способ получения токсинов actinobacillus pleuropneumoniae apxi или apxiii в жидкой культуральной среде, дополненной воздухом, обогащенным углекислым газом

Формула изобретения

1. Способ получения RTX-токсинов ApxI или ApxIII путем культивирования бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в жидкой культуральной среде, которая обеспечивает рост бактерий, отличающийся тем, что во время экспоненциальной фазы роста бактерий и продукции RTX-токсинов через среду пропускают воздух, причем содержание углекислого газа в воздухе выше нормального атмосферного уровня и составляет до 10 об.%.

2. Способ по п.1, в котором среду забуферивают.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что среду забуферивают, используя бикарбонат.

4. Способ по п.1, отличающийсятем, что воздух пропускают через среду при постоянном потоке.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что воздух пропускают непрерывно в течение экспоненциальной фазы роста бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что содержание углекислого газа составляет 5 об.%.

7. Способ по п.1, в котором RTX-токсин представляет собой ApxI, отличающийсятем, что культуральная среда содержит бороглюконат кальция.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу получения RTX-токсинов ApxI или ApxIII путем культивирования бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в жидкой культуральной среде.

Плевропневмония свиней, основное респираторное заболевание свиней, распространена во всем мире и обусловливает тяжелые экономические потери в свиноводстве вследствие молниеносных смертей, лечения тяжелобольных свиней и задержки в сбыте из-за хронически инфицированных животных. Этиологическим агентом является Actinobacillus pleuropneumoniae. Она передается в основном через прямой контакт между животными, и полученная инфекция приводит к течению болезни, варьирующему от молниеносного до хронического. Заболевание, главным образом, представляет собой инфекцию дыхательных путей, имеющую клинические признаки высокой лихорадки, тяжелой дыхательной недостаточности, кашля и анорексии. Начало заболевания быстрое, и заболеваемость и смертность высоки. Один из способов контроля инфицирования бактериями Actinobacillus pleuropneumoniae (в дальнейшем также называемыми «АРР») представляет собой программы вакцинации. В таких программах были использованы пассированные бактерины, но известно об их тяжелых побочных действиях. В настоящее время широко используются субъединичные вакцины на основе токсинов АРР.

АРР продуцирует так называемые RTX-токсины (RTX обозначает повтор в токсине). Наличие этих RTX-токсинов вносит большой вклад в патогенную природу этой бактерии. RTX-токсины были подробно рассмотрены ранее и описаны в литературе. Как хорошо известно, не все серотипы АРР продуцируют все RTX-токсины. Например, серотипы 1, 5, 9 и 11 продуцируют ApxI и ApxII. Серотипы 2, 3, 4, 6 и 8 продуцируют ApxII и ApxIII. Серотип 10 продуцирует лишь ApxI, и серотипы 7 и 12 продуцируют лишь ApxII. Существующие на сегодняшний день коммерчески доступные вакцины против АРР основаны на токсинах ApxI, ApxII и ApxIII. Относительно недавно было обнаружено, что все серотипы АРР продуцируют четвертый RTX-токсин, в настоящее время называемый ApxIV (смотрите ЕР 0875574).

