презентируемый в salmonella enterica n-гликан из c. jejuni и его производные

Формула изобретения

1. Генетически модифицированная бактерия Salmonella enterica для профилактики и/или лечения инфекций Campylobacter jejuni, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное и презентирует, по меньшей мере, один N-гликан Campylobacter jejuni или производное такого N-гликана на своей клеточной поверхности, где один или несколько генов для биосинтеза бациллозамина инактивированы мутацией и/или частичной или полной делецией, предпочтительно частичной и/или полной делецией генов pgl D, Е, F, G.

2. Salmonella enterica по п.1, выбранная из группы, состоящей из Salmonella typhimurium, enteriditis, heidelberg, gallinorum, hadar, agona, kentucky и infantis, более предпочтительно из штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium.

3. Salmonella enterica по любому из пп.1 или 2, содержащая, по меньшей мере, один оперон pgl, в котором продукт гена pglB инактивирован мутацией и/или делецией.

4. Salmonella enterica по любому из пп.1 или 2, в которой, по меньшей мере, одно производное N-гликана имеет формулу (I)

GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc- -1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc.

5. Salmonella enterica по любому из пп.1 или 2, в которой N-гликан(ы) или производное(ые) связан(ы), по меньшей мере, с одним гомологичным или гетерологичным полипептидом из Salmonella, который переносится и презентируется на клеточной поверхности, и предпочтительно связан, по меньшей мере, с одним полипептидом, содержащим, по меньшей мере, один консенсусный сиквон H-Z-S/T, более предпочтительно D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO: 1), где X и Z могут быть любой природной аминокислотой за исключением Pro.

6. Salmonella enterica по любому из пп.1 или 2, в которой, по меньшей мере, один N-гликан или его производное связаны с ядром липида А из Salmonella или с его функциональным производным.

7. Salmonella enterica по любому из пп.1 или 2, в которой штамм Salmonella является ослабленным, предпочтительно мутациями, выбранными из группы, состоящей из pab, pur, aro, aroA, asd, dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, рохА и galU, более предпочтительно мутациями aroA, cya и crp.

8. Salmonella enterica по любому из пп.1 или 2, где штамм Salmonella ослаблен частичной или полной инактивацией экспрессии О-антигена, предпочтительно одной или несколькими мутациями и/или делениями в генном кластере rfb, более предпочтительно в гене wbaP, наиболее предпочтительно делецией гена wbaP.

9. Salmonella enterica по любому из пп.1 или 2, предпочтительно штамм серовара typhimurium, отличающийся тем, что

(а) он содержит

(i) по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное, в котором один или несколько генов для биосинтеза бациллозамина инактивированы и

(ii) мутации и/или делеции в гене wbaP, приводящие к полной инактивации биосинтеза О-антигена,

(b) и презентирует на своей клеточной поверхности, по меньшей мере, один N-гликан из Campylobacter jejuni или производное такого N-гликана, предпочтительно GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc- -1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc.

10. Применение Salmonella enterica, предпочтительно живых Salmonella enterica, по любому из предшествующих пунктов для приготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения инфекций Campylobacter jejuni, предпочтительно вакцины.

11. Применение по п.10 для приготовления лекарственного средства, предпочтительно вакцины, для профилактики и/или лечения инфекций домашнего скота, более предпочтительно крупного рогатого скота и домашней птицы, более предпочтительно домашней птицы, и необязательно инфекций Salmonella.

12. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения инфекций Campylobacter jejuni и, необязательно, Salmonella, предпочтительно инфекций у домашнего скота, более предпочтительно у крупного рогатого скота или домашней птицы, более предпочтительно у домашней птицы, содержащая Salmonella enterica, предпочтительно живые Salmonella enterica, по любому из предыдущих пунктов и необязательно физиологически приемлемые наполнители.

13. Продукт питания, содержащий Salmonella enterica, предпочтительно живые Salmonella enterica, по любому из предыдущих пунктов и необязательно физиологически приемлемые наполнители.

14. Корм, содержащий Salmonella enterica, предпочтительно живые Salmonella enterica, по любому из предыдущих пунктов и необязательно физиологически приемлемые наполнители.

15.Пищевая добавка, содержащая Salmonella enterica, предпочтительно живые Salmonella enterica, по любому из предыдущих пунктов и необязательно физиологически приемлемые наполнители.

16. Кормовая добавка, содержащая живые Salmonella enterica, предпочтительно живые Salmonella enterica, по любому из предыдущих пунктов и необязательно физиологически приемлемые наполнители.

17. Способ лечения и/или профилактики инфекций С. jejuni и, необязательно, Salmonella, включающий введение нуждающемуся в этом человеку или животному Salmonella enterica по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции, содержащей Salmonella enterica по любому из пп.1-9, в физиологически активном количестве.

18. Способ получения генетически модифицированной бактерии Salmonella enterica по любому из пп.1-9, включающий стадию(ии)

(i) введения в Salmonella enterica, по меньшей мере, одним плазмидным вектором или геномной интеграцией, по меньшей мере, одного оперона pgl из C. jejuni или его функционального производного, предпочтительно, по меньшей мере, одного оперона pgl, в котором один или несколько, предпочтительно все гены для биосинтеза бациллозамина инактивированы, и

(ii) предпочтительно введения в ген wbaP мутаций и/или делеций, приводящих к полной инактивации биосинтеза О-антигена.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к Salmonella enterica, содержащей, по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное и относится к презентированию, по меньшей мере, одного N-гликана из Campylobacter jejuni или производного этого N-гликана на ее клеточной поверхности. Кроме того, изобретение направлено на медицинские применения, фармакологические композиции, пищевые и кормовые добавки, а также на способы лечения и/или профилактики инфекций Campylobacter, в частности вызываемых С.jejuni, С.lari, С.coli, С.upsaliensis, и С.fetus, и необязательно инфекций Salmonella и на способы получения этих штаммов Salmonella.

Предшествующий уровень техники

Campylobacter jejuni (С.jejuni) - это пищевой патоген, который является основной причиной острого гастроэнтерита в развивающихся странах. Его обычными хозяевами является домашний скот, в частности куры и коровы. Инфекции С.jejuni также ассоциированы с несколькими длительными последствиями, наиболее тяжелыми из которых являются аутоиммунные заболевания, синдром Миллера-Фишера и синдром Гийена-Барре. Они вызываются антителами млекопитающего-хозяина против структуры на поверхности патогена, имитирующей ганглиозиоды млекопитающих, которые затем также атакует собственные ганглиозиды хозяина. Данная молекулярная мимикрия является одной из причин, почему не существует эффективных вакцин против С.jejuni, так как данная мимикрия исключает применение в качестве вакцин ослабленных или убитых клеток С.jejuni.

В патенте США 2007/065461 описывается вакцина состоящая, по меньшей мере, из одного капсулированного полисахарида (англ. capsular polysaccharide, CPS) из С.jejuni функционально связанного in vitro с белком-носителем. Инъекция данного конъюгата в мышь и человекообразных обезьян защищает от последующего интраназального заражения С.jejuni. Получение данной вакцины требует выделения и очистки CPS, a также химического связывания с белком носителем и дополнительных стадий очистки.

Poly et al. (Infection and Immunity, 75:3425-3433, 2008) описывает тестируемые в настоящее время в качестве вакцинных кандидатов штаммы С.jejuni, потерявшие структуры, имитирующие ганглиозиды.

Ранее гликозилирование считалось специфическим феноменом эукариот, но позднее было показано, что оно широко распространено как в домене Archaea так и в домене Eubacteria. Бактериальные О- и N-связи образуются с более широким спектром сахаров, чем спектр наблюдаемый в эукариотических гликопротеинах. Гликозидное N-гликозилирование белков в прокариотах впервые было показано в С.jejuni (Szymanski et al., Molecular Microbiology 32:1022-1030, 1999). Механизм гликозилирования С.jejuni был описан и даже был успешно перенесен в Е.coli, в которых было продемонстрировано успешное N-гликозилирование белков (Wacker et al., Science, 298:1790-1793, 2002). Генный локус С.jejuni, называемый pgl (для гликозилирования белков) участвует в гликозилировании множества белков. Его мутационный сайленсинг приводит к потере иммуногенности во множестве белков.

