способ получения спорового материала бактерий рода clostridium

Формула изобретения

Способ получения спорового материала бактерий рода Clostridium путем засева инокулятом и культивирования в подходящих условиях в питательной среде, включающей картофель, глюкозу, сернокислый аммоний и мел, отличающийся тем, что инокулят бактерий рода Clostridium получают в полноценной синтетической среде, а в процессе основного брожения на 18-28 ч развития культуры бактерий в зависимости от времени появления в одном поле зрения не менее 80-100 утолщенных форм клеток - клостридий в питательную среду добавляют н-бутанол в количестве 0,16-0,81 мас.%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения спорового материала бактерий рода Clostridium, используемых при получении органических растворителей (н-бутанола, ацетона и этанола) микробиологическим способом.

Органические растворители находят широкое применение во многих отраслях народного хозяйства: в производстве синтетической резины, шелка, при экстрагировании сырья для получения фармацевтических препаратов и органических продуктов. Наиболее ценным продуктом из получаемых органических растворителей является н-бутанол в связи с появлением нового направления в использовании н-бутанола в качестве биотоплива, альтернативного углеводородному [Дебабов В.Г. Биотопливо // Биотехнология. - 2008. - № 1. - С.3-14].

Для микробиологического производства н-бутанола в промышленных масштабах традиционно используют анаэробные сольвентогенные (т.е. образующие растворители: бутанол, этанол и этанол) бактерии рода Clostridium, а именно С.acetobutylicum, C.beijerinckii, C.saccharoperbutylacetonicum, С.saccharobutylicum и C.aurantibutyricum, С.thermosaccharolyticum, С.thermoaceticum.

Для стадии ацидогенеза используют штаммы анаэробных бактерий, таких как: Clostridium tyrobutyricum, C.thermobutyricum, C.butyricum. C.felsinium, C.pasteurianum, C.sporogems.

Приведенные штаммы отличаются по своей способности образовывать спирты и кислоты и утилизировать питательные субстраты.

Одним из старейших процессов в биотехнологии является микробиологический способ получения органических растворителей (н-бутанола, ацетона и этанола) с помощью бактерий Clostridium acetobutylicum.

В ацетонобутиловом процессе бактерии Clostridium acetobutylicum при сбраживании различных углеводов синтезируют одновременно три целевых продукта: н-бутанол, ацетон и этанол, процентное соотношение которых составляет 60:30:10. Это соотношение не является строго постоянным и может значительно варьировать в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения в зависимости от свойств штамма-продуцента, от особенности технологических процессов, видов сбраживаемого сырья и др.

Представители рода Clostridium являются анаэробными бактериями, способными образовывать споры. Вегетативные клетки имеют форму прямых палочек, одиночные или образующие пары. В конце экспоненциальной фазы роста клетки начинают накапливать гранулезу и формируют внеклеточную капсулу, что приводит к изменению их формы с палочковидной на сигаровидную (то есть форму клостридий). Морфологические изменения обычно ассоциированы с переключением метаболизма от синтеза кислот к синтезу нейтральных продуктов - спиртов и ацетона. В стареющей культуре клетки теряют подвижность и переходят к спорообразованию. Образующиеся споры имеют овальную или сферическую форму. Споры бактерий, попадая в благоприятную среду, прорастают в вегетативные клетки, которые растут и делятся, превращая субстраты в конечные продукты [Березина О.В., Захарова Н.В., Яроцкий СВ., Зверлов В.В. Микробные продуценты бутанола // Биотехнология. - 2011. - № 4. - С.8-25].

Основные этапы развития бактерий Clostridium, а именно Clostridium acetobutylicum, (по жизненному циклу) условно разделены на пять типов: начальный рост - клетки удлиненные (Тип I); распадение нитей на отдельные клетки (Тип II); стадия наиболее активной культуры (Тип III); начало автолиза и образования клостридий (Тип IV): образование спор (Тип V) [Логоткин И.С. Технология ацетонобутилового брожения. М. - 1958].

Процесс микробиологического синтеза органических растворителей начинают с оживления бактерий Clostridium, которые хранят в виде спор. Спорообразование является свойством бактерий противостоять неблагоприятным условиям. У бактерий Clostridium acetobutylicum, в частности, к спорообразованию переходит небольшое число клеток: обычно от 0,03 до 0,1×10⁸ кл/мл, что составляет к максимальному числу бактерий от 0,1 до 0,3%. Остальные бактерии в старых культурах отмирают и лизируются [Логоткин И.С. Технология ацетонобутилового брожения. М. - 1958].