Широко известно, как получать RTX-токсины ApxI или ApxIII посредством культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae в жидкой культуральной среде. В частности, ранее в ЕР 0453024 описан способ получения ApxI (смотрите «пример 2», абзац 2 «Очистка и характеристика гемолизина», подпункт «Способы») или ApxIII (смотрите «пример 4», абзац 2 «Очистка и характеристика макрофагального токсина Арр (Mat)», подпункт «Способы»). Отмечено, что использованный ApxI должен обозначаться «HLY», тогда как ApxIII, как правило, обозначали «Mat» (смотрите статью Frey et al. в журнале J Gen Microbiol. , август 1993 года; 139(8): 1723-8). Среда должна поддерживать рост бактерий АРР. Хорошо известно, как составить среду, которая обеспечивает рост бактерий. Классические культуральные среды изначально разрабатывались Иглом, Хэмом и другими в 1950-60 гг. Они обнаружили, что среда, которая удовлетворяет основные потребности роста, должна содержать неорганические соли, источник азота (например, в форме азотсодержащих соединений, таких как пептиды или белки), источник углерода и витамины. Среды преимущественно забуферивают для предотвращения их либо от закисления, либо от защелачивания. В этом основном рецепте доступно большое число различных составов. Например, для обеспечения аминокислотами можно выбрать компоненты животного происхождения, но также можно выбрать химически определенные аминокислоты. В отношении других соединений также возможно большое число вариантов. На самом деле, составить среду, которая обеспечивает рост бактерий, относительно просто. Тем не менее, для оптимизации роста и/или получения метаболитов может потребоваться некоторое время на разработку, в частности, если предпочтительна среда, которая не содержит сыворотки или других компонентов животного происхождения. Стратегии улучшения ферментационной среды, тем не менее, хорошо известны в данной области и подробно описаны в литературе (смотрите, например, обзорную статью Kennedy и Krouse в журнале Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) 23, 456-475). Такая оптимизация составляет часть рутинных экспериментов в лаборатории ферментации. В случае культивирования АРР часть среды по существу составляет NAD (никотинамидадениндинуклеотид), поскольку бактерия АРР является NAD-зависимой. В отсутствие NAD среда не будет поддерживать рост бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae и поэтому может не рассматриваться в качестве жидкой среды для поддержания роста АРР с точки зрения настоящей заявки и прилагаемой формулы изобретения. Жидкие среды для поддержания роста бактерий или компоненты для составления таких сред коммерчески доступны у большого числа фирм, таких как Sigma Aldrich, Quest International, Oxoid, Becton Dickinson, Pharmacia, VGD Inc, Mediatech, Invitrogen, Marcor, Irvin Scientific и т.д.

Несмотря на то, что в предшествующем уровне техники предлагаются способы получения RTX-токсинов ApxI и ApxIII путем культивирования АРР, желательно улучшить выход продукции. К настоящему моменту попытки улучшить выход продукции, главным образом, были нацелены на скорость продукции токсинов в стационарную фазу культивирования АРР, поскольку известно, что максимальная продукция RTX-токсинов наблюдается при высокой плотности клеток, то есть в конце экспоненциальной фазы роста (смотри, например, Microbial Pathogenesis 37 (2004) 29-33). Эти попытки не привели к существенному улучшению полного выхода продукции. Неожиданно, тем не менее, заявитель обнаружил, что при пропускании через среду воздуха во время фазы продукции (то есть во время фазы роста и/или стационарной фазы бактерий АРР) указанных токсинов Actinobacillus pleuropneumoniae, если содержание в воздухе углекислого газа выше нормального атмосферного уровня, продукция RTX-токсинов существенно повышается. На самом деле, вообще известно о применении повышенного уровня углекислого газа в процессе культивирования колоний бактерий на чашках (смотри, например, патент США 6019984: ПРИМЕРЫ «Бактериальные штаммы и условия роста»). Тем не менее, это относится к культивированию колоний бактерий, причем бактерии затем используют для инокуляции ферментеров. На этой стадии происходит лишь рост самих бактерий, но не продукция RTX-токсинов (по меньшей мере на существенном уровне). Как только бактерии АРР переносят в жидкую среду для подращивания до высокой плотности клеток, подходящей для получения RTX-токсина, в предшествующем уровне техники предлагается обойтись без повышенного уровня углекислого газа. Это, конечно, согласуется с предположением предшествующего уровня, указанным в данном документе выше, что максимальная продукция Арх в ферментерах происходит лишь при высокой плотности клеток, то есть в конце экспоненциальной фазы роста. На этой стадии рост клеток закончился и вообще не имеет никакого значения, и, таким образом, углекислый газ ранее полагали несущественным. Более того, бактерии АРР сами продуцируют углекислый газ при образовании RTX-токсинов. Таким образом, полагают, что целенаправленное добавление в среду углекислого газа даже подавляет продукцию токсина. Эти факты объясняют, почему углекислый газ никогда не рассматривался в качестве стимулирующего фактора для получения RTX-токсина. Причина, тем не менее, почему углекислый газ стимулирует продукцию ApxI и ApxIII, не ясна, особенно если учесть, что углекислый газ не оказывает положительного влияния на уровень продукции RTX-токсина ApxII.