В заявке на патент США 2006/0165728 A1 идентифицирован специфический и сильноиммуногенный гептасахарид, который является общим, по меньшей мере, для нескольких видов Campylobacter и множества штаммов, которые являются важными в качестве человеческих и ветеринарных патогенов. Гептасахарид имеет следующую формулу (I):

GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc- -1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-Bac,

где Вас (также известный как бациллозамин) является 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезокси-D-глюкопиранозой, GalNAc является N-ацетил-галактозамином, a Glc является глюкозой. Данная гликанная составляющая является компонентом множества гликопротеинов. В С.jejuni N-гликан важен для взаимодействия С.jejuni с клетками-хозяина. Мутации в механизме гликозилирования приводят к уменьшению колонизации в кишечных трактах у мышей. Кроме того, предложены фармацевтические композиции, содержащие либо (i) указанный гептасахарид или его конъюгат, либо (ii) антитело, направленное против указанного гептасахарида, для применения при вакцинации скота, особенно домашней птицы.

Род Salmonella является членом семейства Enterobacteriaceae. Род состоит из грамотрицательных бацилл, которые являются факультативными анаэробами и жгутиконосцами (подвижными). Они обладают тремя основными антигенами, «Н» или флагеллярный антиген, «О» или соматический антиген (часть ЛПС-составляющей) и «Vi» или капсульный антиген (называемый «K» в других Enterobacteriaceae}. Salmonellae также обладают ЛПС-эндотоксином, характерным для грамотрицательных бактерий. ЛПС состоит из трех доменов: части липида А, также известной как эндотоксин, заякоривающей ЛПС во внешней мембране с помощью своих жирнокислотных цепей. Данная часть соединена через внутренний кор, состоящее из гептоз и KDO (3-дезокси-D-маннооктулозоновой кислоты) с внешним кором, содержащим гексозы и N-ацетилгексозы. Присоединенное к последней глюкозе внешнего кора является полимерной O-антигенной областью. Данная область состоит из от 16 до >100 повторов олигосахаридной структуры, содержащей от четырех до шести моносахаридов. Эндотоксичная часть липида А вызывает лихорадку и может активировать комплемент, кинин и факторы свертывания крови.

Какое-то время штаммы Salmonella привлекали интерес для получения и презентации бактериальных иммуногенов. Например, гены, кодирующие ферменты для биосинтеза O-антигена Shigella были интегрированы в геном вакцинного штамма aroA Salmonella enterica серовар Typhimurium, который затем продуцировал гибридный ЛПС (Fait et al., Microbial Pathogenesis 20:11-30, 1996). Также кластеры, необходимые для биосинтеза O-антигена Salmonella dysenteriae были клонированы в стабильный экспрессирующий вектор, которые затем были перенесены в вакцинный штамм от брюшного тифа Ту21а. Полученный в результате штамм продуцировал гибридный ЛПС и индуцировал иммунитет против заражения S. dysenteriae (DE Qui Xu et al., Vaccine 25:6167-6175, 2007).

Патент США 6,399,074 В1 раскрывает живую ослабленную вакцину с Salmonella для защиты птиц против инфекции птичьими патогенными грамотрицательными микробами. Вакцина является рекомбинантным штаммом Salmonella, экспрессирующим O-антиген птичьего патогенного грамотрицательного микроба, такого как Е.coli O78, который является патогенным для домашней птицы. Рекомбинантный штамм Salmonella не экспрессирует O-антиген Salmonella из-за мутации в полимеразе O-антигена rfz (по новой генной номенклатуре wzy).

В свете представленного выше уровня техники задача настоящего изобретения заключается в обеспечении эффективной и безопасной, простой при массовом производстве, обладающей длительным действием и дешевой вакцинной композиции для профилактики и/или лечения инфекций Campylobacter у людей и животных, в частности у домашнего скота, в частности у домашней птицы.

Эта задача решается путем обеспечения в первом аспекте Salmonella enterica, которая содержит, по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное и презентирует на поверхности клетки, по меньшей мере, один N-гликан из Campylobacter jejuni или производное данного N-гликана.

Полезный для настоящего изобретения штамм Salmonella может быть любым штаммом, который является или может быть достаточно ослабленным для того, чтобы его можно было вводить в живом и/или мертвом виде людям и/или животным не вызывая патологию. Предпочтительные штаммы Salmonella и штаммы Salmonella enterica выбраны из группы состоящей из Salmonella Typhimurium, enteriditis, heidelberg, gallinorum, hadar, agona, kentucky, typhi и infantis, более предпочтительно из штаммов Salmonella enterica серовара Typhimurium. Salmonella Typhimurium особенно полезна для целей вакцинации, потому что ее геномная последовательность полностью охарактеризована и множество исследований на животных подтверждают ее безопасное применение в медицине.

Термин «оперон pgl» при использовании в данном документе относится к любому физиологически активному кластеру генов N-гликозилирования у С.jejuni, способных к N-гликозилированию гомологичных или гетерологичных структур, продуцируемых штаммом Salmonella по изобретению. Оперон pgl в С.jejuni кодирует все ферменты, необходимые для синтеза гептасахарида N-гликана из С.jejuni для его транспорта через внутреннюю мембрану и для переноса на белки. PglD, E, F кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе бациллозамина, PglC переносит фосфорилированный бациллозамин на ундекапринилфосфат, a PglA, H и J добавляют остатки GalNAc. Разветвленная Glc прикрепляется с помощью PglI. Перенос законченного гептасахарида осуществляется PglK, а олигосахаридтрансфераза PglB переносит N-гликан на белок.

Функциональное производное оперона pgl является кластером генов, полученных из любого оперона pgl из С.jejuni имеющего делеции, мутации и/или замены нуклеотида(ов) или целых генов, но все еще способным продуцировать связывающийся олиго- или полисахарид, который может быть связан с гомологичными или гетерологичными структурами, продуцируемыми штаммом Salmonella по изобретению. Один или несколько оперонов pgl или их производных могут быть интегрированы в хромосому штамма Salmonella или их/они могут быть введены как часть, по меньшей мере, одной плазмиды. Хромосомная интеграция является предпочтительной, потому что она более стабильна по сравнению с плазмидными векторами, потеря которых происходит в ходе культивирования. Следует отметить, что штамм Salmonella по изобретению может содержать больше чем один оперон pgl или его производное, продуцирующий один или несколько N-гликанов или его производных. В действительности предпочтительно, когда штамм по изобретению имеет больше чем один тип оперона pgl, дающий в результате больше чем одну N-гликанную структуру, что может быть преимуществом, поскольку вызывает более разнообразный иммунный ответ в человеке или животном против различных штаммов С.jejuni.

Также следует отметить, что уровень экспрессии N-гликана из С.jejuni необязательно может быть регулирован путем применения различных промоторов выше оперона pgl, включая, без ограничения перечисленным, промоторы генов рибосомальных белков, например, spc или rpsm, а также промоторы из генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам, подобных bla или похожих, а предпочтительно сильные промоторы. Данный тип регуляции доступен для кодируемых плазмидами или интегрированных в геном оперонов pgl. Более того, стабильность плазмид необязательно может быть усилена путем включения незаменимых генов в плазмиду с одновременным удалением этих генов в геноме штамма Salmonella по изобретению. Предпочтительные мишени охватывают, например, гены кодирующие tRNA-трансферазы, подобные CysS.

