способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника

Формула изобретения

Способ in vitro генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника, включающий совместное культивирование неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больных раком яичника с дендритными клетками (ДК), активированными опухолевым антигеном и полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, отличающийся тем, что совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых антиген-активированных ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18, а для получения зрелых ДК после двух суток культивирования прилипающей фракции МНК полученные незрелые ДК сначала сутки активируют лизатом аутологичных клеток рака яичника, а затем в течение суток проводят созревание нагруженных лизатом ДК в присутствии рчФНО- .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака яичника

Эпителиальная карцинома яичников, на сегодняшний день, является самой частой причиной смерти среди женщин с гинекологическими злокачественными новообразованиями. Пик заболеваемости приходится на 6-7-ю декаду жизни, при этом средний возраст заболевших составляет 58 лет. При стандартном лечении, включающем оперативное вмешательство в сочетании с химиотерапией или/и радиотерапией, у 90% пациентов развивается рецидив заболевания. И уровень 5-летней выживаемости не превышает 15%. Установлено, что в процесс развития и рост опухоли могут быть вовлечены различные механизмы, такие как дефекты иммунной системы в индукции эффекторной фазы противоопухолевых ответов; недостаточная презентация антигена молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса или костимуляторными молекулами. Большинство опухолевых антигенов - это неизмененные аутоантигены, к которым толерантна иммунная система. В результате - неэффективная презентация антигена или анергия Т-клеточного иммунного ответа. Одной из перспективных стратегий коррекции таких дефектов является повышение эффективности презентации опухолевого антигена с помощью дендритных клеток, основных индукторов цитотоксического ответа. (I.Wertel, G.Polak, W.Bednarek, B.Barczynr ski, J.Rolinr ski, and J.Kotarski Dendritic Cell Subsets in the Peritoneal Fluid and Peripheral Blood of Women Suffering from Ovarian Cancer// Cytometry Part В (Clinical Cytometry). - 2008. - № 74 В - P. 251-258).

Дендритные клетки (ДК) - гетерогенная по происхождению, морфологии и выполняемым функциям популяция иммунокомпетентных клеток, которые принимают участие практически во всех видах иммунных реакций. ДК являются основными антигенпрезентирующими клетками, что обусловливает их непосредственное и важнейшее участие в формировании эффективного специфического иммунного ответа, кроме того, ДК обладают способностью продуцировать провоспалительные цитокины (ФНО-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-1, ИЛ-12 и др.), что приводит к активации функций других иммунокомпетентных клеток, участвующих в противоопухолевой защите. Основной функцией дендритных клеток является их уникальная способность презентировать антигены не только «наивным» Т-лимфоцитам, но и праймированным Т-клеткам памяти в паракортикальных зонах вторичных лимфоидных органов, а также и В-лимфоцитам. (Steinman R.M. The dendritic cell system and 1st role in immunogenicity // Ann. Rev. Immunol. - 1991. - № 9. - Р. 271-296).

В процессе активации в периферии незрелые ДК, обладающие высокой способностью захватывать антиген путем эндо- и микропиноцитоза, подвергаются процессу созревания в ответ на провоспалительные стимулы, происходящие от патогенов или от мертвых клеток. Одним важным результатом процесса созревания является то, что ДК приобретают способность мигрировать в лимфоузел. В процессе созревания ДК приобретают повышенную экспрессию хемокинового рецептора и становятся отвечающими на хемокиновые лиганды, продуцирующие в афферентных лимфатических путях и лимфоузлах. Когда антиген-нагруженные ДК достигают лимфоузла, то там они подвергаются дополнительному этапу активации, именуемому «лицензирование», в ответ на различные стимулы, которые экспрессируются когнитивными Т-клетками. (Sporri R., eSousa R. C. Inflammatory mediators are insufficient for full dendritic cell activation and promote expansion of CD4+Т cell populations lacking helper function. //Nat. ImmunoL - 2005. - № 6. - Р. 163-170).

Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных раком яичника путем культивирования в полной среде с добавлением рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (рчИЛ-4) в течение 6 дней, причем среда с цитокиновым коктейлем менялась каждые 2 дня. Окончательное созревание дендритных клеток достигалось путем добавления рчФНО- , рчИЛ-1 , простогландина Е (PGE2a) на 48 часов. Затем получали антиген-активированные дендритные клетки путем сокультивирования дендритных клеток и лизата, полученного из аутологичных опухолевых клеток с применением катионного липида (DOTAP) для оптимальной доставки внутрь дендритных клеток. Далее в течение 10 дней антиген-активированные дендритные клетки сокультивировали с Т-клетками в присутствии рекомбинантного человеческого ИЛ-2 (рчИЛ-2). Была показана стимуляция цитотоксической способности Т-клеток (цитотоксический тест) и увеличение количества ИФН- -продуцирующих клеток.(A.D.Santin, S.Bellone, M.Palmieri, В.Bossini, S.Cane, Е.Bignotti, J.J.Roman, M.J.Canon & S.Pecorelli Restoration of tumor specific human leukocyte antigens class I-restricted cytotoxicity by dendritic cell stimulation of tumor infiltrating lymphocytes in patients with advanced ovarian cancer // Int J Gynecol Cancer.- 2004.- № 14ю - Р. 64-75).

Описанный способ получения антиген-активированных дендритных клеток как достаточно длителен (8 суток), так и требует использования большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4, рчИЛ-1 , рчФНО- , PGE2a и рчИЛ-2), а также применения катионого липида (DOTAP) для трансфекции дендритных клеток опухолевым лизатом. Все это ведет к значительному удорожанию технологии.

