сухая дифференциально-диагностическая питательная среда для обнаружения и учета e.coli и колиформных бактерий

Формула изобретения

Сухая дифференциально-диагностическая питательная среда для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий, содержащая питательную основу, дрожжевой экстракт, лактозу, 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид, бромтимоловый синий, агар микробиологический, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, высушенный с тергитолом 7 из расчета 0,1 г тергитола 7 на 6 г сухого панкреатического гидролизата рыбной муки, и дополнительно натрий додецилсульфат, натрий углекислый, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки с
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7)	5,5-6,7
Дрожжевой экстракт	4,0-6,0
Д(+)-лактоза, 1-водная	8,0-12,0
Бромтимоловый синий	0,07-0,09
Натрий додецилсульфат	0,08-0,12
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	0,023-0,026
Натрий углекислый	0,14-0,16
Агар микробиологический	8,0-14,0
рН	7,4±0,2

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий в воде, пищевых продуктах, клиническом материале и т.д.

Ведущими зарубежными фирмами выпускаются лактозный агар с тергитолом 7, либо Тергитол 7 агар на основе пептона или смеси панкреатических гидролизатов тканей животных и казеина, дрожжевого экстракта, мясного экстракта и лактозы, а так же содержат Тергитол 7, агар и индикатор - бромтимоловый синий Merck «Микробиология, 2004/2005, стр.168), HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), 1993, стр.223), Fluka (Scientific research 2003/2004, стр.1483), ООО «ГЕМ» (Среды бактериологические. Каталог 2009-2010, стр.88).

Недостатком коммерческих сред является сложность приготовления: требуется раздельная стерилизация базовой среды автоклавированием и стерилизация раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) методом мембранной фильтрации, т.к. ТТХ при повышенных температурах разрушается, что приводит к отсутствию дифференциации в отношении лактозоотрицательных, но восстанавливающих ТТХ бактерий.

В России нет коммерческой сухой питательной среды для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий с тергитолом 7. ГОСТ Р 52426-2005 (ИСО 9308-1:2000) «Вода питьевая», часть 1 « Метод мембранной фильтрации» регламентирует для обнаружения и количественного учета Е.coli и колиформных бактерий использование Лактозного ТТХ агара с гептадецилсульфатом натрия (среда с тергитолом 7) - лабораторного приготовления. Компонентное содержание в г/л представлено в табл.1.

Недостатком лактозного ТТХ агара с гептадецилсульфатом натрия (среда с тергитолом 7) лабораторного изготовления является сложность в приготовлении включающая раздельную подготовку базовой среды, растворов гептадецилсульфата натрия и 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ) с последующей раздельной стерилизацией и приготовление среды полного состава с соблюдением правил асептики, нестандартность.

Наиболее близкой к предлагаемой дифференциально-диагностической питательной среде для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий (лактозному агару с тергитолом 7) является селективная дифференциальная среда для выделения и учета Е.coli и колиформных бактерий в воде методом мембранной фильтрации лактозный агар с тергитолом 7 и ТТХ фирмы Merck, которая состоит из следующих компонентов, г/л:

Лактоза	20,0
Пептон	10,0
Дрожжевой экстракт	6,0
Мясной экстракт	5,0
Бромтимоловый синий	0,05
Тергитол 7	0,1
Агар	12,7

Дополнительно готовится стерильный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ), который затем вносится в базовую стерильную среду.

Недостатком этой среды является сложность приготовления и наличие специального оборудования для стерилизации мембранной фильтрацией.

До настоящего времени в России, в связи с отсутствием отечественной коммерческой среды с тергитолом 7, контроль воды методом мембранной фильтрации для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий проводят на среде Эндо, применение которой предусмотрено до 2010 г., на период, необходимый для накопления статистических данных по применению среды с тергитолом 7. (3)

Техническим результатом изобретения является создание отечественной сухой питательной среды, простота приготовления с сохранением стерильности не менее 10 суток, стабильность результатов по ростовым и дифференцирующим свойствам.

