способы повышения усиливающей целлюлолитической активности полипептида

Формула изобретения

1. Способ повышения активности полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, предусматривающий добавление растворимого активирующего катиона двухвалентного металла к композиции, содержащей полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ в ходе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который повышает уровень разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn⁺⁺, Co⁺⁺, Mg ⁺⁺, Ca⁺⁺ и их сочетания, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.

2. Способ по п.1, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, от около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до 2,5 мМ и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.

3. Способ по п.1 или 2, где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, выбран из группы, состоящей из:

(а) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и X(4) обозначает любую аминокислоту в 4 соседних положениях;

(b) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях;

где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащий [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], необязательно также содержит

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV] или

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],

где Х обозначает любую аминокислоту, X(1,2) обозначает любую аминокислоту в 1 положении или в 2 соседних положениях и X(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях и X(2) обозначает любую аминокислоту в 2 соседних положениях;

(c) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична зрелому полипептиду с последовательностью SEQ ID NO:12;

(d) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях по меньшей мере средней жесткости, в условиях по меньшей мере от средней до высокой степени жесткости, в условиях по меньшей мере высокой жесткости и в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:11, или его полноразмерной комплементарной цепью;

(е) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:11;

(f) варианта полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:12; и

(g) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего или состоящего из зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:12; или его фрагмента, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью.

4. Способ разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, предусматривающий обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который повышает уровень разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn⁺⁺, Co⁺⁺, Mg ⁺⁺, Ca⁺⁺ и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.

5. Способ по п.4, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, от около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до 2,5 мМ и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.

6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, выбран из группы, состоящей из:

(а) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и X(4) обозначает любую аминокислоту в 4 соседних положениях;

(b) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях;

где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, включающий [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], необязательно также включает

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV] или

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(1,2) обозначает любую аминокислоту в 1 положении или в 2 соседних положениях и X(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях и X(2) обозначает любую аминокислоту в 2 соседних положениях;

(c) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична зрелому полипептиду с последовательностью SEQ ID NO:12;

(d) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях по меньшей мере средней жесткости, в условиях по меньшей мере от средней до высокой степени жесткости, в условиях по меньшей мере высокой жесткости и в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:11, или его полноразмерной комплементарной цепью;

(е) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:11;

(f) варианта полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:12; и

(g) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего или состоящего из зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:12; или его фрагмента, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью.

7. Способ по п.4, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством бета-глюкозидазы.

8. Способ по п.4, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из: гемицеллюлазы, эстеразы, протеазы, лакказы, пероксидазы или их смесей.

9. Способ по п. 4, включающий внесение добавки растворимого активирующего катиона двухвалентного металла в концентрации, позволяющей поддерживать эффективную концентрацию указанного растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на уровне от около 0,001 мМ до около 50 мМ.

10. Способ по п.4, включающий также восстановление деградированного содержащего целлюлозу сырья.

11. Способ получения продукта ферментации, предусматривающий (а) осахаривание содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной предпочтительно от около 0,001 мМ до около 50 мМ, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который повышает уровень разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn⁺⁺, Co ⁺⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание; (b) ферментацию осахаренного содержащего целлюлозу сырья со стадии (a) одним или несколькими ферментирующими организмами с получением продукта ферментации; и (c) восстановление продукта ферментации из ферментационной среды.

12. Способ по п.11, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, от около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до 2,5 мМ и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.

13. Способ по п.11 или 12, где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, выбран из группы, состоящей из:

(а) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, включающего [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и X(4) обозначает любую аминокислоту в 4 соседних положениях;

(b) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который включает [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях;

где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, включающий [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], необязательно также включает

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV] или

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(1,2) обозначает любую аминокислоту в 1 положении или в 2 соседних положениях и X(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях и X(2) обозначает любую аминокислоту в 2 соседних положениях;

(c) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична зрелому полипептиду с последовательностью SEQ ID NO:12;

(d) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях по меньшей мере средней жесткости, в условиях по меньшей мере от средней до высокой степени жесткости, в условиях по меньшей мере высокой жесткости и в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:11, или его полноразмерной комплементарной цепью;

(е) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:11;

(f) варианта полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:12; и

(g) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего или состоящего из зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:12; или его фрагмента, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью.

14. Способ по п.11, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством бета-глюкозидазы.

15. Способ по п.11, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из: гемицеллюлазы, эстеразы, протеазы, лакказы, пероксидазы или их смеси.

16. Способ по п. 11, включающий также внесение добавки растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, позволяющий поддерживать эффективную концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на уровне от около 0,001 мМ до около 50 мМ.

17. Композиция целлюлолитического фермента для разложения содержащего целлюлозу сырья, содержащая эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ в ходе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и наличие указанного растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, повышает уровень разложения содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn⁺⁺, Co⁺⁺, Mg⁺⁺ , Ca⁺⁺ и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.

18. Композиция целлюлолитического фермента по п.17, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, от около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до 2,5 мМ и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.

19. Композиция для разложения содержащего целлюлозу сырья, содержащая эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ в ходе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, повышает уровень разложения указанного содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn⁺⁺, Co ⁺⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.

20. Композиция по п.19, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, от около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до 2,5 мМ и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.

Описание изобретения к патенту

Ссылка на перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме. Указанная машиночитаемая форма включена в настоящее описание в качестве ссылочного материала.

Ссылка на документ о депонировании биологического материала

Настоящая заявка содержит ссылку на документ о депонировании биологического материала, при этом документ о депонировании включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам и к композициям, повышающим активность полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность.

Уровень техники

Целлюлоза представляет собой полимер простого сахара, глюкозы, ковалентно связанного бета-1,4-связями. Большое число микроорганизмов продуцируют ферменты, которые гидролизуют бета-связанные глюканы. К этим ферментам относятся эндоглюканазы, целлобиогидролазы и бета-глюкозидазы. Эгдоглюканазы расщепляют целлюлозный полимер в случайных положениях, делая его доступным для воздействия целлобиогидролаз. Целлобиогидролазы последовательно высвобождают молекулы целлобиозы с концов целлюлозного полимера. Целлобиоза представляет собой водоростворимый димер глюкозных остатков, связанных бета-1,4-связью. Бета-глюкозидазы гидролизуют целлобиозу до глюкозы.

Преимуществами преобразования целлюлозного сырья до этанола является возможность использования большого количества сырья, предотвращение сжигания или захоронения отходов, что желательно, и чистота топливного этанола. Древесина, отходы сельхозпроизводства, зеленые культуры и коммунально-бытовые твердые отходы рассматриваются в качестве источников получения этанола. Указанные материалы прежде всего состоят из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. После преобразования целлюлозы в глюкозу, глюкозу легко ферментировать дрожжами до этанола.

В документе WO 2005/074647 описаны выделенные полипептиды, повышающие целлюлолитическую активность, и соответствующие полинуклеотиды, полученные из Thielavia terrestris. В WO 2005/074656 описан выделенный полипептид, повышающий целлюлолитическую активность, и соответствующий полинуклеотид, полученные из Thermoascus aurantiacus. В опубликованной заявке США No. 2007/0077630 описан выделенный полипептид, повышающий целлюлолитическую активность, и соответствующий полинуклеотид, полученные из Trichoderma reesei.

В данной области было бы желательно улучшить активность полипептидов, повышающих целлюлолитическую активность.

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, повышающим активность полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам повышения активности полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, включающим: добавление растворимого активирующего катиона двухвалентного металла в композицию, содержащую полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, где указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, увеличивает деградацию или преобразование содержащего целлюлозу сырья с помощью композиции целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность без растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

Настоящее изобретение также относится к способам деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, включающим: обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ.

Настоящее изобретение также относится к способам получения продукта ферментации, включающим: (a) осахаривание содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ; (b) ферментацию осахаренного содержащего целлюлозу сырья стадии (а) одним или несколькими ферментирующими микроорганизмами с получением продукта ферментации; и (с) восстановление продукта ферментации из ферментационной смеси.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, в процессе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и при этом присутствие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, повышает разложение или преобразование содержащего целлюлозу сырья благодаря композиции целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность, но в отсутствие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

Настоящее изобретение также относится к композициям целлюлолитического фермента, содержащим эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, в процессе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и при этом наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, повышает разложение или преобразование содержащего целлюлозу сырья благодаря композиции целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность, но в отсутствие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана рестрикционная карта pMJ04.

На фиг. 2 показана рестрикционная карта pCaHj527.

На фиг. 3 показана рестрикционная карта pMT2188.

На фиг. 4 показана рестрикционная карта pCaHj568.

На фиг. 5 показана рестрикционная карта pMJ05.

На фиг. 6 показана рестрикционная карта pSMai130.

На фиг. 7 приведена последовательность ДНК и аминокислотная последовательность нативной сигнальной последовательности бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (SEQ ID NO:57 и 58).

На фиг. 8 приведена последовательность ДНК и аминокислотная последовательность сигнальной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens (SEQ ID NO:61 и 62).

На фиг. 9 показана рестрикционная карта pSMai135.

На фиг. 10 показана рестрикционная карта pSMai140.

На фиг. 11 показана рестрикционная карта pSaMe-F1.

На фиг. 12A, 12B, 12C и 12D приведена последовательность ДНК и рассчитанная на ее основе аминокислотная последовательность бета-глюкозидазы варианта BG слитого белка на основе бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (SEQ ID NO:25 и 26, соответственно).

На фиг. 13 показана рестрикционная карта pSaMe-FX.

На фиг. 14A, 14B, 14C и 14D приведена последовательность ДНК и рассчитанная на ее основе аминокислотная последовательность слитого белка на основе бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (SEQ ID NO:27 и 28, соответственно).

На фиг. 15 показана рестрикционная карта pAILo47.

На фиг. 16 проиллюстрирован процесс преобразования целлюлозы предварительно обработанной кукурузной соломы в глюкозу и целлобиозу при добавлении различных растворимых ионов двухвалентного металла до конечной концентрации 10 мМ в смеси, включающие ферментативный бульон, который содержит целлюлолитические ферменты Trichoderma reesei, слитый белок бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae и полипептид GH61A Thermoascus aurantiacus , усиливающий целлюлолитическую активность.

На фиг. 17 проиллюстрирован процесс преобразования целлюлозы предварительно обработанной кукурузной соломы в глюкозу и целлобиозу при добавлении различных ионов двухвалентного металла до конечной концентрации 1 мМ в смеси, включающие ферментативный бульон, который содержит целлюлолитические ферменты Trichoderma reesei и бета-глюкозидазу Aspergillus oryzae при добавлении и без добавления полипептида GH61A Thermoascus aurantiacus, усиливающего целлюлолитическую активность.

На фиг. 18 проиллюстрирован процесс преобразования целлюлозы предварительно обработанной кукурузной соломы в глюкозу и целлобиозу при добавлении MgCl₂ и MnSO₄ до конечной концентрации 0,0001-10 мМ в смеси, содержащие обессоленный или необессоленный ферментативный бульон, который содержит целлюлолитические ферменты Trichoderma reesei, слитый белок бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae и полипептид GH61A Thermoascus aurantiacus, усиливающий целлюлолитическую активность.

Определения

Активность, усиливающая целлюлолитическую активность: Термин «активность, усиливающая целлюлолитическую активность», как используется в настоящей заявке, обозначает биологическую активность, которая усиливает гидролиз содержащего целлюлозу сырья, происходящий под действием белков, обладающих целлюлолитической активностью. Для целей настоящего изобретения, активность, усиливающая целлюлолитическую активность определяется путем измерения повышения восстанавливающихся сахаров или повышения общего количества целлобиозы или глюкозы при гидролизе содержащего целлюлозу сырья под действием целлюлолитического белка при следующих условиях: 1-50 мг общего белка, содержащего 80-99,5 масс.% целлюлолитического белка/г целлюлозы в PCS и 0,5-20 масс.% белка с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность в течение 1-7 дней при температуре 50°C, по сравнению с контрольным гидролизом под действием эквивалентного количества белка, но без активности, усиливающей целлюлолитическую активность (1-50 мг целлюлолитического белка/г целлюлозы в PCS). В предпочтительном аспекте настоящего изобретения в качестве стандарта целлюлолитической активности используют смесь целлюлазного белка CELLUCLAST® 1,5 л (Novozymes A/S, Baqsværd, Дания) в присутствии 3% бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (полученной рекомбинантными методами в Aspergillus oryzae в соответствии с процедурой, описанной в WO 02/095014) или 3% бета-глюкозидазы Aspergillus fumigatus (полученной рекомбинантными методами в Aspergillus oryzae в соответствии WO 02/095014, пример 22).

Активность, усиливающая целлюлолитическую активность у полипептидов, усиливающих целлюлолитическую активность, составляет, по меньшей мере на 20%, предпочтительно, по меньшей мере на 40%, более предпочтительно, по меньшей мере на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% и, также наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 100% от активности зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14.

Полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, повышают гидролиз содержащего целлюлозу сырья, катализируемого белками с целлюлолитической активностью, за счет снижения количества целлюлолитического фермента, необходимого для достижения той же степени гидролиза, предпочтительно, по меньшей мере в 0,1, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,2, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,3, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,4, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,5, более предпочтительно, по меньшей мере в 1, более предпочтительно, по меньшей мере в 3, более предпочтительно, по меньшей мере в 4, более предпочтительно, по меньшей мере в 5, более предпочтительно, по меньшей мере в 10, более предпочтительно, по меньшей мере в 20, еще более предпочтительно, по меньшей мере в 30, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 50 и, еще наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100.

Целлюлолитическая активность: Термин «целлюлолитическая активность», как определено в настоящей заявке, относится к активности целлюлазы (например, эндоглюканаз(ы), целлобиогидролаз(ы), бета-глюкозидаз(ы) или их комбинаций), благодаря которой происходит гидролиз содержащего целлюлозу сырья. Целлюлолитический белок может гидролизовать карбоксиметилцеллюлозу (СМС), таким образом уменьшая вязкость инкубационной смеси. Полученное снижение вязкости можно определить с помощью вибрационного вискозиметра (например, MIVI 3000 от компании Sofraser, Франция). При установлении целлюлазной активности, выражаемой в единицах целлюлазной вязкости (CEVU), определяют количество каталитической активности, присутствующей в образце, за счет измерения способности образца снижать вязкость раствора карбоксиметилцеллюлозы (СМС). Анализ проводят при температуре и pH, подходящих для целлюлолитического белка и субстрата.

Для целей настоящего изобретения, целлюлолитическую активность определяют путем измерения повышения гидролиза содержащего целлюлозу сырья под действием целлюлолитической композиции при следующих условиях: 1-50 мг целлюлолитического белка/г целлюлозы в PCS в течение 1-7 дней при температуре 50°C, по сравнению с контрольным гидролизом без добавления целлюлолитического белка.

Эндоглюканаза: Термин «эндоглюканаза», как определено в настоящей заявке, обозначает эндо-1,4-(1,3;1,4)-бета-D-глюкан 4-глюканогидролазу (E.C. No. 3.2.1.4), которая катализирует эндогидролиз 1,4-бета-D-глюкозидных связей в целлюлозе, производных целлюлозы (таких как карбоксиметилцеллюлоза и гидроксиэтилцеллюлоза), лихенине, бета-1,4 связей в смешанных бета-1,3 глюканах, таких как бета-D-глюканы или ксилоглюканы злаков, и другого растительного сырья, содержащего целлюлозные компоненты. Для целей настоящего изобретения, эндоглюканазную активность определяют с помощью гидролиза карбоксиметилцеллюлозы (СМС), в соответствии с работой Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem., 59:257-268.

Целлобиогидролаза : термин «целлобиогидролаза», как определено в настоящей заявке, обозначает 1,4-бета-D-глюкан-целлобиогидролазу (E.C. 3.2.1.91), которая катализирует гидролиз 1,4-бета-D-глюкозидных связей в целлюлозе, целлоолигосахаридах или любом полимере, содержащем бета-1,4-связанную глюкозу, высвобождая целлобиозу из восстановленных или невосстановленных концов цепи. Для целей настоящего изобретения, целлобиогидролазную активность определяют в соответствии с процедурами, описанными Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; и van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288. В настоящем изобретении использовался метод Lever et al. для оценки гидролиза целлюлозы в кукурузной соломе, тогда метод van Tilbeurgh et al. использовался для определения целлобиогидролазной активности флуоресцентного дисахаридного производного.

Бета-глюкозидаза : Термин «бета-глюкозидаза», как определено в настоящей заявке, означает бета-D-глюкозид глюкогидролазу (E.C. 3.2.1.21), которая катализирует гидролиз концевых невосстановленных остатков бета-D-глюкозы с высвобождением бета-D-глюкозы. Для целей настоящего изобретения, бета-глюкозидазную активность определяли в соответствии с основной процедурой, описанной Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66, за исключением использования отличающихся условий, как описано в настоящей заявке. Одна единица бета-глюкозидазной активности определяется как 1,0 мкмоль п-нитрофенола, продуцируемого в минуту при температуре 50°C, pH 5 из 4 мМ п-нитрофенил-бета-D-глюкопиранозида, используемого в качестве субстрата, в 100 мМ цитрата натрия, 0,01% TWEEN®20.

Гликозидгидролаза семейства 7, 12, 45 или 61: Термин «гликозидгидролаза семейства 7» или «семейства GH7», «гликозидгидролаза семейства 12» или «семейства GH12», «гликозидгидролаза семейства 45» или «семейства GH45» и «гликозидгидролаза семейства 61» или «семейства GH61», как определено в настоящем изобретении, обозначает полипептид, относящийся к гликозидгидролазе семейства 7, семейства 12, семейства 45 и семейства 61, соответственно, согласно Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat В., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. В настоящее время Henrissat определяет семейство GH61 как неклассифицируемое, указывая, что свойства, такие как механизм, каталитический нуклеофил/основание, доноры каталитического протона и 3-D структура неизвестны для полипептидов, принадлежащих этому семейству. Белок GH7, GH12 или GH45 также обозначает как белок CEL7, CEL12 или CEL45, соответственно.

Содержащее целлюлозу сырье: Преобладающим полисахаридом в первичной клеточной стенке биомассы является целлюлоза, вторым по распространенности является гемицеллюлоза, а третьим - пектин. Вторичная клеточная стенка, продуцируемая клетками после остановки роста, также содержит полисахариды и ее прочность усиливается полимерным лигнином, ковалентно связанным с гемицеллюлозой. Целлюлоза представляет собой гомополимер ангидроцеллобиозы, и, таким образом, линейный бета-(1-4)-D-глюкан, тогда как гемицеллюлозы включают различные соединения, такие как ксиланы, ксилоглюканы, арабиноксиланы и маннаны, в виде сложных разветвленных структур с разнообразными заместителями. В основном являясь полиморфной, целлюлоза обнаруживается в ткани растений, прежде всего в виде нерастворимого кристаллического матрикса из параллельных цепей глюкана. Гемицеллюлозы обычно связаны водородными связями с целлюлозой, а также с другими гемицеллюлозами, что способствует стабилизации матрикса клеточной стенки.

Содержащее целлюлозу сырье может представлять собой любое сырье, содержащее целлюлозу. Целлюлоза, как правило, обнаруживается, например, в стеблях, листьях, шелухе, пленке и початках растений или в листьях, ветвях или древесине деревьев. Содержащее целлюлозу сырье может представлять собой, но этим не ограничиваясь, травянистое сырье, отходы сельхозпроизводства, отходы лесного производства, коммунально-бытовые твердые отходы, отходы бумажного производства, а также шлам и бумажную крошку. Содержащее целлюлозу сырье может представлять собой биомассу любого типа, включая, но ими не ограничиваясь, источники древесины, коммунально-бытовые твердые отходы, отходы бумажного производства, зерновые культуры и их остатки (см., например, Wiselogel et al., 1995, Handbook on Bioethanol (под редакцией Charles E. Wyman), pp. 105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd. 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, главный редактор, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, New York). Следует понимать, что в контексте настоящего изобретения содержащее целлюлозу сырье предпочтительно находится в форме лигноцеллюлозы, например, материала клеточной стенки растений, содержащего лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозу в составе смешанного матрикса.

В предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой кукурузную солому. В другом предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой кукурузные волокна. В другом предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой кукурузу в початках. В другом предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой траву. В другом предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой рисовую солому. В другом предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой отходы и шлам бумажного производства. В другом предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой древесные или травянистые растения. В другом предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье представляет собой багассу.

Содержащее целлюлозу сырье может использоваться как таковое или может быть подвергнуто предварительной обработке с использованием обычных методов, известных в данной области. Например, методы физической предварительной обработки могут включать различные типы помола, облучения, обработки паром/паровым взрывом и гидротермолиз; методы химической предварительной обработки могут включать обработку разбавленной кислотой, основанием, органическим растворителем, аммиаком, диоксидом серы, диоксидом углерода, а также метод pH-контролируемого гидротермолиза; и методы биологической предварительной обработки могут включать использование солюбилизирующих лигнин микроорганизмов (см., например, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, С. Е., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., and Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: краткий обзор в Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, С. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G, Т., 1999, Ethanol production from renewable resources, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, Т., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., and Hahn-Hagerdal, В., 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; and Vallander, L, and Eriksson, K.-E. L., 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotecnnol. 42:63-95).

Предварительная обработка кукурузной соломы : Термин «PCS» или «предварительно обработанная кукурузная солома», как определено в настоящей заявке, обозначает содержащее целлюлозу сырье, полученное из кукурузной соломы путем тепловой обработки и разбавленной кислотой. Для целей настоящего изобретения PCS получают методом, описанным в примере 20 или его вариантами, с изменением времени, температуры и количества кислоты.

Выделенный полипептид: Термин «выделенный полипептид», как используется в настоящей заявке, обозначает полипептид, который был выделен из некоего источника. В предпочтительном аспекте чистота полипептида по результатам анализов SDS-PAGE, составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90%.

По существу чистый полипептид : Термин «по существу чистый полипептид», как используется в настоящей заявке, обозначает полипептидный препарат, который содержит не менее чем 10%, предпочтительно, не менее чем 8%, более предпочтительно, не менее чем 6%, более предпочтительно, не менее чем 5%, более предпочтительно, не менее чем 4%, более предпочтительно, не менее чем 3% и еще более предпочтительно, не менее чем 2%, наиболее предпочтительно, не менее чем 1% и, еще наиболее предпочтительно, не менее чем 0,5% по массе относительно другого полипептидного сырья, с которым он связан в нативной или рекомбинантной форме. Таким образом, предпочтительно, чтобы по существу чистый полипептид имел чистоту, составляющую по меньшей мере 92%, предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 97%, более предпочтительно, по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,5% и, еще наиболее предпочтительно, по меньшей мере 100% по массе всего полипептидного сырья, присутствующего в препарате. Полипептиды по настоящему изобретению предпочтительно находятся по существу в чистой форме, то есть полипептидный препарат по существу свободен от другого полипептидного сырья, с которым он связан в нативной или рекомбинантной форме. Такая чистота может быть достигнута, например, путем получения полипептида хорошо известными рекомбинантными методами или путем классических методов очистки.