Отмечено, что существует большое число техник, позволяющих пропускать воздух через среду. Широко используемый подход - пропускать воздух с помощью устройства, которое позволяет воздуху поступать где-либо в среду (то есть под поверхность среды) в виде пузырьков. Такие устройства могут иметь одну единственную насадку или большое число насадок в зависимости, среди прочего, от того, имеется ли желание установить (приблизительно) ситуацию равновесия в среде, и если это так, то как быстро это равновесие должно достигаться. В любом случае пропускание воздуха через среду противоречит применению свободного пространства воздуха над жидкостью и основано, главным образом, просто на диффузии. Было обнаружено, что такая техника приводит к неадекватным результатам. «Воздух» в контексте настоящего изобретения означает газообразную среду, содержащую один или несколько газообразных компонентов, которые обычно присутствуют в атмосферном воздухе, таких как кислород, азот, диоксид углерода, гелий, неон, аргон, ксенон, радон и т.д. «Нормальный атмосферный уровень углекислого газа» составляет 0,04% объема СО₂ к общему объему воздуха.

В одном из вариантов осуществления воздух пропускают во время экспоненциальной фазы роста бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae. Экспоненциальная фаза роста в противовес тому, что было описано в предшествующем уровне техники, представляет собой фазу, которая является частью всей фазы продукции RTX-токсинов (наряду со стационарной фазой). Неожиданно заявитель обнаружил, что пропускание углекислого газа во время экспоненциальной фазы роста приводило к очень существенной стимуляции продукции RTX-токсина, так что даже в конце этой фазы в ферментере присутствует экономически значимое количество токсина. Поэтому в этом варианте осуществления предлагается выбрать завершение ферментации в конце экспоненциальной фазы роста или в начале стационарной фазы. Важное преимущество заключается в том, что это может сократить значительное время продукции, а также в том, что количество липополисахаридов в конечном продукте может быть снижено.

В другом варианте осуществления, где среду забуферивают (т.е. добавляют вещество, которое минимизирует изменение кислотности раствора при добавлении в раствор кислоты или основания), ее забуферивают, используя бикарбонат (т.е. соль, содержащую ионы НСО₃ ^-). При использовании бикарбонатного буфера обнаружено, что эффект снижения величины рН, присущий избытку углекислого газа, может быть очень эффективно нейтрализован. Очевидно, используя такой буфер, например, натрий-бикарбонатный или бикарбонатный буфер с другим щелочным металлом, в среде будет почти немедленно достигнуто (приблизительно) равновесное состояние.

В другом варианте осуществления воздух пропускают через среду при постоянном потоке. На самом деле, может быть разработано большое число различных способов пропускания газа через среду. Один из них представляет собой пульсирующий поток воздуха, имеющего исключительно высокое содержание углекислого газа (вплоть до, например, 90%). Тем не менее, авторы обнаружили, что очень хорошие результаты могут быть получены при постоянном потоке. При таком постоянном потоке в воздухе могут быть использованы умеренные уровни углекислого газа. Это создает преимущество в том, что буфер будет способен лучше поддерживать величину рН около равновесной величины в любое время. Отмечено, что постоянный поток не обязательно означает, что добавление углекислого газа вообще не прерывается в некоторые точки времени. Например, короткий перерыв потока в процессе культивирования не исключает того, что до и после этого перерыва поток постоянен. В одном из вариантов осуществления воздух пропускают непрерывно в течение экспоненциальной фазы роста бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae, т.е. во время экспоненциальной фазы роста поток не должен быть прерван.

В одном из вариантов осуществления содержание углекислого газа составляет до 10 об.%. В этом варианте осуществления максимальное волюметрическое содержание углекислого газа в воздухе составляет 10%. Выше этого уровня возможно, что буфер будет не способен обеспечивать равновесие все время при высокой скорости. Это может отрицательно влиять на выход RTX-токсина. В предпочтительном варианте осуществления содержание углекислого газа составляет 5 об.%. При этом содержании углекислого газа были получены хорошие результаты, а также с экономической точки зрения это предпочтительное количество углекислого газа, поскольку такая смесь коммерчески доступна и очень дешева.

