полимеру в форме шарика, геля или пластины). Антитело, прикрепленное к твердой основе, можно использовать в форме столбика. Перечень примеров подходящих твердых основ включает в себя, не ограничиваясь, агарозу, целлюлозу, декстран, полиакриламид, полистирол, сефарозу и другие нерастворимые органические полимеры. Антитело к маркеру может быть, если это желательно, дополнительно прикреплено к твердой основе посредством молекулы-спейсера. Надлежащие условия связывания (например, температура, уровень рН и концентрация соли) для обеспечения связывания агента и антитела могут быть без труда определены специалистом в данной области. В предпочтительном варианте выполнения изобретения антитело к маркеру прикрепляют к столбику из сефарозы, такой как Сефароза 4В.

В качестве дополнения, в случае, если агент является антителом, диагностическая проба, взятая у субъекта, может быть подвергнута анализу с целью определения экспрессии иммунологического маркера путем исследований связывания, в которых используют одно или более антител, иммунореактивных с маркером, а также обычные иммунологические методики обнаружения. Например, протеин-маркер, элюированный из колонки для аффинной хроматографии, может быть подвергнут твердофазному иммуноферментному анализу (ELISA), вестерн-блоттингу, проточной цитометрии или проанализирован согласно любому другому способу окраски с использованием иммунной метки, в котором используется взаимодействие между антигеном и антителом. В предпочтительном варианте выполнения изобретения диагностическую пробу анализируют с целью определения экспрессии маркера путем вестерн-блоттинга.

В качестве альтернативы, анализ диагностической пробы, взятой у субъекта, с целью определения экспрессии маркера может быть выполнен с применением гибридизационного анализа нуклеиновой кислоты, извлеченной из диагностической пробы, взятой у субъекта. В соответствии с данным способом согласно настоящему изобретению гибридизационный анализ может быть выполнен с использованием нозерн-блоттинга мРНК. Анализ согласно этому способу может также быть выполнен с использованием сазерн-блоттинга ДНК с применением одного или более зондов нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой, кодирующей маркер. Зонды нуклеиновых кислот могут быть приготовлены путем разнообразных методик, известных специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь, следующие методики; расщепление нуклеиновой кислоты-маркера рестрикционным ферментом; и автоматизированный синтез олигонуклеотидов, обладающих последовательностями, которые соответствуют выбранным участкам нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-маркера с использованием серийно выпускаемых синтезаторов олигонуклеотидов, таких как синтезатор ДНК/РНК Applied Biosystems Model 392.

Зондами нуклеиновых кислот, используемыми в настоящем изобретении, могут быть ДНК- или РНК-зонды, которые могут иметь различную длину, от порядка 8 нуклеотид и до полной длины нуклеиновой кислоты, являющейся маркером воспаления. В качестве дополнения, зонды нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут быть помечены одним или более обнаружимыми маркерами или метками. Нанесение меток на зонды нуклеиновых кислот может быть произведено путем одного из многочисленных способов, известных в данной области, включая любой способ из описанных в настоящей заявке. Сочетания из двух или более зондов нуклеиновых кислот (или праймеров), соответствующих различным или частично совпадающим участкам нуклеиновой кислоты-маркера, также могут быть использованы для анализа диагностической пробы с целью определения экспрессии маркера, с использованием, например, ПЦР или ОТ-ПЦР.

После определения экспрессии маркера в соответствии со способом согласно настоящему изобретению может быть выполнен анализ с целью измерения или определения количественного показателя уровня экспрессии маркера в диагностической пробе, взятой у субъекта. Такие анализы хорошо известны специалисту в данной области, и в их число может входить иммуногистохимический/иммуноцитохимический анализ, проточная цитометрия, масс-спектроскопия, вестерн-блоттинг или иммуноферментный твердофазный анализ с целью измерения количества протеина-маркера. Например, при использовании иммуногистохимического анализа гистологические (залитые в парафин) срезы ткани могут быть помещены на предметные стекла, а затем подвергнуты инкубации с антителом против маркера. Затем предметные стекла могут быть подвергнуты инкубации со вторым антителом (против первичного антитела), которое отмечено красителем или другой калориметрической системой (например, флуорохромом, радиоактивным агентом или агентом, наиболее заметным при электронной микроскопии), с целью обеспечения визуализации маркера, имеющегося на срезах.