Зрелый полипептид: Термин «зрелый полипептид», как используется в настоящей заявке, обозначает полипептид с биологической активностью, такой как, ферментативная активность, которая сохраняется в его окончательной форме после трансляции и после любой пост-трансляционной модификации, такой как N-концевой процессинг, С-концевое усечение, гликозилирование, фосфорилирование и т.п.

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид: Термин «последовательность, кодирующая зрелый полипептид», как используется в настоящем описании, обозначает нуклеотидную последовательность, которая кодирует зрелый полипептид с биологической активностью.

Идентичность: Связь двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей описывается параметром «идентичность».

Для целей настоящего изобретения степень идентичности двух аминокислотных последовательностей определяется с помощью алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), встроенного в программу Needle в пакете прикладных программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), предпочтительно, версия 3.0.0 или более поздняя версия. Используемыми оптимальными параметрами являются штраф за пропуск, равный 10, штраф за удлинение, равный 0,5, и матрицу замещения EBLOSUM62 (EMBOSS версия, BLOSUM62). Результат в программе Needle как «самая длинная идентичность» (получаемая с помощью параметра -nobrief ), выражают как процент идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки×100)/(длина выравнивания - общее число пропусков при выравнивании).

Для целей настоящего изобретения степень идентичности двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей определяют, используя алгоритм Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra), встроенного в программу Needle в пакете прикладных программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), предпочтительно, версия 3.0.0 или более поздняя версия. Используемые оптимальные параметры включают штраф за пропуск, равный 10, штраф за удлинение, равный 0,5, и матрицу замещения EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4). Результат в программе Needle как «самая длинная идентичность» (получаемая с помощью параметра -nobrief ), выражают как процент идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные дезоксирибонуклеотиды×100)/(длина выравнивания - общее число пропусков при выравнивании).

Гомологичная последовательность: Термин «гомологичная последовательность», как используется в настоящей заявке, обозначает последовательность со значением E (или ожидаемое количество баллов) менее 0,001, используя blastp (для белковых баз данных), или tblastn (для баз данных нуклеиновых кислот) в качестве алгоритмов с матрицей BLOSUM62, с размером слова 3, штрафом за пропуск, равным 11, штрафом за удлинение, равным 1, без фильтрации низкой сложности и при использовании в качестве запроса последовательности зрелого белка. См., Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

Полипептидный фрагмент: Термин «полипептидный фрагмент», как определено в настоящей заявке, обозначает полипептид с одной или несколькими аминокислотами, делетированными на амино- и/или карбоксильном конце зрелого полипептида или его гомологичной последовательности; где указанный фрагмент обладает активностью соответствующего зрелого полипептида.

Субпоследовательность : Термин «субпоследовательность», как используется в настоящем описании, обозначает нуклеотидную последовательность с одним или несколькими нуклеотидами, делетированными с 5'- и/или 3'- конца последовательности, кодирующей зрелый полипептид или гомологичной ей последовательности; где указанная субпоследовательность кодирует фрагмент полипептида с активностью соответствующего зрелого полипептида.

Аллельный вариант: Термин «аллельный вариант», как используется в настоящей заявке, обозначает любые две или несколько альтернативных форм гена, занимающего один и тот же хромосомальный локус. Аллельный вариант возникает естественным образом в ходе мутации и может быть результатом полиморфизма в пределах популяции. Генные мутации могут быть молчащими (без изменения кодируемого полипептида) или могут кодировать полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый алелльным вариантом гена.

Выделенный полинуклеотид: Термин «выделенный полинуклеотид», как используется в настоящей заявке, обозначает полинуклеотид, выделенный из источника. В предпочтительном аспекте чистота полинуклеотида по результатам электрофореза в агарозном геле составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90%.

По существу чистый полинуклеотид: Термин «по существу чистый полинуклеотид», как используется в настоящей заявке, относится к полинуклеотидному препарату, свободному от других чужеродных или нежелательных нуклеотидов, который находится в форме, подходящей для применения в системах получения белка методами генной инженерии. Таким образом, по существу чистый полинуклеотид содержит не менее чем 10%, предпочтительно, не менее чем 8%, более предпочтительно, не менее чем 6%, более предпочтительно, не менее чем 5%, более предпочтительно, не менее чем 4%, более предпочтительно, не менее чем 3%, еще более предпочтительно, не менее чем 2%, наиболее предпочтительно, не менее чем 1% и еще наиболее предпочтительно, не менее чем 0,5% по массе относительно другого полинуклеотидного материала, с которым он связан в нативной или рекомбинантной форме. Тем не менее, по существу чистый полинуклеотид может включать природные 5'- и 3'-нетранслируемые участки, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно чистота по существу чистого полинуклеотида составляла по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 97%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99% и, еще наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,5% по массе. Полинуклеотиды по настоящему изобретению предпочтительно находятся в по существу чистой форме, то есть, нуклеотидный препарат по существу свободен от другого полинуклеотидного материала, с которым он связан в нативной или рекомбинантной форме. Полинуклеотиды могут быть геномными, получены из кДНК, РНК, полусинтетическими или синтетическими, или представляют собой любую их комбинацию.

кДНК: Термин «кДНК», как определено в настоящем описании, обозначает молекулу ДНК, которая может быть получена путем обратной транскрипции из зрелой, сплайсированной, молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. Молекула кДНК лишена интронных последовательностей, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный транскрипт РНК представляет собой предшественник мРНК, который процессируется в серии стадий с образованием зрелой сплайсинговой мРНК. Указанные стадии включают удаление интронных последовательностей процессом, называемого сплайсинг. Таким образом, кДНК, полученная из мРНК, утрачивает любые интронные последовательности.

Конструкция нуклеиновой кислоты: Термин «конструкция нуклеиновой кислоты», как используется в настоящем описании, обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая может быть одноцепочечной или двуцепочечной, и которая выделена из природного гена или модифицирована так, что содержит сегменты нуклеиновых кислот, не существующим в природе образом, или которая является синтетической. Термин «конструкция нуклеиновой кислоты» является синонимом термину «кассета экспрессии», если конструкция нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, требуемые для экспрессии кодирующей последовательности по настоящему изобретению.

Контрольные последовательности: Термин «контрольные последовательности», как описано в настоящей заявке, обозначает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или они могут быть нативными или чужеродными относительно друг друга. Такие контрольные последовательности включают, но ими не ограничиваясь, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промоторную, сигнальную пептидную последовательность и терминатор транскрипции. В качестве минимальной формы, контрольные последовательности включают промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Указанные контрольные последовательности могут существовать в сочетании с линкерами, с тем чтобы можно было встраивать специфические сайты рестрикции, облегчающие лигирование контрольных последовательностей с кодирующим участком нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.

Функционально связанный: Термин «функционально связанный», как используется в настоящей заявке, обозначает конфигурацию, в случае которой контрольная последовательность находится в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотидной последовательности, так что контрольная последовательность направляет экспрессию кодирующей последовательности для данного полипептида.

Кодирующая последовательность: Термин «кодирующая последовательность», как используется в настоящей заявке, обозначает нуклеотидную последовательность, которая непосредственно определяет аминокислотную последовательность своего белкового продукта. Границы кодирующей последовательности в основном определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается от ATG старт-кодона или от альтернативных старт-кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается таким стоп-кодоном, как TAA, TAG и TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность ДНК, кДНК, синтетическую иди рекомбинантную нуклеотидную последовательность.

Экспрессия : Термин «экспрессия», как используется в настоящей заявке, означает любую стадию, относящуюся к получению полипептида, и включает, но ими не ограничивается, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию, трансляцию, пост-трансляционную модификацию и секрецию.

Вектор экспрессии: Термин «вектор экспрессии», как используется в настоящей заявке, обозначает линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению и который функционально связанный с дополнительными нуклеотидами, необходимыми для его экспрессии.

Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин», как используется в настоящей заявке, обозначает клетку любого типа, которая является чувствительной к трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п., содержащую конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид.

Модификация: Термин «модификация», как используется в настоящей заявке, обозначает любую химическую модификацию зрелого полипептида или гомологичной последовательности, а также генетическую манипуляцию ДНК, кодирующей такой полипептид. Модификация может представлять собой замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот, а также замену одной или нескольких аминокислот боковых цепей.

Искусственный вариант: Как используется в настоящем изобретении, термин «искусственный вариант» обозначает полипептид, продуцируемый организмом, экспрессирующим модифицированную нуклеотидную последовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, или гомологичную последовательность. Модифицированную нуклеотидную последовательность получают путем проведения модификации полинуклеотидной последовательности или ее гомологичной последовательности.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам повышения активности полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, включающим добавление растворимого активирующего катиона двухвалентного металла в композицию, содержащую полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, повышает уровень деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья благодаря композиции целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

Настоящее изобретение также относится к способам деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, включающим обработку указанного содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ.

Настоящее изобретение также относится к способам получения продукта ферментации, включающим: (а) осахаривание содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ; (b) ферментацию осахаренного содержащего целлюлозу сырья со стадии (а) одним или несколькими ферментирующими микроорганизмами с получением продукта ферментации; и (с) восстановление продукта ферментации из ферментативной среды.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и присутствие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, повышает уровень деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья благодаря композиции целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

Настоящее изобретение также относится к композициям целлюлолитического фермента, содержащим эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и присутствие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, повышает степень деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья благодаря композициям целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

Катионы двухвалентного металла

В настоящем изобретении может быть использован любой растворимый активирующий катион двухвалентного металла. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбирают из группы, состоящей из Mn⁺⁺, Co⁺⁺ , Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ и их комбинации. В более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла представляет собой Mn⁺⁺. В другом более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла представляет собой Co⁺⁺. В другом более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла представляет собой Mg⁺⁺. В другом более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла представляет собой Ca⁺⁺. В другом более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла представляет собой два или несколько катионов, выбранных из группы, состоящей из Mn⁺⁺, Co⁺⁺, Mg⁺⁺ и Ca⁺⁺. В наиболее предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла представляет собой Mn⁺⁺. В другом наиболее предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла представляет собой Mg⁺⁺.

Растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей предпочтительно от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,01 мМ до примерно 25 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,1 мМ до примерно 25 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,1 мМ до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 5 мМ, наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 2,5 мМ, и еще наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 1 мМ.

В предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют в процессе деградации или преобразования указанное содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ. В более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла материала добавляют в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей от примерно 0,01 мМ до примерно 25 мМ. В более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей от примерно 0,1 мМ до примерно 25 мМ. В более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей от примерно 0,1 мМ до примерно 10 мМ. В еще более предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей от примерно 0,3 мМ до примерно 5 мМ. В наиболее предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей от примерно 0,3 мМ до примерно 2,5 мМ. В еще наиболее предпочтительном аспекте растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья в эффективной концентрации, составляющей от примерно 0,3 мМ до примерно 1 мМ.

Растворимый активирующий катион двухвалентного металла добавляют предпочтительно в виде растворимой соли, такой как, например, сульфатная, карбонатная, хлоридная, цитратная, нитратная, нитритная, фторидная или йодидная соль. Однако, специалистам в данной области известно, что целлюлозная биомасса может содержать множество катионов двухвалентных металлов (см., например, F. B. Salisbury and С. W. Ross: Plant Physiology, Wadsworths Publishing Company, Belmont, California (1992)). Таким образом, целлюлозная биомасса может использоваться, частично или полностью, как источник катионов металла. Активирующие катионы двухвалентного металла могут быть растворимыми или нерастворимыми. Термин «растворимый активирующий катион двухвалентного металла», как используется в настоящей заявке, обозначает катион двухвалентного металла, который доступен в виде раствора и может использоваться для повышения активности полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность. Термин «нерастворимый активирующий катион двухвалентного металла», как используется в настоящей заявке, обозначает катион двухвалентного металла, который недоступен в виде раствора для повышения активности полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность. Катион двухвалентного металла может быть недоступен, в частности, в связи с тем, что он хелатирован, например, такими соединениями как ЭДТА или ЭГТА, или в связи с тем, что он входит в состав комплекса с компонентом целлюлозной биомассы, например, находится в комплексе с пирофосфатом.

Целлюлозная биомасса может также поставлять растворимые катионы двухвалентного металла, которые ингибируют целлюлолизис (в тексте настоящего описания для их обозначения используется термин «растворимый ингибирующий катион двухвалентного металла»). Например, ингибирующим катионом двухвалентного металла является Zn ⁺⁺ или Fe⁺⁺. Следовательно, в условиях, когда присутствует смесь растворимых катионов двухвалентного металла, некоторые из них активируют, а другие ингибируют целлюлолизис, добавляют избыток растворимого активирующего катион двухвалентного металла, с тем чтобы преодолеть ингибирующий эффект ингибирующих катионов двухвалентного металла. В такой ситуации, для предупреждения ингибирующего действия катионов двухвалентного металла, снижающего активность полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, способы по настоящему изобретению также включают добавку соответствующей концентрации растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, с тем чтобы поддерживать эффективную концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла в диапазоне, равном предпочтительно от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,01 мМ до примерно 25 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,1 мМ до примерно 25 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,1 мМ до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 5 мМ, наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 2,5 мМ, и еще наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 1 мМ, в течение периода времени, достаточного для деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья.

В предпочтительном аспекте концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла вводят на стадии деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья таким образом, чтобы поддерживать эффективную концентрацию от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ. В более предпочтительном аспекте концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на стадии деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья вводят на таком уровне, чтобы поддерживать эффективную концентрацию от примерно 0,01 мМ до примерно 25 мМ. В более предпочтительном аспекте вводят такую концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на стадии деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, чтобы поддерживать эффективную концентрацию в диапазоне от примерно 0,1 мМ до примерно 25 мМ. В более предпочтительном аспекте настоящего изобретения, вводят концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на стадии деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья на таком уровне, чтобы поддерживать эффективную концентрацию в диапазоне от примерно 0,1 мМ до примерно 10 мМ. В еще более предпочтительном аспекте настоящего изобретения, вводят концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на стадии деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья на таком уровне, чтобы поддерживать эффективную концентрацию в диапазоне от примерно 0,3 мМ до примерно 5 мМ. В наиболее предпочтительном аспекте настоящего изобретения, вводят концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на стадии деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья на таком уровне, чтобы поддерживать эффективную концентрацию в диапазоне от примерно 0,3 мМ до примерно 2,5 мМ. В еще наиболее предпочтительном аспекте настоящего изобретения, вводят концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на стадии деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья на таком уровне, чтобы поддерживать эффективную концентрацию в диапазоне от примерно 0,3 мМ до примерно 1 мМ.

Концентрация катионов двухвалентного металла в целлюлозной биомассе может быть определена с использованием любого, известного в данной области метода, такого как метод атомной абсорбции, использование электрохимических электродов, биосенсоров на основе ионов металла или оптических сенсоров или при проведении титрования продуктов хелатирования (см., например, Methods in Enzymology, v. 158 (multiple chapters), Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th ed.; Molecular Probes. Inc.: Eugene, OR, 1996., Thompson et al. Anal. Chem., 70 (22), 4717-4723, 1998, inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, Akbar Montaser (под редакцией) May 1998).

В способах по настоящему изобретению, растворимый активирующий катион двухвалентного металла повышает активность полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, предпочтительно, по меньшей мере в 0,1, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,2, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,3, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,4, более предпочтительно, по меньшей мере в 0,5, более предпочтительно, по меньшей мере в 1, более предпочтительно, по меньшей мере в 3, более предпочтительно, по меньшей мере в 4, более предпочтительно, по меньшей мере в 5, более предпочтительно, по меньшей мере в 10, более предпочтительно, по меньшей мере в 20, и еще более предпочтительно, по меньшей мере в 30, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 50, и еще наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз.

Композиции целлюлолитического фермента

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной предпочтительно от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,01 мМ до примерно 25 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,1 мМ до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 5 мМ, наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 2,5 мМ, и еще наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 1 мМ, в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и присутствие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, повышает уровень деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья благодаря композиции целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

Настоящее изобретение также относится к композициям целлюлолитического фермента, содержащим эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной предпочтительно от примерно 0,001 мМ до примерно 50 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,01 мМ до примерно 25 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,1 мМ до примерно 25 мМ, более предпочтительно, от примерно 0,1 мМ до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 5 мМ, наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 2,5 мМ, и еще наиболее предпочтительно, от примерно 0,3 мМ до примерно 1 мМ, в процессе деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и присутствие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, повышает уровень деградации или преобразования содержащего целлюлозу сырья благодаря композициям целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом, усиливающим целлюлолитическую активность, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла.

В способах настоящего изобретения, композиция целлюлолитического фермента может содержать любой белок, вовлекаемый в процессинг содержащего целлюлозу сырья до глюкозы или гемицеллюлозы до ксилозы, маннозы, галактозы и арабинозы, их полимеров или продуктов, полученных из них согласно приведенному ниже описанию. В одном аспекте композиции с целлюлолитическим ферментом содержат эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу и их сочетание. В другом аспекте композиция с целлюлолитическим ферментом также включают одну или несколько дополнительных активных ферментов, способствующих улучшению процесса деградации содержащего целлюлозу сырья. Предпочтительные дополнительные ферменты включают гемицеллюлазы, эстеразы (например, липазы, фосфолипазы и/или кутиназы), протеазы, лакказы, пероксидазы или их смеси.

Композиция с целлюлолитическим ферментом может представлять собой монокомпонентный препарат, например, препарат на основе эндоглюканазы, но это может быть многокомпонентный препарат, например, содержащий эндоглюканазу(ы), целлобиогидролазу(ы) и бета-глюкозидазу(ы), или сочетание многокомпонентных и монокомпонентных белковых препаратов. Целлюлолитические белки могут обладать активностью, то есть, способностью гидролизовать содержащее целлюлозу сырье, в кислом, нейтральном или щелочном диапазоне pH.

Как указывалось выше, целлюлолитические белки, используемые по настоящему изобретению, могут представлять собой монокомпонентные препараты, то есть один компонент, по существу свободный от других целлюлолитических компонентов. Единственный компонент может представлять собой рекомбинантный компонент, то есть компонент, полученный путем клонирования последовательности ДНК, кодирующей единственный компонент, с последующей трансформацией клетки последовательностью ДНК и экспрессией в клетке-хозяине (см., например WO 91/17243 и WO 91/17244). Клетка-хозяин может представлять собой гетерологичную клетку-хозяина (где фермент будет чужеродным для клетки-хозяина) или клетка-хозяин может представлять собой клетку-хозяин дикого типа (фермент является нативным для клетки-хозяина). Монокомпонентные целлюлолитические белки могут быть также получены путем выделения и последующей очистки такого белка из ферментативного бульона.

Ферменты, используемые в настоящем изобретении, могут находиться в любой форме, подходящей для использования в приведенных в настоящем описании процессах, например, в виде неочищенного ферментативного бульона при наличии клеток или в их отсутствие, это может быть сухой порошок или гранулят, нераспыляемый гранулят, жидкость, стабилизированная жидкость или защищенный фермент. Грануляты могут быть получены, например, как описано в патентах США No. 4106991 и 4661452, и могут необязательно быть покрыты способом, известным в данной области. Жидкие ферментативные препараты, например, могут быть стабилизированы путем добавления стабилизатора, такого как сахар, сахарный спирт или другой полиол, и/или молочной кислотой или другой органической кислоты, в соответствии с установленным методом. Защищенные ферменты могут быть получены способом, описанным в EP 238216.

Полипептид с активностью целлюлолитического фермента, может быть получен из микроорганизмов любого рода. Термин «получен из», как используется в настоящей заявке, означает, что данный фермент был выделен из организма, который продуцирует фермент в природном состоянии как нативный фермент. Термин «получен из», как используется в настоящей заявке, также означает, что фермент может быть получен рекомбинантными методами из организма-хозяина, где фермент, полученный рекомбинантным методом, является либо нативным, либо чужеродным для организма-хозяина или имеет модифицированную аминокислотную последовательность, например, с делецией, инсерцией и/или заменой одной или нескольких аминокислот, например, фермент, полученный рекомбинантным способом, является мутантом и/или фрагментом нативной аминокислотной последовательности, или ферментом, полученным в результате процессов перегруппировки как известно в данной области. В определение нативного фермента включаются природные варианты, а в определение чужеродного фермента включаются варианты, полученные путем химического или рекомбинантного мутагенеза, такого как сайт-направленный мутагенез или перегруппировка. Следовательно, химически модифицированные мутанты целлюлолитических белков или мутанты, полученные методами белковой инженерии, могут также использоваться в настоящем изобретении. В предпочтительном аспекте полипептид, полученный из данного источника, секретируется за пределы клетки.

Полипептид с активностью целлюлолитического фермента представляет собой бактериальный полипептид. Например, полипептид может представлять собой полипептид из грамположительных бактерий, такой как полипептид с активностью целлюлолитического фермента, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, или Oceanobacillus, или полипептид из грамотрицательных бактерий, такой как полипептид с активностью целлюлолитического фермента E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria или Ureaplasma.

В предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид с активностью целлюлолитического фермента Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

В другом предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид с активностью целлюлолитического фермента Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis или Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

В другом предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид с активностью целлюлолитического фермента Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus или Streptomyces lividans.

Полипептид с активностью целлюлолитического фермента может представлять собой полипептид грибов и, более предпочтительно, полипептид дрожжей, такой как полипептид с активностью целлюлолитического фермента Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или более предпочтительно, полипептид нитевидных грибов, такой как полипептид с активностью целлюлолитического фермента Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, NeocalLimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella или Xylaria.

В предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид с активностью целлюлолитического фермента Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis .

В предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид с активностью целлюлолитического фермента, из Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum,Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicolainsolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillum purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride или Trichophaea saccata.

В способах по настоящему изобретению может использоваться любая эндоглюканаза, целлобиогидролаза и/или бета-глюкозидаза, а также любой другой целлюлолитический фермент.

Примеры бактериальных эндоглюканаз, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают, но ими не ограничиваясь, эндоглюканазу Acidothermus celtulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; патент США No. 5275944; WO 96/02551; патент США No. 5536655, WO 00/70031, WO 05/093050); эндоглюканазу III Thermobifida fusca (WO 05/093050); и эндоглюканазу V Thermobifida fusca (WO 05/093050).

Примеры эндоглюканаз грибов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают, но ими не ограничиваясь, эндоглюканазу I Trichoderma reesei (Penttila et a. 1986, Gene 45: 253-263; GenBank , номер доступа No. M15665); эндоглюканазу II Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1988, Gene 63:11-22; GenBank , номер доступа M19373); эндоглюканазу III Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; GenBank , номер доступа AB003694); эндоглюканазу IV Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249: 584-591; GenBank , номер доступа Y11113); и эндоглюканазу V Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; GenBank , номер доступа Z33381); эндоглюканазу Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); эндоглюканазу Aspergillis kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); Chrysosporium sp. C1 (патент США No. 6573086; GenPept, номер доступа AAQ38150); Corynascus heterothallicus (патент США No. 6855531; GenPept, номер доступа AAY00844); эндоглюканазу Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); эндоглюканазу Fusarium oxysporum endogiucanase (GenBank , номер доступа L29381); эндоглюканазу Humicola grisea var. thermoidea (GenBank , номер доступа AB003107); эндоглюканазу Melanocarpus albomyces (GenBank , номер доступа MAL515703); эндоглюканазу Neurospora crassa (GenBank , номер доступа XM_324477); Piromyces equi (Eberhardt et al., 2000, Microbiology 146: 1999-2008; GenPept, номер доступа CAB92325); Rhizopus oryzae (Moriya et al., 2003, J. Bacteriology 185:1749-1756; GenBank , номера доступа AB047927, AB056667 и AB056668); и Thielavia terrestris (WO 2004/053039; EMBL, номер доступа CQ827970).

Описаны другие эндоглюканазы из более чем 13 семейств гликозилгидролаз, которые были сгруппированы в соответствии с классификацией Henrissat В., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, и Henrissat В., и Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316:695-696.

В предпочтительном аспекте эндоглюканаза представляет собой эндоглюканазу I Trichoderma reesei (CEL7B). В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза представляет собой эндоглюканазу II Trichoderma reesei (CEL5A). В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза представляет собой эндоглюканазу III Trichoderma reesei (CEL12A). В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза представляет собой эндоглюканазу V Trichoderma reesei (CEL45A). В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза представляет собой эндоглюканазу Myceliophthora thermophila CEL7. В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза представляет собой эндоглюканазу Chrysosporium lucknowense CEL12. В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза представляет собой эндоглюканазу Chrysosporium lucknowense CEL45.

В более предпочтительном аспекте эндоглюканаза I Trichoderma reesei (CEL7B) представляет собой зрелый полипептид SEQ ID NO:74 или ортолог или вариант данной последовательности. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза II Trichoderma reesei (CEL5A) представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:76 или ортолог или вариант. В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза III Trichoderma reesei (CEL12A) представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:78 или ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза V Trichoderma reesei (CEL45A) представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:80 или ортолог или вариант. В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза Myceliophthora thermophila CEL7 представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:82 или ортолог или вариант. В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза Myceliophthora thermophila CEL12 представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:84 или ее ортолог или вариант. В другом предпочтительном аспекте эндоглюканаза Myceliophthora thermophila CEL45 представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:86 или ее ортолог или вариант.

В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза I Trichoderma reesei (CEL7B) кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:73 или ортологом или вариантом данной последовательности. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза II Trichoderma reesei (CEL5A) кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:75 или ортологом или вариантом данной последовательности. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза III Trichoderma reesei (CEL12A) кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:77 или ортологом или вариантом данной последовательности. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза V Trichoderma reesei (CEL45A) кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:79 или ортологом или вариантом данной последовательности. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза Myceliophthora thermophila CEL7 кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:81 или ортологом или вариантом данной последовательности. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза Chrysosporium CEL12 кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:83 или ортологом или вариантом данной последовательности. В другом более предпочтительном аспекте эндоглюканаза из Chrysosporium CEL45 кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:85 или ортологом или вариантом данной последовательности.

Эндоглюканаза I Trichoderma reesei (CEL7B) может быть получена по описанной в литературе процедуре Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263). Эндоглюканаза II из Trichoderma reesei (CEL5A) может быть получена, как описано Saloheimo et al., 1988, Gene 63:11-22. Эндоглюканаза III Trichoderma reesei (CEL12A) может быть получена по описанной в литературе процедуре Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol 64: 555-563. Эндоглюканаза V Trichoderma reesei (CEL45A) может быть получена, как описано Saioheimo ef al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228. Эндоглюканаза Myceliophthora thermophila CEL7 может быть получена, как описано в WO 95/024471. Эндоглюканаза из Chrysosporium lucknowense CEL12 может быть получена, как описано в WO 2001/25468. Эндоглюканаза из Chrysosporium lucknowense CEL45 может быть получена, как описано в WO 2000/20555.

В другом предпочтительном аспекте целлобиогидролаза представляет собой целлобиогидролазу I Trichoderma reesei (CEL7A). В другом предпочтительном аспекте целлобиогидролаза представляет собой целлобиогидролазу II Trichoderma reesei (CEL6A). В другом предпочтительном аспекте целлобиогидролаза представляет собой целлобиогидролазу Chrysosporium lucknowense CEL7 с доменом связывания целлюлозы. В другом предпочтительном аспекте целлобиогидролаза представляет собой целлобиогидролазу Myceliophthora thermophila CEL7 без домена связывания глюкозы. В другом предпочтительном аспекте целлобиогидролаза представляет собой целлобиогидролазу Thielavia terrestris .

В другом предпочтительном аспекте целлобиогидролаза I Trichoderma reesei (CEL7A) представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:88 или ее ортолог или вариант. В другом предпочтительном аспекте целлобиогидролаза II Trichoderma reesei (CEL6A) представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:90 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза CEL7 Chrysosporium lucknowense с доменом связывания целлюлозы представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:92 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза Myceliophthora thermophila CEL7 без домена связывания целлюлозы представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:94 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза Thielavia terrestris представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:96 или ее ортолог или вариант.

В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза I Trichoderma reesei (CEL7A) представляет собой целлобиогидролазу, которая кодируется кодирующей последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO:87 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза II Trichoderma reesei (CEL6A) представляет собой целлобиогидролазу, которая кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:89 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза Chrysosporium lucknowense CEL7 с доменом связывания целлюлозы кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:91 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза из Myceliophthora thermophila CEL7 без домена связывания целлюлозы кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:93 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте целлобиогидролаза из Thielavia terrestris кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:95 или ее ортологом или вариантом.

Целлобиогидролаза I Trichoderma reesei (CEL7A) может быть получена, как описано Shoemaker et al., 1983, Biotechnology (N.Y.) 1: 691-696. Целлобиогидролаза II Trichoderma reesei (CEL6A) может быть получена, как описано Terri et al, 1987, Gene 51: 43-52. Целлобиогидролаза Chrysosporium lucknowense CEL7 с доменом связывания целлюлозы может быть получена, как описано в WO 2001/79507. Целлобиогидролаза Myceliophthora thermophila CEL7 без домена связывания целлюлозы может быть получена, как описано в WO 2003/000941. Целлобиогидролаза Thielavia terrestris может быть получена, как описано в WO 2006/074435.

В другом предпочтительном аспекте бета-глюкозидазу получают из Aspergillus oryzae. В другом предпочтительном аспекте бета-глюкозидазу получают из Aspergillus fumigatus. В другом предпочтительном аспекте бета-глюкозидазу получают из Penicillium brasilianum, например, Penicillium brasilianum, штамм IBT 20888. В другом предпочтительном аспекте бета-глюкозидазу получают из Aspergillus niger. В другом предпочтительном аспекте бета-глюкозидазу получают из Aspergillus aculeatus.

В более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus oryzae представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:16 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus fumigatus представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:18 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Penicillium brasilianum представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:20 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus niger представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:22 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus aculeatus представляет собой зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:24 или ее ортолог или вариант. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus oryzae кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:15 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus fumigatus кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:17 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Penicillium brasilianum кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:19 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus niger кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:21 или ее ортологом или вариантом. В другом более предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза Aspergillus aculeatus кодируется последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:23 или ее ортологом или вариантом.

Полипептид Aspergillus oryzae с бета-глюкозидазной активностью может быть получен методом, описанным в WO 2002/095014. Полипептид из Aspergillus fumigatus с бета-глюкозидазной активностью может быть получен методом, описанным в WO 2005/047499. Полипептид Penicillium brasllianum с бета-глюкозидазной активностью, может быть получен методом, описанным в WO 2007/019442. Полипептид Aspergillus niger с бета-глюкозидазной активностью может быть получен методом, описанным Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. Полипептид Aspergillus aculeatus с бета-глюкозидазной активностью может быть получен методом, описанным Kawaguchi et al., 1996, Gene 173; 287-288.

В другом предпочтительном аспекте зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:16 кодируется полинуклеотидом, содержащимся в плазмиде, которая входит в E. coli DSM 14240. В другом предпочтительном аспекте зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:18 кодируется полинуклеотидом, содержащимся в плазмиде, которая включена в pEJG113, включенную в E. coli NRRL B-30695. В другом предпочтительном аспекте зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO:20 кодируется полинуклеотидом, содержащимся в плазмиде pKKAB, которая входит в E. coli NRRL B-30860.

В другом предпочтительном аспекте бета-глюкозидаза представляет собой слитый белок варианта BG бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae с последовательностью SEQ ID NO:26. В другом предпочтительном аспекте слитый белок на основе варианта BG бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae кодируется полинуклеотидом SEQ ID NO:25. В другом предпочтительном варианте бета-глюкозидаза представляет собой слитый белок бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae с последовательностью SEQ ID NO:28. В другом предпочтительном аспекте слитый белок бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae кодируется полинуклеотидом SEQ ID NO:27.

Примеры других бета-глюкозидаз, которые также могут использоваться в настоящем изобретении, включают, но ими не ограничиваясь, бета-глюкозидазу Aspergillus oryzae (WO 02/095014; WO 04/099228); бета-глюкозидазу Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et at., 1996, Gene 173; 287-288); бета-глюкозидазу Aspergillus avenaceus (GenBank , номер доступа AY943971); бета-глюкозидазу Aspergillus fumigatus (GenBank , номер доступа XM745234); бета-глюкозидазу Aspergillus kawachii (GenBank^TM, номер доступа AB003470); бета-глюкозидазу Aspergillus niger (GenBank , номер доступа AJ132386); бета-глюкозидазу Magnaporthe grisea (GenBank , номер доступа AY849670); бета-глюкозидазу Phanerochaete chrysosporium (GenBank , номер доступа AB253327); бета-глюкозидазу Talaromyces emersonii (GenBank^TM, номер доступа AY072918) и бета-глюкозидазу Trichoderma reesei (GenBank , номера доступа U09580, AB003110, AY281374, AY281375, AY281377, AY281378 и AY281379). Могут также использоваться варианты бета-глюкозидазы, такие, как описано в WO 04/099228.

Описаны также другие бета-глюкозидазы более чем 13 семейств гликозилгидролаз в соответствии с классификацией Henrissat В., 1991, A classification of glycosyi hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat В., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316:695-696.

Следует понимать, что указанные выше в настоящем описании виды охватывают как их совершенные, так и несовершенные формы, а также другие таксономические эквиваленты, например, анаморфы, независимо от наименования вида, под которым они известны. Специалисты в данной области могут легко определить идентичность соответствующих эквивалентов.

Штаммы указанных видов легко доступны во множестве известных Коллекций культур, таких как American Type Culture Collection (ATCC)), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Кроме того, такие полипептиды могут быть идентифицированы и получены из других источников, включающих микроорганизмы, выделенные из природной среды (например, из почвы, компостов, воды и т. п.), с использованием соответствующих, указанных выше зондов. Методики выделения микроорганизмов из природной среды хорошо известны специалистам в данной области. Полинуклеотид может быть далее получен при проведении скрининга библиотеки геномной ДНК или кДНК из такого микроорганизма. При детекции полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, с использованием указанных одного или нескольких зондов, далее такой полинуклеотид может быть выделен или клонирован с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, supra).

Полипептиды с активностью целлюлолитического фермента, включают также слитые полипептиды или расщепляемые слитые полипептиды, в которых другой полипептид слит с полипептидом или его фрагментом с активностью целлюлолитического фермента, на N-конце или на C-конце такого полипептида или фрагмента. Слитый полипептид получают путем слияния нуклеотидной последовательности (или ее части), кодирующей другой полипептид, с нуклеотидной последовательностью (или ее частью), кодирующей полипептид с активность целлюлолитического фермента. Методики получения слитых полипептидов известны в данной области и предусматривают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, таким, чтобы они находились в рамке считывания, и экспрессия такого слитого полипептида находится под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора.

Указанный слитый полипептид может также включать сайт расщепления. При секреции слитого белка сайт расщепляется, высвобождая полипептид с активностью целлюлолитического фермента из слитого белка. Примеры сайтов расщепления включают, но ими не ограничиваясь, сайт Kex2, который кодирует дипептид Lys-Arg (Martin et al., 2003. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3; 568-76; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; и Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381), сайт Ile-(Glu или Asp)-Gly-Arg, который расщепляется протеазой фактора Xa после остатка аргинина (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512); сайт Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, который расщепляется энтерокиназой после лизина (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); сайт His-Tyr-Glu или сайт His-Tyr-Asp, который расщепляется гененазой (Genenasa) I (Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248); сайт Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, который расщепляется тромбином после Arg (Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48); сайт Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, который расщепляется TEV протеазой после Gln (Stevens, 2003, supra); и сайт Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, который расщепляется генетически сконструированной формой протеазы человеческого риновируса 3C после Gln (Stevens, 2003, supra).

В предпочтительном аспекте композиция целлюлолитического фермента содержит бета-глюкозидазу, целлобиогидролазу I Trichoderma reesei (CEL7A), целлобиогидролазу II Trichoderma reesei (CEL6A) и эндоглюканазу I Trichoderma reesei (CEL7B).

В другом предпочтительном аспекте композиция целлюлолитического фермента содержит бета-глюкозидазу, целлобиогидролазу I Trichoderma reesei (CEL7A), целлобиогидролазу II Trichoderma reesei (CEL6A) и эндоглюканазу I Trichoderma reesei (CEL7B), а также содержит один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из эндоглюканазы II Trichoderma reesei (CEL5A), эндоглюканазы V Trichoderma reesei (CEL45A) и эндоглюканазы III Trichoderma reesei (CEL12A).

В другом предпочтительном аспекте композиция целлюлолитического фермента содержит бета-глюкозидазу; целлобиогидролазу I Trichoderma reesei (CEL7A), целлобиогидролазу II Trichoderma reesei (CEL6A) и эндоглюканазу I Trichoderma reesei (CEL7B), а также содержит целлобиогидролазу Thielavia terrestris .

В другом предпочтительном аспекте композиция целлюлолитического фермента содержит бета-глюкозидазу; целлобиогидролазу I Trichoderma reesei (CEL7A), целлобиогидролазу II Trichoderma reesei (CEL6A), и эндоглюканазу I Trichoderma reesei (CEL7B), а также включает (1) один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из эндоглюканазы II Trichoderma reesei (CEL5A), эндоглюканазы V Trichoderma reesei (CEL45A) и эндоглюканазы III Trichoderma reesei (CEL12A), и/или также включает (2) целлобиогидролазу Thielavia terrestris .

В другом предпочтительном аспекте композиция целлюлолитического фермента содержит один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из полипептида Myceliophthora thermophila CEL7 с эндоглюканазной активностью, полипептида из Chrysosporium lucknowense CEL12 с эндоглюканазной активностью, полипептида Chrysosporium lucknowense CEL45 с эндоглюканазной активностью, полипептида Chrysosporium lucknowense CEL7 с целлобиогидролазной активностью, с доменом связывания целлюлозы и полипептида Myceliophthora thermophila CEL7 с целлобиогидролазной активностью, без домена связывания целлюлозы. В другом предпочтительном аспекте композиция целлюлолитического фермента содержит полипептид Myceliophthora thermophila CEL7 с эндоглюканазной активностью, полипептид Chrysosporium lucknowense CEL12 с эндоглюканазной активностью, полипептид из Chrysosporium lucknowense CEL45 с эндоглюканазной активностью, полипептид CEL7 с целлобиогидролазной активностью с доменом связывания целлюлозы и полипептид Myceliophthora thermophila CEL7 с целлобиогидролазной активностью без домена связывания целлюлозы. В другом предпочтительном аспекте композиция также содержит один или несколько полипептидов с бета-глюкозидазной активностью.

Композиция целлюлолитического фермента может также представлять собой коммерческий препарат. Примеры коммерческих препаратов с целлюлолитическим ферментом, подходящие для использования по настоящему изобретению, включают, например, CELLUCLAST (доступный от компании Novozymes A/S) и NOVOZYM 188 (доступный от компании Novozymes A/S). Другие коммерчески доступные препараты, которые также могут использоваться, включают: CELLUZYME , CEREFLO и ULTRAFLO (Novozymes A/S), LAMINEX и SPEZYME CP (Genencor Int.), ROHAMENT 7069 W (Rohm GmbH) и FIBREZYME® LDI, FIBREZYME® LBR или VISCOSTAR© 150L (Dyadic International, Inc., Jupiter, FL, USA).

Другие целлюлолитические белки, которые могут использоваться по настоящему изобретению, описаны в: EP 495257, EP 531315, EP 531372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, патент США No. 4435307, патент США No. 5457046, патент США No. 5648263, патент США No. 5686593, патент США NO. 5691178, патент США No. 5763254 и патент США No. 5776757.

Целлюлолитические белки, используемые в способах по настоящему изобретению, могут быть получены путем ферментации указанных выше микробных штаммов на питательной среде, содержащей подходящие источники углерода и азота, а также неорганические соли, с использованием методик, известных в данной области (см., например, Bennett, J.W. и LaSure, L (eds.). More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с описанными в литературе композициями (например, в каталоге Американской Коллекции типовых культур (American Type Culture Collection)). Диапазоны температур и другие условия, подходящие для роста и продукции целлюлолитического белка, известны в данной области (см., например, Bailey, J.E., и Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

Ферментация может быть проведена по любому способу культивирования клетки, который приводит к экспрессии или выделению целлюлолитического белка. Таким образом, ферментацию можно понимать как процесс, включающий культивирование колб на шейкере, или способ мелко- или крупномасштабной ферментации (включая методы непрерывной ферментации, периодической ферментации, периодической ферментации с подачей ферментируемой среды или ферментации в твердой фазе) в лабораторных или промышленных ферментерах, в подходящей среде и при условиях, позволяющих экспрессию или выделение целлюлолитического белка. Полученные описанными выше методами целлюлолитические белки могут быть восстановлены из ферментационной среды и далее очищены с использованием стандартных процедур, приведенных в настоящем описании.

Полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность

В первом аспекте выделенные полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, включают следующие мотивы:

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV],

где X обозначает любую аминокислоту, X(4,5) представляет собой любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях, и X(4) представляет собой любую аминокислоту в 4 соседних положениях.

Выделенный полипептид, включающий указанные выше мотивы, может также включать:

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV] или

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], где X представляет собой любую аминокислоту, X(1,2) представляет собой любую аминокислоту в 1 положении или в 2 соседних положениях, X(3) представляет собой любую аминокислоту в 3 соседних положениях и X(2) представляет собой любую аминокислоту в 2 соседних положениях. В указанных выше мотивах, используются принятые в номенклатуре IUPAC однобуквенные сокращения названия аминокислот.

В предпочтительном аспекте выделенный полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, также содержит: H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]. В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения, выделенный полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, также включает: [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]. В другом предпочтительном аспекте выделенный полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, также включает: H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV].

Во втором аспекте настоящего изобретения, выделенные полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, включают следующий мотив:

[ILMV]-P-x(4,6)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ],

где х обозначает любую аминокислоту, x(4,5) представляет собой любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и x(3) представляет собой любую аминокислоту в 3 соседних положениях. В указанном выше мотиве, используются принятые в номенклатуре IUPAC однобуквенные сокращения названия аминокислот.

В третьем аспекте выделенные полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, содержат аминокислотную последовательность, которая обладает степенью идентичности зрелому полипептиду с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14, составляющей предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, и еще наиболее предпочтительно, по меньшей мере 96%, 97%, 98%, или 99%, где указанные полипептиды обладают активностью, усиливающей целлюлолитическую активность (далее называемые как «гомологичные полипептиды»). В предпочтительном аспекте гомологичные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, которая отличается по десяти аминокислотам, предпочтительно по пяти аминокислотам, более предпочтительно, по четырем аминокислотам, еще более предпочтительно, по трем аминокислотам, наиболее предпочтительно, по двум аминокислотам, и еще наиболее предпочтительно, по одной аминокислоте от зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее аллельный вариант, или ее фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает зрелый полипептид SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 20-326 последовательности SEQ ID NO:2 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 20-326 последовательности SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 20-326 последовательности SEQ ID NO:2 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 20-326 последовательности SEQ ID NO:2.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В другом предпочтительном аспекте полипептид содержит зрелый полипептид SEQ ID NO:4. В другом предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислоты 18-240 последовательности SEQ ID NO:4, или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 18-240 последовательности SEQ ID NO:4. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO:4. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 18-240 последовательности SEQ ID NO:4 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 18-240 последовательности SEQ ID NO:4.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, предпочтительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или аллельный вариант, или фрагмент, который обладает активностью, усиливающую целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает зрелый полипептид SEQ ID NO:6. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 20-258 последовательности SEQ ID NO:6, или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 20-258 последовательности SEQ ID NO:6. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающую целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO:6. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из аминокислот 20-258 последовательности SEQ ID NO:6 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из аминокислот 20-258 последовательности SEQ ID NO:6.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте изобретения полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид включает зрелый полипептид SEQ ID NO:8. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 19-226 последовательности SEQ ID NO:8 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 19-226 последовательности SEQ ID NO:8. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8 или аллельного варианта, или фрагмента, который обладает активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO:8. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из аминокислот 19-226 последовательности SEQ ID NO:8 или аллельного варианта, или фрагмента, который обладает активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 19-226 последовательности SEQ ID NO:8.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 или аллельный вариант, или фрагмент, который обладает активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид включает зрелый полипептид SEQ ID NO:10. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид включает аминокислоты 20-304 последовательности SEQ ID NO:10 или аллельный вариант или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 20-304 последовательности SEQ ID NO:10. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10 или аллельного варианта, или фрагмента, который обладает активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO:10. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из аминокислот 20-304 последовательности SEQ ID NO:10 или аллельного варианта, или фрагмента, который обладает активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 20-304 последовательности SEQ ID NO:10.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12. В другом предпочтительном аспекте полипептид содержит зрелый полипептид SEQ ID NO:12. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид включает аминокислоты 23-250 последовательности SEQ ID NO:12 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислоты 23-250 последовательности SEQ ID NO:12. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO:12. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 23-250 последовательности SEQ ID NO:12 или аллельного варианта или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 23-250 последовательности SEQ ID NO:12.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном аспекте полипептид содержит зрелый полипептид SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 20-249 последовательности SEQ ID NO:14 или аллельный вариант, или фрагмент с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид включает аминокислоты 20-249 последовательности SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном аспекте изобретения полипептид состоит из зрелого полипептида последовательности SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 20-249 последовательности SEQ ID NO:14 или аллельного варианта, или фрагмента с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 20-249 последовательности SEQ ID NO:14.

Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2 содержит по меньшей мере 277 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере 287 аминокислотных остатков, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 297 аминокислотных остатков. Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:4 содержит по меньшей мере 185 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере 195 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 205 аминокислотных остатков. Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:6 содержит по меньшей мерее 200 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере 212 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 224 аминокислотных остатка. Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:8 содержит по меньшей мерее 175 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере 185 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 195 аминокислотных остатков. Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:10 содержит по меньшей мерее 240 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере 255 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 270 аминокислотных остатков. Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:12 содержит по меньшей мерее 175 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере 190 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 205 аминокислотных остатков. Предпочтительно, фрагмент зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:14 содержит по меньшей мерее 200 аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере 210 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 220 аминокислотных остатков.

Предпочтительно, субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1 содержит по меньшей мере 831 нуклеотид, более предпочтительно, по меньшей мере 861 нуклеотид и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 891 нуклеотид. Предпочтительно, субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:3 содержит по меньшей мере 555 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 585 нуклеотидов и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 615 нуклеотидов. Предпочтительно, субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:5 содержит по меньшей мере 600 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 636 нуклеотидов и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 672 нуклеотида. Предпочтительно, субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:7 содержит по меньшей мере 525 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 555 нуклеотидов и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 585 нуклеотидов. Предпочтительно, субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:9 содержит по меньшей мере 720 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 765 нуклеотидов и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 810 нуклеотидов. Предпочтительно, субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, 67-796 последовательности SEQ ID NO:11 содержит по меньшей мере 525 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 570 нуклеотидов и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 615 нуклеотидов. Предпочтительно, субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:13 содержит по меньшей мере 600 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 630 нуклеотидов и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 660 нуклеотидов.

В четвертом аспекте настоящего изобретения, выделенные полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, кодируются полинуклеотидами, которые гидролизуются в условиях по меньшей мере очень низкой жесткости, предпочтительно в условиях по меньшей мере низкой жесткости, более предпочтительно, в условиях по меньшей мере средней жесткости, более предпочтительно, в условиях жесткости, составляющей по меньшей мере от средней до высокой степени, еще более предпочтительно, в условиях по меньшей мере высокой жесткости и наиболее предпочтительно, в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости, с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, (ii) с последовательностью кДНК, содержащейся в последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:11, или последовательности геномной ДНК, содержащей последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:13, (iii) субпоследовательности по пунктам (i) или (ii), или (iv) полноразмерной комплементарной цепи по пунктам (i), (ii) или (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, supra). Субпоследовательность последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13 содержит по меньшей мере 100 последовательных нуклеотидов или, предпочтительно, 200 последовательных нуклеотидов. Кроме того, субпоследовательность может кодировать фрагмент полипептида с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность. В предпочтительном аспекте последовательность, кодирующая зрелый полипептид представляет собой нуклеотиды 388-1332 последовательности SEQ ID NO:1, нуклеотиды 98-821 последовательности SEQ ID NO:3, нуклеотиды 126-978 последовательности SEQ ID NO:5, нуклеотиды 55-678 последовательности SEQ ID NO:7, нуклеотиды 58-912 последовательности SEQ ID NO:9, нуклеотиды 67-796 последовательности SEQ ID NO:11 или нуклеотиды 77-766 последовательности SEQ ID NO:13.

Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13 или ее субпоследовательность, а также аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:14 или ее фрагмент могут использоваться для разработки зонда нуклеиновой кислоты с целью идентификации и клонирования ДНК, кодирующих полипептиды с активностью, усиливающей целлюлолитическую активность, из штаммов различных родов или видов, как описано выше.

Как используется в настоящем описании термин «гибридизация» указывает на то, что нуклеотидная последовательность гибридизуется с меченым зондом нуклеиновой кислоты, соответствующим последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7. SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, с последовательностью кДНК, содержащейся в последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:11, или с последовательностью геномной ДНК, содержащей последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:13, с ее полноразмерной комплементарной цепью или ее субпоследовательностью, в условиях жесткости, изменяющихся от очень низкой до очень высокой, как описано выше.

В предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую зрелый полипептид. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 388-1332 последовательности SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:2, или ее субпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, находящуюся в плазмиде pEJG120, которая входит в состав E. coli NRRL B-30699, причем указанная полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, который находится в плазмиде pEJG120, которая входит в состав штамма E.coli NRRL 8-30699.

В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:3. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 98-821 последовательности SEQ ID NO:3. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:4, или ее субпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:3. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, находящуюся в плазмиде pTter61C, которая включена в E. coli NRRL B-30813, где указанная полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, который находится в плазмиде pTter61C, включенной в E. coli NRRL B-30813.

В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:5. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 126-978 последовательности SEQ ID NO:5. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:6, или ее субпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:5. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая находится в плазмиде pTter61D, которая входит в E coli NRRL В-30812, где полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, который находится в плазмиде pTter61D, которая включена в E. coli NRRL B-30812.

В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:7. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 55-678 последовательности SEQ ID NO:7. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:8, или ее субпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:7. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, находящуюся в плазмиде pTter61E, которая включена в E. coli NRRL B-30814, где полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, которая находится в плазмиде pTter61E, включенной в E. coli NRRL B-30814.

В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:9. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 58-912 последовательности SEQ ID NO:9. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:10, или ее субпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:9. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, находящуюся в плазмиде pTter61G, которая включена в Е. coli NRRL B-30811, где полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой кодирующую зрелый полипептид последовательность, которая находится в плазмиде pTter61G, включенной в E. coli NRRL B-30811.

В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:11. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 67-796 последовательности SEQ ID NO:11. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:12, или ее субпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:11. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая находится в плазмиде pDZA2-7, которая включена в E. coli NRRL B-30704, где полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой кодирующую зрелый полипептид последовательность, которая находится в плазмиде pDZA2-7, включенной в E.coli NRRL B-30704.

В другом предпочтительном аспекте нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:13. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотиды 77-766 последовательности SEQ ID NO:13. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:14, или ее субпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:13. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая находится в плазмиде pTr333, которая входит в состав Е. coll NRRL B-30878, где полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой кодирующую зрелый полипептид последовательность, которая находится в плазмиде pTr333, включенной в E. coli NRRL B-30878.

Для длинных зондов, включающих по меньшей мере 100 нуклеотидов в длину, в настоящем описании определены условия, варьирующие от очень низкой до очень высокой жесткости.

Для длинных зондов, составляющих по меньшей мерее 100 нуклеотидов в длину, материал носителя представляет собой полностью промытый материал, по настоящему описанию.

Для коротких зондов, включающих от примерно 15 нуклеотидов до примерно 70 нуклеотидов в длину, условия жесткости определены ниже в настоящем описании.

Для коротких зондов, составляющих от примерно 15 нуклеотидов до 70 нуклеотидов в длину, материал носителя промывают в соответствии приведенному в настоящем описании способу.

В пятом аспекте настоящего изобретения полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, кодируются полинуклеотидами, включающими нуклеотидные последовательности или состоящими из нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность и степень идентичности которых с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, составляет предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% и еще наиболее более предпочтительно, по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99%.

В предпочтительном аспекте последовательность, кодирующая зрелый полипептид, представляет собой нуклеотиды 388-1332 последовательности SEQ ID NO:1, нуклеотиды 98-821 в SEQ ID NO:3, нуклеотиды 126-978 последовательности SEQ ID NO:5, нуклеотиды 55-678 последовательности SEQ ID NO:7, нуклеотиды 58-912 последовательности SEQ ID NO:9, нуклеотиды 67-796 последовательности SEQ ID NO:11 или нуклеотиды 77-766 последовательности SEQ ID NO:13. См. раздел настоящего описания, относящийся к полинуклеотидам.

В шестом аспекте полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, представляют собой искусственные варианты, содержащие замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот в зрелом полипептиде SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14; или гомологичную последовательность. Способы получения таких искусственных вариантов описаны выше.

Общее число аминокислотных замен, делеций и/или вставок в зрелом полипептиде SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14, составляет 10, предпочтительно 9, более предпочтительно 8, более предпочтительно 7, более предпочтительно не менее чем 6, более предпочтительно 5, более предпочтительно 4, еще более предпочтительно 3, наиболее более предпочтительно 2 и, еще наиболее предпочтительно 1.

Источники полипептидов, усиливающих целлюлолитическую активность

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность может быть получен из микроорганизмов любого рода. В предпочтительном аспекте полипептид, получаемый из данного источника, секретируется из клетки.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, может представлять собой бактериальный полипептид. Например, полипептид может представлять собой полипептид из грамположительной бактерии, такой как Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus или Oceanobacillus, где полипептид усиливает целлюлолитическую активность, или полипептид из грамотрицательных бактерий, такой как полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria или Ureaplasma.

В предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus ientus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumitus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, или Bacillus thuringiensis.

В другом предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид из Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis или Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, где полипептид усиливает целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitills, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus или Streptomyces lividans, где полипептид усиливает целлюлолитическую активность.

Полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, может представлять собой полипептид грибов и, более предпочтительно, полипептид дрожжей, например, Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia, где указанный полипептид усиливает целлюлолитическую активность; или более предпочтительно, полипептид из нитевидных грибов, например, Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cachliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Hotomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella или Xylaria, где полипептид усиливает целлюлолитическую активность.

В предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis, где полипептид усиливает целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspore, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride или Trichophaea saccata, где полипептид усиливает целлюлолитическую активность.

В более предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность Thielavia terrestris. В более предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид Thielavia terrestris NRRL 8126, усиливающий целлюлолитическую активность, то есть зрелый полипептид SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 или 10, или его фрагмент, усиливающий целлюлолитическую активность.

В другом более предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид Thermoascus aurantiacus, например, зрелый полипептид SEQ ID NO:12.

В другом более предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, Trichoderma reesei. В другом наиболее предпочтительном аспекте полипептид представляет собой полипептид Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765), усиливающий целлюлолитическую активность, например, зрелый полипептид SEQ ID NO:14, или его фрагменты, усиливающие целлюлолитическую активность.

Следует понимать, что, применительно к указанным выше видам, настоящее изобретение охватывает как совершенные, так и несовершенные формы, а также другие таксономические эквиваленты, например, анаморфы, независимо от названия вида, под которым они известны. Специалисты в данной области могут легко определить идентичность соответствующих эквивалентов.

Штаммы указанных выше видов могут быть получены из множества публично доступных Коллекций культур тканей, таких как American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Кроме того, такие полипептиды могут быть идентифицированы и получены из других источников, включающих микроорганизмы, которые были выделены из природной среды (например, из почвы, компостных материалов, воды и т. п.) с использованием указанных выше зондов по настоящему изобретению.

Полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, также включают слитые полипептиды или расщепляемые слитые полипептиды, в которых другой полипептид слит с полипептидом или фрагментом, усиливающим целлюлолитическую активность, на его N-конце или C-конце, и указанный полипептид также может включать сайт расщепления по настоящему изобретению.

Дополнительные подробности, относящиеся к полипептидам, усиливающим целлюлолитическую активность, и к соответствующим им полинуклеотидам, описаны в документах WO 2005/074647, WO 2005/074656 и в опубликованной серийной заявке на патент США No. 2007/0077630, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность

Полинуклеотиды, включающие нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность, могут быть выделены и использованы в практике осуществления способов настоящего изобретения, как это будет описано ниже.

Полинуклеотиды включают нуклеотидные последовательности, степень идентичности которых с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, составляет по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% и, еще наиболее предпочтительно, по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99%, которые кодируют полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность.

В предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO:1 или состоит из последовательности SEQ ID NO:1. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность или состоит из последовательности, которая находится в плазмиде pEJG120, которая включена в Escherichia coli NRRL В-30699. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность содержит последовательность, кодирующую зрелый полипептид SEQ ID NO:1, или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность содержит последовательность, кодирующую зрелый полипептид, который находится в плазмиде pEJG120, которая включена в Escherichia coli NRRL B-30699, или состоит из указанной выше последовательности. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или его зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:1 за счет вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к субпоследовательностям SEQ ID NO:1, которые кодируют фрагменты SEQ ID NO:2, усиливающие целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO:3 или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность содержит последовательность, содержащуюся в плазмиде pTter61C, которая включена в Escherichia coli NRRL B-30813, или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:3, или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, которая содержится в плазмиде pTter61C, включенной в Escherichia coli NRRL B-30813, или состоит из нее. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или его зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:3 за счет вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к субпоследовательностям SEQ ID NO:3, которые кодируют фрагменты SEQ ID NO:4, усиливающие целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:5 или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, находящуюся в плазмиде pTter61D, которая включена в Escherichia coli NRRL B-30812, или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:5, или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, который находится в плазмиде pTter61D, включенной в Escherichia coli NRRL B-30812, или состоит из нее. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, или его зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:5 за счет вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к субпоследовательностям SEQ ID NO:5, которые кодируют фрагменты SEQ ID NO:6, усиливающие целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:7 или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, находящуюся в плазмиде pTter61E, которая включена в Escherichia coli NRRL B-30814, или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:7, или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, который содержится в плазмиде pTter61E, которая включена в Escherichia coli NRRL B-30814, или состоит из нее. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, или зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:7 за счет вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к субпоследовательностям SEQ ID NO:7, которые кодируют фрагменты SEQ ID NO:8, усиливающие целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:9 или состоит из SEQ ID:9. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, находящуюся в плазмиде pTter61G, которая включена в Escherichia coli NRRL В-30811, или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:9, или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, содержащуюся в плазмиде pTter61G, которая включена в Escherichia coli NRRL B-30811, или состоит из нее. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или его зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:9 за счет вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к субпоследовательностям SEQ ID NO:9, которые кодируют фрагменты SEQ ID NO:10, усиливающие целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:11 или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, находящуюся в плазмиде pDZA2-7, которая входит в Escherichia coli NRRL В-30704, или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:11, или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, который содержится в плазмиде pDZA2-7, входящей в Escherichia coli NRRL B-30704, или состоит из нее. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, или его зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:11 за счет вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к субпоследовательностям SEQ ID NO:11, который кодируют фрагменты SEQ ID NO:12, усиливающие целлюлолитическую активность.

В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:13 или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, которая содержится в плазмиде pTr3337, включенной в Escherichia coli NRRL B-30878, или состоит из нее. В другом предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:13, или состоит из нее. В другом более предпочтительном аспекте нуклеотидная последовательность включает кодирующую зрелый полипептид последовательность, которая содержится в плазмиде pTr3337, включенной в Escherichia coli NRRL B-30878, или состоит из нее. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, или его зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:13, или соответствующую последовательность, кодирующую зрелый полипептид, отличающийся за счет вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к субпоследовательностям SEQ ID NO:13, которые кодируют фрагменты SEQ ID NO:14, усиливающие целлюлолитическую активность.

Настоящее изобретение также относится к мутантным полинуклеотидам, включающим по меньшей мере одну мутацию в кодирующей зрелый полипептид последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, где мутантная нуклеотидная последовательность кодирует зрелый полипептид SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14. В предпочтительном аспекте зрелый полипептид включает аминокислоты 20-326 последовательности SEQ ID NO:2, аминокислоты 18-240 последовательности SEQ ID NO:4, аминокислоты 20-258 последовательности SEQ ID NO:6, аминокислоты 19-226 последовательности SEQ ID NO:8, аминокислоты 20-304 последовательности SEQ ID NO:10, аминокислоты 23-250 последовательности SEQ ID NO:12 или аминокислоты 20-249 последовательности SEQ ID NO:14. В другом предпочтительном аспекте кодирующая зрелый полипептид последовательность включает нуклеотиды 388-1332 последовательности SEQ ID NO:1, нуклеотиды 98-821 последовательности SEQ ID NO:3, нуклеотиды 126-978 последовательности SEQ ID NO:5, нуклеотиды 55-678 последовательности SEQ ID NO:7, нуклеотиды 58-912 последовательности SEQ ID NO:9, нуклеотиды 67-796 последовательности SEQ ID NO:11 или нуклеотиды 77-766 последовательности SEQ ID NO:13.

Как указывалось выше, методы, используемые для выделения или клонирования полинуклеотида, кодирующего соответствующий полипептид, известны в данной области, и включают выделение из геномной ДНК, получение из кДНК или сочетание таких методов.

Полинуклеотид также может представлять собой полинуклеотид, кодирующий полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, который гибридизуется в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно в условиях по меньшей мере низкой жесткости, более предпочтительно, в условиях по меньшей мере средней жесткости, более предпочтительно в условиях жесткости, составляющей по меньшей мере от средней до высокой, еще более предпочтительно, в условиях по меньшей мере высокой жесткости, и наиболее предпочтительно, в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости (i) с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, (ii) с последовательностью кДНК, которая содержится в последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:11, или с последовательностью геномной ДНК, содержащей последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:13, или (iii) с полноразмерной комплементарной цепью по пунктам (i) или (ii); или с аллельными вариантами или субпоследовательностями указанных последовательностей (Sambrook et al., 1989, supra), по настоящему изобретению. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, указанная кодирующая зрелый полипептид последовательность включает нуклеотиды 388-1332 последовательности SEQ ID NO:1, нуклеотиды 98-821 последовательности SEQ ID NO:3, нуклеотиды 126-978 последовательности SEQ ID NO:5, нуклеотиды 55-678 последовательности SEQ ID NO:7, нуклеотиды 58-912 последовательности SEQ ID NO:9, нуклеотиды 67-796 последовательности SEQ ID NO:11 или нуклеотиды 77-766 последовательности SEQ ID NO:13.

Конструкции нуклеиновых кислот

Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, или полипептид с активностью целлюлолитического фермента, может быть подвержен манипуляциям с использованием различных способов, позволяющих достичь экспрессии полипептида, путем создания конструкции нуклеиновой кислоты, включающей выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, функционально связанный с одной или несколькими контрольными последовательностями, которые направляют экспрессию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине, в условиях, совместимых с контрольными последовательностями. Перед встраиванием полинуклеотидной последовательности в вектор могут быть проведены определенные операции, желательные или необходимые, в зависимости от выбранного вектора экспрессии. Методы модификации полинуклеотидных последовательностей с использованием технологии рекомбинантных ДНК хорошо известны в данной области.

Контрольная последовательность может представлять собой соответствующую промоторную последовательность, нуклеотидную последовательность, которая распознается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида, кодирующего данный полипептид. Указанная промоторная последовательность содержит контрольные последовательности транскрипции, которые вовлекаются в экспрессию полипептида. Указанный промотор может представлять собой любую нуклеотидную последовательность, которая демонстрирует транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, включающей мутантный, усеченный и слитый промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные относительно данной клетки-хозяина.

Примеры подходящих промоторов, направляющих транскрипцию конструкций нуклеиновой кислоты, особенно в бактериальной клетке-хозяине, включают промоторы, получаемые из lac оперона E. coli, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансукразы Bacillus subtilis (sacB), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus(amyM), гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis(penP), генов xylA и xylB из Bacillus subtilis и прокариотического гена бета-лактамазы (Vilia-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), а также lac промотор (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25). Другие промоторы описаны в «Useful proteins from recombinant bacteria», Scientific American, 1980,242:74-94; и Sambrook et al., 1989, supra .

Примеры подходящих промоторов, способных направлять транскрипцию конструкций нуклеиновых кислот в клетке-хозяине нитевидных грибов, включают промоторы, получаемые из генов ТАКА-амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger , кислотостабильной альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori(glaA), липазы Rhizomucor miehei, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, ацетамидазы Aspergillus nidulans, амилоглюкозидазы из Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum (WO 96/00787), бета-глюкозидазы Trichoderma reesei, целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, целлобиогидролазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы I Trichoderma reesei, эндоглюканазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы III Trichoderma reesei, эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, эндоглюканазы V Trichoderma reesei, ксиланазы I Trichoderma reesei , ксиланазы II Trichoderma reesei, бета-ксилозидазы Trichoderma reesei, а также NA2-tpi промотор (гибрид на основе промоторов, полученных из генов нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae); а также их мутантные, усеченные и гибридные промоторы.

В случае клеток-хозяев дрожжей подходящие для использования промоторы получают из генов энолазы из Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы из Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH1,ADH2/GAP), триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae (TPI), металлотионеина Saccharomyces cerevisiae (CUP1) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae. Другие подходящие для использования промоторы в случае дрожжевых клеток-хозяев описаны в работе Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488.

Контрольная последовательность может также представлять собой подходящую последовательность терминации транскрипции, последовательность, распознаваемую клеткой-хозяином для терминации транскрипции. Терминирующая последовательность функционально связана с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Любой терминатор, который функционирует в выбранной клетке-хозяине, может использоваться в настоящем изобретении.

Предпочтительные терминаторы для случая клеток-хозяев нитевидных грибов получают из генов ТАКА-амилазы из Aspergillus oryzae , глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger и трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum.

Предпочтительные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов энолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома С из Saccharomyces cerevisiae (CYC1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из Saccharomyces cerevisiae. Другие подходящие для использования в дрожжевых клетках-хозяевах терминаторы описаны Romanos et al., 1992, supra.

Контрольная последовательность может представлять собой подходящую лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, где указанная лидерная последовательность важна для трансляции хозяйской клетки. Лидерные последовательности функционально связаны с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Может использоваться любая лидерная последовательность, которая функционирует в выбранной клетке-хозяине по настоящему изобретению.

Лидерные последовательности, предпочтительные для использования в клетках-хозяевах нитевидных грибов, получают из генов ТАКА-амилазы Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans.

Лидерные последовательности, предпочтительные для использования в дрожжевых клетках-хозяевах, получают из генов энолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3'-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

Контрольная последовательность также может представлять собой последовательность полиаденилирования, последовательность, функционально связанную с 3'-концом нуклеотидной последовательности, и которая, при транскрибировании, распознается клеткой-хозяином как сигнал добавления полиаденозиновых остатков к транскрибируемой мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая функционирует в выбранной клетке-хозяине, может быть использована в настоящем изобретении.

Предпочтительные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев нитевидных грибов получают из генов ТАКА-амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum и альфа-глюкозидазы Aspergillus niger.

Подходящие для использования последовательности полиаденилирования в дрожжевых клетках-хозяевах описаны Guo и Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990.

Контрольная последовательность может также представлять собой кодирующую последовательность сигнального пептида, которая кодирует аминокислотную последовательность, связанную с аминоконцом полипептида и которая направляет кодируемый полипептид в направлении секретирования клеткой. 5'-конец кодирующей последовательности в данной нуклеотидной последовательности может содержать кодирующую последовательность для сигнального пептида, которая в природном состоянии связана в транслируемой рамке считывания с сегментом кодирующего участка, который кодирует секретируемый полипептид. Альтернативно, 5'-конец указанной кодирующей последовательности может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной для данной кодирующей последовательности. Последовательность, кодирующая чужеродный сигнальный пептид, может быть необходима в том случае, когда такая кодирующая последовательность не содержится в природном состоянии в кодирующей сигнальный пептид последовательности. Альтернативно, указанная последовательность, кодирующая чужеродный сигнальный пептид, может просто замещать последовательность, кодирующую природный сигнальный пептид, с тем, чтобы достичь повышения секреции полипептида. Однако, любая последовательность, кодирующая сигнальный пептид, которая направляет экспрессированный полипептид на путь его секреции выбранной клеткой-хозяином, например, секреции в культуральную среду, может использоваться в настоящем изобретении.

Эффективные для бактериальных клеток-хозяев последовательности, кодирующие сигнальный пептид, включают последовательности, кодирующие сигнальный пептид, который получают из мальтогенной амилазы представителя рода Bacillus NCIB 11837, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus , субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licneniformis, нейтральных протеаз из Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и Bacillus subtilis prsA. Другие сигнальные пептиды описаны Simonen и Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Эффективные для использования в клетках-хозяевах нитевидных грибов последовательности, кодирующие сигнальный пептид, включают последовательности, кодирующие сигнальный пептид, который получают из генов ТАКА-амилазы Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкамилазы из Aspergillus niger, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы из Humicola insolens, эндоглюканазы V из Humicola insolens и липазы Humicola lanuginosa.

В предпочтительном аспекте сигнальный пептид включает аминокислоты 10-19 последовательности SEQ ID NO:2 или состоит из них. В другом предпочтительном аспекте участок, кодирующий сигнальный пептид, включает нуклеотиды 330-387 последовательности SEQ ID NO:1 или состоит из них.

В другом предпочтительном аспекте сигнальный пептид включает аминокислоты 1-17 последовательности SEQ ID NO:4 или состоит из них. В другом предпочтительном аспекте участок, кодирующий сигнальный пептид, включает нуклеотиды 47-97 последовательности SEQ ID NO:3 или состоит из них.

В другом предпочтительном аспекте сигнальный пептид включает аминокислоты 1-19 последовательности SEQ ID NO:6 или состоит из них. В другом предпочтительном аспекте, кодирующий участок для сигнального пептида включает нуклеотиды 69-125 последовательности SEQ ID NO:5 или состоит из них.

В другом предпочтительном аспекте сигнальный пептид включает аминокислоты 1-18 последовательности SEQ ID NO:8 или состоит их них. В другом предпочтительном аспекте кодирующий сигнальный пептид участок включает нуклеотиды 1-54 последовательности SEQ ID NO:7 или состоит из них.

В другом предпочтительном аспекте сигнальный пептид включает аминокислоты 1-19 последовательности SEQ ID NO:10 или состоит из них. В другом предпочтительном аспекте участок кодирования сигнального пептида включает нуклеотиды 1-57 последовательности SEQ ID NO:9 или состоит из них.

В другом предпочтительном аспекте сигнальный пептид включает аминокислоты 1-22 последовательности SEQ ID NO:12 или состоит из них. В другом предпочтительном аспекте кодирующий сигнальный пептид участок включает нуклеотиды 1-66 последовательности SEQ ID NO:11 или состоит из них.

В другом предпочтительном аспекте сигнальный пептид включает аминокислоты 1-19 последовательности SEQ ID NO:14 или состоит из них. В другом предпочтительном аспекте кодирующий сигнальный пептид участок включает нуклеотиды 20-76 последовательности SEQ ID NO:13 или состоит из них.

Подходящие для использования в дрожжевых клетках-хозяевах сигнальные пептиды получают из генов альфа-фактора из Saccharomyces cerevisiae и инвертазы из Saccharomyces cerevisiae. Другие подходящие для сигнального пептида кодирующие последовательности описаны в работе Romanos et al. 1992, supra.

Контрольная последовательность может также представлять собой пропептидную кодирующую последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, локализованную на аминоконце полипептида. Получаемый полипептид известен как проэнзим или прополипептид (или зимоген в некоторых случаях). Полипептид в основном является неактивным и может быть преобразован в зрелый активный полипептид путем каталитического или аутокаталитического расщепления пропептида из прополипептида. Кодирующая пропептид последовательность может быть получена из щелочной фосфатазы представителей рода Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы из Bacillus subtilis(nprT), альфа-фактора из Saccharomyces cerevisiae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Когда последовательности и сигнального пептида, и пропептида присутствуют на аминоконце полипептида, указанная пропептидная последовательность локализуется рядом с аминоконцом полипептида, а последовательность сигнального пептида локализуется рядом с аминоконцом пропептидной последовательности.

В этом случае, может быть желательно добавить регуляторную последовательность, которая позволяет достичь регуляции экспрессии полипептида применительно к росту клетки-хозяина. Примеры регуляторных систем включат такие системы, которые переключают экспрессию гена или выключают ее в ответ на химические или физические стимулы, в том числе, в ответ на присутствие регуляторного соединения. Регуляторная система в прокариотических системах включает lac, tac и trp операторные системы. В дрожжах может быть использована система AOH2 или GAL1. В случае нитевидных грибов, используют промотор TAKA альфа-амилазы, в качестве регуляторной последовательности может также использоваться промотор глюкоамилазы из Aspergillus niger и промотор глюкоамилазы Aspergillus oryzae. Другие примеры регуляторных последовательностей включают такие последовательности, которые позволяют достичь амплификации гена. В эукариотических системах такие регуляторные последовательности включают ген дигидрофолятредуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, а также гены металлотионеина, которые амплифицируются в присутствии тяжелых металлов. В этих случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, будет функционально связана с регуляторной последовательностью

Векторы экспрессии

Различные, приведенные в настоящем описании нуклеиновые кислоты и контрольные последовательности могут быть объединены с целью получения рекомбинантного вектора экспрессии, включающего полинуклеотид, кодирующий полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, или полипептид, который обладает активностью целлюлолитического фермента, промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Векторы экспрессии могут включать один или несколько удобных для манипуляций сайтов рестрикции, с тем чтобы в таких сайтах можно было встраивать или замещать полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий такой полипептид, может быть экспрессирован при встраивании полинуклеотидной последовательности или конструкции нуклеиновой кислоты, включающей соответствующую последовательность, в подходящий вектор экспрессии. При создании вектора экспрессии, кодирующую последовательность вводят в вектор, так чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с соответствующими контрольными последовательностями экспрессии.

Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который может быть подвергнут обработке с использованием технологии рекомбинантных ДНК и который может осуществлять экспрессию полинуклеотидной последовательности. При этом, выбор вектора в типичном случае зависит от совместимости данного вектора с клеткой-хозяином, в которую вектор будет встраиваться. Векторы могут быть линейными плазмидами или плазмидами с закрытым кольцом.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, то есть вектор, который существует в виде внехромосомной структуры, репликация которого не зависит от репликации хромосомы, например, это может быть плазмида, внехромосомный элемент, минихромосома или искусственная хромосома. Вектор может содержать любое средство, способствующее процессу саморепликации. Альтернативно, указанный вектор может представлять собой такой вектор, который при введении его в клетку-хозяин интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), с которой(ыми) он интегрирован. Кроме того, может использоваться один вектор или плазмида, или два или несколько векторов или плазмид, которые в совокупности содержат общую ДНК, встраиваемую в геном клетки-хозяина, или это может быть транспозон.

Векторы предпочтительно содержат один или несколько селектируемых маркеров, которые обеспечивают легкую селекцию трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных, или тому подобное, клеток. Указанный селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает резистентность к биоциду или вирусу, или резистентность к тяжелым металлам, способствуют переходу от прототрофности к ауксотрофности и т.п.

Примеры бактериальных селектируемых маркеров включают гены dal Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые обеспечивают резистентность к антибиотикам, например, резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Подходящими маркерами для дрожжевых клеток-хозяев являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селектируемые маркеры, подходящие для использования в клетках-хозяевах нитевидных грибов, включают, но ими не ограничиваются, amdS (ацетамидаза), argB (орнитинкарбамоилтрансфераза), bar (фосфинотрицинацетилтрансфераза), hph (гигромицинфосфотрансфераза), niaD (нитратредуктаза), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза), sC (сульфатаденилатрансфераза) и trpC (антранилатсинтетаза), а также их эквиваленты. Предпочтительными для использования в клетке Aspergillus являются гены amdS и pyrG из Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген bar из Streptomycis hygroscopicus.

Векторы предпочтительно содержат один или несколько элементов, которые способствуют интеграции вектора в геном клетки-хозяина или автономной репликации вектора в клетке, независимо от генома.

Для интеграции в геном клетки-хозяина, вектор может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид или любой другой элемент вектора, для интеграции в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. Альтернативно, вектор может содержать дополнительные нуклеотидные последовательности для направления интеграции гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина в одном или нескольких точных местоположениях в одной или нескольких хромосомах. Для повышения вероятности интеграции в точном положении, указанные интеграционные элементы должны предпочтительно содержать достаточное число нуклеиновых кислот, например, от 100 до 10000 пар оснований, предпочтительно от 400 до 10000 пар оснований, и наиболее предпочтительно, от 800 до 10000 пар оснований, которые характеризуются высокой степенью идентичности к соответствующей целевой последовательности, для повышения вероятности гомологичной рекомбинации. Интеграционные элементы могут представлять собой любую последовательность, которая гомологична целевой последовательности в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интеграционные элементы могут представлять собой некодирующую или кодирующую нуклеотидные последовательности. Однако, вектор может быть интегрирован в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.

В случае автономной репликации вектор может также включать ориджин репликации, позволяющий вектору автономно реплицироваться в рассматриваемой клетке-хозяине. Ориджин репликации может представлять собой любой плазмидный репликатор, опосредующий автономную репликацию, которая функционирует в клетке. Термин «ориджин репликации» или «плазмидный репликатор», как используется в настоящей заявке, обозначает нуклеотидную последовательность, которая позволяет вектору или плазмиде реплицироваться in vivo.

Примеры бактериальных ориджинов репликации включают ориджины репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, которые позволяют достичь репликации в Ecoli, а также pUB110, pE194, pTA1060 и pAM 1 для репликации в Bacillus.

Примеры ориджинов репликации, подходящих для использования в дрожжевых клетках-хозяевах, включают 2 микронных ориджина репликации, ARS1, ARS4, сочетание ARS1 и CEN3, а также сочетание ARS4 и CEN6.

Примеры ориджинов репликации, подходящих для использования в клетке нитевидных грибов, включают AMA1 и ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Выделение AMA1 гена и конструирование плазмид или векторов, включающих ген, может быть осуществлено методами, описанными в WO 00/24883.

В клетку-хозяин может быть встроено более одной копии полинуклеотида, кодирующего такой полипептид, с тем чтобы повысить продукцию полипептида. Повышение копийности полинуклеотида может быть быстро достигнуто при интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или при включении амплифицируемого селектируемого маркерного гена в полинуклеотид, где клетки, содержащие копии селектируемого маркерного гена и, таким образом, дополнительные копии полинуклеотида, могут быть отобраны для культивирования таких клеток в присутствии подходящего селектируемого агента.

Процедуры, используемые для лигирования описанных выше элементов, с целью создания рекомбинантных векторов экспрессии, хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, supra).

Клетки-хозяева

Рекомбинантные клетки-хозяева, включающие полинуклеотид, который кодирует полипептид, усиливающий целлюлолитическую активность, или полипептид с активностью целлюлолитического фермента, могут с успехом применяться в рекомбинантном получении полипептида. Вектор, включающий такой полинуклеотид, встраивают в клетку-хозяин таким образом, чтобы вектор поддерживался в виде интегрированной в хромосому структуры или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано выше. Термин «клетка-хозяин» охватывает также любое поколение родительской клетки, которое не идентично родительской клетке в связи с наличием мутаций, происходящих при репликации. Выбор клетки-хозяина в значительной мере зависит от гена, кодирующего полипептид, и его источника.

Клетка-хозяин может представлять собой одноклеточный микроорганизм, например, прокариотический организм, или неодноклеточный микроорганизм, например, эукариот.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую грамположительную бактерию или грамотрицательную бактерию. Грамположительные бактерии включают, но ими не ограничиваются, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus и Oceanobacillus. Грамотрицательные бактерии включают, но ими не ограничиваются, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria и Ureaplasma.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клетку Bacillus, клетки Bacillus, подходящие для использования в практике настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, клетки Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.

В предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus или Bacillus subtilis. В более предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Bacillus amyloliquefaciens. В другом более предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Bacillus clausii. В другом более предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Bacillus licheniformis. В другом более предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Bacillus subtilis.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой также клетку Streptococcus. Клетки Streptococcus, подходящие для использования в практике осуществления настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, клетки Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

В предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptococcus equisimilis. В другом предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptococcus pyogenes . В другом предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptococcus uberis. В другом предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus .

Бактериальная клетка-хозяин также может представлять собой любую клетку Streptomyces. Клетки Streptomyces , подходящие для использования в практике осуществления настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, клетки Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus и Streptomyces lividans.

В предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptomyces achromogenes. В другом предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptomyces avermitilis. В другом предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptomyces coelicolor. В другом предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptomyces griseus. В другом предпочтительном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Streptomyces lividans.

Введение ДНК в клетку Bacillus может быть осуществлено, например, путем трансформации протопласта (см., например, Chang и Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), при использовании компетентных клеток (см., например, Young и Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 или Dubnau и Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), путем электропорации (см., например Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), или путем конъюгации (см., например, Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278). Встраивание ДНК в клетку E. coli может быть осуществлено, например, путем трансформации протопласта (см., например, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) или путем электропорации (см., например, Dower et al., 1988. Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Встраивание ДНК в клетку Streptomyces может быть осуществлено, например, путем трансформации протопласта и электропорации (см., например, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), путем конъюгации (см., например, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171:3583-3585) или путем трансдукции (см., например, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). Встраивание ДНК в клетку Pseudomonas может быть осуществлено, например, путем электропорации (см., например, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) или путем конъюгации (см., например, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71; 51-57). Встраивание ДНК в клетку Streptococcus может быть осуществлено, например, с использованием природной компетенции (см., например, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32:1295-1297), путем трансформации протопласта (см., например, Catt and JollicK, 1991, Microbios. 68:189-2070), путем электропорации (см., например,Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) или путем конъюгации (см., например, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). При этом может использоваться любой метод, известный в данной области как подходящий для встраивания ДНК в клетку-хозяин.

Клетка-хозяин может также представлять собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего, клетка насекомого, клетка растения или клетка грибов.

В предпочтительном аспекте клетка-хозяин представляет собой грибную клетку. Термин «грибы», как используется в настоящей заявке, включает виды Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota (согласно определению, данному Hawksworth et al., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), а также Oomycota (согласно определению, данному Hawksworth et al., 1995, supra, page 171) и все митоспорные грибы (Hawksworth et al., 1995, supra).

В более предпочтительном аспекте грибная клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. Термин «дрожжи», как используется в настоящей заявке, включает аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам (Blastomycetes). Поскольку классификация дрожжей может в будущем меняться, то в тексте настоящего описания дрожжи будут определяться в соответствии с принципами, приведенными в руководстве Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

В еще более предпочтительном аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Candida, Hansenula, Ktuyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia .

В более предпочтительном аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis. В другом наиболее предпочтительном аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Kluyveromyces lactis. В другом наиболее предпочтительном аспекте дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Yarrowia lipolytica.

В другом более предпочтительном аспекте грибная клетка-хозяин представляет собой клетку нитевидных грибов. Термин «нитевидные грибы» включает все нитевидные формы подгруппы Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth et al., 1995, supra). Нитевидные грибы в основном характеризуются наличием стенки мицеллия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост осуществляется посредством элонгации гифов и катаболизм углерода является строго аэробным. Тогда как вегетативный рост дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae , происходит за счет почкования одноклеточного таллуса и катаболизм углерода может быть ферментативным.

В еще более предпочтительном аспекте клетка-хозяин нитевидных грибов представляет собой клетку Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes или Trichoderma .

В наиболее предпочтительном аспекте клетка-хозяин нитевидных грибов представляет собой клетку Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. В другом наиболее предпочтительном аспекте клетка-хозяин нитевидных грибов представляет собой клетку Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides или Fusarium venenatum. В другом наиболее предпочтительном аспекте клетка-хозяин нитевидных грибов представляет собой клетку Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inhops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa. Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pieurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

Грибные клетки могут быть трансформированы в ходе процесса, включающего образование протопласта, трансформацию протопласта и регенерацию клеточной стенки по известному per se методу. Подходящая процедура для трансформации клеток-хозяев Aspergillus и Trichoderma описана в EP 238023 и Yeiton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Подходящие способы трансформации Fusarium описаны в работе Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156 и в WO 96/00787. Дрожжи могут быть трансформированы методами, описанными Becker and Guarente, In Abelson, J,N. and Simon, M.I., под редакцией, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194. pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et at, 1983. Journal of Bacteriology 153:163; и Hinnen et al. 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920.

Способы получения

Способы получения полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, или полипептида с активностью целлюлолитического фермента, включают: (а) культивирование клетки, которая в своей форме дикого типа способна продуцировать полипептид, при условиях, подходящих для получения полипептида; и (b) восстановление указанного полипептида.

Альтернативно, способы получения полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, или полипептида с активностью целлюлолитического фермента, включают: (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина в условиях, подходящих для получения полипептида; и (b) восстановление указанного полипептида.

В способах получения клетки культивируют в питательной среде, подходящей для продукции полипептида, с использованием известных в данной области методов. Например, культивирование указанных клеток может проводиться в колбах на качалках, а также в ферментерах с малым и большим объемом культивируемой среды (включая процессы непрерывной ферментации, периодической ферментации, ферментации с периодической подачей сырья или твердофазной ферментации), в лабораторных или промышленных масштабах, в подходящей среде и в соответствующих условиях, позволяющих достичь экспрессии и/или выделения полипептида. Для культивирования используют, с помощью известных в данной области процедур, подходящую питательную среду, которая включает источники углерода и азота, а также неорганические соли. Подходящие среды, доступные от коммерческих поставщиков, могут быть получены в соответствии с имеющимися в публикациях данными о составе таких композиций (например, в каталогах Американской Коллекции типовых культур (American Type Culture Collection)). Если полипептид секретируется питательной средой, такой полипептид может быть восстановлен непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется в среду, он может быть восстановлен из клеточных лизатов.

Полипептиды, усиливающие целлюлолитическую активность или с активностью целлюлолитического фермента, могут быть детектированы с использованием приведенных в настоящем описании способов.

Полученный бульон может использоваться сам по себе или полипептид может быть восстановлен с использованием известных в данной области процедур. Например, полипептид может быть восстановлен из питательной среды с помощью традиционных процедур, включающих, но этим не ограничиваются, центрифугирование, фильтрование, экстракцию, распылительную сушку, выпаривание или осаждение.

Полипептиды могут быть подвергнуты очистке различными процедурами, известными в данной области, которые включают, но ими не ограничиваются, хроматографию (например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, гидрофобную хроматографию, хроматофокусирование и вытеснительную хроматографию), или электрофоретические процедуры (например, препаративное изоэлектрофокусирование), разделение, основанное на дифференциальной растворимости соединений (например, осаждение сульфатом аммония), SDS PAGE или экстракцию (см., например, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, под редакцией, VCH Publishers, New York, 1989), позволяющих получить полипептиды с достаточной чистотой.

Способы обработки содержащего целлюлозу сырья

Композиции и способы по настоящему изобретению могут использоваться для гидролиза (осахаривания) содержащего целлюлозу сырья, например лигноцеллюлозы, до ферментируемых сахаров, с последующим преобразованием ферментируемых сахаров в различные полезные вещества, например, химические вещества и топливо. Получение желательного продукта ферментации из содержащего целлюлозу сырья в типичном случае включает предварительное нагревание, энзиматический гидролиз (осахаривание) и ферментацию.

Обработка содержащего целлюлозу сырья по настоящему изобретению может быть проведена с использованием известных в данной области методов. Кроме того, способы по настоящему изобретению могут быть осуществлены с использованием любого аппарата обработки биомассы, сконструированного таким образом, чтобы проводить операции по настоящему изобретению.

Гидролиз (осахаривание) и ферментация, проводимые по отдельности или одновременно, включают, но ими не ограничиваясь, отдельный гидролиз и ферментацию (SHF), одновременное осахаривание и ферментацию (SSF), одновременное осахаривание и ферментацию (SSCF), гибридный гидролиз и ферментацию (HHF), SHCF (отдельный гидролиз и совместную ферментацию), HHCF (гибридный гидролиз и ферментацию) и направленную микробную конверсию (DMC). Следует понимать, что в практике осуществления настоящего изобретения может использоваться любой известный в данной области способ, включающий предварительную обработку, энзиматический гидролиз (осахаривание), ферментацию или их комбинацию.

Традиционно используемый в данном случае аппарат может включать перемешиваемый реактор, реактор с возможностью подпитки культуры, периодический реактор с перемешиванием, перемешиваемый реактор с непрерывно подаваемым потоком сырья с ультрафильтрацией и/или реактор непрерывного действия с поршневым потоком (Fernanda de Castilhos Corazza, Flavio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V. and Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process. Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), реактор с истощением (Ryu, S. K., and Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25; 53-65) или реактор с интенсивным перемешиванием, вызываемым электромагнитным полем (Gusakov. A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, 0. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56:141-153). Дополнительные типы реакторов включают, например, реактор с псевдоожиженным слоем, с восходящим поточным слоем, реакторы с иммобилизованной фазой и реакторы экструдерного типа для гидролиза и/или ферментации.