Тип иммунного ответа с преимущественным развитием тканевого воспаления, гуморальных или клеточных реакций определяется в первую очередь тем, как патоген взаимодействует с антиген-представляющими клетками и какие цитокины при этом синтезируются. Основным регулятором клеточного иммунного ответа является Ил-12. Впервые описан в 1989 г. в качестве активатора натуральных киллеров (НК) и цитотоксических лимфоцитов. Источники его синтеза - моноциты, макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, В-лимфоциты. Этот цитокин стимулирует дифференцировку Т-лимфоцитов в Тh1, усиливает синтез ИФН- и IgG и тем самым индуцирует противоопухолевый иммунитет. Зачастую ИЛ-12 применяется с другим провоспалительным цитокином ИЛ-18, который также активирует продукцию ИФН- Т- и НК-клетками. Показано, что такой синергетический эффект ИЛ-12 и ИЛ-18 вызывает стимуляцию продукции ИНФ- (Munk. R. B., Sugiyama К., Ghosh P., Sasaki C. Y., Rezanka L., Banerjee K., Takahashi H., Sen R., Longo D. L. Antigen-independent IFN- production by human naive CD4+Т cells activated by IL-12 plus IL-18 // Plos One.- 2011- Vol.6.- № 5.-P. 18553).

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа генерации антиген-специфических цитотоксических клеток из клеток периферической крови больных раком яичника.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных раком яичника культивируют с антиген-активированными дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Антигенную активацию ДК проводят с помощью аутологичных опухолевых клеток, а для созревания ДК используют рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО- ). Для эффективной модуляции противоопухолевой защиты совместное культивирование зрелых антиген-активированных ДК и неприлипающей фракции МНК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина (рчИЛ-12 и рчИЛ-18), что позволяет повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток. Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность необходимых для стимуляции и поддержания направленной дифференцировки наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа, а также применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование аутологичных опухолевых антигенов и рчФНО- , что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов (увеличение цитотоксического ответа), а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 3-х суток.

Предлагаемое изобретение повышает эффективность генерации цитотоксических клеток, а также позволяет сократить сроки сокультивирования ДК и МНК, что в итоге приводит к снижению стоимости способа.

Техническим результатом изобретения является генерация in vitro антиген-специфических клонов Т-клеток с активностью Т-хелперов 1 типа, необходимых для формирования эффективного противоопухолевого ответа против клеток рака яичника.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенные из периферической крови больных раком яичника прилипающие фракции мононуклеарных клеток культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО₂ при 37°С с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования к полученным незрелым ДК добавляется опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 24 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится рчФНО- в дозе 25 нг/мл.

Полученные дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.

Для оценки потенциальной цитотоксической активности мононуклеарных клеток больных раком яичника, культивированных с антиген-стимулированными дендритными клетками, определяли содержание клеток, содержащих внутриклеточный мономерный белок перфорин - фактор цитотоксичности, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране, что приводит к лизису опухолевых клеток (табл. 1).

Таблица 1. Количество перфорин-позитивных мононуклеарных клеток больных раком яичника, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-12 и интерлейкином-18 т vitro (n=7).

Группы	Количество перфорин-позитивных клеток (%)
МНК+рчИЛ-12+рчИЛ-18	12,6±4,1
МНК+ДК (без антигена)	12,8±4,4
МНК+ДК (с антигеном)	11,5±2,5
МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-12+рчИЛ-18	16,2±5,4 a,b

Примечание: Данные представлены в виде среднего значения и ошибки среднего (М±m). Достоверность определена с помощью критерия Уилкоксона при уровне значимости р<0.05.

МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток.

МНК+рчИЛ-12+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся опухолевый антиген.

МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-12+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

а - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой МНК+рчИЛ-12+рчИЛ-18.

b - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой МНК+ДК (без антигена)+рчИЛ-12+рчИЛ-18.

Таким образом, показано, что совместное культивирование зрелых аутологичных ДК и неприлипающей фракции МНК совместно с рекомбинантным человеческим интерлейкином-12 и рекомбинантным человеческим интерлейкином-18 приводит к достоверному повышению содержания перфорин-позитивных клеток с потенциальной цитотоксической активностью.

Для определения модуляции цитотоксической активности Т-лимфоцитов с помощью полученных ДК оценивали гибель опухолевых клеток в цитотоксическом тесте. Для этого к мононуклеарным клеткам больного, которые предварительно сокультивировали с антиген-активированными ДК, добавляли аутологичные опухолевые клетки. Цитотоксичность оценивали по увеличению содержания внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы в кондиционной среде в результате гибели опухолевых клеток. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности, что служит показателемактивации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл. 2).

Таблица 2. Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток больных раком яичника, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-12 и интерлейкином-18 in vitro (n=9).

Группы	Количество позитивных клеток (%)
МНК+рчИЛ-12+рчИЛ-18	13,5±3,5
МНК+ДК (без антигена)	24,5±6,4
МНК+ДК (с антигеном)	41,9±6,5a,b
МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-12+рчИЛ-18	51,4±9,1 a,b,c

Примечание: Данные представлены в виде среднего значения и ошибки среднего (М±m). Достоверность определена с помощью критерия Уилкоксона при уровне значимости р<0,05.

МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток.

МНК+рчИЛ-12+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся опухолевый антиген.

МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген.

МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-12+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

а - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой МНК+рчИЛ-12+рчИЛ-18.

b - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой МНК+ДК (без антигена).

с - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с группой МНК+ДК (с антигеном).

Совместное культивирование ДК и МНК больных раком яичника в сочетании с рчИЛ-12 и рчИЛ-18 является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их цитотоксического противоопухолевого ответа. Использование рекомбинантного человеческого ИЛ-12 и ИЛ-18 для усиления индукции ответа Т-хелперов 1 типа статистически достоверно увеличивает цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток in vitro. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-12 и рчИЛ-18 in vitro.