В предпочтительном воплощении, штамм Salmonella по изобретению является штаммом содержащим, по меньшей мере, один оперон pgl, в котором один или несколько генов для биосинтеза бациллозамина инактивированы мутацией или частичной или полной делецией, предпочтительно частичной и/или полной делецией генов D, Е, F, G. В наиболее предпочтительном воплощении гены pglE, F и G оперона pgl полностью удалены, а ген pglD частично удален, например, когда открытая рамка считывания (ORF) pglD заканчивается после 270 пар оснований (полноразмерная ORF содержит 612 пар оснований).

В другом предпочтительном воплощении инактивирован ген pglB оперона pgl, что означает, что соответствующая олигосахарилтрансфераза В либо не экспрессируется, либо, по меньшей мере, ферментативно инактивирована. Продукт гена pglB переносит N-гликан на специфический полипептидный акцепторный сайт дополнительно описанный ниже. Инактивация трансферазы приводит к тому, что N-гликан или производное N-гликана исключительно связаны с ядром липида А акцептора O-антигена в Salmonella.

В наиболее предпочтительном воплощении производное pgl является производным, в котором один или несколько генов для биосинтеза бациллозамина, pglD, Е, F, G, и переноса инактивированы, и ген pglB инактивирован тоже. Данное воплощение приводит к обмену GlcNac на бациллозамин, приводящий к увеличению его презентации на клетке, а также к переносу модифицированного гептасахарида на ядро липида А вместо полипептидных акцепторов.

По меньшей мере, один N-гликан из С.jejuni или производное этого N-гликана может быть любым N-гликаном, продуцируемым опероном pgl из Campylobacter jejuni или его функциональным производным. Конечно, предпочтительно, если N-гликан все еще является иммуногенным, т.е. вызывает иммунный ответ, специфичный для С.jejuni.

В предпочтительном воплощении, N-гликан является гептасахаридом формулы (I) как описано выше, т.е. GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc- -1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-Bac, где Вас (также известный как бациллозамин) является 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезокси-D-глюкопиранозой.

Предпочтительный оперон pgl, в котором гены для биосинтеза бациллозамина инактивированы, а предпочтительней в основном или полностью удалены, синтезирует производное N-гликана, т.е. полисахарид формулы (II), а именно GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc- -1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc.

Удивительно, но производное N-гликана формулы (II) в больших, чем N-гликан формулы (I) количествах презентируется на поверхности клеток штаммов Salmonella настоящего изобретения и также является иммуногенным. Это экспериментально подтверждается в разделе примеров ниже.

В предпочтительном воплощении, N-гликаны или производное(ые) полученные, по меньшей мере, из одного оперона pgl или его производного могут быть связаны, по меньшей мере, с одним гомологичным или гетерологичным полипептидом Salmonella, который в конечном итоге переносится и презентируется на клеточной поверхности. Предпочтительно, если, по меньшей мере, один N-гликан или производное N-гликана связаны с полипептидом, содержащим, по меньшей мере, один консенсусный сиквон N-Z-S/T (см. Nita-Lazar M et al., Glycobiology. 2005; 15(4):361-7), предпочтительно D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO:1), где X и Z могут быть любой природной аминокислотой за исключением Pro (см. Kowarik et al. EMBO J. 2006; 25(9):1957-66).

Полипептид, связанный с N-гликаном (производным) может быть любым типом полипептида, таким как чистый полипептид (только аминокислоты) или посттрансляционно модифицированный полипептид, например, полипептид, связанный с липидом.

Предпочтительно, если гетерологичные полипептиды, используемые в качестве носителей N-гликана(ов) (производных), содержат сигнальную последовательность MKKILLSVLTTFVAWLAAC (SEQ ID NO:2), направляющую N-связанный конъюгат к внешней мембране клетки и в которых мотив LAAC (SEQ ID NO:3) используется для ацилирования остатка цистеина, который заякоривает полипептид во внешней мембране (см. также Kowarik et al., EMBO J. May 3; 25(9):1957-66, 2006).

В наиболее предпочтительном воплощении, по меньшей мере, один N-гликан или его производное возникшее вследствие функционирования, по меньшей мере, одного оперона pgl или его производного, связан с ядром липида А из Salmonella или с функциональным эквивалентом его производного. Ядро липида А из Salmonella представляет собой олигосахаридную структуру состоящую из гексоз, N-ацетилгексоз, гептоз и KDO (5-деокси-D-манно-октулозоновой кислоты), связанную через два глюкозамина с шестью цепями жирных кислот, заякоривающих структуру во внешней мембране бактерии. Функциональный эквивалент производного ядра липида А является производным, способным принять один или несколько гликанов или их производных и презентировать их на поверхности клеток. Следует отметить, что в данном случае N-гликан или его производное не N-связаны потому что структурный липид А из Salmonella не является полипептидом. Предпочтительно если N-гликан связан с GIcII в ядре липида А или его функционального производного.

Предпочтительно, если, по меньшей мере, один N-гликан или его производное занимает место боковых цепей O-антигена в ЛПС (линополисахаридах). Внешнее и внутреннее ядро липида А из Salmonella остается неизмененным, если биосинтез O-антигена прерывается мутацией wbaP. Затем N-гликан переносится лигазой O-антигена WaaL и связывается с остатком GIcII олигосахаридной структуры внешнего ядра липида А.

Предпочтительно и крайне важно для применения в медицине, чтобы штамм Salmonella по изобретению не вызывал патогенных эффектов при введении животному или человеку в живой или инактивированной форме. Специалист знает много путей ослабления вирулентных видов Salmonella мутацией. Предпочтительные мутации для ослабления штаммов Salmonella для применения в настоящем изобретении выбраны из группы состоящей из pab, pur, aro, aroA, asd, dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, рохА и galU. Может присутствовать одна или несколько этих мутаций. Мутации aroA, cya и/или crp являются более предпочтительными.

Гены биосинтеза O-антигена из Salmonella кластеризованы в локус rfb гипервариабельной области ДНК хромосомы Salmonella. Частичная или полная инактивация была связана с ослаблением штаммов Salmonella. С другой стороны, O-антиген также является важной антигенной детерминантой для индукции иммунитета в хозяине.

В особенно предпочтительном воплощении штамм Salmonella по настоящему изобретению ослаблен частичной или полной инактивацией экспрессии O-антигена, предпочтительно одной или несколькими мутациями и/или делениями в генном кластере rfb, более предпочтительно в гене wbaP, при этом наиболее предпочтительной является делеция гена wbaP.

Понятно, что при использовании в данном документе термины «локус rfb» и «ген wbaP» предназначены для охвата любого соответствующего локуса и гена в любом штамме Salmonella, который способен экспрессировать O-антиген или связанные антигены.

Продукт гена wbaP является фосфогалактозилтрансферазой, которая начинает биосинтез O-антигена путем добавления фосфогалактозы к ундекапренилфосфату. Его инактивация/удаление приводит к полной отмене биосинтеза O-антигена, сахарный продукт которого конкурирует с N-гликаном(ами) (производными) из С.jejuni за переносчик липидов ундекапренилфосфат и за перенос лигазой WaaL. N-гликозилирование, индуцированное локусом pgl, и зависимый от wzy синтез O-антигена в бактерии являются гомологичными процессами. Было обнаружено, что лигаза WaaL O-антигена из Salmonella имеет нестрогую субстратную специфичность и что она может перенести N-гликан из С.jejuni на ядро липида А из Salmonella.

Таким образом, в наиболее предпочтительном воплощении штамм Salmonella по изобретению является мутированным в гене wbaP, что приводит к инактивации фермента фосфогалактозилтрансферазы. Следует отметить, что данный тип инактивации O-антигена не был описан ранее для целей вакцинации, и превосходит известные в настоящее время негативные мутанты O-антигена, потому что является генетически определенным и позволяет увеличить количество N-гликанов (производных) из С.jejuni, присутствующих на поверхности клеток штаммов Salmonella.