Технический результат достигается сбалансированностью компонентного состава среды, которая содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, высушенный с расчетным количеством тергитола 7, дрожжевой экстракт, лактозу, 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ), бромтимоловый синий, натрий углекислый, агар микробиологический и дополнительно натрий додецилсульфат при следующем соотношении компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки с
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7)	5,5-6,7
Дрожжевой экстракт	4,0-6,0
Д(+)-лактоза, 1-водная	8,0-12,0
Бромтимоловый синий	0,07-0,09
Натрий додецилсульфат	0,08-0,12
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	0,023-0,026
Натрий углекислый	0,14-0,16
Агар микробиологический	8,0-14,0
pH	7,4±0,2

Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование в качестве белковой основы панкреатического гидролизата рыбной муки с тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7), дополнительное содержание натрия додецилсульфата и отсутствие мясного экстракта. Количественное соотношение компонентов питательной среды, ее рН, обеспечивают среде сохранение стерильности готовой среды не менее 10 суток, ингибирующий эффект в отношении грамположительных микроорганизмов, хороший рост и первичную дифференциацию колиформных бактерий и Е.coli.

Пример 1. Для приготовления среды на стадии производства жидкого ПГРМ, в осветленный панкреатический гидролизат рыбной муки вносится тергитол 7 из расчета 0,1 г тергитола 7 на 6,0 г ПГРМ в пересчете на сухое вещество и высушивается на сушильной установке с виброкипящим слоем А1-ФМУ. Берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки с
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7)	5,5
Дрожжевой экстракт	4,0
Д(+)-лактоза, 1-водная	8,0
Бромтимоловый синий	0,07
Натрий додецилсульфат	0,08
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	0,023
Натрий углекислый	0,14
Агар микробиологический	8,0
рН	7,4±0,2

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят при постоянном перемешивании в течение 3-4 мин на медленном огне до полного расплавления агара. Охлаждают до температуры 40-50°С и разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки подсушивают при комнатной температуре, соблюдая правила асептики в течение 40-60 мин.

Предлагаемая среда обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10^-6:

Escherichia coli 3912/41 (055:К59),

Escherichia coli ATCC 25922,

Klebsiella pneumoniae 418,

Shigella sonnei «S-form,

Salmonella typhimurium 79

и ингибицию S.aureus Wood-46 из разведения 10^-3 через 20-24 ч инкубации при температуре (37±1)°С.

При этом колонии Е.coli 3912/41(055:К59), Е.coli АТСС 25922 - круглые желто-оранжевого цвета с желтой зоной, диаметром 2,0-3,0 мм; колонии К.pneumoniae 418 - круглые, слизистые, оранжевого цвета, диаметром 2,5-4,0 мм; колонии S.sonnei «S-form» - круглые, красно-коричневого цвета с синей зоной, диаметром 1,5-2,5 мм; колонии S. typhimurium 79 - красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной, диаметром 2,0-3,5 мм.

Дифференциально-диагностические свойства проверяют методом посева смеси равных объемов тест-штаммов Е.coli 3912/41(055:К59) и S. typhimurium 79 из разведения 10^-6.

Ингибирующие свойства среды проверяют посевом 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма S. aureus Wood-46 из разведения 10^-3 .

Результаты биологического контроля представлены в табл.2

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки с
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7)	6,1
Дрожжевой экстракт	5,0
Д(+)-лактоза, 1-водная	10,0
Бромтимоловый синий	0,08
Натрий додецилсульфат	0,1
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	0,025
Натрий углекислый	0,15
Агар микробиологический	11,0
рН	7,4±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки с
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7)	6,7
Дрожжевой экстракт	6,0
Д(+)-лактоза, 1-водная	12,0
Бромтимоловый синий	0,09
Натрий додецилсульфат	0,12
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	0,026
Натрий углекислый	0,16
Агар микробиологический	14,0
pH	7,4±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки с
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7)	4,9
Дрожжевой экстракт	3,0
Д(+)-лактоза, 1-водная	6,0
Бромтимоловый синий	0,06
Натрий додецилсульфат	0,06
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	0,023
Натрий углекислый	0,13
Агар микробиологический	5,0
рН	7,4±0,2