В одном из вариантов осуществления, в котором RTX-токсин представляет собой ApxI, культуральная среда содержит бороглюконат кальция. В действительности, широко известно, что транскрипционная активность оперона ApxI усиливается при добавлении в ростовую среду кальция (смотрите Microbiol Pathogenesis 37 (2004) 29-33). Были обнаружены некоторые преимущества при использовании бороглюконата (2,3-дигидрокси-3-[2-гидрокси-5-(гидроксиметил)-1,3,2-диоксаборолан-4-ил]пропаноата) для образования комплекса с ионами кальция. Во-первых, показано, что часто встречающаяся проблема преципитированных солей кальция в ходе процесса, в частности фильтры, которые склонны забиваться, может быть предотвращена или по меньшей мере существенно снижена. Далее показано, что можно получать ApxI на уровне, который существенно выше по сравнению с уровнем, достигаемым способами предшествующего уровня техники, в которых используются другие комплексообразующие агенты, такие как ЭДТА. Очевидно, используя этот конкретный комплексообразующий агент, так что среда содержит комплекс кальций-бороглюконат (т.е. 2,3-дигидрокси-3-[2-гидрокси-5-(гидроксиметил)-1,3,2-диоксаборолан-4-ил] пропаноат кальция, также известный как D-глюконовая кислота, циклический 4,5-сложный эфир с борной кислотой, кальциевая соль 2:1), может быть предотвращена значительная преципитация ионов кальция с другими отрицательными ионами, в то же время ионы кальция остаются способными усиливать транскрипционную активность оперона ApxI бактерии Actinobacillus pleuropneumoniae.

Хотя это несущественно для настоящего изобретения, среда может не содержать компонентов животного происхождения. Недостаток многих способов предшествующего уровня техники заключается в том, что они основаны на применении сред, содержащих компоненты животного происхождения, таких как колумбийская питательная среда. Другие компоненты животного происхождения, упоминаемые в предшествующем уровне техники, представляют собой, например, модифицированную колумбийскую питательную среду или сердечно-мозговую инфузионную среду. Как хорошо известно, применение компонентов животного происхождения имеет некоторые существенные недостатки. Во-первых, химическая композиция может заметно варьировать между партиями продукции. Кроме того, добавки животного происхождения могут быть контаминированы инфекционными агентами. Самое опасное - это присутствие прионов, вызывающих TSE у людей или животных. Можно просто выбрать среду, которая не содержит компонентов животного происхождения (часто обозначаемую как среда «ACF»). «Компонент животного происхождения» в этом смысле означает любой компонент, который присутствует как таковой у животного (например, кровь или белок) или происходит из такого компонента (например, модифицированная сыворотка, полученная из крови, или аминокислоты, полученные из белка). Заявитель, тем не менее, обнаружил, что эффективность продукции ApxI значительно ниже при использовании таких сред ACF по сравнению со средами, содержащими компоненты животного происхождения, даже если концентрация кальция находится на достаточном уровне. Не касаясь теории, возможно, что при использовании сыворотки проблема преципитации кальциевой соли стоит не столь остро благодаря наличию агентов, которые образуют растворимые комплексы ионов кальция. В любом случае при использовании бороглюконата для образования комплекса с ионами кальция может быть получено существенное повышение выхода ApxI, неожиданно получая выход, который даже выше, чем выход, получаемый с помощью принятой среды, содержащей сыворотку.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Бактериальный штамм и среды

Исследования осуществляли, используя штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, продуцирующий ApxI, серотип 10, далее в данном документе называемый АРР 10, и штамм, продуцирующий ApxII и ApxIII, а именно штамм серотипа 2, далее в данном документе называемый АРР 2. Во всех случаях рабочий посевной материал этих штаммов восстанавливали, используя чашки с основой колумбийского кровяного агара (BAB) (продукция фирмы Becton, Dickinson USA). Использованные жидкие среды представляли собой либо колумбийскую питательную среду (продукция фирмы Becton, Dickinson USA), либо среду, не содержащую компонентов животного происхождения (называемую «ACF»). Последняя среда содержала в качестве буфера смесь К₂НРО₄ (14,6 г/л) и NaH₂ PO₄ (3,6 г/л) и, кроме того, NaNO₃ (0,2 г/л), 50% раствор глюкозы (10 мл), дрожжевой экстракт (15 г/л) (продукция фирмы Becton, Dickinson), следовые элементы (например, 2,5 мл раствора SL-10, указанного в руководстве Handbook of Microbiological Media, 3^rd rdition, Ronald Atlas, CRC press, 2004), и 10 мМ раствор аминокислот (содержащий все 20 аминокислот, за исключением триптофана). Альтернативная протестированная среда, не содержавшая компонентов животного происхождения (называемая «ACF-alt»), содержала цистеин·HCl (0,1 г/л), NaNO ₃ (0,5 г/л), KCl (0,1 г/л), следовые элементы (смотрите выше), 50% раствор глюкозы (10 мл) и 10 мМ раствор аминокислот (смотрите выше), буфер HEPES (6 г/л; например, продукция фирмы Sigma Aldrich) и дрожжевой экстракт (10 г/л).