Поэтому, и в качестве независимого изобретения, настоящее изобретение также относится к штамму Salmonella с мутированным, предпочтительно делегированным и, таким образом, инактивированным геном wbaP, который является полезным для вакцинных применений штаммов Salmonella как таковых, а также применений штаммов Salmonella в качестве носителей гетерологичных антигенов, предпочтительно гликозилированных, более предпочтительно N-гликозилированных антигенов.

В наиболее предпочтительном воплощении изобретение направленно на Salmonella enterica, предпочтителен на серовар typhimurium, который

(a) содержит

(i), по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное, предпочтительно, по меньшей мере, один оперон pgl, в котором инактивированы один или несколько генов для биосинтеза бациллозамина, и

(ii) мутации и/или делеции в гене wbaP, приводящие к полной инактивации биосинтеза O-антигена,

(b) и презентирует, по меньшей мере, один N-гликан из Campylobacter jejuni или производное такого N-гликана, предпочтительно (I) GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc- -1,3]GalNAc-а1,4-Gal-NAc-а1,4-GalNAc-а1,3-2,4-диацетамидо-2,4,6-тридеокси-D-глюкопиранозу и/или (II) GalNAc-a1,4-GalNAc-a1,4-[Glc- -1,3]GalNAc-a1,4-Gal-NAc-a1,4-GalNAc-a1,3-GlcNAc на поверхности своей клетки.

Описанные выше штаммы Salmonella по изобретению являются сильно иммуногенными и вызывают иммунный ответ против инфекций С.jejuni. Более того, полученные один раз они могут легко быть репродуцированы и серийно произведены. В качестве дополнительного преимущества введение их животному или человеку обеспечивает иммунитет против инфекций С.jejuni и Salmonella. Они могут быть введены в виде инактивированной или живой вакцин, живых вакцин, позволяющих длительное культивирование и устойчивый иммунный стимул в хозяине, а также полные иммунные ответы без адъювантов.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к применению в медицине живых или инактивированных штаммов Salmonella по настоящему изобретению в частности для приготовления лекарственного средства, предпочтительно вакцины.

Предпочтительно, если лекарственное средство полезно для профилактики и/или лечения инфекций Campylobacter jejuni и необязательно Salmonella, предпочтительно инфекций домашнего скота, более предпочтительно крупного рогатого скота и домашней птицы, наиболее предпочтительно домашней птицы, такой как куры, индейки, гуси и утки.

Третий аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, пищевому продукту или корму (добавке), содержащим инактивированную или живую Salmonella enterica по настоящему изобретению и физиологически приемлемый наполнитель.

Например, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть получена выращиванием в среднем или большом масштабе штаммов Salmonella по изобретению содержащих, по меньшей мере, либо один кодируемый плазмидой, либо интегрированный в хромосому оперон pgl или его производное. Эти Salmonella могут быть использованы напрямую или могут входить в состав средства, предназначенного для конкретной цели - человека или животного и к конкретному пути введения. Фармацевтические композиции, содержащие живую Salmonella, являются предпочтительными по очевидным причинам.

В ином случае, изобретение относится к пищевому продукту или корму для людей или животных, предпочтительно для домашнего скота, более предпочтительно для домашней птицы, содержащему инактивированную или живую Salmonella enterica по настоящему изобретению и физиологически приемлемый наполнитель и/или продукт питания. Например, такой корм будет значительно сокращать колонизацию С.jejuni в стаях домашней птицы и, следовательно, уменьшать шанс инфицирования человека С.jejuni, а также инфицирования через зараженное мясо Salmonella.

Четвертый аспект настоящего изобретения направлен на способ лечения и/или профилактики инфекций С.jejuni и необязательно Salmonella, содержащему введение Salmonella enterica, фармацевтической композиции, продукта питания или корма по настоящему изобретению человеку или животному нуждающемуся в этом, в физиологически активном количестве.

Для терапевтического и/или профилактического применения фармацевтическая композиция по изобретению может быть введена в любой традиционной лекарственной форме в любой традиционной манере. Пути введения включают, без ограничения перечисленным, внутривенный, внутримышечный, подкожный, интраназальный, внутрисиновиальный, инфузицей, подъязычный, трансдермальный (чрескожный), пероральный (например, искусственное питание через зонд), местный и ингаляцией. Предпочтительными режимами введения являются пероральный, внутривенный и интраназальный, из них интраназальный наиболее предпочтителен.

Salmonella по изобретению может быть введена отдельно или в комбинации с адъювантами, которые повышают стабильность и/или иммуногенность бактерий, облегчают введение фармацевтических композиций содержащих их, обеспечивают повышенное растворение или дисперсию, увеличивают репродуктивную активность обеспечивают вспомогательную активность, и т.п. включая другие активные ингредиенты.

Фармацевтические лекарственные формы с Salmonella описанные в данном документе включают фармацевтически приемлемые носители и/или адъюванты, известные специалисту в данной области. Эти носители и адъюванты включают, например, ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, буферные вещества, воду, соли, электролиты, вещества на основе целлюлозы, желатин, воду, вазелин, животный или растительный жир, минеральное или синтетическое масло, физиологический раствор, декстрозу или другие сахаридные и гликолевые соединения, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, антиоксиданты, лактат и т.п. Предпочтительные лекарственные формы включают таблетки, капсулы, растворы, суспензии, эмульсии, реконструируемые порошки и трансдермальные пластыри. Способы для приготовления лекарственных форм хорошо известны, см., например, Н. С. Ansel and N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990) and, in particular, Pastoret et al., Veterinary Vaccinology, Elsevier March 1999). Уровни дозировок и требования широко известны в данной области и могут быть выбраны обычным специалистом в данной области из доступных способов и методов, подходящих для конкретного пациента. Специалист поймет, что в зависимости от конкретных факторов могут потребоваться более низкие или более высокие дозы. Например, конкретные дозы и схемы лечения будут зависеть от факторов, таких как общий профиль здоровья пациента (человека или животного), тяжесть и течение расстройства у пациента, и предрасположенность к нему, и от решения лечащего врача или ветеринара.

В предпочтительном воплощении для пероральной вакцинации схема состоит из введения Salmonella, содержащих оперон pgl или его производное либо в плазмиде, либо интегрированный в хромосому, на 1 или 2 день после вылупления цыплят в количестве около 10⁶ КОЕ (колониеобразующих единиц) на цыпленка с повторным введением (буст) на 14 или 21 день после вылупления таким же количеством бактерий. Эти два введения обеспечат достаточное стимулирование иммунной системы для того, чтобы выстроить ответ против N-гликана из С.jejuni или его производных, а также против белков Salmonella для обеспечения защиты от позднейшей колонизации у кур. Альтернативой для вакцинации кур является внутривенная инъекция инактивированных, например, инактивированных нагреванием или формалином бактерий на 1 или 2 день после вылупления и повторное введение на 14 или 21 день. Как еще один вариант, цыплята также могут быть вакцинированы всего лишь единожды в более поздней временной точке вплоть до 3 недельного возраста либо внутривенно термоинактивированными или формалининактивированными бактериями, либо внутрижелудочно живыми бактериями.

Не в последнюю очередь, настоящее изобретение касается способа для получения Salmonella enterica в соответствии с изобретением содержащим стадию(ии)

(i) введения в Salmonella enterica предпочтительно, по меньшей мере, одним плазмидным вектором или геномной интеграцией, по меньшей мере, одного оперона pgl из С.jejuni или его функционального производного, предпочтительно, по меньшей мере, одного оперона pgl, в котором один или несколько, а предпочтительнее все гены для биосинтеза бациллозамина инактивированы, и

(ii) предпочтительно введения мутаций и/или делеций в ген wbaP, приводящих к полной инактивации биосинтеза O-антигена.

Далее настоящее изобретение будет дополнительно иллюстрировано со ссылкой на конкретные воплощения и эксперименты, которые не должны быть истолкованы как ограничивающие объем притязаний изобретения, представленного приложенной формулой изобретения.