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к резкому ухудшению ростовых, а следовательно, и дифференцирующих свойств среды.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки с
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7)	7,3
Дрожжевой экстракт	7,0
Д(+)-лактоза, 1-водная	14,0
Бромтимоловый синий	0,1
Натрий додецилсульфат	0,14
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	0,027
Натрий углекислый	0,17
Агар микробиологический	17,0
рН	7,4±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и показывают ухудшение ростовых и дифференцирующих свойств среды.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда приготовленная в соответствии с примерами 1, 2, 3, обладает хорошими ростовыми свойствами, высокой точностью дифференциации Е.coli и колиформных бактерий от других энтеробактерий, подавляет рост стафилококка.

Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается резкое снижение чувствительности, изменение диаметра и морфологии колоний энтеробактерий.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая питательная среда имеет ряд преимуществ:

- для ее изготовления впервые разработана сухая питательная основа, содержащая панкреатический гидролизат рыбной муки с тергитолом 7;

- проста в приготовлении, не требует стерилизации автоклавированием, стерилизуется кипячением в течение 3-4 мин и может быть использована в течение 10-12 суток при условии хранения при температуре 2-8°С, при этом сохраняет дифференцирующие свойства в отношении лактозоотрицательных, но восстанавливающих ТТХ бактерий, которые окрашиваются в красно-коричневый цвет;

- не требует дробного внесения компонентов и отдельной стерилизации гепта-децилсульфата натрия (тергитола 7) автоклавированием в течение 15 мин при температуре 121°С и раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) методом мембранной фильтрации;

- не требует наличия специального оборудования и расходных материалов для стерилизации компонентов методом мембранной фильтрации;

- на предлагаемой среде энтеробактерий через 20 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С формируют колонии большего диаметра, что обеспечивает более точную дифференциацию и, как следствие, достоверную интерпретацию результатов.

Таблица 1.
Компонентный состав питательных сред различных фирм производителей, г/л
№ п/п	Компонентный состав питательных сред	Лактозный ТТХ агар с гептадецил-сульфатом натрия (среда с Тергито-лом-7) ГОСТ Р 52426-2005; ИСО 9308-1,2000	Лактозный агар с Тергито-лом-7 и ТТХ Merck	Тергитол-7 агар HiMedi»	Лактозный ТТС агар с Тергито-лом-7 ООО «ГЕМ»	Tergitol@-7 agar Fluka
1	Пептон	10,0	10,0	5,0	10,0	5,0
2	Пептический гидролизат тканей животных	-	-	-	-	-
3	Панкреатический гидролизат казеина	-	-	-	-	-
4	Мясной экстракт	5,0	5,0	-	5,0	-
5	Дрожжевой эксракт	6,0	6,0	3,0	6,0	3,0
6	Лактоза	20,0	20,0	10,0	20,0	10,0
7	Бромтимоловый синий	0,05	0,05	0,025	0,05
8	Агар	15,0-20,0	12,7	15,0	12,0	15,0
9	Тергитол-7	5 мл 0,2%-ного раствора на 100 мл	0.1	0,1	0,1	0,1
10	ТТХ	5 мл 0,05%-ного раствора на 100 мл	0,025		0,025