Эти среды использовали в прекультурах и ферментациях. Никотинамидадениндинуклеотид (0,01%) использовали в прекультурах и ферментациях. Все среды стерилизовали фильтрацией с диаметром пор 0,22 мкм. Перед использованием в ферментациях среды нагревали при 85°С в течение одной минуты.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Прекультура

Рабочие посевные материалы штаммов АРР высевали на чашку с колумбийским агаром ВАВ и инкубировали в течение приблизительно 24 часов при 37°С. Несколько колоний отбирали для инокуляции сосудов объемом 500 мл, содержащих по 75 мл колумбийской питательной среды. Сосуды инкубировали в течение приблизительно 6 часов при 37°С со встряхиванием для образования прекультуры. С помощью этих прекультур осуществляли несколько ферментаций.

Культивирование в ферментере SIXFORS

В ферментер SIXFORS (продукция фирмы Infors AG, Switzerland), содержащий приблизительно 400 мл культуральной среды, добавляли в качестве инокулюма около 20 мл прекультуры. Температура культивирования составляет 37°С, рН 7,2±0,1 (посредством добавления 4 н. раствора гидроксида натрия или 4 н. раствора уксусной кислоты) и аэрацию осуществляют при 50% рО₂. Культивирование в ферментере останавливали после около 24 часов.

Культивирование в ферментере Biostat

В ферментеры Biostat C (продукция фирмы B. Braun Biotech, Germany), которые содержали 10 л среды, в качестве инокулюма добавляли 500 мл прекультуры АРР. Использовали те же параметры, как в ферментерах SIXFORS. Тем не менее, уровень углекислого газа повышали, сохраняя постоянный поток воздуха 1 vvm (объем газа на объем среды в минуту) для газовой смеси воздух/СО₂ 95/5 об/об. Это приводит к параметрам аэрации, имеющим рСО₂ около 5%. Культивирование в ферментере останавливали в конце экспоненциальной фазы через приблизительно 8,5 часа.

Культивирование в масштабе опытной установки

Эксперименты на опытной установке осуществляли в стерилизуемом ферментере объемом 100 л. Оси мешалки оснащали тремя шестилопастными турбинными мешалками Раштона. Ферментер заполняли 75 литрами среды и инокулировали 3 литрами прекультуры. Температуру поддерживали при 37°С, рН при 7,3 с помощью автоматического рН-контроллера, используя 20% (масса/объем) раствор NaOH и 8 н. раствор уксусной кислоты. Стандартное культивирование осуществляли при повышенном давлении СО₂ в свободном пространстве (500 мбар), и мешалки вращались при постоянной скорости 250 об/мин. Давление кислорода не контролировали. Для экспериментов культивирования с распылением СО₂ среду дополняли NaHCO₃ до конечной концентрации 10 мМ и аэрировали постоянным потоком воздуха 0,25 vvm воздуха, обогащенного 0,014 vvm СО₂. Это приводит к рСО₂ около 5%. В случае штамма АРР 10, среду дополняли 25 мМ раствором CaCl ₂ и аэрацию проводили при 50% рО₂.

Анализ

В конце каждого эксперимента образцы культур бактериальных клеток асептически забирали из ферментера для определения оптической плотности при 648 нм и уровня ApxI, ApxII и/или ApxIII (ELISA; единицы на мл) и необязательно уровня LPS (анализ LAL; единицы×10⁵ на мл).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Первый эксперимент проводили в масштабе опытной установки со штаммом АРР 2 для исследования влияния углекислого газа, пропущенного через среду (эксперименты с «распыленным» СО₂). Использованная среда представляла собой колумбийскую среду. Результаты представлены в таблице 1. Приводятся результаты двух экспериментов (exp 1 и exp 2).