Чертежи

Фиг.1 является схематическим изображением дисплея N-гликана из С.jejuni, на S. enterica sv. Typhimurium.

А) показан перенос N-гликана из С.jejuni на ядро липида А из S. Typhimurium в штамме, продуцирующем O-антиген и имеющем оперон pgl_mut («mut» означает, что PglB инактивирован 2-мя точечными мутациями);

B) показан штамм S. Typhimurium wbaP без какого-либо O-антигена и имеющий оперон pgl3 _mut, в котором гены для биосинтеза бациллозамина удалены;

C) иллюстрирует делеции в опероне pgl3_mut .

На фиг.2 продемонстрирован дисплей N-гликана из С.jejuni на S. enterica sv. Typhimurium

A) показан иммуноблоттинг с антителами, связывающими N-гликан из С.jejuni после ДСН-ПААГ обработанных протеинкиназой К цельных экстрактов клеток штаммов S. Typhimurium дикого типа и wbaP, несущих указанные плазмиды, и демонстрирующий дисплей N-гликана из С.jejuni на ядре липида А в S. Typhimurium.

B) представляет собой ДСН-ПААГ, окрашенный серебром (левая панель) и иммуноблоттинг с антителами, связывающими группу В O-антигена Salmonella (правая панель) после ДСН-ПААГ обработанных протеинкиназой К цельных экстрактов клеток штаммов S. Typhimurium дикого типа и wbaP. Фигура подтверждает отсутствие полимерного 0-антигена в штамме wbaP.

C) показан иммуноблоттинг с антителами, связывающими N-гликан из С.jejuni после ДСН-ПААГ штамма S. Typhimurium wbaP с интегрированным пустым вектором (контролем) или интегрированным опероном pgl3_mut и подтверждает экспрессию N-гликана из С.jejuni на ядре липида A S. Typhimurium wbaP с интегрированным опероном pgl3_mut.

D) в левой панели изображен иммуноблоттинг с сывороткой из мыши, инфицированной внутривенно термоинактивированными S. Typhimurium wbaP, воспроизводящими N-гликан из С.jejuni с GlcNac на восстанавливающем конце и кодируемый pgl3_mut. Распознавание клеток С.jejuni дикого типа, но не С.jejuni 81-176pglB является очевидным. В правой панели показан окрашенный Кумасси гель ДСН-ПААГ образцов, использованных в иммуноблоттинг-анализе мышиных сывороток.

На фиг.3 представлены in vitro тесты, использованные для демонстрации ослабления S. Typhimurium wbaP

А) показана повышенная чувствительность S. Typhimurium wbaP к компонентам человеческой сыворотки: опосредованный комплементом цитолиз устойчивого к канамицину серовара Typhimurium штамма дикого типа, М939, отрицательного по O-антигену wbaP::cat (SKI11) и комплементированный мутант wbaP::pK19 (SKI33) тестировали инкубацией смеси 1:1:1 Salmonella дикого типа, wbaP и wbaP::pK19 (SKI33) в течение указанных временных точек вместе с 20% человеческой сывороткой или с 20% термоинактивированной человеческой сывороткой. Выживаемость была проанализирована путем рассевания на дифференцирующих средах.

B) отображен результат экспериментальных условий А), но с отличием, заключающемся в применении термоинактивированной сыворотки. Выживаемость ни одного из штаммов не изменилась.

C) иллюстрирует дефект S. Typhimurium wbaP при перемещении плаванием по сравнению с S. Typhimurium дикого типа и неподвижным штаммом fliGHI:Tn10.

На фиг.4 продемонстрирована пониженная способность к колонизации для S. Typhimurium wbaP в эксперименте с совместной инфекцией с S. Typhimurium дикого типа.

A) графически представлены конкурентные индексы (CI; (мутант/дикий тип) на выходе/ (мутант/дикий тип) на входе) серовара Typhimurium wbaP (SK112) и дикого типа, определенные на 1-3 дни после инфекции в экскрементах и на 4 день после инфекции в содержимом слепой кишки, демонстрирующие уменьшенную способность к колонизации S. Typhimurium wbaP по сравнению с диким типом.

B) CI в брызжеечных лимфоузлах (mLN), селезенке и печени на 4 день после инфекции.

Примеры

Бактериальные штаммы и условия роста

Сводка по бактериальным штаммам, которые использованы в экспериментах, перечисленных в примерах, приведена в таблице 1. Бактерии выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) (10 г/л Бакто-триптона, 5 г/л Бакто-дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl). Чашки с LB-агаром были дополнены 1,5% (масс./об.) агаром. Антибиотики использовали в следующих конечных концентрациях: ампициллин (amp) 100 мкг/мл, канамицин (kan) 50 мкг/мл, хлорамфеникол (cam) 25 мкг/мл, стрептомицин (strep) 50 мкг/мл, тетрациклин (tet) 10 мкг/мл.

Пример 1. Дисплей N-гликана из C.jejuni на ядре липида A Salmonella enterica sv. Typhimurium.

Wzy-зависимый биосинтез 0-антигена и биосинтез N-гликана из С.jejuni являются гомологичными процессами (Feldman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 102(8):3016-21, 2005), которые оба начинаются со сборки олигосахаридной структуры на ундекапренилпирофосфатном линкере. Гомология двух путей, а также нестрогая субстратная специфичность лигазы O-антигена WaaL из S. enterica sv. Typhimurium (Fait et al., Microbial Pathogenesis 20:11-30, 1996; De Qui Xu et al., Vaccine 25:6167-6175, 2007) были исследованы на предмет возможности объединения путей для дисплея N-гликана из С.jejuni на ядре липида А из Salmonella.

Плазмиду, содержащую оперон pgl_mut из C.jejuni с инактивированным PglB (pACYCpgl_mut; Wacker et al 2002) вводили в штамм Salmonella enterica serovar Typhimurium электропорацией. В качестве отрицательного контроля применяли соответствующий пустой вектор pACYC184.

Гликонъюгаты трансформантов тестировали на предмет дисплея N-гликана из С.jejuni с помощью ДСН-ПААГ и последующего иммуноблоттинга с антисывороткой к N-гликану С.jejuni (Amber 2008). Образцы были приготовлены следующим образом: Эквивалент 2 OD₆₀₀/мл растущих в лог-фазе культур S. enterica sv Typhimurium содержащих либо pACYC184, либо pACYpgl_mut осаждали при 16000 g в течение 2 минут и отбрасывали надосадочную жидкость. Клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера Лэммли для образцов (0,065 М Tris-HCl рН 6,8, 2% ДСН (масс./об.), 5% -меркаптоэтанол (об./об.), 10% глицерин (об./об.), 0,05% бромфеноловый синий (масс./об.)) и лизировали в течение 5 мин. при 95°С. После охлаждения до комнатной температуры, добавляли протеиназу К (Gibco/Life Technologies) (конечная концентрация 0,4 мг/мл) инкубировали 1 час при 60°С до внесения равных количеств на 15% полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) и проводили гель-электрофорез. Для обнаружения N-гликана из С.jejuni применяли кроличью поликлональную антисыворотку, связывающую N-гликан из С.jejuni (S. Amber, PhD.-thesis, ETH Zurich, Department of Biological Science. Zurich, 2008). Визуализацию сигналов проводили HRP-конъюгатом козьих антител, связывающих кроличьи IgG (Santa Cruz) и ECL (Amersham), как рекомендовано производителем.

N-гликан из С.jejuni можно было обнаружить на ядре липида A S. enterica sv. Typhimurium, когда в клетках присутствовала pACYCpgl_mut (фиг.2А дорожка 2), но не в случае, когда в клетки вводили пустой вектор (фиг.2А дорожка 1). Это говорит о том, что WaaL из S. enterica sv Typhimurium переносит N-гликан из С.jejuni с ундекапренилпирофосфата на ядро липида А.