Описаны различные способы получения спорового материала бактерий рода Clostridium. Так 25%-ную картофельную среду используют для Clostridium butyricum [SU 339191]; сложную питательную среду, содержащую гидролизат мяса, казеин, кукурузный экстракт, дрожжи, тиогликолевую кислоту, - для получения спор тест культуры Clostridium sporogenes [SU 1712408]; на картофельной мезге с добавлением сернокислого аммония, кукурузного экстракта, хлорного железа и мела получают споры Clostridium felsinium в количестве 5-6×10⁶ в 1 мл [SU 293045].

Известен способ получения спор бактериальных клеток Clostridium thermosuccharolyticum путем добавления в питательную среду двухвалентных катионов и медленно метаболизирующего источника углерода ксилана. В этом способе подбирают условия для получения синхронизированных клеток и ведения процесса таким образом, чтобы селективно индуцировать образование продуктов метаболизма и спор. В качестве источника двухвалентных катионов используют соли кальция [RU 2091483].

В многочисленных работах по способу получения н-бутанола и применения новых штаммов Clostridium acetobutylicum сообщается о способе хранения культуры ацетонобутиловых бактерий в виде спор в жидких питательных средах в запаянных пробирках при температуре от плюс 4°C до комнатной температуры. Практически из источника к источнику цитируется одна и та же фраза. Хранение штамма - в виде спор на жидкой питательной среде: 6% мучной среде, картофельно-глюкозной, на мелассно-мучной или синтетической др. При этом указанные среды используют также и для основного процесса брожения, а споровый материал перед посевом пастеризуют [RU 2381279, RU 2393213, RU 2404247, RU 2455350, RU 2458118].

Информации о количестве спор бактерий Clostridium acetobutylicum, образовавшихся в использованных жидких питательных средах, не обнаружено.

Известен способ получения спорового материала путем сбраживания мучных сред производственным штаммом Clostridium acetobutylicum [Промышленный регламент на производство растворителей: ацетона, бутанола и этанола способом брожения. ПР 64-35-89, г. Ефремов, 1989].

Заготовку спорового материала производят на 6%-ной мучной среде (кукурузной, ржаной или пшеничной). Применяют два варианта заготовки спор: а) массовый высев и б) способ разлива:

а) при массовом высеве каждую пробирку с приготовленной свежей стерильной мучной средой засевают самостоятельно и весь цикл брожения, заканчивающийся образованием спор, проводят в ней от начала до конца;

б) при разливе брожение проводят в одном большом стеклянном сосуде, из которого по окончании процесса сброженную среду разливают в стерильные пробирки, которые затем запаивают и в таком виде хранят при комнатной температуре.

По истечении двухмесячного срока хранения активность спорового материала проверяют путем повторных пересевов на свежие питательные среды через 24 часа (всего 5-7 пересевов). Окончательную проверку осуществляют на производственной 8%-ной мучной среде. Качество спорового материала оценивают по следующим техническим параметрам: отсутствие крахмала (через 24 часа); общее количество выделившихся газов брожения (не менее 30 г/л); содержание ацетона (не менее 6 г/л); содержание несброженных углеводов (не более 0,3%). Процесс проверки активности спорового материала является достаточно трудоемким и длительным.

Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ получения спорового материала бактерий Clostridium acetobutylicum на картофельно-глюкозной среде, следующего состава (мас.%): картофель - 25.0, глюкоза - 0,5, сернокислый аммоний - 0,15, мел - 0,2, вода - остальное, которую затем используют в качестве питательной среды для оживления этого спорового материала [RU 2080382]. Среда, содержащая картофель, по химическому составу богаче, чем содержащая муку. В клубнях картофеля содержатся белки (до 2%) углеводы (крахмал - 13,1-36,8%), клетчатка, пектиновые вещества, моно- и олигосахариды: глюкоза, фруктоза, сахароза, а также витамины и минеральные соли. Основные витамины - аскорбиновая кислота, весь комплекс витаминов группы В: В1, В2, В6, фолиевая и никотиновая кислоты. В состав картофеля входит свыше 20 различных химических элементов. Из минеральных солей преобладают соли калия (400-500 мг%) и фосфора (45-50 мг%), а также микро- и макроэлементы - железо, кальций, магний, марганец, никель, кобальт, йод. В картофеле присутствуют все вещества, необходимые для роста и развития ацетонобутиловых бактерий.