Таблица 1
Способ культивирования	Время (ч)	OD648	ApxII	ApxIII	LPS
Стандартный, ехр 1	12	1,35	44	130	0,36
Стандартный, ехр 2	11	1,47	77	146	0,32
Распыление СО2, ехр 1	5	1,42	52	242	0,34
Распыление СО2, ехр 2	5	1,86	38	287	0,09

Из этих результатов становится понятно, что продукция ApxIII может быть практически удвоена за счет прохождения углекислого газа через среду при уровне выше нормального атмосферного давления. В отношении уровня ApxII не наблюдалось абсолютного повышения. Концентрация LPS в конце экспоненциальной фазы роста (что являлось концом каждого эксперимента таблицы 1) сильно не различалась. Но поскольку уровень ApxIII вдвое выше, количество LPS на дозу ApxIII в конечном продукте будет составлять максимально около половины количества LPS продукта, полученного со стандартными параметрами.

Второй эксперимент осуществляли также в масштабе опытной установки, но теперь со штаммом АРР 10, для изучения влияния углекислого газа, пропущенного через среду (эксперименты с «распылением» СО₂), на получение ApxI. Использованная среда представляла собой колумбийскую среду. Результаты представлены в таблице 2. Вновь приводятся результаты двух экспериментов (exp 1 и exp 2).

Таблица 2
Способ культивирования	Время (ч)	OD648	ApxI	LPS
Стандартный, ехр 1	12	2,99	520	4,10
Стандартный, ехр 2	11	3,11	643	6,10
Распыленный СО2, ехр 1	6	3,08	1074	3,36
Распыленный СО2, ехр 2	5	2,99	1774	5,48

Как становится понятно из таблицы 2, в отношении ApxI могут быть получены сопоставимые результаты.

В третьем эксперименте изучали влияние углекислого газа, пропущенного через среду, используя среду ACF, описанную в данном документе выше. Первое культивирование осуществляли в ферментере SIXFORS в отсутствие дополнительного углекислого газа, пропускаемого через среду. Второе культивирование осуществляли в ферментере Biostat C при наличии дополнительного углекислого газа, пропущенного через среду, как указано в данном документе выше. Вследствие того факта, что в ферментере Biostat условия могут контролироваться несколько лучше, ожидалось, что выход токсина Арх будет (все параметры равнозначны) примерно в 2 раза выше (максимально в 3 раза), чем в ферментере SIXFORS. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Способ культивирования	Время (ч)	OD660	ApxIII
ACF, без распыления СО 2	7	4,00	1003
ACF, с распылением СО2	4,75	3,13	4575

Поскольку уровень ApxIII в ферментере Biostat примерно в 4 1/2 раза выше, можно сделать вывод, что при использовании среды ACF углекислый газ, пропущенный через среду, также положительно влияет на продукцию Apx.

В четвертом эксперименте, осуществленном в ферментере SIXFORS со штаммом АРР 10, авторы изучали, возможно ли добавить кальций в форме бороглюконатного комплекса (вместо кальция, не образовавшего комплекса). Концентрацию бороглюконата варьировали между 40, 50 и 70 мМ. Культивирование останавливали в конце экспоненциальной фазы роста. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Способ культивирования	ApxI
ACF-alt, без добавления кальция, 5% СО 2	0
ACF-alt, добавлен 40 мМ Са-бороглюконат, 5% СО2	520
ACF-alt, добавлен 50 мМ Са-бороглюконат, 5% СО2	357
ACF-alt, добавлен 70 мМ Са-бороглюконат, 5% СО2	222

Исходя из результатов, можно сделать вывод, что для получения удовлетворительных уровней ApxI кальций может присутствовать в форме комплекса кальций-бороглюконат. Преимущество этого состоит в том, что преципитаты кальция больше не влияют отрицательным образом на ход обработки среды (в частности на процесс фильтрации). По-видимому, более высокие концентрации бороглюконата отрицательно влияют на выход продукции.