Предварительная обработка. В практике осуществления способов настоящего изобретения может использоваться любой способ предварительной обработки, который в настоящей области используется для разрушения компонентов содержащего целлюлозу сырья из клеточной стенки растений. Содержащее целлюлозу сырье может быть обработано погружением, замачиванием или соответствующим кондиционированием перед предварительной обработкой в соответствии с известными в данной области способами. Традиционные методы предварительной обработки включают, но ими не ограничиваясь, обработку паром (при наличии парового взрыва или без него), предварительную обработку разбавленной кислотой, предварительную обработку горячей водой, предварительную обработку известью, окисление во влажной среде, паровой взрыв во влажной среде, паровой взрыв с использованием насыщенных аммиаком волокон, предварительную обработку органосолвом и биологическую предварительную обработку. Дополнительные виды предварительной обработки включают обработку ультразвуком, электропорацию, микроволновую обработку, обработку CO₂ при надкритической температуре, обработку H₂O при надкритической температуре и перколяционное фильтрование с использованием аммиака.

Содержащее целлюлозу сырье может быть подвергнуто предварительной обработке перед гидролизом и/или ферментацией. Предварительная обработка предпочтительно проводится перед гидролизом. Альтернативно, предварительная обработка может быть проведена одновременно с гидролизом, например одновременно с обработкой содержащего целлюлозу сырья одним или несколькими целлюлолитическими ферментами или другими ферментами с другими видами активности, позволяющими высвободить ферментируемые сахара, такие как глюкоза и/или мальтоза. В большинстве случаев, стадия предварительная обработка сама по себе приводит к некоторому преобразованию биомассы в ферментируемые сахара (даже в отсутствие ферментов).

Предварительная обработка паром. При проведении предварительной обработки паром содержащее целлюлозу сырье нагревают для разрушения компонентов клеточной стенки растений, включающих лигнин, гемицеллюлозу и целлюлозу, с образованием целлюлозных и других фракций, например, гемицеллюлозных, которые доступны для действия ферментов. Содержащее целлюлозу сырье вводят в реакционный резервуар или пропускают через реакционный резервуар, в который подают пар для повышения температуры до требуемого значения температуры и давления, где указанное содержащее целлюлозу сырье выдерживают в течение нужного периода времени. Предварительную обработку паром предпочтительно проводят при температуре 140-230°C, более предпочтительно, при температуре 160-200°C, и наиболее предпочтительно, при температуре 170-190°С, где оптимальный температурный диапазон определяется наличием добавленного химического катализатора. Время выдерживания в условиях предварительной обработки паром составляет предпочтительно 1-15 минут, более предпочтительно, 3-12 минут, и наиболее предпочтительно, 4-10 минут, где оптимальное время выдерживания при проведении такой предварительной обработки определяется температурным диапазоном и наличием добавленного химического катализатора. Предварительная обработка паром позволяет вносить достаточно высокие количества твердых веществ, так что содержащее целлюлозу сырье лишь немного смачивается при такой предварительной обработке. Предварительную обработку паром часто объединяют с проведением взрывного выгруза материала после предварительной обработки, который известен как паровой взрыв, при котором происходит быстрый сброс давления до атмосферного, и турбулентный поток материала повышает доступную для обработки площадь поверхности за счет фрагментации (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol Biotechnol. 59:618-628; публикации по патенту США No. 20020164730).

Часто перед проведением предварительной обработки паром добавляют катализатор, такой как H₂SO₄ или SO₂ (обычно 0,3-3 вес.%), где указанное добавление позволяет снизить время и температуру процесса и повысить уровень восстановления, а также улучшает ход энзиматического гидролиза (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al. 2004. Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762).

Химическая предварительная обработка: термин «химическая предварительная обработка» относится к любой химической предварительной обработке, которая способствует разделению и/или высвобождению целлюлозы, гемицеллюлозы и/или лигнина. Примеры подходящих способов химической предварительной обработки включают, например, предварительную обработку разбавленной кислотой, предварительную обработку известью, окисление во влажной среде, обработку взрывом с использованием насыщенных аммиаком волокон и/или при замораживании (AFEX), при проведении перколяционного фильтрования с использованием аммиака (APR) и предварительную обработку с использованием органосолва.

При проведении предварительной обработки разбавленной кислотой содержащее целлюлозу сырье смешивают с разбавленной кислотой, обычно, случае с H₂SO₄, и водой с получением взвеси, нагревают взвесь паром до желательной температуры и после выдерживания в течение заданного периода времени сбрасывают давление до атмосферного. Предварительная обработка разбавленной кислотой может проводиться с использованием реакторов разных конструкций, например, с использованием реакторов с поршневым потоком, противоточных реакторов или реакторов непрерывного действия с противоточным сжатым слоем (Duff and Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al. 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

Могут также использоваться некоторые способы предварительной обработки в щелочных условиях. Указанные виды щелочной предварительной обработки включают, но этим не ограничиваясь, обработку известью, окисление во влажной среде, перколяционное фильтрование с использованием аммиака (APR) и обработку взрывом с использованием насыщенных аммиаком волокон/взрывной обработки при замораживании (AFEX).

Известковую предварительную обработку проводят с использованием карбоната кальция, гидроксида натрия или аммиака при низких температурах, составляющих 85-150°C, в течение периода выдерживания от 1 часа до нескольких дней (Wyman et al., 2005. Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96:673-686). В документах WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900 и WO 2006/110901 описываются способы предварительной обработки с использованием аммиака.

Окисление во влажной среде представляет собой термическую предварительную обработку, которая проводится в типичном случае при температуре 180-200°С в течение 5-15 минут с добавлением окислителя, такого как пероксид водорода, или при повышенном давлении кислорода (Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64:139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol, Biotechnol. 81: 1669-1677). Предварительную обработку проводят предпочтительно при 1-40% сухого материала, более предпочтительно, 2-30% сухого материала и наиболее предпочтительно, 5-20% сухого материала, и часто исходный pH повышают за счет добавления щелочи, такой как карбонат натрия.

Модификация метода предварительной обработки путем влажного окисления, известная как обработка взрывом во влажной среде (сочетание влажного окисления и парового взрыва), может проводиться при наличии сухого материала до 30%. При проведении обработки взрывом во влажной среде окислитель вводят на стадии предварительной обработки по окончании некоторого периода выдерживания. После этого предварительную обработку прерывают путем быстрого сброса давления до атмосферного (WO 2006/032282).

Обработка взрывом во влажной среде с использованием насыщенных аммиаком волокон (AFEX) включает обработку содержащего целлюлозу сырья жидким или газообразным аммиаком при умеренных температурах, составляющих 90-100°C, при высоком давлении, таком как 17-20 бар, в течение 5-10 минут, где содержание сухого материала может быть достаточно высоким и доходить до 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121:1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96:2014-2018).

Предварительная обработка органосолвом позволяет провести делигнификацию содержащего целлюлозу сырья в ходе экстракции с использованием водного этанола (40-60% этанола) при температуре 160-200°C в течение 30-60 минут (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90:473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94:851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121:219-230). В этом случае обычно добавляют серную кислоту в качестве катализатора. При проведении предварительной обработки органосолвом, удаляется большая часть гемицеллюлозы.

Другие примеры подходящих способов предварительной обработки описаны Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85 и Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96:673-686 и в опубликованной заявке на патент США No. 2002/0164730.

В одном аспекте химическую предварительную обработку предпочтительно проводят как обработку кислотой, и более предпочтительно, в виде обработки, включающей непрерывное воздействие разбавленной и/или слабой кислотой. Используемая кислота в типичном случае представляет собой серную кислоту, но могут использоваться также и другие кислоты, такие как уксусная кислота, лимонная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, винная кислота, янтарная кислота, хлористоводородная кислота, или их смеси. Обработка слабой кислотой проводится в диапазоне pH, составляющем примерно 1-5, более предпочтительно 1-4, и наиболее предпочтительно 1-3. В одном аспекте концентрация кислоты варьирует предпочтительно от 0,01 до 20 вес.% кислоты, более предпочтительно, от 0,05 до 10 вес.% кислоты, еще более предпочтительно, от 0,1 до 5 вес.% кислоты и наиболее предпочтительно, от 0,2 до 2,0 вес.% кислоты. Кислоту приводят в контакт с содержащим целлюлозу сырьем и выдерживают при температуре, например, в диапазоне 160-220°C, предпочтительно 165-195°C, в течение периода времени, от одной или нескольких секунд до минут, например, от 1 секунды до 60 минут.

В другом аспекте предварительную обработку проводят в виде стадий обработки взрывом с использованием насыщенных аммиаком волокон (стадия предварительной обработки AFEX).

В другом аспекте предварительная обработка проводится в водной взвеси. В предпочтительных аспектах содержащее целлюлозу сырье присутствует в ходе предварительной обработки в количествах, составляющих предпочтительно, 10-80 вес.%, более предпочтительно, 20-70 вес.%, и наиболее предпочтительно, 30-60 вес.%, например, составляет около 50 вес.%. Предварительно обработанное содержащее целлюлозу сырье может оставаться непромытым или может быть подвергнуто промывке с использованием любого, известного в данной области способа, например, может быть промыто водой.

Механическая предварительная обработка: термин «механическая предварительная обработка» относится к различным типам размола или измельчения материала (например, сухой размол, влажный размол или размол вибрирующими шариками).

Физическая предварительная обработка: термин «физическая предварительная обработка» относится к любой предварительной обработке, которая способствует разделению и/или высвобождению целлюлозы, гемицеллюлозы и/или лигнина из содержащего целлюлозу сырья. Например, физическая предварительная обработка может включать облучение (например, микроволновое облучение), пропускание пара, паровой взрыв, гидротермолиз и их комбинации.

Физическая предварительная обработка может включать использование высокого давления и/или высокой температуры (паровой взрыв). В одном аспекте термин «высокое давление» обозначает давление в диапазоне, составляющем предпочтительно от примерно 300 до примерно 600 фунт/дюйм², более предпочтительно, от примерно 350 до примерно 550 фунт/дюйм² и наиболее предпочтительно, от примерно 400 до примерно 500 фунт/дюйм², и может составлять, например 450 фунт/дюйм². В другом аспекте термин «высокая температура» обозначает температуру в диапазоне от примерно 100°С до примерно 300°C, предпочтительно, от примерно 140°С до примерно 235°C. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, механическую предварительную обработку проводят в виде периодического процесса в системе гидролиза с паровой подачей, в которой используется высокое давление и высокая температура, как описано выше, например, Sunds Hydrolyzer, доступной от компании Sunds Defibrator AB, Швеция.

Объединенная физическая и химическая предварительная обработка: содержащее целлюлозу сырье может быть подвергнуто предварительной обработке с использованием физических и химических методов. Например, стадия предварительной обработки может включать обработку разбавленной или слабой кислотой, и обработку в условиях высокой температуры и/или высокого давления. Физическая и химическая стадии предварительной обработки могут проводиться либо последовательно, либо в одновременном режиме, по потребности. При этом может включаться также механическая предварительная обработка.

Соответственно, в предпочтительном аспекте содержащее целлюлозу сырье подвергают механической обработке, или химической, или физической предварительной обработке, или их сочетанием, для улучшения процесса разделения и/или высвобождения целлюлозы, гемицеллюлозы и/или лигнина.

Биологическая предварительная обработка: термин «биологическая предварительная обработка» относится к любой биологической предварительной обработке, которая способствует разделению и/или высвобождению целлюлозы, гемицеллюлозы и/или лигнина из содержащего целлюлозу сырья. Методы биологической предварительной обработки могут включать добавление солюбилизирующих лигнин микроорганизмов (см., например, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Btoethanol: Production and Utilization, Wyman, С. Е., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39:295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: краткий обзор, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S. Cao, N, J., Du, J., and Tsao, G. T. 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, Т., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; and Vallander and Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42:63-95).

Осахаривание . На стадии гидролиза, также известной как осахаривание, предварительно обработанное содержащее целлюлозу сырье гидролизуют с целью разложения целлюлозы и, альтернативно, также гемицеллюлозы до ферментируемых сахаров, таких как глюкоза, ксилоза, ксилулоза, арабиноза, мальтоза, манноза, галактоза и/или растворимые олигосахариды. Гидролиз проводят в энзиматическом режиме с использованием композиций целлюлолитического фермента по настоящему изобретению, содержащих эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла. Энзиматические компоненты композиции могут также добавляться в последовательном режиме.

Энзиматический гидролиз предпочтительно проводят в подходящей водной среде при условиях, которые могут быть легко определены специалистом в данной области. В предпочтительном аспекте гидролиз проводят в условиях, подходящих для проявления активности одного или нескольких ферментов, то есть в условиях, оптимальных для действия фермента(ов). Гидролиз может проводиться в виде периодического процесса с подачей сырья или в виде непрерывного процесса, где предварительно обработанное содержащее целлюлозу сырье (субстрат) подают постепенно, например, к гидролизному раствору, содержащему фермент.

Осахаривание обычно проводят в реакторах резервуарного типа с перемешиванием или в ферментерах в условиях контролируемых значений pH, температуры и при перемешивании. Подходящее время обработки, значения температуры и pH могут быть легко определены любым специалистом в данной области. Так, например, осахаривание может длиться 200 часов, но в типичном случае проводится предпочтительно в течение от примерно 12 до примерно 96 часов, более предпочтительно от примерно 16 до примерно 72 часов и наиболее предпочтительно от примерно 24 до примерно 48 часов. Температура составляет предпочтительно от примерно 25°С до примерно 70°С, более предпочтительно, от примерно 30°С до примерно 65°С, и наиболее предпочтительно от примерно 40°С до примерно 60°С, в частности, при температуре 50°С. Значение pH находится предпочтительно в диапазоне от примерно 3 до примерно 8, более предпочтительно, от примерно 3,5 до примерно 7, и наиболее предпочтительно, от примерно 4 до примерно 6, в частности, значение pH равно примерно 5. Содержание твердых компонентов составляет предпочтительно от 5 до примерно 50 вес.%, более предпочтительно, от примерно 10 до примерно 40 вес.%, и наиболее предпочтительно, от примерно 20 до примерно 30 вес.%.

Оптимальное количество ферментов и полипептидов, усиливающих целлюлолитическую активность, зависит от ряда факторов, включающих, но этим не ограничиваясь, смесь используемых в качестве компонентов целлюлолитических белков, целлюлозный субстрат, концентрацию целлюлозного субстрата, характер одной или нескольких предварительных обработок, которым подвергается целлюлозный субстрат, значение температуры, времени обработки, pH и наличие ферментирующего организма (то есть, включение в процедуру обработки дрожжей для одновременного проведения осахаривания и ферментации).

В предпочтительном аспекте эффективное количество одного или нескольких целлюлолитических ферментов для воздействия на содержащее целлюлозу сырье, составляет от примерно 0,5 до примерно 50 мг, предпочтительно, от примерно 0,5 до 40 мг, более предпочтительно, от примерно 0,5 до примерно 25 мг, более предпочтительно, от примерно 0,75 мг до примерно 20 мг, более предпочтительно, от примерно 0,75 до примерно 15 мг, еще более предпочтительно, от примерно 0,5 до примерно 10 мг, и наиболее предпочтительно, от примерно 2,5 до примерно 10 мг на г содержащего целлюлозу сырья.

В другом предпочтительном аспекте эффективное количество полипептида, усиливающего целлюлолитическую активность, используемого для воздействия на содержащее целлюлозу сырье, составляет от примерно 0,5 до примерно 50 мг, предпочтительно, от примерно 0,5 до примерно 40 мг, более предпочтительно, от примерно 0,5 до примерно 25 мг, более предпочтительно, от примерно 0,75 мг до примерно 20 мг, более предпочтительно, от примерно 0,75 до примерно 15 мг, еще более предпочтительно, от примерно 0,5 до примерно 10 мг и наиболее предпочтительно, от примерно 2,5 до примерно 10 мг на г содержащего целлюлозу сырья.

В другом предпочтительном аспекте эффективное количество одного или нескольких полипептидов, усиливающих целлюлолитическую активность, используемого для воздействия на содержащее целлюлозу сырье, составляет от примерно 0,01 до примерно 50,0 мг, предпочтительно, от примерно 0,01 до примерно 40 мг, более предпочтительно, от примерно 0,01 до примерно 30 мг, более предпочтительно, от примерно 0,01 мг до примерно 20 мг, более предпочтительно, от примерно 0,01 до примерно 10 мг, более предпочтительно, от примерно 0,01 до примерно 5 мг, более предпочтительно, от примерно 0,025 до примерно 1,5 мг, более предпочтительно, от примерно 0,05 до примерно 1,25 мг, более предпочтительно, от примерно 0,075 до примерно 1,25 мг, более предпочтительно, от примерно 0,1 до примерно 1,25 мг, еще более предпочтительно, от примерно 0,15 до примерно 1,25 и наиболее предпочтительно, от примерно 0,25 до примерно 1,0 мг на г содержащего целлюлозу сырья.

В другом предпочтительном аспекте эффективное количество одного или нескольких полипептидов, усиливающих целлюлолитическую активность применительно к одному или нескольким целлюлолитическим белкам, составляет от примерно 0,005 до примерно 1,0 г, предпочтительно, от примерно 0,01 до примерно 1,0 г, более предпочтительно, от примерно 0,15 до примерно 0,75 г, более предпочтительно, от примерно 0,15 до примерно 0,5 г, более предпочтительно, от примерно 0,1 до примерно 0,5 г, еще более предпочтительно, от примерно 0,1 до примерно 0,5 г, наиболее предпочтительно, от примерно 0,05 до примерно 0,2 г на г содержащего целлюлозу сырья.

Ферментация. Ферментируемые сахара, получаемые из предварительно обработанного и гидролизованного содержащего целлюлозу сырья, могут быть подвергнуты ферментации одним или несколькими ферментирующими микроорганизмами, которые способны проводить ферментацию сахаров, непосредственно или опосредованно, с образованием желательного продукта ферментации. Термин «ферментация» или «процесс ферментации» относится к любому процессу ферментации или к любому процессу, включающему стадию ферментации. Процессы ферментации также включают такие процессы ферментации, которые используются в производстве биотоплива, в производстве алкогольных напитков (например, пива, вина), в молочной промышленности (например, при получении ферментированных молочных продуктов), в кожевенной промышленности и в производстве табачных изделий. Условия ферментации зависят от желательного продукта ферментации и используемого для ферментации организма и могут быть легко определены специалистом в данной области.

На стадии ферментации сахара, высвобождаемые из содержащего целлюлозу сырья в результате предварительной обработки и проведения стадий энзиматического гидролиза, ферментируются до продукта, например, с образованием этанола, ферментирующим организмом, таким как дрожжи. Гидролиз (осахаривание) и ферментация могут представлять собой отдельные процессы или могут проводиться одновременно. Такие методы включают, но ими не ограничиваются, отдельный гидролиз и ферментацию (SHF), одновременное осахаривание и ферментацию (SSF), одновременное осахаривание и совместную ферментацию (SSCF), гибридный гидролиз и ферментацию (HHF), SHCF (отдельный гидролиз и совместная ферментация), HHCF (гибридный гидролиз и ферментация) и направленную микробную конверсию (DMC).

На стадии ферментации, в практике осуществления настоящего изобретения, может использоваться любое подходящее гидролизуемое содержащее целлюлозу сырье. Материал в основном выбирают на основании данных о желательном продукте ферментации, то есть с учетом вещества, которое должно быть получено в ходе ферментации и имеющейся информации об используемом процессе, как это известно в данной области.

Термин «ферментационная среда», как используется в настоящей заявке, относится к среде, имевшейся до добавления одного или нескольких ферментирующих микроорганизмов, включая такую среду, которая является результатом процесса осахаривания, а также включая среду, которая используется, например, в одновременном процессе осахаривания и ферментации (SSF).

Термин «ферментирующий микроорганизм» относится к любому микроорганизму, включая бактериальные и грибные организмы, подходящие для использования в желательном процессе ферментации, с целью получения продукта ферментации. Ферментирующий организм может представлять собой С₆ и/или С₅ ферментирующий организм, или их комбинацию. И С₆, и С₅ ферментирующие организмы хорошо известны в данной области. Подходящие ферментирующие микроорганизмы способны ферментировать, то есть превращать сахара, такие как глюкоза, ксилоза, ксилулоза, арабиноза, мальтоза, манноза, галактоза или олигосахариды, непосредственно или опосредованно, в желательный продукт ферментации.

Примеры бактериальных и грибных ферментирующих организмов, продуцирующих этанол, описаны Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnot. 69:627-642.

Примеры ферментирующих микроорганизмов, которые могут ферментировать C₆ сахара, включают бактериальные и грибные организмы, такие как дрожжи. Предпочтительные дрожжи включают штаммы Saccharomyces spp., предпочтительно, Saccharomyces cerevisiae.

Примеры ферментирующих организмов, которые могут ферментировать C₅ сахара, включают бактериальные и грибные организмы, такие как дрожжи. Предпочтительные С₅ ферментирующие дрожжи включают штаммы Pichia, предпочтительно, Pichia stipitis, такие как Pichia stipitis CBS 5773; штаммы Candida, предпочтительно Candida boidinii, Candida brassicae, Candida sheatae, Candida diddensii, Candida pseudotropicalis или Candida utilis.

Другие ферментирующие организмы включают штаммы Zymomonas, такие как Zymomonas mobilis, Hansenula, такие как Hansenula anomala; Kluyveromyces, такие как K. fragilis; Schizosaccharomyces, такие как S. pombe; и E coli, в особенности те штаммы E.coli, которые были генетически модифицированы с целью повышения выхода этанола.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, дрожжи представляют собой Saccharomyces spp. В более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Saccharomyces distaticus. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Saccharomyces uvarum. В другом предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Kluyveromyces. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Kluyveromyces marxianus. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Kluyveromyces fragilis. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Candida. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Candida boidinii. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Candida brassicae. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Candida diddensii. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Candida pseudotropicalis. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Candida utilis. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Clavispora. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Clavispora lusitaniae. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Clavispora opuntiae. В другом предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Pachysolen. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Pachysolen tannophilus. В другом предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Pichia. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Pichia stipitis. В другом предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Bretannomyces. В другом более предпочтительном аспекте дрожжи представляют собой Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E, ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).

Бактерии, которые могут эффективно ферментировать гексозу и пентозу до этанола, включают, например, Zymomonas mobilis и Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).