Пример 2. Конструирование делеции wbaP в Salmonella enterica sv Typhimurium и повышенное воспроизведение N-гликана из С.jejuni в негативном по O-антигену штамме

Предполагалось, что делеция биосинтеза O-антигена ликвидирует конкуренцию между путем биосинтеза O-антигена и биосинтезом N-гликана из С.jejuni за переносчик липидов ундекапренилфосфат.

Конструирование делеционного мутанта S. Typhimurium дикого типа SL1344 с делецией wbaP проводили, как описано (Datsenko and Wanner, PNAS USA 97(12):6640-5, 2000). Были синтезированы праймеры RfbP H1P1 (последовательности см. в таблице 1) и RfbP H2P2, которые отжигаются на матричной ДНК из плазмиды pKD3, несущей ген устойчивости к хлорамфениколу, фланкированный сайтами FRT (мишень, распознаваемая FLP). Праймеры также содержат от 40 до 45 дополнительных нуклеотидов, соответствующих областям непосредственно выше и ниже гена wbaP. Их применяли для амплификации генной кассеты для делеции в рамке считывания wbaP, как описано (Datsenko and Wanner, см. выше). После индукции арабинозой экспрессии Red рекомбиназы из плазмиды pKD46 в штамме SL1344 S. Typhimurium дикого типа происходит замена гена-мишени на кассету с хлорамфениколом, полученную из ПЦР-продукта, введенного электропорацией, путем рекомбинации. Трансформанты отбирали рассеванием на чашках с хлорамфениколом при 37°С в течение ночи, а наличие гена cat в правильной позиции в геноме подтверждали с помощью ПЦР. Полученный клон с устойчивостью к хлорамфениколу (wbaP::cat) назвали SKI11. Удаление кассеты устойчивости к хлорамфениколу было возможно при использовании рСР20, кодирующей FLP-рекомбиназу, которая распознает фланкирующие FRT-области, полученный в результате клон назвали SKI12 после проверки с помощью ПЦР (также см. Hg, Endt et al., Inf. Immun., 77, 2568, June 2009).

Фенотипический анализ гликоконъюгатов полученного штамма осуществляли с помощью ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием гликоконъюгатов серебром. Для ДСН-ПААГ, образцы готовили следующим способом: Эквивалент 2 OD₆₀₀/мл растущих в логарифмической фазе культур S. Typhimurium дикого типа или S. Typhimurium wbaP (SK112) осаждали при 16000 g в течение 2 минут и отбрасывали надосадочную жидкость. Клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера Лэммли для образцов (0,065 М Tris-HCl pH 6,8, 2% ДСН (масс./об.), 5% -меркаптоэтанол (об./об.), 10% глицерин (об./об.), 0,05% бромфеноловый синий (масс./об.)) и лизировали в течение 5 мин. при 95°С. После охлаждения до комнатной температуры, добавляли протеиназу К (Gibco/Life Technologies) (конечная концентрация 0,4 мг/мл) инкубировали 1 час при 60°С до внесения равных количеств на 12% полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) м проводили гель-электрофорез. Для обнаружения O-антигена в S. Typhimurium применяли O-антисыворотку связывающую факторы 1, 4, 5, 12 группы В Salmonella (Difco). Визуализацию сигналов проводили HRP-конъюгатом козьих антител, связывающих кроличьи IgG (Santa Cruz) и ECL (Amersham), как рекомендовано производителем. Для окрашивания применяли метод Tsai and Frasch (Tsai and Frasch, Anal. Biochem. 119(1):115-9, 1982).

Делеция гена, кодирующего фосфогалактозилтрансферазу WbaP в S. enterica дикого типа, приводит к отмене биосинтеза O-антигена, как видно на фиг.2В. ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием глюкоконъюгатов серебром, а также ДСН-ПААГ с последующим иммуноблотингом с анти-O-антисывороткой, специфичной к группе В Salmonella, демонстрирует типичный паттерн липополисахаридной лесенки полимерного O-антигена для штамма дикого типа S. enterica sv. Typhimurium и отсутствие такого паттерна в штамме wbaP.

Данные отрицательные по O-антигену S. enterica sv. Typhimurium wbaP SK112 тестировали на предмет их способности к дисплею N-гликана из С.jejuni на своей клеточной поверхности. Плазмиды pACYCpgl_mut или pACYC184 вводили электропорацией. Гликоконъюгаты трансформантов анализировали, как описано в примере 1. N-гликан из С.jejuni может быть обнаружен с более высокими интенсивностями в дорожке, содержащей штамм wbaP по сравнению диким типом (фиг.2А дорожка 4 по сравнению с дорожкой 2). Нельзя обнаружить N-гликан из С.jejuni при наличии в S. enterica sv. Typhimurium wbaP SK112 пустого вектора pACYC184. Это говорит о том, что в штамме wbaP больше N-гликана из С.jejuni переносится на ядро липида А.

Пример 3. Конструирование измененного оперона pgl_mut из С.jejuni, приводящего к усиленному дисплею N-гликана из С.jejuni на Salmonella enterica sv. Typhimurium

В С.jejuni N-гликан синтезируется в виде гептасахарида GalNAc5(Glc)-Bac, где Вас, сахар с восстанавливающим концом, является 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридеоксиглюкопиранозой. В E.coli и S. Typhimurium Вас не синтезируется при отсутствии гетерологичной экспрессии компонентов системы биосинтеза N-гликана из С.jejuni. Было показано, что в клетках E.coli дикого типа, коэкспрессирующих компоненты системы биосинтеза N-гликана из С.jejuni, синтезируется два различных типа N-гликанов, один из который с Вас на восстанавливающем конце и один - с GlcNAc. Это явление можно объяснить действием WecA, UDP-GlcNAc:ундекапренилфосфат GlcNAc-1-фосфаттрансферазы, участвующей в биосинтезе гликолипидов (Linton D. et al., Mol. Microbiol., 55(6):1695-703, 2005). В связи с тем, что лигаза O-антигена WaaL из Salmonella enterica sv Typhimurium может переносить содержащие GlcNAc структуры на ядро липида А, было выдвинуто предположение о том, что содержащий GlcNac N-гликан может быть более лучшим субстратом для WaaL, чем N-гликан содержащий Вас. Оперон pgl_mut сконструировали так, чтобы были удалены гены биосинтеза бациллозамина, а именно pglD, Е, F, G. Гены, кодирующие PglE1, F, G удаляли полностью, при этом ген, кодирующий PglD, удаляли частично. Открытая рамка считывания pglD (ORF) в измененном опероне pgl заканчивается через 270 пар оснований, тогда как полноразмерная ORF содержит 612 пар оснований. Процедуру конструирования данного измененного оперона pgl_mut , с использованием Е.coli DH5 в качестве штамма-хозяина для воспроизводства плазмид, проводили следующим образом: ДНК pACYCpgl_mut расщепляли с помощью Alw44I и SmaI, затем выступающую часть Alw44I заполняли с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и повторно лигировали. Полученный в результате оперон назвали pACYCpgl3_mut и трансформировали в штамм wbaP. Гликоконъюгаты полученных в результате трансформантов анализировали, как описано в примере 1. В дорожке, содержащей штамм wbaP с опероном pgl3mut, N-гликан из С.jejuni проявляет большую интенсивность, чем в дорожке, содержащей штамм wbaP с опероном pgl3mut, если сравнивать с диким типом (фиг.2А дорожка 5 по сравнению с дорожкой 4). В целом, при исследовании антисывороткой к N-гликану из С.jejuni штамм wbaP с pgl3mut показывает наивысшие интенсивности и, следовательно, демонстрирует наивысшие уровни N-гликана из С.jejuni, представленного на ядре липида A Salmonella enterica sv Typhimurium.