Таблица 2.
Сравнительная характеристика биологических показателей Лактозного ТТХ агара с тергитолом 7
п/п	Наименование тест-штаммов	Предлагаемая среда по примеру					Среды сравнения		Контроль роста тест-штаммов на ГРМ агаре
		1	2	3	4	5	Lactose TTC agar with Tergitol 7, Merck	Tergitol-7 Agar, Fluka
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	E.coli 055 3912/41	74	81	72	65	34	77	80	85
		2,5-3,0	2,5-3,0	2,5-3,0	2,3-2,5	1,0-1,5	2,2-2,5	1,4-1,8	2,0-3,0
		Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, светло-желтые со слабой желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг
									Круглые, бесцветные, гладкие
2	E.coliATCC 25922	82	79	85	36	28	68	81	96
		2,5-3,2	2,5-3,2	2,5-3,2	2,0-2,7	0,8-1,4	2,5-3,0	1,4-1,6	2,2-2,8
		Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, светло-желтые со слабой желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг
									Круглые, бесцветные,гладкие
3	S.enteritidis 11276	60	65	63	60	60	60	64	71
		2.3-2,7	2,3-2,7	2,3-2,7	2,3-2,7	1,2-1,4	3,0-3,5	1,4-2,0	1,2-1,5
		красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	Бледно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной
									Круглые, бесцветные, гладкие

Продолжение таблицы 2
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
4	S.typhimurium	69	75	65	39	26	72	84	96
	79	2,5-3,5	2,8-3,5	2,5-3,2	3,0-4,0	1,5-2,0	2,5-3,0	1,8-2,2	2,0-3,0
		красно-	красно-	красно-	Светло-	красно-	красно-	красно-
		коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	Круглые, бесцветные, гладкие
5	К.pneumonia 418	53	58	59	43	26	49	61	53
		3,0-4,0	3,0-4,0	3,0-3,5	2,5-4,0	3,0-3,5	2,5-3,7	1,8-2,0	3,0-3,5
		Круглые, слизистые, оранж., слабая желтая зона	Круглые, слизистые, оранж., слабая желтая зона	Круглые, слизистые, оранж., слабая желтая зона	Круглые, слизистые, желтые, слабая желтая зона	Круглые, слизистые, желтые, слабая желтая зона	Блестящие, слизистые, оранж., желтая зона,S -ф	Блестящие, слизистые, оранж.,
									Круглые, слизистые, бесцветные
6	К.oxytoca 2102	64	68 2,3-2,7 Круглые, желтые с желтой зоной вокруг	59 2,3-2,7 Круглые, желтые с желтой зоной вокруг	24 2,3-2,7 Круглые, светло-желтые со слабой желтой зоной вокруг	14	61	48	72
		2,3-2,7				2,3-2,7	2,0-2,3	2,5-3,2	2,5-3,0
		Круглые, желтые с желтой зоной вокруг				Круглые, желтые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг
									Круглые, слизистые, бесцветные

Продолжение таблицы 2
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
7	K pneumonia 3534/51	46	52	43	26	16	45	42	63
		3,0-4,0	3,0-4,0	3,0-4,0	3,0-4,5	1,5-2,5	3,0-3,5	2,0-2,5	2,5-3,5
		Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг
									Круглые, слизистые, бесцветные
8	S.sonnei "S-form"	58	55	52	25	15	45	43	64
		2,0-2,5	2,0-2,5	2,0-2,5	2,0-3,0	1,0-1,5	3,5-3,7	1,6-2,0
		Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, светло-коричневые со слабой синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг SR-форма	Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг SR-форма	1,5-2,0
									Круглые, бесцветные, гладкие
9	С.freundii 101/57	51	57	53	53	53	48	51	56
		1,6-1,8	1,6-1,8	1,6-1,8	1,2-1,5	0,8-1,2	1,8-2,0	1,2-1,5
		Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желтые - со слабой желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг	1,5-2,0
									Круглые, слизистые, бесцветные

Продолжение таблицы 2
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
10	P.aervginosa 27/99	48	46	50	38	18	22	30	59
		1,2-2,0	1,2-2,0	1,2-2,0	0,8-1,6	1,2-2,0	1,6-2,5	0,6-1,0	2,0-3,0
		красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	светло-коричневого цвета с неровным краем и со слабой синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной R-форма	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной R-форма
									Круглые, полупрозрачные, серо-зеленые
11	P.mirabilis 3177	51	58	53	21	15	50	Нет роста	Сплошное роение
		1,2-1,8	1,2-1,8	1,2-1,8	0,8-1,2	0,5-1,0	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной Очаговое роение
		красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	Светло-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной	красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной