способ определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови

Формула изобретения

Способ определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что предусматривает инкубацию выделенных лимфоцитов в присутствии фермента в инкубационной среде, с последующей отмывкой клеток от фермента, окрашивание моноклональными антителами, содержащими флуоресцентную метку, к соответствующим поверхностным детерминантам клеточных рецепторов и сравнение с контролем методом проточной цитометрии, где клетки инкубируются в среде без содержания ферментов или в присутствии ингибиторов протеолитических ферментов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам определения действия протеиназ на внеклеточные домены белковых рецепторов, экспрессируемых на поверхности лимфоцитов. Данный способ может быть использован в энзимологии, фармакологии, клинической биохимии, как для скрининга, так и для количественной оценки активности протеолитических ферментов, действующих на белковые клеточные рецепторы.

Протеолитическое отщепление внеклеточной части мембранных белков с поверхности клеток, называемое протеолитическим шеддингом (слущиванием, сходом) или кливеджем (расщеплением) процесс достаточно распространенный и в его реализации участвуют различные типы ферментов, цинк-зависимые, сериновые и аспартил-зависимые протеиназы, так и внутриклеточные протеолитические ферменты клеток. Для разных мембранных антигенов продемонстрировано участие в шеддинге разных протеолитических ферментов.

Особо актуальным с позиции патологической физиологии является действие экзогенных протеиназ, в том числе, и образуемых различными микроорганизмами, на клеточные рецепторы экспрессируемые на иммунокомпетентных клетках. В результате протеолитической модификации поверхностных белков клеток образуются растворимые формы рецепторов, которые характеризуются отсутствием внутриклеточного и трансмембранного доменов и имеет меньшую молекулярную массу, чем мембранная форма. Присутствующие в ее составе внеклеточные домены, как правило, сохраняют свои функциональные возможности, что существенно для выполнения биологической роли, связанной с регуляцией иммунного ответа. Шеддинг чаще всего является следствием активационных процессов, затрагивающих различные популяции клеток.

Для выявления активности ферментов были разработаны различные методы. Однако, эти методы обеспечивают оценку протеолитической активности, не поддаются стандартизации и, работают по отношению к выделенным субстратам в искусственной модели. Наиболее перспективным из современных способов определения протеиназной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса (1). Однако, метод иммуноферментного анализа протеазной активности, наиболее близкий к нашему изобретению, требует изготовления и сорбции на планшете бактериальных антигенов, применения специфических к используемому бактериальному антигену иммуноглобулинов и высокого расхода пула неспецифических иммуноглобулинов (1). С помощью иммуноферментного анализа, невозможно дифференцировать рецепторы, экспрессируемые на клетках и произвести количественный подсчет этих клеток.

В связи с этим цель заявленного изобретения разработка способа, позволяющего определять протеолитическую модификацию белковых рецепторов на лимфоцитах с применением моноклональных антител с флуоресцентной меткой к поверхностным детерминантам клеточных рецепторов на основе метода проточной цитометрии.

Поставленная цель достигается путем разработки способа детекции протеолитического кливедджа внеклеточных доменов поверхностных рецепторов, который предусматривает инкубацию выделенных клеток в присутствии фермента, отмывку клеток от фермента, окрашивание моноклональными антителами, содержащими флуоресцентную метку к соответствующим поверхностным детерминантам клеточных рецепторов и сравнение с контролем методом проточной цитометрии. В контроле клетки инкубируются в среде без содержания ферментов или в присутствии ингибиторов протеолитических ферментов.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения протеиназной активности ферментов в отношении поверхностных детерминант белковых рецепторов лимфоцитов, который характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью за счет флуоресцирующих антител и возможностью определять чувствительные к протеолизу рецепторы и количественно оценивать активность ферментов и ингибиторов.

Пример 1. Определение протеолиза рецепторов на донорских лимфоцитах человека при действии протеолитических ферментов супернатантов 16-ти часовой культуры золотистого стафилококка. Выделяли донорские лимфоциты человека из периферической крови методом изопакфикколовой сепарации. Инкубацию выделенных лимфоцитов проводили с супернатантом в разведении 1:2 с буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, при Т 36°С в течение 60±5 минут. После инкубации лимфоциты отмывали 2-кратно физиологическим раствором хлорида натрия и окрашивали набором моноклональных антител к поверхностным детерминантам лимфоцитарных рецепторов, используя наборы моноклональных антител 6-color TBNK BD Multitest или IMK lymphocyte Kit. В контроле проводили инкубацию этой же взвеси лимфоцитов со стерильной жидкой питательной средой при тех же условиях и составе буферной среды, что и в опыте. Экспрессию рецепторов на лимфоцитах опытных и контрольных проб определяли проточной цитометрией на анализаторе FACSCanto II. Полученные результаты приведены в таблице 1.

При инкубации лимфоцитов с протеолитически активными супернатантами штаммов S. aureus (эталонный и изолированые с кожи и слизистых) выявлено достоверное уменьшение экспрессии рецепторов относящихся к кластерам дифференцировки CD4, CD8, CD 16, по сравнению, с контролем и протеазонеактивными супернатанами (р<0,001 и р<0,0001) (таблица 1). Протеолитически активные супернатанты эталлоного штамма, изолятов кожи, слизистых носа и зева достоверно не изменяли экспрессию таких кластеров дифференцировки, как CD3 и CD19 на ДЛ (р>0,05), таблица 1.

Активность протеолитических ферментов супернатантов в отношении поверхностных клеточных рецепторов рассчитывают по формуле:

A=(D_k-D ₀)/tC_r;

где:

А - активность фермента в усл. единицах,

D_k - % клеток позитивных по данному рецептору в контроле по данным цитометрии,

D_o - % клеток позитивных по данному рецептору в опыте по данным цитометрии,

Т - время протеолиза, в мин

C_r - концентрация фермента или общего белка в анализируемом растворе.

Пример 2. Определение протеолиза рецепторов на донорских лимфоцитах человека раствором трипсина. Определение проводят аналогично примеру 1, но вместо супернатантов бактерий, используют 1×10 ^-5 М раствора трипсина. Протеиназную активность трипсина в отношении лимфоцитарных рецепторов рассчитывают на количество трипсина, по формуле в примере 1.

Пример 3. Определение протеолиза рецепторов на донорских лимфоцитах человека раствором трипсина в присутствии различных концентраций ингибитора - (PMSF) проводили аналогично примеру 1, но наряду с раствором трипсина использовали, трипсин с различными концентрациями ингибитора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Тюрин Ю.А. Протеиназная активность микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей. // Автореф. дисс. канд. мед. наук - Казань, 2003. - 21 с.

Таблица 1
Экспрессия кластеров дифференцировки CD3, CD4, CD19, CD8, CD16 на донорских лимфоцитах (ДЛ) после инкубации с супернатантами штаммов S. aureus
Супернатанты штаммов S. aureus	Экспрессия кластеров дифференцировки на донорских лимфоцитах (ДЛ), %, М±m
	CD3	CD19	CD4	CD8	CD16
Эталонный штамм АТСС 29213 (К+)	74,7±0,2	8,7±0,2	2,9±0,4***	3,7±0,6	5,4±0,3
Изоляты носа № № 30, 39, 38, 11, 37, 12, 10, 9, 32, 31, 36, n=11	74,4±0,15	8,41±0,1	2,06±0,7***	6,4±0,9	6,5±0,3
Изоляты зева № № 24, 23, 20, 26, 22, 8, 40, 42, 27, 41, 21, 25, n=12	74,5±0,24	8,3±0,13	3,07±0,8**	5,4±0,6	6,5±0,5
Изоляты кожи № № 5, 34, 6, 35, 19, 33, 18, 7, 4, 2, 1, 3, n=12	74,6±0,23	8,1±0,09	1,02±0,2***	0,6±0,06	6,6±0,2
протеазонеактивные изоляты, n=10, № № 43, 44, 45, 13, 14, 15, 16, 17, 28, 29	74,6±0,32	8,2±0,1	13,7±0,16	36,5±0,2	9,1±0,13
Контроль (К-)	75,4±0,5	8,9±0,3	13,1±0,2	35,8±0,2	9,4±0,15
*** - Различия в средних значениях между группой эталлоный штамм, изоляты носа, зева и кожи и группой протеазонеактивных изолятов и контролем достоверны при р<0,0001
** - Различия в средних значениях между группой эталлоный штамм, изоляты носа, зева и кожи и группой протеазонеактивных изолятов и контролем достоверны при р<0,001