В предпочтительном аспекте бактерия представляет собой Zymomonas. В более предпочтительном аспекте бактерия представляет собой Zymomonas mobilis. В другом предпочтительном аспекте бактерия представляет собой Clostridium. В другом более предпочтительном аспекте бактерия представляет собой Clostridium thermocellum.

Коммерчески доступные дрожжи, подходящие для получения этанола, включают, например, дрожжи ETHANOL RED (доступны от Fermentis/Lesaffre, США), FALI (доступны от Fleischmann's Yeast, США), SUPERSTART и THERMOSACC (Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM AFT и XR (доступны от NABC - North American Byproducts Corporation, GA, США), GERT STRAND (доступны от Gert Strand AB, Швеция) и FERMIOL (доступны от DSM Specialties).

В предпочтительном аспекте ферментирующий микроорганизм был генетически модифицирован для достижения его способности ферментировать пентозные сахара, с получением таких микроорганизмов, которые способны утилизировать ксилозу, утилизировать арабинозу, и микроорганизмов, способных к совместной утилизации ксилозы и арабинозы.

Клонирование гетерологичных генов в различных ферментирующих микроорганизмах привело к конструированию организмов, способных превращать гексозы и пентозы в этанол (коферментация) (Chen and Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter andCiriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470).

В предпочтительном аспекте генетически модифицированный ферментирующий микроорганизм представляет собой Saccharomyces cerevisiae. В другом предпочтительном аспекте генетически модифицированный ферментирующий микроорганизм представляет собой Zymomonas mobilis. В другом предпочтительном аспекте генетически модифицированный ферментирующий микроорганизм представляет Escherichia coli. В другом предпочтительном аспекте генетически модифицированный ферментирующий микроорганизм представляет собой Klebsiella oxytoca.

Ферментирующий микроорганизм(ы) добавляют в типичном случае к продуктам деградации целлюлозы или гидролизату и ферментацию проводят в течение периода времени от примерно 8 до примерно 96 часов, например, в течение периода времени от примерно 24 до примерно 60 часов. Температура обычно составляет от примерно 26°С до примерно 60°С, и составляет, в частности, примерно 32°C или 50°C, а значение pH варьирует от примерно 3 до примерно pH 8, и составляет примерно pH 4-5, 6 или 7.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, указанные один или несколько ферментирующих микроорганизмов добавляют к разлагаемой целлюлозе или гидролизату и ферментацию проводят в течение периода времени от примерно 12 до примерно 96 часов, и обычно период составляет 24-60 часов. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, используемая в процессе ферментации температура составляет предпочтительно от примерно 20°С до примерно 60°C, более предпочтительно, от примерно 25°C до примерно 50°C, и наиболее предпочтительно от примерно 32°C до примерно 50°C, составляя, в частности, примерно 32°С или 50°C, и значения pH составляют в основном от примерно pH 3 до примерно pH 7, предпочтительно составляя примерно pH 4-7. Однако некоторые, например, бактериальные, ферментирующие организмы, характеризуются более высоким температурным оптимумом в процессе ферментации. Один или несколько ферментирующих микроорганизмов предпочтительно добавляют в количестве примерно 10⁵ -10¹², предпочтительно, в количестве примерно 10 ⁷-10¹⁰, в особенности, в количестве примерно 2×10⁸ жизнеспособных клеток на мл ферментативного бульона. Дополнительные инструкции относительно используемых для ферментации дрожжей могут быть найдены, например, в "The Alcohol Textbook" под редакцией K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999, где указанное руководство включено в настоящее описания в качестве ссылки.

Для получения этанола, образованную в ходе ферментации ферментированную взвесь перегоняют для экстракции этанола. Получаемый способом по настоящему изобретению этанол может быть использован, например, в качестве топлива, как питьевой этанол, например, в виде нейтрального питьевого спирта, или как промышленный этанол.

В настоящем изобретении может использоваться стимулятор ферментации в комбинации с любым ферментативным процессом по настоящему изобретению, для дополнительного улучшения процесса ферментации, и частности, для улучшения свойств ферментирующего микроорганизма, например, для повышения скорости ферментации и выхода этанола. Термин «стимулятор ферментации» относится к стимуляторам роста ферментирующих микроорганизмов, в частности, дрожжей. Предпочтительные для усиления роста стимуляторы ферментации включают витамины и минералы. Примеры витаминов включают мультивитамины, биотин, пантотенат, никотиновую кислоту, мезоинозит, тиамин, пиридоксин, парааминобензойную кислоту, фолиевую кислоту, рибофлавин и витамины A, B, C, D и E. См., например, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), которое включено в настоящее описание в качестве ссылки. Примеры минералов включают минералы и минеральные соли, которые могут поставлять соответствующие питательные компоненты, включающие P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn и Cu.

Продукты ферментации. Продукт ферментации может представлять собой любое вещество, получаемое в ходе ферментации. Продукт ферментации может представлять собой, но этим не ограничиваясь, спирт (например, арабинитол, бутанол, этанол, глицерол, метанол, 1,3-пропандиол, сорбит и ксилит), органическую кислоту (например, уксусную кислоту, ацетоновую кислоту, адапиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, лимонную кислоту, 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, глюкаровую кислоту, глюконовую кислоту, глюкуроновую кислоту, глютаровую кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, итаконовую кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, щавелевую кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту и ксилоновую кислоту); кетон (например, ацетон), альдегид (например, формальдегид), аминокислоту (например, аспарагиновую кислоту, глютаминовую кислоту, глицин, лизин, серин и треонин) и газ (например, метан, водород (H₂), диоксид углерода (CO₂) и монооксид углерода (CO)). Продукт ферментации может представлять собой также белок, как высокоценный продукт.

В предпочтительном аспекте продукт ферментации представляет собой спирт. Следует понимать, что термин «спирт» охватывает вещество, которое содержит один или несколько гидроксильных фрагментов. В более предпочтительном аспекте спирт представляет собой арабинитол. В другом более предпочтительном аспекте спирт представляет собой бутанол. В другом более предпочтительном аспекте спирт представляет собой этанол. В другом более предпочтительном аспекте спирт представляет собой глицерин. В другом более предпочтительном аспекте спирт представляет собой метанол. В другом более предпочтительном аспекте спирт представляет собой 1,3-пропандиол. В другом более предпочтительном аспекте спирт представляет собой сорбит. В другом более предпочтительном аспекте спирт представляет собой ксилит. См., например, Gong, С. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T. 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, M. M., and Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., and Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, Т. С., Quresht, N. and Blaschek, H. P.. 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

В другом предпочтительном аспекте продукт ферментации представляет собой органическую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой уксусную кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой ацетоновую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой адипиновую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой аскорбиновую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой лимонную кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой муравьиную кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой фумаровую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой глюкаровую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой глюконовую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой глюкуроновую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте настоящего изобретения, указанная органическая кислота представляет собой глютаровую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой 3-гидроксипропионовую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой итаконовую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой молочную кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой яблочную кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой малоновую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой щавелевую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой пропионовую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой янтарную кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой ксилоновую кислоту. См., например, Chen. R. and Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

В другом предпочтительном аспекте продукт ферментации представляет собой кетон. Следует понимать, что термин «кетон» относится к веществу, которое содержит один или несколько кетоновых фрагментов. В другом более предпочтительном аспекте кетон представляет собой ацетон. См, например, Qureshi and Biaschek, 2003, supra.

В другом предпочтительном аспекте продукт ферментации представляет собой альдегид. В другом более предпочтительном аспекте альдегид представляет собой формальдегид.

В другом предпочтительном аспекте продукт ферментации представляет собой аминокислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой аспарагиновую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой глютаминовую кислоту. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой глицин. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой лизин. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой серин. В другом более предпочтительном аспекте органическая кислота представляет собой треонин (см., например, Richard, A., and Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515).

В другом предпочтительном аспекте продукт ферментации представляет собой газ. В другом более предпочтительном аспекте газ представляет собой метан. В другом более предпочтительном аспекте газ представляет собой Н₂. В другом более предпочтительном аспекте газ представляет собой СО₂. В другом более предпочтительном аспекте газ представляет собой СО. См., например, Kataoka, N., A. Miya, and K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria. Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; и Gunaseelan V.N, in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: краткий обзор.

Восстановление. Продукт(ы) ферментации могут быть необязательно восстановлены из ферментационной среды с использованием любого известного в данной области метода, включающего, но этим не ограничиваясь, хроматографию (например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, гидрофобную хроматографию, хроматофокусирование и гель-проникающую хроматографию), электрофоретические методы (например, препаративное изоэлектрофокусирование), методы, основанные на различной растворимости соединений (например, осаждение сульфатом аммония), перегонку или экстракцию. Например, этанол отделяют от ферментированного содержащего целлюлозу сырья и очищают с использованием стандартных методов дистилляции. Может быть получен этанол с чистотой, достигающей примерно 96 об.%, который может использоваться, например, для получения топливного этанола, питьевого спирта, например нейтрального питьевого спирта, или промышленного этанола.

Ниже настоящее изобретение описывается с использованием соответствующих примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие область настоящего изобретения.

Примеры

Материалы

Химические вещества, используемые в качестве буферов, и субстраты представляют собой коммерческие продукты с по крайней мере аналитической чистотой.

Секвенирование ДНК

Секвенирование ДНК проводят на анализаторе Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) с окрашиванием терминатора (Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38:47-60). Последовательность собирают с помощью phred/phrap/consed (University of Washington, Seattle, WA, США) с использованием специфичных праймерных последовательностей.

Среды

Среду NNCYP получают при добавлении, в расчете на литр, 5,0 г NH₄NO ₃, 0,5 г MgSO₄×7H₂O, 0,3 г CaCl ₂, 2,5 г лимонной кислоты, 1,0 г бактопептона, 5,0 г дрожжевого экстракта, раствора металлических микроэлементов COVE и достаточного количества K₂HPO₄ для установления значения pH примерно до рН 5,4.

Раствор металлических микроэлементов COVE содержит, в расчете на литр, 0,04 г Na ₂B₄O₇×5H₂O, 0,4 г CuSO₄×5H₂O, 1,2 г FeSO₄ ×7H₂O, 0,7 г MnSO₄×H₂ O, 0,8 г Na₂MoO₂×2H₂O, и 10 г ZnSO₄×7H₂O.

Среда YP содержит, в расчете на литр, 10 г дрожжевого экстракта и 20 г бактотриптона.

Среда для индукции целлюлазы содержит, в расчете на литр, 20 г целлюлозы, 10 г твердых частей замоченного зерна, 1,45 г (NH₄)₂SO ₄, 2,08 г KH₂PO₄, 0,28 г CaCl ₂, 0,42 г MgSO₄ 7H₂O и 0,42 мл раствора металлических микроэлементов.

Раствор металлических мироэлементов включает в расчете на литр 216 г FeCl₃ ×6H₂O, 58 г ZnSO₄×7H₂ O, 27 г MnSO₄×H₂O, 10 г CuSO₄ ×5H₂O, 2,4 г H₃BO₃ и 336 г лимонной кислоты.

STC включает 1 M сорбита, 10 мМ CaCl₂ и 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5.

Чашки COVE содержат, в расчете на литр, 342 г сахарозы, 10 мл раствора солей COVE, 10 мл 1 M ацетамида, 10 мл 1,5 M CsCl и 25 г агара Нобля.

Раствор солей COVE содержит, в расчете на литр, 26 г KCl, 26 г MgSO₄, 76 г KH ₂PO₄ и 50 мл раствора металлических микроэлементов COVE.

Чашки COVE2 содержат, в расчете на литр, 30 г сахарозы, 20 мл раствора солей COVE, 25 г агара Нобля и 10 мл 1 M ацетамида.

Чашки PDA содержат, в расчете на литр, 39 грамм картофельного декстрозного агара.

Среда LB содержит, в расчете на литр, 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлорида натрия.

Чашки 2X YT-Amp содержат, в расчете на литр, 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлорида натрия и 15 г бактоагара, и в эту смесь после автоклавирования добавляют 2 мл раствора ампициллина с концентрацией 50 мг/мл после стерильного фильтрования.

Среда MDU2BP содержит в расчете на литр 45 г мальтозы, 1 г MgSO₄ ×7H₂O, 1 г NaCl, 2 г K₂HSO₄ , 12 г KH₂PO₄, 2 г мочевины и 500 мкл раствора металлических микроэлементов AMG, pH раствора корректируют до значения рН 5,0 и затем проводят стерильное фильтрование с использованием фильтрующего устройства с размером пор 0,22 мкм.

Раствор микроэлементов AMG содержит в расчете на литр 14,3 г ZnSO₄×7H₂O, 2,5 г CuSO₄ ×5H₂O, 0,5 г NiCl₂×6H₂ O, 13,8 г FeSO₄×H₂O, 8,5 г MnSO ₄×7H₂O и 3 г лимонной кислоты.

Чашки с минимальной средой содержат, в расчете на литр, 6 г NaNO ₃, 0,52 г KCl, 1,52 г KH₂PO₄, 1 мл раствора металлических микроэлементов COVE, 20 г агара Нобля, 20 мл 50% глюкозы, 2,5 мл 20% MgSO₄×7H₂ O и 20 мл концентрированного раствора биотина.

Концентрированный раствор биотина включает, в расчете на литр, 0,2 г биотина.

Среда SOC включает 2% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl ₂ и 10 мМ MgSO₄, и в эту смесь после автоклавирования добавляют 20 мМ глюкозы после стерильного фильтрования.

Пример 1: Конструирование вектора экспрессии pMJ04

Вектор экспрессии pMJ04 конструируют при проведении ПЦР-амплификации гена экзоцеллобиогидролазы I Trichaderma reesei(cbh1, CEL7A), терминатора из геномной ДНК Trichoderma reesei RutC30, с использованием праймеров 993429 (антисмысловой) и 993428 (смысловой), показанных ниже. Антисмысловой праймер конструировали таким образом, чтобы на 5'-конце был сайт Pac I и на 3'-конце смыслового праймера был сайт Spe I.

Праймер 993429 (антисмысловой):

5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTG-3' (SEQ ID NO:29)

Праймер 993428 (смысловой):

5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3' (SEQ ID NO:30)

Геномную ДНК Trichoderma reesei RutC30 выделяют с использованием набора DNEASY® Plant Maxi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Реакционные среды для проведения амплификации (50 мкл) включают: реакционный буфер 1X ThermoPol Reaction (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), 0,3 мМ dNTP, 100 нг геномной ДНК Trichoderma reesei RutC30, 0,3 мкМ праймера 993429, 0,3 мкМ праймера 993428 и 2 единицы ДНК полимеразы Vent (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Реакционные среды инкубируют в среде EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) при программировании реакции на 5 циклов, где каждый по 30 секунд, при 94°С, 30 секунд при 50°C и 60 секунд при 72°C, затем 25 циклов, каждый по 30 секунд, при 94°C, 30 секунд при 65°C и 120 секунд при 72°С (5 минут для окончательного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием 40 мМ Трис-основания, 20 мМ ацетата натрия-1 мМ буфера динатрий-ЭДТА (TAE), где полосы продукта размером 229 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), в соответствии с инструкциями производителя.

Полученный ПЦР фрагмент расщепляют с использованием Pac I и Spe I и лигируют в pAILo1 (WO 05/067531), расщепляют теми же рестрикционными ферментами с использованием набора для быстрого лигирования (Rapid Ligation Kit; Roche, Indianapolis, IN, USA), с получением pMJ04 (фиг. 1).

Пример 2: Конструирование pCaHj568

Плазмиду pCaHj568 конструируют на основе pCaHj170 (патент США No. 5763254) и pMT2188. Плазмида pCaHj170 включает полноразмерный участок кодирования эндоглюканазы V Humicola insolens (CEL45A) (SEQ ID NO:31, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32). Конструирование pMT2188 начинают с ПЦР-амплификации pUC19 ориджина репликации из pCaHj483 (WO 98/00529) с использованием праймеров 142779 и 142780, показанных ниже. Праймер 142780 встраивают в сайт Bbu I ПЦР-фрагмента.

Праймер 142779:

5'-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3' (SEQ ID NO:33)

Праймер 142780:

5'-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3' (SEQ ID NO:34)

Для проведения указанной амплификации используют систему для проведения ПЦР (EXPAND® PCR System; Roche Molecular Biochemicals, Basel, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. Продукты ПЦР разделяют в агарозном геле и фрагмент размером 1160 п.н. выделяют и очищают с использованием набора для экстракции из геля Jetquick Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Wielandstr, Германия).

Ген URA3 амплифицируют, с помощью системы для проведения ПЦР EXPAND® PCR System, с использованием основного клонирующего вектора pYES2 из Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и праймеров 140288 и 142778, показанных ниже. Праймер 140288 вводят в сайт Eco RI в ПЦР фрагменте.

Праймер 140288:

5'-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3' (SEQ ID NO:35)

Праймер 142778:

5'-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3' (SEQ ID NO:36)

Продукты ПЦР разделяют в агарозном геле, и фрагмент размером 1126 п.н. выделяют и очищают с использованием набора для экстракции из геля Jetquick Gel Extraction Spin Kit.

Два фрагмента ПЦР сливают при смешивании и амплифицируют с использованием показанных выше праймеров 142780 и 140288, по перекрывающему сплайсинг-методу (Horton et al., 1989, Gene 77: 61-68). Продукты ПЦР разделяют в агарозном геле, и фрагмент размером 2263 п.н. выделяют и очищают с использованием набора для экстракции из геля Jetquick Gel Extraction Spin Kit.

Полученный фрагмент расщепляют с помощью Eco RI и Bbu I и далее лигируют с помощью стандартных процедур с самым крупным фрагментом pCaHj483, полученным после его расщепления теми же рестрикционными ферментами. Лигирующую смесь трансформируют в pyrF-отрицательный штамм E. coli DB6507 (ATCC 35673), который был сделан компетентным по методу Mandel and Higa, 1970, J. Mol. Biol. 45: 154. Проводят селекцию трансформантов на твердой среде M9 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) с добавкой, в расчете на литр, 1 г казаминокислот, 500 мкг тиамина и 10 мг канамицина. Плазмиду из одного трансформанта выделяют и обозначают как pCaHj527 (фиг. 2).

Проводят сайт-направленный мутагенез NA2-tpi промотора, имеющегося в pCaHj527, по методу ПЦР с использованием системы EXPAND® PCR, в соответствии с инструкциями производителя. Нуклеотиды 134-144 преобразуют из GTACTAAAACC (SEQ ID NO:37) в CCGTTAAATTT (SEQ ID NO:38) с использованием мутагенного праймера 141223, показанного ниже.

Праймер 141223:

5'-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3' (SEQ ID NO:39)

Нуклеотиды 423-436 преобразуют из ATGCAATTTAAACT (SEQ ID NO:40) в CGGCAATTTAACGG (SEQ ID NO:41) с использованием мутагенного праймера 141222, показанного ниже.

Праймер 141222:

5'-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3' (SEQ ID NO:42).

Полученная плазмида была обозначена как pMT2188 (фиг. 3).

Кодирующий участок для эндоглюканазы V из Humicola insolens переносят из pCaHj170 в виде фрагмента Bam HI-SalI в pMT2188, расщепляют Bam HI и Xho I с получением pCaHj568 (фиг. 4). Плазмида pCaHj568 включает мутированный промотор NA2-tpi, функционально связанный с полноразмерной кодирующей последовательностью для эндоглюканазы V Humicola insolens.

Пример 3: Конструирование pMJ05

Плазмиду pMJ05 конструируют при проведении ПЦР-амплификации полноразмерного кодирующего участка размером 915 п.н. для эндоглюканазы V Humicola insolens на основе pCaHj568 с использованием праймеров HiEGV-F и HiEGV-R, показанных ниже.

Праймер HiEGV-F (смысловой):

5'-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3' (SEQ ID NO:43)

Праймер HiEGV-R (антисмысловой):

5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (SEQ ID NO:44)

Среды для реакции амплификации (50 мкл) включают реакционный буфер 1 X ThermoPol Reaction Buffer (New England Biolabs. Beverly, MA, USA), 0,3 мМ dNTP, 10 нг/мкл pCaHj568, 0,3 мкМ праймера HiEGV-F, 0,3 мкМ праймера HiEGV-R и 2 единицы ДНК-полимеразы Vent (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Реакционные смеси инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 5 циклов, каждый по 30 секунд при температуре 94°C, 30 секунд при температуре 50°C и 60 секунд при температуре 72°C, затем проводят 25 циклов, каждый по 30 секунд при температуре 94°C, 30 секунд при температуре 65°C и 120 секунд при температуре 72°C (5 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 937 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Очищенный фрагмент размером 937 п.н. используют в качестве матричной ДНК для последующих амплификаций с использованием следующих праймеров:

Праймер HiEGV-R (антисмысловой):

5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (SEQ ID NO:45)

Праймер HiEGV- F-перекрывающийся (смысловой):

5'-ACCGCGGACTGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCCTCC- 3' (SEQ ID NO:46).

Показанные курсивом праймерные последовательности являются гомологичными к промотору размером 17 п.н. для гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei (cbh1) (WO 91/17243), а подчеркнутые праймерные последовательности являются гомологичными к кодирующему участку размером 29 п.н. для эндоглюканазы V Humicola insolens. Перекрывающийся участок размером 36 п.н. между промотором и кодирующей последовательностью позволяет проводить точное слияние фрагмента размером 994 п.н., включающего cbh1 промотор Trichoderma reesei, с фрагментом размером 918 п.н., включающим кодирующий участок эндоглюканазы V Humicola insolens.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают реакционный буфер 1 X ThermoPol Reaction Buffer, 0,3 мМ dNTP, 1 мкл очищенного ПЦР фрагмента размером 937 п.н., 0,3 мкМ HiEGV-F-перекрывающегося праймера, 0,3 мкМ HiEGV-R праймера и 2 единицы ДНК-полимеразы Vent. Реакционные смеси инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 5 циклов, где каждый цикл длится 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 50°C и 60 секунд при 72°C, и затем проводят 25 циклов, каждый по 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 65°C и 120 секунд при 72°C (5 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 945 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Проводят отдельную ПЦР для амплификации промоторной последовательности cbh1 Trichoderma reesei, охватывающей участок из 994 п.н. против направления считывания информации от ATG старта-кодона гена в геномной ДНК Trichoderma reesei RutC30, с использованием показанных ниже праймеров (смысловой праймер был сконструирован таким образом, чтобы на 5'-конце был сайт рестрикции Sal I). Геномную ДНК Trichoderma reesei RutC30 выделяют с использованием набора DNeasy Plant Maxi Kit.