В способе - ближайшем аналоге количество спор в составе использованного спорового материала бактерий Clostridium acetobutylicum не указано.

Технической задачей настоящего изобретения является получение спорового материала бактерий рода Clostridium с повышенным содержанием спор.

Задачу решают путем разработки способа получения спорового материала бактерий Clostridium путем засева инокулятом бактерий Clostridium, выращенным в полноценной синтетической среде, с последующим культивированием в подходящих условиях в питательной среде, состоящей из картофеля, глюкозы, сернокислого аммония и мела, в которую в процессе основного брожения на 18-28 часу развития культуры бактерий в зависимости от времени появления в одном поле зрения не менее 80-100 утолщенных форм клеток - клостридий, добавляют н-бутанол в количестве 0,16-0,81 мас.%.

Одна из основных особенностей предлагаемого способа заключается в использовании в опытах культур микроорганизмов, находящихся в строго определенном физиологическом возрасте.

Способ в общем виде

Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Готовят картофельную среду следующего состава (мас.%): картофель (с содержанием крахмала 17-19%) - 20,0, глюкоза - 0,5, сернокислый аммоний - 0,15, мел - 0,2, вода - остальное, стерилизуют при 0,8 атм в течение 20-25 минут, охлаждают до температуры 37°С. Затем среду засевают инокулятом бактерий рода Clostridium, предварительно выращенным на полноценной синтетической среде, в частности среде ПСС следующего состава, мас.%: K ₂HPO₄ - 0,07; KH₂PO₄ - 0,07; MgSO₄·7H₂O - 0,01; MnSO ₄·H₂O - 0,002; FeSO₄·7H ₂O - 0,0015; NaCl - 0,001; глюкоза - 2,0; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1; бактотриптон - 0,1; цистеин - 0,05, вода остальное при 37°С в течение 24 часов (RU 2080382), или на среде MSS (medium synthetic structure) следующего состава, мас.%: K₂HPO₄ - 0,1; KH₂PO ₄ - 0,08; MgSO₄·7H₂O - 0,1; FeSO₄·7H₂O - 0,005; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,5; цистеин-HCl - 0,05; пара-аминобензойная кислота - 0,001, глюкоза - 2, вода остальное при 37°С в течение 24 часов (RU 2455350), или на среде SOL (solution) следующего состава, мас.%: K₂HPO₄ - 0,07; KH₂ PO₄ - 0,07; MgSO₄·7H₂O - 0,01; MnSO₄·H₂O - 0,002; FeSO ₄·7H₂O - 0,0015; NaCl - 0,001; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1; пептон - 0,1; цистеин - 0,05; крахмал - 0,1; глюкоза - 1,0; витаминный раствор - 1 мл/л (пара-аминобензойная кислота - 0,0001; тиамин - 0,0001; биотин - 1 мкг); резазурин - 0,0001, вода остальное при 37°С в течение 24 часов (RU 2458118). Среды ПСС, MSS и SOL готовят следующим образом: навески компонентов среды последовательно переносят в емкость, растворяют в дистиллированной воде, разливают в специальные флаконы общим объемом 120 см для анаэробного культивирования бактерий, кипятят на водяной бане 25 мин, насыщают азотом (для создания анаэробных условий), закрывают резиновыми пробками и завинчивают металлическими крышками. После этого стерилизуют путем автоклавирования при 116°С в течение 20 минут.

Процесс анаэробного брожения проводят на картофельной среде в течение 18-28 часов при температуре 37°С. Начиная с 18 часа брожения, культуру бактерий исследуют под микроскопом с целью фиксирования момента появления утолщенных форм клеток - клостридий. При наличии в одном поле зрения не менее 80-100 клостридий в среду добавляют н-бутанол в количестве 0,16-0,81 мас.%. Затем процесс продолжают до 48 часов. По окончании процесса брожения в сброженной среде подсчитывают под микроскопом с помощью счетной камеры Горяева количество образовавшихся спор. Заявляемый способ позволяет получить споровый материал, содержащий до 3,6×10⁸ спор/мл.

Хранение спорового материала бактерий рода Clostridium осуществляют, поместив в специальные стеклянные пробирки с резиновыми пробками и завинчивающимися крышками для хранения анаэробных культур, в жидких средах при +4°С, или лиофильно высушивают для хранения в анабиотическом состоянии.