Настоящее изобретение описано на следующих примерах, которые представлены для облегчения понимания изобретения и не должны рассматриваться как каким-либо образом налагающие ограничения на объем изобретения, определяемый формулой изобретения, которая приведена ниже.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 - СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ

Пептиды согласно Таблице 1 были синтезированы с применением методики синтеза пептидов в твердой фазе.

Все необходимые Fmoc-защищенные аминокислоты взвешивали при трехкратном молярном избытке в расчете на 1 ммоль желаемого пептида. Затем аминокислоты растворяли в диметилформамиде (DMF) (7.5 мл) для получения 3 ммоль раствора. Надлежащее количество смолы Rink amide MBHA взвешивали, принимая во внимание замещение смолы. Затем смолу перемещали в автоматизированный реакционный сосуд для синтеза и предварительно пропитывали дихлорметаном (DCM) в течение 15 минут.

Защиту смолы устраняли путем добавления 25% пиперидина в DMF (30 мл) в смолу и смешивания в течение 20 минут. После удаления защиты смолы производили первое связывание путем смешивания 3 ммоль раствора аминокислоты и 4 ммоль 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата (HBTU) и 8 ммоль N,N-диизопропилэтиламина (DIEPA). Раствор предварительно активировался в течение 5 минут, после чего его добавляли в смолу. Аминокислоте позволяли связываться в течение 4 5 минут.

После связывания смолу тщательно промывали DMF и диэтилацетамидом (DMA). У присоединенной Fmoc-защищенной аминокислоты удаляли защиту тем же путем, что описан выше, и присоединяли следующую аминокислоту с помощью той же методики связывания АА:HBTU:DIEPA.

После окончания синтеза пептид отделяли от смолы посредством смеси растворителя, содержащей 97.5% трифторуксусной кислоты (TFA) и 2.5% воды. Смолу оставляли плавать в смеси растворителя на протяжении 1 ½ часов. Затем раствор фильтровали посредством гравитации с применением бюхнеровской воронки и собирали фильтрат в 50-мл пробирку для центрифугирования. Пептид изолировали путем преципитации охлажденным диэтиловым эфиром. После центрифугирования и слива диэтилового эфира неочищенный пептид вновь промывали диэтиловым эфиром, после чего сушили в вакуумном эксикаторе в течение 2 часов. Затем пептид растворяли в деионизированной воде (10 мл) замораживали при -80°С и лиофилизировали. После этого сухой пептид был готов к очистке с помощью ВЭЖХ.

Изоляция пептида диэтиловым эфиром не происходила вследствие гидрофильной природы таких пептидов. Поэтому была необходима экстракция хлороформом. TFA испаряли, и полученный пептидный остаток растворяли в 10% уксусной кислоте (15 мл). Примеси и очистители удаляли из раствора пептида в уксусной кислоте путем двукратного промывания раствора хлороформом (30 мл). Затем водный раствор пептида замораживали при -80°С и лиофилизировали, в результате чего получали пептид в виде порошка, готового к очистке с помощью ВЭЖХ.

Пептиды с последовательностью SEQ ID NO 33 и 34 содержали одну N-концевую аминокислоту, имевшую в своем составе метильную группу. В этом случае связывание выполняли путем объединения N-концевой аминокислоты, имевшей в своем составе метильную группу, PyBroP и растворов М-гидроксибензотриазол*H ₂O(HOBt) и DIEPA в реакционном сосуде, содержащем смолу. После 45 минут связывания N-концевую аминокислоту, имеющую в своем составе метильную группу, подвергали двойному связыванию с целью обеспечения полного связывания. Было установлено, что связывание после N-концевой аминокислоты, имеющей в своем составе метильную группу, не было совершенно полным. Поэтому в этом случае связывание выполняли с применением N,N,N',N'-тетраметил-O-(7-азабензотриазол-1-ил)урония гексафторфосфата (HATU) вместо HBTU. В результате этого также получался неочищенный пептид, который обычно содержал две примеси, составляющие в общей сложности 30-40% от общего объема. Пептид очищали в измененных условиях ВЭЖХ с целью изоляции пика чистого пептида от примесей, имеющих близкие значения при элюировании.

ПРИМЕР 2 - НЕАНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ

Бактерии (S.aureus 25923) посеяли в лунки, содержащие пептид (200 мкМ), среду (Tris) или антибиотик (эритромицин, 12 мкг/мл). Бактериям позволяли расти в течение 2 часов. Затем определяли жизнеспособность бактерий посредством колориметрического анализа жизнеспособности WST-1 (номер по каталогу 1644807; Roche Diagnostics). В качестве фонового контроля использовали DMEM и DMEM+WST-1. Как показано на Фиг.1А и 1В, пептид с последовательностями SEQ ID NO 5 и 47 показали заметно невысокую активность по сравнению с контрольным антибиотиком.

ПРИМЕР 3 - ЗАЩИТА IN VIVO

Мышей инфицировали S.aureus 25923 посредством внутрибрюшинной инъекции. Спустя четыре часа пептид с последовательностями SEQ ID NO 1, 4, 5, 6, 45 и 47 вводили в дозировках 12 мг/кг и 24 мг/кг для SEQ ID NO 1 (Фиг.2А и 2В), 9.6 мг/кг для SEQ ID NO 5 (Фиг.2С), 13 мг/кг для SEQ ID NO 47 (Фиг.2D), 12 мг/кг для SEQ ID NO 4 (Фиг.2Е), 9 мг/кг для SEQ ID NO 6 (Фиг.2F), и 13 мг/кг для SEQ ID NO 45 (Фиг.2G) посредством внутрибрюшинной инъекции. Через двадцать четыре часа после инфицирования выжившие животные были забиты, и перитонеальную жидкость нанесли на планшеты с целью определения остаточного количества бактерий (число колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл)) в присутствии терапевтически применяемого пептида и при его отсутствии.

В ходе исследования из всех животных самое большое количество бактерий было установлено у умерших животных. Пептид с последовательностями SEQ ID NO 1, 4, 5, 6, 45 и 47 отчетливо показал защитные свойства по сравнению с контролем, как показано на Фиг.2А-G.

ПРИМЕР 4 - ЗАЩИТА ПРИ ПРОФИЛАКТИКЕ IN VIVO

За двадцать четыре часа до инфицирования вводили пептид в дозе 12 мг/кг (SEQ ID NO 1, Фиг.3А) и 11.5 мг/кг (SEQ ID NO 5, Фиг.3В) посредством внутрибрюшинной инъекции. Затем мышей инфицировали S. aureus 25923 посредством внутрибрюшинной инъекции. Через двадцать четыре часа после инфицирования выжившие животные были забиты, и перитонеальную жидкость нанесли на планшеты с целью определения остаточного количества бактерий (число колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл)) в присутствии терапевтически применяемого пептида и при его отсутствии.

В ходе исследования из всех животных самое большое количество бактерий было установлено у умерших животных. Пептид с последовательностями SEQ ID NO 1 и 5 отчетливо показал защитные свойства (0 умерших мышей (применение пептида) против 2 умерших мышей (контроль)). См. Фиг.3А и В.

Ниже приведен комментарий к результатам, полученным авторами изобретения в экспериментах, связанных с Примерами 1-4:

Авторы изобретения показали, что пептид, обладающий аминокислотной последовательностью из числа показанных в Таблице 1, или описанный в настоящей заявке в качестве части изобретения обладает способностью усиливать врожденный иммунитет. В частности, пептиды с последовательностями SEQ ID NO 1, 4, 5, 6, 45 и 47 обладали способностью предотвращать инфекцию и защищать против нее, как показано на моделях in vivo (Фиг.2 и Пример 3, Фиг.3 и Пример 4). Однако пептид с последовательностями SEQ ID NO 5 и 47 не обладал антимикробной активностью, как показано на Примере 1 и Фиг.1. Соответственно, модуляция врожденного иммунитета посредством пептида с последовательностью SEQ ID NO 5 и/или 47 указывает на то, что эти пептиды могут быть использованы в качестве терапевтического средства при лечении инфекционного заболевания.