Пример 4. Интеграция оперона pgl3mut в геном отрицательного по O-антигену штамма Salmonella enterica sv Typhimurium wbaP

Для обеспечения непрерывного дисплея in vivo N-гликана из С.jejuni на ядре липида А штамма Salmonella enterica sv Typhimurium wbaP, оперон pgl3mut интегрировали в геном wbaP-штамма SK112 ниже гена pagC.

Все стадии клонирования, включающие суицидальную плазмиду с oriR6K осуществляли в Е.coli CC118 pir. Конечную интегративную суицидальную плазмиду pK115 сконструировали следующим образом: 512 п.о. последовательность, гомологичную области-мишени в геноме Salmonella, амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами 3' PagC Fw NotI и 3' PagC Rev SacII (последовательности см. в таблице 1). Полученный в результате фрагмент ДНК вставляли с помощью SacII и NotI в pSB377 и после проверки последовательности вставки назвали плазмиду pK114. PK115 сконструировали расщеплением ДНК pACYCpgl3mut с помощью BamHI и EheI, при этом pKI14 расщепляли BamHI и SmaI. Вырезанный из pACYCpgl3mut фрагмент длиной 11083 п.о. затем лигировали с каркасом pKI14. Поскольку электропорация суицидальных плазмид в штаммы Salmonella очень неэффективна, pKI15 или pKI14 вначале вводили в E.coli Sm10 pir для конъюгации электропорацией. Sm10 pir, содержащие pKI15 или pKI14 затем конъюгировали с SKI12. Для конъюгации эквиваленты 4 OD₆₀₀ культур Sm10 pir в поздней лог-фазе, содержащий pKI15 и SKI12 центрифугировали и отмывали три раза 1 мл LB. Осадки ресуспендировали в 100 мкл LB, объединяли и размазывали по чашке с LB-агаром диаметром 3 см, которую затем инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующее утро бактерии смывали с чаши 1 мл LB и несколько разведении высевали на LB(+strep+tet) для отбора конъюгатов. Полученные в результате штаммы назвали SKI34 (SKI12::pKI14) и SKI35 (SKI12::pKI15).

Для проверки N-гликана из С.jejuni на ядре липида А из отрицательных по O-антигену штаммов, содержащих либо интегрированный кластер pgl3mut, либо интегрированный пустой вектор в качестве отрицательного контроля, цельные экстракты клеток SKI34 и SKI35 были приготовлены и проанализированы как описано в примере 1. фиг.2С представляет собой иммуноблоттинг, где анализ проводился с помощью антисыворотки к N-гликану из С.jejuni, на котором показан интенсивный сигнал в дорожке 2, содержащей SKI35, но не в дорожке 1 содержащей SKI34. Это говорит об эффективном переносе N-гликана из С.jejuni на ядро липида A Salmonella enterica sv Typhimurium из интегрированного оперона pgl3mut.

Пример 5. Иммуногенность гликана, кодируемого опероном pgl3_mut

Для того чтобы исследовать иммунногеность гликана, кодируемого pgl3_mut, мышей инфицировали термоинактивированными бактериями SKI12+pMLpgl3 _mut и их сыворотки тестировали на предмет наличия антител, связывающих N-гликан из С.jejuni. Эксперимент проводили следующим образом:

Эксперименты с инфицированием мышей

Инфекции Salmonella проводили в индивидуально вентилируемых клетках при RCHCI, Цюрих, как описано ранее (Stecher, Hapfelmeier et al., Infection Infect Immun. 2004 Jul; 72(7):4138-50 2004). Для внутривенной инфекции мышам инъецировали в хвостовую вену 5×10⁵ КОЕ термоинактивированных S. Typhimurium SL1344 wbaP (SKI12), несущих pMLBAD (контроль) или pMLpgl3 _mut. После анализа сыворотки на 29 день после инфекции мышей повторно инъецировали теми же самыми бактериальными штаммами на 36 день и сыворотку анализировали на 50 день.

Анализ мышиных сывороток

Продуцирование антител, связывающих N-гликан из С.jejuni, анализировали в мышиных сыворотках иммуноблотингом цельноклеточных экстрактов С.jejuni 81-176 и 81-l76pglB (отрицательный контроль). С.jejuni 81-l76pglB не продуцирует гликозилированные белки и служит в качестве отрицательного контроля. Цельноклеточные экстракты были приготовлены сбором С.jejuni из чашек с конфлюэнтным бактериальным ростом в 1 мл PBS. После корректировки образцов PBS до одной оптической плотности клетки собирали центрифугированием в течение 2 минут при 16000 × g при комнатной температуре. Клетки лизировали в течение 5 минут при 95°С в буфере Лэммли для образцов (0,065 М Tris-HCl рН 6,8, 2% ДСН (масс./об.), 5% -меркаптоэтанол (об./об.), 10% глицерин (об./об.), 0.05% бромфеноловый синий (масс./об.)), добавляли PBS до одинаковых конечных объемов, как определено выше, для того, чтобы получить одинаковое количество клеток в каждом образце. Это было подтверждено разделением равных объемов каждого образца на ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием белков с помощью Кумасси Синего. Дополнительно гликозилированный и негликозилированный белок AcrA использовали для визуализации иммунного ответа против N-гликана из C.jejuni. Для анализа мышиных сывороток равные объемы цельноклеточных экстрактов, а также равные количества гликозилированного и негликозилированного AcrA разделяли с помощью ДСН-ПААГ с последующим переносом белков на поливинилиденфлюоридную мембрану для обнаружения иммуноблоттингом. Мышиные сыворотки выступали в роли первичных антисывороток в первой стадии инкубации. Связанный IgG идентифицировали с помощью HRP-конъюгата, связывающего мышиные IgG (Bethyl Laboratories). Обнаружение осуществляли с помощью ECL (Amersham) в соответствии с рекомендациями производителя.

На фиг.1D) показано наличие IgG, связывающих N-гликан из С.jejuni, в мышиных сыворотках на 61 день после повторной инфекции. Антитела не распознавали негликозилированный AcrA или негликозилированные белковые экстракты из С.jejuni, что, таким образом, доказывает специфичность к гликанам. С сыворотками мышей, инфицированных контрольными штаммами, не наблюдали специфичной реакции с N-гликаном из С.jejuni (данные не показаны).

Пример 6. Ослабленный фенотип S. Typhimurium wbaP

Ослабление S. Typhimurium wbaP проверяли несколькими in vitro и in vivo способами. In vitro способ состоит из проверок мутанта вместе с диким типом на предмет их устойчивости к сыворотке, подвижности и устойчивости к антимикробному пептиду-иммитатору полимиксину В. Способность к колонизации wbaP анализировали в in vivo эксперименте с одновременной инфекции.

Анализ устойчивости к сыворотке

В общем и целом бактерицидную активность комплемента проверяли, как описано (Bengoechea, Najdenski et al. 2004). Вкратце, серовар Typhimurium wbaP::cat (SKI11), M939, устойчивое к канамицину производное штамма дикого типа SL1344 серовара Typhimurium (aph, интегрированный ниже sopE) и клетки из серовара Typhimurium wbaP::pK19 (SKI33), взятые из культур в экспоненциальном росте, смешивали в равных количествах (3×10⁸ КОЕ/мл для М393; 4×10⁸ КОЕ/мл для SK111 и SKI33) и разводили для применения в 5×10⁴ раза стерильным 1×PBS. Данную разведенную бактериальную культуру смешивали 1:1 с 20% человеческой сывороткой, не содержащей антител против ЛПС серовара Typhimurium и инкубировали при 37°C с небольшим перемешиванием. Аликвоты брали на 0, 15 и 30 мин после смешивания и останавливали активность комплемента добавлением бульона с сердечно-мозговым экстрактом. Аликвоты выдерживали на льду до посева на LB (strep, kan) для отбора дикого типа, LB (Sm, Cam) для отбора wbaP::cat и LB (Sm, Tet) для определения КОЕ wbaP::pKI9. Подобный эксперимент проводили с помощью сыворотки, в которой комплемент был термоинактивирован при 56°С в течение 30 мин. Данные представлены как среднее логарифма КОЕ ± стандартное отклонение. На фиг.3А показано уменьшение устойчивости к сыворотке для S. Typhimurium wbaP при сравнении с диким типом: Через 30 минут инкубации с 20% человеческой сывороткой количество для wbaP было в шестьдесят раз меньше, чем в начале инкубационного периода. На фиг.3А изображен тот же штамм, проинкубированный с термоинактивированной сывороткой в качестве отрицательного контроля.