Пример 1. Получение спорового материала традиционным для промышленности способом на мучных средах [Промышленный регламент на производство растворителей: ацетона, бутанола и этанола способом брожения. ПР 64-35-89, г. Ефремов, 1989].

Готовят мучную среду путем смешивания ржаной муки (крахмалистостью 58%) с водой из расчета 6 мас.% по весу. Полученную массу разваривают в течение 60 мин в кипящей воде на водяной бане и стерилизуют при 1,5 атм в течение 1,5 часа. Далее охлаждают среду до температуры 37°С и засевают инокулятом, представляющим собой промышленный штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-43 61, выращенный на мучной среде, в количестве 5% от объема среды. Брожение проводят при температуре 37°С в течение 60 часов. Количество образовавшихся спор составило 0,3×10⁸ в мл. После окончания брожения споровый материал оставляют на хранение. По истечении месяца партию спор подвергают проверке, проводя пробные брожения на 6 и 8% мучной среде, путем пересева из одной пробирки в другую со свежеприготовленной 6%-ной мучной средой. Первый пересев осуществляют через 24 часа, а остальные через 14 часов. Последнюю проверку проводят на 8 мас.% мучной среде.

В результате получают стандартные споры бактерий для промышленного применения, качество спорового материала оценивают по количеству выделившихся газов брожения и накоплению ацетона в среде.

Пример 2. Получение спорового материала штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359 на картофельной среде без добавления н-бутанола (контроль к заявляемому способу) с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359, хранящийся в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах. Для получения посевного материала (инокулята) ампулу вскрывают, добавляют около 500 мкл стерильной дистиллированной воды, оставляют для набухания, после этого 100 мкл суспензии клеток переносят с помощью шприца в герметично закрытый флакон с питательной средой ПСС и культивируют при 37°С в течение 24 часов.

Среду для получения инокулята готовят следующим образом: навески компонентов среды ПСС последовательно переносят в химический стакан емкостью 1 л (помещенный на магнитную мешалку), растворяют в 1000 л дистиллированной воды, разливают по 60 мл в специальные флаконы для анаэробного культивирования, кипятят на водяной бане 25 мин, по окончании кипячения среду насыщают азотом, закрывают резиновыми пробками и завинчивают металлическими крышками. После этого стерилизуют автоклавированием при 116°С в течение 20 минут.

Для получения спорового материала используют картофель с содержанием крахмала 19%. Среду готовят следующим образом: навеску картофеля 200 г (предварительно отчищенного) измельчают на мелкой терке, переносят в химический стакан емкостью 1 л, добавляют 600 мл дистиллированной воды, ставят на водяную баню и, постоянно перемешивая, нагревают до клейстеризации картофеля и разваривают в течение 30 минут. Навески глюкозы (5 г), (NH₄)₂SO₄ (1,5 г) и СаСО₃ (2,0 г) последовательно растворяют в 100 мл воды и переносят в клейстеризованный картофель. Разваривают еще в течение 20 минут, затем объем среды доводят до 1 литра, разливают по 70 мл в стеклянные флаконы (специальные для анаэробного брожения) и стерилизуют автоклавированием при 116°С в течение 20 минут. После этого среду охлаждают до температуры 37°С, затем в подготовленную картофельную среду вносят инокулят, полученный на среде ПСС, в количестве 5% от объема среды; процесс брожения осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов. По окончании ферментации в сброженной среде подсчитывают количество образовавшихся спор, содержание которых после окончания брожения составляет 1,06×10⁸ в мл.

Пример 3. Получение спорового материала штамма Clostridium beijerinckii ВКПМ В-9600 на картофельной среде без добавления н-бутанола (контроль к заявляемому способу) с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Повторяют процедуру, описанную в примере 2, но используют штамм Clostridium beijerickii ВКПМ В-9600, хранящийся в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах. По окончании ферментации в сброженной среде подсчитывают количество образовавшихся спор, содержание которых после окончания брожения составляет 0,98×10⁸ в мл.

Пример 4. Получение спорового материала штамма Clostridium saccharoperbutylacetonicum ВКПМ В-9602 на картофельной среде без добавления н-бутанола (контроль к заявляемому способу) с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Повторяют процедуру, описанную в примере 2, но используют штамм Clostridium saccharoperbutylacetonicum ВКПМ В-9602, хранящийся в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах. По окончании ферментации в сброженной среде подсчитывают количество образовавшихся спор, содержание которых после окончания брожения составляет 1,18×10⁸ в мл.