ПРИМЕР 5 - АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ DPPIV В ПЛАЗМЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРОВИ МЫШЕЙ

Кровь мышей получали у мышей линии ICR путем пункции сердца и собирали в гепаринизированные сосуды для сбора крови. Кровь нескольких мышей объединили и разделили на равные части объемом 300 мкл. Пептид растворили в буферном растворе (физиологический раствор с ацетатом) с уровнем рН 5.5 до концентрации в 9 мМ. Из этого раствора 30 мкл добавили к 300 мкл крови и перемешали путем ресуспендирования (концентрация в крови 0.82 мМ). В качестве контроля в 300 мкл крови добавили 30 мкл чистого буферного раствора (физиологического раствора с ацетатом). Каждая группа образцов с пептидом была приготовлена в трех экземплярах, в то время как контрольные образцы были приготовлены в шести экземплярах. Образцы инкубировали при 37°С в закрытых микрокапиллярах в течение двух часов. После инкубирования из образцов выделяли плазму путем центрифугирования при относительной центробежной силе в 4000 единиц (rcf). Плазму переместили на планшет с 96 лунками для проведения анализа DPPIV. Анализ начали с добавления 5 мкл субстрата DPPIV gly-pro-p-нитроанилида (16 мМ в деионизированной воде) к 95 мкл плазмы (концентрация в плазме 0.8 мМ), и в течение периода в 20 минут отслеживали повышение уровня поглощения в УФ-области (405 нм). Скорость выработки р-нитроанилина путем ферментного расщепления gly-pro-p-нитроанилида приняли в качестве показателя активности DPPIV (Durinx С.et al., (2001) "Reference values for plasma dipeptyl-aminopeptidase IV activity and their association with other laboratory parameters". Clin Chem Lab Med. 39(2):155-9.)

Результаты можно увидеть в Таблице 1. Наблюдали эффект пептидов на активность DPPIV. Результаты представлены в виде нормализованного, усредненного процентного показателя активности по сравнению с контрольным физическим раствором (принятым за 100%). Любой результат менее 100% является показателем снижения активности DPPIV.

В одном аспекте настоящего изобретения предполагается, что снижение активности DPPIV примерно, или, в одном варианте выполнения изобретения, по меньшей мере на 25% (т.е. до примерно 75%) является показателем активности пептида. Специалисту в данной области должно быть понятно, что желаемый уровень активности может быть различным в зависимости от применения пептидов.

Обсуждение

Трансмембранная сывороточная протеаза II типа дипептидилпептидаза IV (DPPIV), также известная как CD26 или белок, связывающий аденозиндеаминазу, является важным регулятором различных физиологических процессов, включая иммунные функции. CD26/DPPIV представляет собой гликопротеин молекулярной массой в 110 кД, расположенный на поверхности клетки, экспрессия которого происходит главным образом в зрелых тимоцитах, активированных Т-клетках, В-клетках, NK-клетках, макрофагах и эпителиальных клетках. Он выполняет по меньшей мере две функции - функцию сигнальной трансдукции и протеолитическую функцию (Morimoto С, Schlossman SF. The structure and function of CD26 in.-. The T-cell immune response. Immunol. Review. 1998, 161: 55-70.). Одна из его функций в клетке включает в себя модуляцию активности хемокинов путем отщепления дипептидов с N-конца хемокина. Модуляция NH₂-концов хемокинов является очень важной не только с точки зрения связывания с их рецепторами и последующих реакций, но также с точки зрения изменения рецепторной специфичности обработанного хемокина. Более того, было показано, что растворимый rCD26 усиливает трансэндотелиальную миграцию Т-клеток, в то же время снижая ответную миграционную активность моноцитов [Oravecz, Т. et al., (1997) Regulation of the receptor specificity and formation of the chemokine RANTES (regulated on activation, normal Т cell expressed and secreted) by dipeptydyl peptidase IV (CD26)-mediated cleavage. J. Exp.Med. 186:1865-1872; Iwata, S., et. al., (1999) CD26/dipeptidyl peptidase IV differentially regulates the chemotaxis of Т cells and monocytes toward RANTES: possible mechanism for the switch from innate to acquired immune response. Int. Immunol. 11:417-426). Эти результаты указывают на то, что CD26/DPPIV дифференциально регулирует хемотаксический ответ Т-клеток и моноцитов и участвует в переходе от врожденного иммунного ответа к приобретенному иммунному ответу. В таком случае снижение активности DPPIV как таковое, возможно, оказывает обратный эффект, усиливая врожденный иммунный ответ и ответную миграционную активность макрофагов. Также есть данные о том, что ингибирование активности фермента DPPIV фармакологическими средствами могло снижать уровень развития артрита в экспериментальной модели крыс с ревматоидным артритом (Tanaka S et al., Anti-arthritic effects of the novel dipeptidyl peptidase IV inhibitors TMC-2A and TSL-225. Iromunopharmacology 1998, 40:21-26; TanakaS, et al.,: Suppression of arthritis by the inhibitors of dipeptidyl peptidase IV. Int J Immunopharmacol 1997, 19:15-24), что указывает на то, что снижения активности DPPIV в определенных обстоятельствах могут способствовать уменьшению воспаления. Сочетание противовоспалительной роли и модуляции активности хемокинов делает DPPIV хорошей молекулой для изучения таких видов активности у новых соединений.