Анализ перемещения плаванием

Поскольку подвижность бактерий является известным фактором вирулентности, подвижность бактерий тестировали на чашках с мягким агаром (0,3% (масс./об.) агар, 5 г/л NaCl, 10 г/л Бакто-триптона). 1 мкл ночных культур дикого типа серовара Typhimurium (SL1344), серовара Typhimurium wbaP (SKI12), серовара Typhimurium wbaP::pKI9 (SKI33) или серовара Typhimurium fliGHI::Tn10 (М933) помещали в середину чашек и подвижность оценивали измерением диаметра ореола, видимого через 4,75 часа и 9,5 часа инкубации при 37°С. Каждый эксперимент проводили трижды в двух различных подходах, данные представлены как среднее ± стандартные отклонения. Как видно на фиг.3С подвижность сильно снизилась в wbaP (SKI12) по сравнению с диким типом, но была более высокой, чем в неподвижном контроле fliGHI::Tn10.

Анализ устойчивости к полимиксину В

Осаждали эквивалент 1 OD₆₀₀/мл экспоненциально растущих культур штамма серовара дикого типа Typhimurium SL1344 или серовара Typhimurium wbaP (SKI12), ресуспендировали в 150 мкл холодного стерильного 1×PBS и разводили перед применением в 5×10⁶ раз. Для анализа 45 мкл разведенных культур смешивали с 5 мкл Полимиксина В (Sigma, конечная концентрация 1 мкг/мл) или 5 мкл PBS и инкубировали в течение 1 часа при 37°С при слабом перемешивании. После добавления 80 мкл LB бактерии высевали в чашки с LB-агаром, содержащим стрептомицин. Эффективность выживания рассчитывали делением КОЕ (колониеобразующих единиц) обработанной пептидом культуры на КОЕ необработанной культуры с умножением на 100. Анализ осуществляли трижды в двух независимых экспериментах и данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Фиг.3D свидетельствует о снижении устойчивости к полимиксину В у S. Typhimwium wbaP по сравнению с диким типом.

Способность wbaP к колонизации в эксперименте совместной инфекции

Способность S. Typhimurium wbaP к колонизации проверяли в эксперименте совместной инфекции, в котором мышей инфицировали внутрижелудочно мутантом wbaP совместно со штаммом дикого типа. Мышей C57BL/6 (SPF; колония RCHCI, Цюрих) предварительно обрабатывали 20 мг стрептомицина с помощью зонда. Через 24 часа мышей инокулировали 5×10 ⁷ КОЕ серовара штамма Typhimurium или смесью штаммов как указано. Бактериальные нагрузки (КОЕ) в свежих фекальных комочках, брызжеечных лимфоузлах (англ. mesenteric lymph nodes, mLNs), селезенке и в содержимом слепой кишки определяли рассеванием в чашках с агаром МакКонки (50 мкг/мл стрептомицина) как описано ранее (Barthel, Hapfelmeier et al. 2003). Конкурентные индексы (англ. competitive indices, C1) определяли по формуле CI=(мутант/дикий тип) на выходе/(мутант/дикий тип) на входе после рассевания. Проводили эксперимент с совместной инфекцией серовара Typhimurium (M939) дикого типа и штамма wbaP (SKI11). 5 обработанных стрептомицином мышей инфицировали смесью 1:2 (общее количество КОЭ 5×10⁷) внутрижелудочно штаммом wbaP (SKI11) и штаммом дикого типа. Соотношение 2 штаммов (CI; конкурентный индекс, см. Материалы и Методы) определяли в фекалиях на 1, 2 и 3 день после инфекции. Обнаружили снижение количества wbaP по сравнению с диким типом (одна логарифмическая единица в день) и доказали что штамм wbaP (SKI11) действительно имеет в кишечном тракте серьезный конкурентный дефект по сравнению с диким типом штамма серовара Typhimurium (p>0.05; фиг.4А). Более того, CI двух штаммов в системных сайтах (ml_N, печень, селезенка) на 4 день после инфекции также демонстрировали значительный дефект серовара Typhimurium wbaP (SK112). Тем не менее, дефект был менее выраженным, чем в кишечнике (фиг.4В).

Таблица 1
Штаммы, плазмиды и праймеры для делеции wbaP, использованные в данной работе
Штаммы Salmonella enterica sv Typhimurium
Штамм	Генотип и фенотип	Источник или ссылка
SL1344	дикий тип; strepK	Hoiseth, S. K. and В. A. Stacker, Nature 291:238-239, 1981
SKI11	SL1344 wbaP::caf; strepR, camR	Данное исследование
SKI12	SL1344 wbaP; strepR	Данное исследование
SKI34	SKI12::pKI14; strepR, tetR	Данное исследование
SKI35	SKI12::pKI15; strepR, tetR	Данное исследование
Штаммы Escherichia coli
DH5a	SupE44 lacU169 (Ф80/acZ M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1	Hanahan, D., J. Mol. Biol., 5, 166(4):557-80, 1983
CC118 pir	(ara-leu), araD, lacX74, galE, galK, phoA20, thi-1, rpsE, rpoB, argE(Am), recA, pir	Herrero, M., V. de Lorenzo, and K. N. Timmis. J Bacteriol 172:6557-6567.
Sm10 pir	thi thr leu tonA lacY supE recAv::RP4 2-Tc::Mu pir, kanR	Miller, V. L. and J. J. Mekalanos. J. Bacteriol. 170:2575-2583, 1988.
Плазмиды
Плазмида	Генотип	Источник или ссылка
pSB377	tetR oriR6K	Mirold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9845-9850, 1999.
pKD3	bla FRT cat FRT PSI PS2 oriR6K	Datsenko, K. A. and B. L. Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645, 2000.
pKD46	bla Pbad gam bet exo pSC101 onTS	Datsenko, K. A., and В. L. Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645, 2000.
pCP20	bla cat c1857 PR flp pSC101 or/TS	Datsenko, K. A., and В. L. Wanner. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645, 2000
pACYC184	CmR, TcR, ori p15A	New England Biolabs
pACYCpgl mut	CmR, ori p15A; кластер pgl из C.jejuni с pglBW458A,D459A клонированный в pACYC184	Science, 298(5599):1790-3, 29. Nov. 2002
pACYCpgl3mut	CmR, ori p15A; кластер pgl из C.jejuni с pglBW458A,D459A клонированный в pACYC184, деления pglE, F, G и 3'- половины pglD	Данное исследование
pKI14	TetR, oriR6K, 500 п.о. область 3'PagC клонированная в pSB377	Данное исследование
pKI15	TetR, oriR6K, кластер pgl3mut из C.jejuni с pglBW458A,D459A клонированный в pKI15	Данное исследование

Праймеры для удаления wbaP
RfbPH1P1	CTTAATATGCCTATTTTATTTACATTATGCACGGTCAGAGGGTG AGGATTAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO:4)
RfbP H2P2	GATTTTACGCAGGCTAATTTATACAATTATTATTCAGTACTTCT CGGTAAGCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCC (SEQ ID NO:5)
Праймеры для интеграции pgl3 mut
3' PagC Fw NotI	AAGCGGCCGCGCATAAGCTATG CGGAAGGTTC (SEQ ID NO:6)
3' PagC Rev SacII	ACCGCGGGACACTGAGGTAATA ACATTATACG (SEQ ID NO:7)