Пример 5. Получение спорового материала штамма Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 на картофельной среде без добавления н-бутанола (контроль к заявляемому способу) с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Повторяют процедуру, описанную в примере 2, но используют штамм Clostridium butyricum ВКПМ В-9619, хранящийся в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах. По окончании ферментации в сброженной среде подсчитывают количество образовавшихся спор, содержание которых после окончания брожения составляет 0,86×10 ⁸ в мл.

Пример 6. Получение спорового материала штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615 на картофельной среде без добавления н-бутанола (контроль к заявляемому способу) с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Повторяют процедуру, описанную в примере 2, но используют штамм Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615, хранящийся в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах. По окончании ферментации в сброженной среде подсчитывают количество образовавшихся спор, содержание которых после окончания брожения составляет 0,78×10⁸ в мл.

Пример 7. Получение спорового материала заявляемым способом с ипользованием штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359 с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Процесс осуществляют по примеру 2. В процессе брожения, начиная с 18 часа, под микроскопом исследуют культуру с целью фиксирования момента появления клостридий. После обнаружения их в количестве 100 в одном поле зрения в среду добавляют 0,41 мас.% н-бутанола и проводят процесс до 48 часов. По окончании процесса брожения в среде количество образовавшихся спор составляет 2,75×10⁸ в мл, что в 2,6 раза больше, чем в контроле.

Пример 8. Получение спорового материала заявляемым способом с пользованием штамма Clostridium beijerinckii ВКПМ В-9600 с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Процесс осуществляют по примеру 7, но с использованием штамма Clostridium beijerinckii ВКПМ В-9600. По окончании процесса брожения в среде количество образовавшихся спор составляет 2,68×10⁸ в мл, что в 2,73 раза больше, чем в контроле.

Пример 9. Получение спорового материала заявляемым способом с ипользованием штамма Clostridium saccharoperbutylacetonicum ВКПМ В-9602 с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Процесс осуществляют по примеру 7, но добавляют 0,62 мас.% н-бутанола с использованием штамма Clostridium saccharoperbutylacetonicum ВКПМ В-9602.

По окончании процесса брожения в среде количество образовавшихся спор составляет 2,54×10⁸ в мл, что в 2,15 раза больше, чем в контроле.

Пример 10. Получение спорового материала заявляемым способом с использованием штамма Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Процесс осуществляют по примеру 9, но с использованием штамма Clostridium butyricum ВКПМ В-9619. По окончании процесса брожения в среде количество образовавшихся спор составляет 1,98×10⁸ в мл, что в 2,3 раза больше, чем в контроле.

Пример 11. Получение спорового материала заявляемым способом с использованием штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615 с использованием инокулята, выращенного на среде ПСС

Процесс осуществляют по примеру 7, но с использованием штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615.

По окончании процесса брожения в среде количество образовавшихся спор составляет 1,85×10 ⁸ в мл, что в 2,4 раза больше, чем в контроле.

Пример 12. Получение спорового материала штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359, на картофельной среде без добавления н-бутанола с использованием инокулята, выращенного на среде MSS (контроль к заявляемому способу)

Используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359, хранящийся в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах. Для получения посевного материала (инокулята) ампулу вскрывают, добавляют около 500 мкл стерильной дистиллированной воды, оставляют для набухания, после этого 100 мкл суспензии клеток переносят с помощью шприца в герметично закрытый флакон с питательной средой MSS и культивируют при 37°С в течение 24 часов.

Среду для получения инокулята готовят следующим образом: навески компонентов среды MSS последовательно переносят в химический стакан емкостью 1 л (помещенный на магнитную мешалку), растворяют в 1000 л дистиллированной воды, разливают по 60 мл в специальные флаконы для анаэробного культивирования, кипятят на водяной бане 25 мин, по окончании кипячения среду насыщают азотом, закрывают резиновыми пробками и завинчивают металлическими крышками. После этого стерилизуют автоклавированием при 116°С в течение 20 минут.

Для получения спорового материала используют картофель с содержанием крахмала 19%. Среду готовят, как в примере 2. В подготовленную картофельную среду вносят инокулят, полученный на среде MSS, в количестве 5% от объема среды; процесс брожения осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов. По окончании ферментации в сброженной среде подсчитывают количество образовавшихся спор, содержание которых после окончания брожения составляет 1,08×10 ⁸ в мл.

Пример 13. Получение спорового материала заявляемым способом с использованием штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359 с использованием инокулята, выращенного на среде MSS

Процесс осуществляют по примеру 12. В процессе брожения, начиная с 18 часа, под микроскопом исследуют культуру с целью фиксирования момента появления клостридий. После обнаружения их в количестве 100 в одном поле зрения в среду добавляют 0,41 мас.% н-бутанола и проводят процесс до 48 часов. По окончании процесса брожения в среде количество образовавшихся спор составило -2,78×10⁸ в мл, что в 2,57 раза больше, чем в контроле.

Пример 14. Получение спорового материала штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359, на картофельной среде без добавления н-бутанола (контроль к заявляемому способу) с использованием инокулята, выращенного на среде SOL

Используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359, хранящийся в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах. Для получения посевного материала (инокулята) ампулу вскрывают, добавляют около 500 мкл стерильной дистиллированной воды, оставляют для набухания, после этого 100 мкл суспензии клеток переносят с помощью шприца в герметично закрытый флакон с питательной средой SOL и культивируют при 37°С в течение 24 часов.

Среду для получения инокулята готовят следующим образом: навески компонентов среды SOL последовательно переносят в химический стакан емкостью 1 л (помещенный на магнитную мешалку), растворяют в 1000 л дистиллированной воды, разливают по 60 мл в специальные флаконы для анаэробного культивирования, кипятят на водяной бане 25 мин, по окончании кипячения среду насыщают азотом, закрывают резиновыми пробками и завинчивают металлическими крышками. После этого стерилизуют автоклавированием при 116°С в течение 20 минут.

Для получения спорового материала используют картофель с содержанием крахмала 19%. Среду готовят, как в примере 2. В подготовленную картофельную среду вносят инокулят, полученный на среде SOL, в количестве 5% от объема среды; процесс брожения осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов. По окончании ферментации в сброженной среде подсчитывают количество образовавшихся спор, содержание которых после окончания брожения составляет 1,12×10⁸ в мл.

Пример 15. Получение спорового материала заявляемым способом с использованием штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359 с использованием инокулята, выращенного на среде SOL

Процесс осуществляют по примеру 14. В процессе брожения, начиная с 18 часа, под микроскопом исследуют культуру с целью фиксирования момента появления клостридий. После обнаружения их в количестве 100 в одном поле зрения в среду добавляют 0,41 мас.% н-бутанола и проводят процесс до 48 часов. По окончании процесса брожения в среде количество образовавшихся спор составило -2,86×10⁸ в мл, что в 2,55 раза больше, чем в контроле.

Таблица
Характеристика заявляемого способа
Используемый штамм	Количество спор в споровом материале, n×108 в мл
	Ферментация без н-бутанола	Ферментация с н-бутанолом
Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-5359	1,06-1,12	2,75-2,86
Clostridium beijerinckii ВКПМ В-9600	0,98	2,68
Clostridium saccharoperbutylacetonicum ВКПМ В-9602	1,18	2,54
Clostridium butyricum ВКПМ В-9619	0,86	1,98
Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615	0,78	1,85

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить споровый материал бактерий Clostridium, содержащий до 3,6×10⁸ спор/мл, то есть значительно (более чем в 2 раза) увеличить количество спор в споровом материале различных видов бактерий Clostridium.

Использование этого спорового материала для засева сбраживаемых субстратов после хранения в жидкой среде или в лиофильно высушенном состоянии не требует пастеризации и многоступенчатой проверки активности, что существенно упрощает процесс микробиологического синтеза органических растворителей, в частности н-бутанола.

Источники информации

1. Дебабов В.Г. Биотопливо // Биотехнология. - 2008. - № 1. - С.3-14.

2. Березина О.В., Захарова Н.В., Яроцкий С.В., Зверлов В.В. Микробные продуценты бутанола // Биотехнология. - 2011. - № 4. - С.8-25.

3. Логоткин И.С. Технология ацетонобутилового брожения. М. - 1958.

4. Промышленный регламент на производство растворителей: ацетона, бутанола и этанола способом брожения. ПР 64-35-89, г. Ефремов, 1989.