CD26/DPPIV участвует в патологии различных заболеваний, таких как развитие СПИД и ВИЧ (Blazquez et al. 1992; Vanham et al. 1993; Schols et al. 1998 Oravecz et al. 1995), базедова болезнь (Eguchi et al. 1989; Nishikawa et al. 1995), рак (Stecca et al. 1997) и диабет (Hinke et al. 2000; Marguet et al. 2000).

Кроме того, было показано, что CD26 как индикатор активации Т-клеток изменяется параллельно развитию нескольких аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (Nakao et al., 1989) и аутоиммунный тиреоидит (Eguchi et al., 1989). CD26 описан как маркер, который хорошо коррелирует с уровнем выраженности этих заболеваний. Более того, он был изучен как индикатор развития болезни при хроническом прогрессирующем рассеянном склерозе (Constantinescu et al., 1995).

Пептиды согласно настоящему изобретению показали свою способность снижать активность DPPIV. В этом качестве они могут быть применены при лечении определенных иммунологических состояний, таких как состояния, связанные или ассоциированные с DPPIV, и могут согласно одному аспекту модулировать врожденный иммунитет и воспаление, такое как воспаление, приводящее к сепсису.

При том, что вышеуказанное изобретение было описано в некоторых подробностях для ясности и понимания, специалист в данной области должен понимать при прочтении описания, что возможны различные изменения в форме и подробностях без отступления от истинного объема изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения.

ПРОДОЛЖЕНИЕ ТАБЛИЦЫ 1

Примечание 1 к Таблице 1:

X₁ выбрана из группы, состоящей из K, Н, R, S, Т, О, Cit, Hci, Dab, Dpr или соединений, основанных на глицине, с заменойосновных функциональных групп на N-конце (например, Nlys),hSer, Val(betaOH)

Х₂ выбрана из группы, состоящей из V, I, К, Р и Нвключая изолированный пептид, включающий в себя до 10аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность SEQID NO 55.

Примечание 2 к Таблице 1:

где X₁ выбрана из группы, состоящей из K, Н, R, S, Т, О, Cit, Hci, Dab, Dpr или соединений, основанных на глицине, с заменой основных функциональных групп на N-конце (например, Nlys), hSer, Val(betaOH) и где X ₂ выбрана из группы, состоящей из А, I, L, V, К, Р, G, Н, R, S, О, Dab, Dpr, Cit, Hci, Abu, Nva, Nie и где X₂ может быть N-метилированной, и где Хз выбрана из группы, состоящей из I, V, Р, причем в одном варианте выполнения изобретения Хз не является N-метилированной. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид может содержать аминокислотную последовательность, включающую в себя до 10 аминокислот, но не являющуюся SEQ ID NO 2 или 17.

Примечание 3 к Таблице 1:

где X₁, Х₂ и Х₃ определены как в последовательности SEQ ID NO 56 и где «а» выбрана из группы, состоящей из S, Р, I, R, С, Т, L, V, А, G, K, Н, R, О, С, М и F или изолированного пептида, включающего в себя до 10 аминокислот, содержащего указанные последовательности.

Примечание 4 к Таблице 1:

где X ₁X₂X₃P определены как в последовательности SEQ ID NO 56 и «b» выбрана из группы, состоящей из A, A*, G, S, L, F, К, С, I, V, Т, Y, R, Н, О и М, но в одном варианте выполнения изобретения эта группа не включает в себя Р. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид является пептидом, включающим в себя до 10 аминокислот, содержащим последовательность SEQ ID МО 58, но не SEQ ID NO 17.

Примечание 5 к Таблице 1:

где X₁, X₂ и Х₃ определены как в последовательности SEQ ID NO 56 и «a₁» выбрана из группы, состоящей из К, I, R, Н, О, L, V, А и G и «а2» выбрана из группы, состоящей из S, Р, R, Т, Н, К, О, L, V, А, G, S и I. В одном варианте выполнения изобретения «a₁» не является ацетилированной или где a₁ является К, К не является ацетилированной или не соответствует последовательности SEQ ID NO₂. В одном варианте выполнения изобретения изолированный пептид включает в себя до 10 аминокислот и содержит последовательность SEQ ID NO 59.

Примечание 6 к Таблице 1:

где X₁, Х₂ и Х₃ определены как в последовательности SEQ ID NO 56 и где «а» выбрана из группы, состоящей из S, R, К, Н, О, Т, I, L, V, А и G и где «b» выбрана из группы, состоящей из А, V, I, L, G, К, Н, R, О, S, Т и F или пептида, включающего в себя до 10 аминокислот, содержащего последовательность SEQ ID NO 60.

Источники информации

Blazquez MV, Madueno JA, Gonzalez R, Jurado R, Bachovchin WW, Pena J, Munoz E. Selective decrease of CD26 expression in Т cells from HIV-1-infected individuals. J. Immunol. 1992 Nov 1; 149(9):3073-7.

Vanham G, Kestens L, De Meester I, Vingerhoets J, Penne G, Vanhoof G, Scharpe S, Heyligen H, Bosmans E, Ceuppens JL, et al. Decreased expression of the memory marker CD26 on both CD4+and CD8+Т lymphocytes of HIV-infected subjects. J Acquir Immune Defic Syndr. 1993 Jul; 6(7):749-57.

Schols D, Proost P, Struyf S, Wuyts A, De Meester I, Scharpe S, Van Damme J, De Clercq E. CD26-processed RANTES(3-68), but not intact RANTES, has potent anti-HIV-1 activity. Antiviral Res. 1998 Oct; 39(3): 175-87. Erratum in: Antiviral Res 1999 Jan; 40(3):189-90.

Oravecz T, Roderiquez G, Koffi J, Wang J, Ditto M, Bou-Habib DC, Lusso P, Norcross MA. CD26 expression correlates with entry, replication and cytopathicity of monocytotropic HIV-1 strains in a T-cell line. Nat Med. 1995 Sep; 1(9):919-26. Comment in: Nat Med. 1995 Sep; 1(9):881-2.

Nishikawa Y, Nakamura M, Fukumoto K, Matsumoto M, Matsuda T, Tanaka Y, Yoshihara H. [Adenasine deaminase isoenzymes in patients with Graves disease] Rinsho Byori. 1995 Oct; 43(10):1057-60 [статья на японском]

Eguchi К, Ueki Y, Shimomura С, Otsubo T, Nakao H, Migita К, Kawakami A, Matsunaga M, Tezuka H, Ishikawa N, et al. Increment in the Tal+cells in the peripheral blood and thyroid tissue of patients with Graves disease. J Immunol. 1989 Jun 15; 142(12):4233-40.

Stecca BA, Nardo В, Chieco P, Mazziotti A, Bolondi L, Cavallari A. Aberrant dipeptidyl peptidase IV (DPP IV/CD26) expression in human hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 1997 Aug; 27(2):337-45.

Hinke SA, Pospisilik JA, Demuth HU, Mannhart S, Kuhn-Wache K, Hoffmann T, Nishimura E, Pederson RA, Mclntosh CH. Dipeptidyl peptidase IV (DPIV/CD26) degradation of glucagon. Characterization of glucagon degradation products and DPIV-resistant analogs. J Biol Chem. 2000 Feb 11; 275 (6):3827-34.

Marguet D, Baggio L, Kobayashi T, Bernard AM, Pierres M, Nielsen PF, Ribel U, Watanabe T, Drucker DJ, Wagtmann N. Enhanced insulin secretion and improved glucose tolerance in mice lacking CD26. Proc Nati Acad Sci USA. 2000 Jun 6; 97(12):6874-9.

Nakao H, Eguchi К, Kawakami A, Migita K, Otsubo T, Ueki Y, Shimomura C, Tezuka H, Matsunaga M, Maeda K, et al. Increment of Tal positive cells in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 1989 Jul; 16(7): 904-10.

Constantinescu CS, Kamoun M, Dotti M, Farber RE, Galetta SL, Rostami A. A longitudinal study of the T cell activation marker CD26 in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 1995 Jun; 130(2):178-82.