Праймер TrCBHIpro-F (смысловой):

5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (SEQ ID NO:47)

Праймер TrCBHIpro-R (антисмысловой):

5'-GATGCGCAGTCCGCGGT-3' (SEQ ID NO:48)

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают реакционный буфер 1X ThermoPol Reaction Buffer, 0,3 мМ dNTP, 100 нг/мкл геномной ДНК Trichoderma reesei RutC30, 0,3 мкМ праймера TrCBHIpro-F, 0,3 мкМ праймера TrCBHIpro-R и 2 единицы ДНК-полимеразы Vent. Реакционную смесь инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый по 30 секунд при температуре 94°C, 30 секунд при температуре 55°C и 120 секунд при температуре 72°C (5 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 998 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Очищенный ПЦР фрагмент размером 998 п.н. используют в качестве матричной ДНК для последующей амплификации с использованием праймеров, показанных ниже.

Праймер TrCBHIpro-F:

5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (SEQ ID NO:49)

Праймер TrCBHIpro-R-перекрывающийся:

5'-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT -3'(SEQ ID NO:50)

Показанные курсивом последовательности гомологичны промотору cbh1 Trichoderma reesei размером 17 п.н., а подчеркнутые последовательности гомологичны кодирующему участку для эндоглюканазы V Humicola insolens размером 29 п.н. Перекрывающийся участок размером 36 п.н. между промотором и кодирующей последовательностью позволяет проводить точное слияние фрагмента размером 994 п.н., включающего промотор cbh1 Trichoderma reesei, с фрагментом размером 918 п.н., включающим полноразмерный кодирующий участок для эндоглюканазы V Humicola insolens.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают реакционный буфер 1X ThermoPol Reaction Buffer, 0,3 мМ dNTP, 1 мкл очищенного ПЦР фрагмента размером 998 п.н., 0,3 мкМ праймера TrCBHIpro-F, 0,3 мкМ TrCBHIpro-R-перекрывающегося праймера и 2 единицы ДНК-полимеразы Vent. Реакционную смесь инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 5 циклов, каждый по 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 50°C и 60 секунд при 72°C, затем проводят 25 циклов, каждый по 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 65°C и 120 секунд при 72°C (5 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 1017 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

ПЦР фрагмент промотора cbh1 из Trichoderma reesei размером 1017 п.н. и ПЦР фрагмент размером 945 п.н. эндоглюканазы V Humicola insolens используют в качестве матричной ДНК для последующей амплификации с использованием приведенных ниже праймеров для достижения точного слияния промотора cbh1 размером 994 п.н. с полноразмерным кодирующим участком эндоглюканазы V с размером 918 п.н. с помощью перекрывающейся ПЦР.

Праймер TrCBHlpro-F:

5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3' (SEQ ID NO:51)

Праймер HiEGV-R:

5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' (SEQ ID NO:52)

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают реакционный буфер 1X ThermoPol, 0,3 мМ dNTP, 0,3 мкМ праймера TrCBHIpro-F, 0,3 мкМ праймера HiEGV-R и 2 единицы ДНК-полимеразы Vent. Реакционную смесь инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 5 циклов, каждый по 30 секунд при 94°C, 30 секунд при температуре 50°C и 60 секунд при температуре 72°C, затем проводят 25 циклов, каждый по 30 секунд при температуре 94°C, 30 секунд при температуре 65°C и 120 секунд при температуре 72°C (5 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 1926 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Полученный фрагмент размером 1926 п.н. клонируют в векторе pCR®-Blunt-II-TОPО® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с использованием набора для клонирования ZEROBLUNT® TOPO® PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), в соответствии с протоколом производителя. Полученную плазмиду расщепляют с использованием NotI и SalI и фрагмент размером 1926 п.н. выделяют из геля с использованием набора для экстракции QIAQUICK® и лигируют с использованием ДНК-лигазы T4 (Roche, Indianapolis, IN, USA) в pMJ04, которая также была расщеплена теми же двумя рестрикционными ферментами, с получением pMJ05 (фиг. 5). Плазмида pMJ05 включает промотор и терминатор целлобиогидролазы I Trichoderma reesei в функциональной связи с полноразмерной кодирующей последовательностью для эндоглюканазы V Humicola insolens.

Пример 4: Конструирование вектора экспрессии pSMai130

Амплифицируют фрагмент ДНК размером 2586 п.н., локализованный на участке от старт-кодона ATG до стоп-кодона TAA в полноразмерной кодирующей последовательности бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (SEQ ID NO:15 для последовательности кДНК и SEQ ID NO:16 для рассчитанной аминокислотной последовательности; E. coli DSM 14240) по методу ПЦР на основе pJaL660 (WO 2002/095014), взятой в качестве матрицы с праймерами 993467 (смысловой) и 993456 (антисмысловой), показанных ниже. Создают на 5'-конце антисмыслового праймера сайт Spe I для облегчения лигирования. Праймерные последовательности, показанные курсивом, являются гомологичными к промотору cbh1 Trichoderma reesei размером 24 п.н., а подчеркнутые последовательности гомологичны кодирующему участку бета-глюкозидазы размером 22 п.н. Aspergillus oryzae.

Праймер 993467:

5'-ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG -3' (SEQ ID NO:53)

Праймер 993456:

5'-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (SEQ ID NO:54)

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для проведения амплификации Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0,25 мМ dNTP, 10 нг pJaL660, 6,4 мкМ праймера 993467, 3,2 мкМ праймера 993456, 1 мМ MgCl₂ и 2,5 единицы ДНК-полимеразы Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Реакционные смеси инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый по 1 минуте при температуре 94°C, 1 минута при температуре 55°C и 3 минуты при температуре 72°C (15 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют электрофорезом в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 2586 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Отдельную ПЦР проводят для амплификации промоторной последовательности cbh1Trichoderma reesei, охватывающей участок 1000 п.н. против направления считывания от ATG старт-кодона гена, с использованием праймера 993453 (смысловой) и праймера 993463 (антисмысловой), показанных ниже, с получением ПЦР фрагмента размером 1000 п.н.

Праймер 993453:

5'-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3' (SEQ ID NO:55)

Праймер 993463:

5'-CCTCGATCCAACCAAGCTTCAT GATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3' (SEQ ID NO:56)

Праймерные последовательности, показанные курсивом, гомологичны промотору cbh1 размером 24 п.н. Trichoderma reesei , подчеркнутые праймерные последовательности гомологичны полноразмерному кодирующему участку для бета-глюкозидазы размером 22 п.н. Aspergillus oryzae. Перекрывающийся участок размером 46 п.н. между промотором и кодирующей последовательностью позволяет достичь точного слияния фрагмента размером 1000 п.н., включающего промотор cbh1 Trichoderma reesei, с фрагментом размером 2586 п.н., включающим кодирующий участок для бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для проведения амплификации Pfx, 0,25 мМ dNTP, 100 нг геномной ДНК Trichoderma reesei RutC30, 6,4 мкМ праймера 993453, 3,2 мкМ праймера 993463, 1 мМ MgCl₂ и 2,5 единицы ДНК-полимеразы Pfx. Реакционную смесь инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый по 1 минуте при температуре 94°C, 1 минута при температуре 55°C и 3 минуты при температуре 72°C (15 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении гель-электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 1000 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Очищенные фрагменты используют в качестве матричной ДНК для последующей амплификации по методу перекрывающейся ПЦР с использованием праймера 993453 (смысловой) и праймера 993456 (антисмысловой), показанных выше, для достижения точного слияния фрагмента размером 1000 п.н., включающего промотор cbh1Trichoderma reesei, с фрагментом размером 2586 п.н., включающим полноразмерный кодирующий участок для бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для проведения амплификации Pfx, 0,25 мМ dNTP, 6,4 мкМ праймера 99353, 3,2 мкМ праймера 993456, 1 мМ MgCl₂ и 2,5 единицы ДНК-полимеразы Pfx. Реакционную смесь инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый по 1 минуте при температуре 94°C, 1 минута при температуре 60°C и 4 минуты при температуре 72°C (15 минут для конечного удлинения).

Полученный фрагмент размером 3586 п.н. расщепляют с использованием Sal I и Spe I и лигируют в pMJ04, расщепленной теми же двумя рестрикционными ферментами, с получением pSMai130 (фиг. 6). Плазмида pSMai130 включает промотор и терминатор гена целлюбиогидролазы I Trichoderma reesei, в функциональной связи с сигнальной последовательностью и кодирующей последовательностью для нативной бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (то есть, полноразмерная кодирующая последовательность для бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae).

Пример 5: Конструирование SMai135

Кодирующий участок для зрелой бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (минус нативная сигнальная последовательность; см. фиг. 7; SEQ ID NO:57 и 58 для сигнального пептида и его кодирующей последовательности) от Lys-20 до ТАА стоп-кодона подвергают ПЦР-амплификации на основе pJaL660, взятой в качестве матрицы, с использованием праймера 993728 (смысловой) и праймера 993727 (антисмысловой), показанных ниже.

Праймер 993728:

5'-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCCAAGGATGATCTCGCGTACTCCC -3' (SEQ ID NO:59)

Праймер 993727:

5'-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3' (SEQ ID NO:60)

Последовательности, показанные курсивом, гомологичны сигнальной последовательности для эндоглюканазы V размером 20 п.н. Humicola insolens, а подчеркнутые последовательности гомологичны кодирующему участку бета-глюкозидазы размером 22 п.н. Aspergillus oryzae. Создают сайт SpeI на 5'-конце антисмыслового праймера.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для амплификации Pfx, 0,25 мМ dNTP, 10 нг/мкл pJaL660, 6,4 мкМ праймера 993728, 3,2 мкМ праймера 993727, 1 мМ MgCl₂ и 2,5 единицы ДНК-полимеразы Pfx. Реакционные смеси инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый по 1 минуте при температуре 94°C, 1 минута при температуре 55°C и 3 минуты при температуре 72°C (15 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 2523 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Отдельную ПЦР-амплификацию проводят для амплификации промотора cbh1 размером 1000 п.н. из Trichoderma reesei и сигнальной последовательности для эндоглюканазы V размером 63 п.н. из Humicola insolens (от ATG старт-кодона до Ala-21, фиг. 8, SEQ ID NO:61 и 62) с использованием праймера 993724 (смысловой) и праймера 993729 (антисмысловой), показанных ниже.

Праймер 993724:

5'-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3' (SEQ ID NO:63).

Праймер 993729:

5'-GGGAGTACGCGAGATCATCCTTGGCAAGGGCCAACACCGGCA -3' (SEQ ID NO:64)

Праймерные последовательности, показанные курсивом, гомологичны сигнальной последовательности эндоглюканазы V размером 20 п.н. Humicola insolens, а подчеркнутые праймерные последовательности гомологичны кодирующему участку бета-глюкозидазы размером 22 п.н. Aspergillus oryzae .

Плазмиду pMJ05, которая включает кодирующий участок для эндоглюканазы V Humicola insolens под контролем cbh1 промотора, используют в качестве матрицы для создания фрагмента размером 1063 п.н., включающего промотор cbh1 Trichoderma reesei и фрагмент сигнальной последовательности для эндоглюканазы V из Humicola insolens. Перекрывающийся участок размером 42 п.н. является общим для промотора cbh1 из Trichoderma reesei и сигнальной последовательностью для эндоглюканазы V из Humicola insolens и кодирующей последовательности для зрелой бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, что обеспечивает совершенное соединение между промотором и ATG старт-кодоном кодирующего участка бета-глюкозидазы размером 2523 п.н. Aspergillus oryzae.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для амплификации Pfx, 0,25 мМ dNTP, 10 нг/мкл pMJ05, 6,4 мкМ праймера 993728, 3,2 мкМ праймера 993727, 1 мМ MgCl₂ и 2,5 единицы ДНК-полимеразы Pfx. Реакционные смеси инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый по 1 минуте при температуре 94°C, 1 минута при температуре 60°C и 4 минуты при температуре 72°C (15 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 1063 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Очищенные перекрывающиеся фрагменты используют в качестве матрицы для амплификации с использованием праймера 993724 (смысловой) и праймера 993727 (антисмысловой), описанных выше, для достижения точного слияния фрагмента размером 1063 п.н., включающего промотор cbh1Trichoderma reese и сигнальную последовательность для эндоглюканазы V Humicola insolens, с фрагментом размером 2523 п.н., включающим кодирующий участок рамки для зрелой бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, по методу перекрывающейся ПРЦ.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для амплификации Pfx, 0,25 мМ dNTP, 6,4 мкМ праймера 993724, 3,2 мкМ праймера 993727, 1 мМ MgCl₂ и 2,5 единицы ДНК-полимеразы Pfx. Реакционные смеси инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый по 1 минуте при температуре 94°C, 1 минута при температуре 60°C и 4 минуты при температуре 72°C (15 минут для конечного удлинения). Продукты реакции выделяют при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 3591 п.н. вырезают из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Полученный фрагмент размером 3591 п.н. расщепляют с использованием Sal I и Spe I и лигируют в pMJ04, расщепленной теми же самыми рестрикционными ферментами, с получением pSMai135 (фиг. 9) Плазмида pSMai135 включает промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, в функциональной связи с сигнальной последовательностью для эндоглюканазы V Humicola insolens , и зрелой кодирующей последовательности бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae.

Пример 6: Экспрессия бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae с сигнальной последовательностью секреции для эндоглюканазы V Humicola insolens

Плазмиду pSMai135, кодирующую зрелую бета-глюкозидазу Aspergillus oryzae, связанную с сигналом секреции эндоглюканазы V Humicola insolens (фиг. 8), вводят в Trichoderma reesei RutC30 путем ПЭГ-опосредованной трансформации (Penttila et al., 1987, Gene 61 155-164). Плазмида содержит ген amdS из Aspergillus nidulans, что позволяет трансформантам расти на ацетамиде в качестве единственного источника азота.

Trichoderma reesei RutC30 культивировали при температуре 27°C со скоростью качания 90 об/мин в 25 мл среды YP с добавкой 2% (вес/объем) глюкозы и 10 мМ уридина в течение 17 часов. Мицелий собирали фильтрованием с использованием одноразовой системы вакуумной фильтрации (Millipore, Bedford, MA, USA) и дважды промывали деионизированной водой и дважды 1,2 M сорбитом. Протопласты получали путем суспендирования промытого мицелия в 20 мл 1,2 М сорбита, содержащего 15 мг GLUCANEX® (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark) на мл и 0,36 единиц хитиназы (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) на мл, и инкубировали в течение 15-25 минут при температуре 34°C при осторожном качании со скоростью 90 об/мин. Протопласты собирали центрифугированием в течение 7 минут при 400×gи дважды промывали холодным 1,2 М сорбитом. Количество протопластов подсчитывают с использованием гемацитометра и ресуспендировали в STC до конечной концентрации 1×10⁸ протопластов на мл. Избыток протопластов хранили в контейнерах для замораживания Cryo 1°C (Nalgene, Rochester, NY, USA) при температуре -80°C.

Примерно 7 мкг плазмиды pSMai135, расщепленной Pme I, добавляли к 100 мкл раствора протопластов и осторожно перемешивали, после чего добавляли 260 мкл ПЭГ-буфера, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого добавляли STC (3 мл) и перемешивали, и затем раствор для трансформации вносили на COVE чашки с использованием для селекции Aspergillus nidulans amdS. Чашки инкубировали при температуре 28°C в течение 5-7 дней. Трансформанты подвергали субкультивированию на COVE2 чашках и выращивали при температуре 28°C.

Шестьдесят семь трансформантов, обозначенных как SMA135, которые были получены с использованием pSMai135, подвергали субкультивированию на свежих чашках, содержащих ацетамид, и оставляли для спорообразования на 7 дней при температуре 28°C.

67 трансформантов SMA135 Trichoderma reesei культивировали в качалочных колбах с перегородкой на 125 мл, содержащих 25 мл среды для индукции целлюлазы при pH 6,0, инокулировали споры трансформантов, инкубировали при температуре 28°C и 200 об/мин в течение 7 дней. Trichoderma reesei RutC30 использовали в качестве контроля. Образцы культурального бульона отбирали на 7 день. Один мл каждого культурального бульона центрифугировали со скоростью 15700×g в течение 5 минут в микроцентрифуге и супернатанты переносили в новые пробирки. Образцы хранили при температуре 4°С до проведения ферментативного теста. Супернатанты оценивали на наличие бета-глюкозидазной активности с использованием п-нитрофенил-бета-D-глюкопиранозида в качестве субстрата, как описано ниже.

Активность бета-глюкозидазы определяли при температуре окружающей среды с использованием 25 мкл аликвот культуральных супернатантов, разбавленных в соотношении 1:10 50 мМ сукцинатом, pH 5,0 с содержанием, в 200 мкл 0,5 мг/мл п-нитрофенил-бета-D-глюкопиранозида, в качестве субстрата, в 50 мМ сукцината, pH 5,0. После 15-минутной инкубации реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М Трис-HCl, pH 8,0, и определяли поглощение на спектрофотометре при длине волны 405 нм. Одна единица активности бета-глюкозидазы соответствует получению 1 мкмоль п-нитрофенила в минуту на литр при pH 5,0 и при температуре окружающей среды. В качестве стандартного образца на энзиматическую активность, использовали бета-глюкозидазу Aspergillus niger (NOVOZYM 188, Novozymes A/S. Bagsværd, Denmark).

Множество SMA135 трансформантов продуцировали бета-глюкозидазу с активностью, превышающей в несколько раз активность, наблюдаемую в случае Trichoderma reesei RutC30. Трансформант SMA135-04 продуцировал наивысшую бета-глюкозидазную активность.

Электрофорез в SDS-PAGE проводили с использованием гелей CRITERION® Трис-HCl (5% разрешение) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и системы CRITERION® System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Пять мкл супернатантов, отобранных на 7 день эксперимента (см. выше), суспендировали в 2Х-концентрированном буфере для образцов Laemmli (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и кипятили в присутствии 5% бета-меркаптоэтанола в течение 3 минут. Образцы супернатантов наносили на полиакриламидный гель и проводили электрофорез с использованием, в качестве буфера для разделения, 1X Трис/Глицин/SDS (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Полученный гель окрашивали кумасси-красителем BIO-SAFE® (Bio-Rad, Hercuies, CA, USA).

В целом, 26 из 38 трансформантов Trichoderma reesei SMA135 продуцировали белок с молекулярной массой примерно 110 кДа, который не отмечался при анализе Trichoderma reesei RutC30, использованного в качестве контроля. Трансформант Trichoderma reesei SMA135-04 продуцировал наивысший уровень бета-глюкозидазы.

Пример 7: Конструирование вектора экспрессии pSMai140

Вектор экспрессии pSMai140 конструировали путем расщепления с помощью NcoI плазмиды pSATe111BG41 (WO 04/099228), которая содержит полноразмерный кодирующий участок варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae (SEQ ID NO:25, который кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26). Полученный фрагмент размером 1243 п.н. выделяли при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера и далее очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Вектор экспрессии pSMai135 расщепляли с помощью NcoI и фрагмент размером 8286 п.н. выделяли при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера и далее очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя. Фрагмент варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae размером 1243 п.н., полученный после расщепления NcoI, далее лигировали с векторным фрагментом размером 8286 п.н. с использованием ДНК-лигазы T4 (Roche, Indianapolis, IN, USA), в соответствии с протоколом производителя, с целью создания вектора экспрессии pSMai140 (фиг. 10). Плазмида pSMai140 включает промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei (CEL7A), функционально связанный с сигнальной последовательностью эндоглюканазы V Humicola insolens и со зрелой кодирующей последовательностью варианта бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae.

Пример 8: Трансформация Trichoderma reesei RutC30 с использованием pSMai140

Плазмиду pSMai140 линеаризуют с PmeI и трансформируют в штамм Trichoderma reesei RutC30, как описано в примере 6. В ходе четырех независимых экспериментов по трансформации было получено в целом 100 трансформантов, которые далее культивировали в качалочных колбах в среде для индукции целлюлазы, и активность бета-глюкозидазы определяли в культуральной среде трансформантов по процедуре, описанной в примере 6. Множество трансформантов, полученных на основе Trichoderma reesei SMA140, демонстрировали бета-глюкозидазную активность, которая в несколько раз превышала соответствующую активность в случе Trichoderma reesei RutC30.

Наличие в культуральной среде белка бета-глюкозидазного варианта BG41 Aspergillus oryzae определяли при проведении электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, как описано в примере 6, с дальнейшим окрашиванием кумасси-красителем тех же 13 культуральных супернатантов, энзиматическая активность которых оценивалась. Все тринадцать трансформантов, которые демонстрировали высокую бета-глюкозидазную активность, также экспрессировали, с разными выходами, вариант BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae размером примерно 110 кДа.

Трансформант с наивысшим уровнем экспрессии варианта бета-глюкозидазы, по данным оценки в тесте на активность бета-глюкозидазы и при использовании электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, был обозначен как Trichoderma reesei SMA140-43.

Пример 9: Конструирование вектора экспрессии pSaMe-F1

Фрагмент ДНК, содержащий промотор гена целлобиогидролазы I, размером 209 п.н. из Trichoderma reesei и ядерный участок (нуклеотиды 1-702 последовательности SEQ ID NO:31, которые кодируют аминокислоты 1-234 последовательности SEQ ID NO:32; WO 91/17243) гена эндоглюканазы V Humicola insolens, подвергли ПЦР-амплификации с использованием pMJ05 в качестве матрицы и праймеров, показанных ниже.

Праймер 995103:

5'-cccaagcttagccaagaaca-3' (SEQ ID NO:65)

Праймер 995137:

5'-gggggaggaacgcatgggatctggacggc-3' (SEQ ID NO:66)

Реакционная смесь для проведения амплификации (50 мкл) включает 1X буфер для амплификации Pfx, 10 мМ dNTP, 50 мМ MgSO₄, 10 нг/мкл pMJ05, 50 пикомолей праймера 995103, 50 пикомолей праймера 995137 и 2 единицы ДНК-полимеразы Pfx. Реакционную смесь инкубировали в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый на 30 секунд при температуре 94°C, 30 секунд при температуре 55°C и 60 секунд при температуре 72°C (3 минуты для конечного удлинения).

Продукты реакции выделяли при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 911 п.н. вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Фрагмент ДНК, содержащий участок размером 806 п.н. гена для варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae , амплифицировали с использованием pSMai140 в качестве матрицы и показанных ниже праймеров.

Праймер 995133:

5'-gccgtccagatccccatgcgttcctccccc-3' (SEQ ID NO:67)

Праймер 995111:

5'-ccaagcttgttcagagtttc-3' (SEQ ID NO:68)

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для амплификации 1× Pfx, 10 мМ dNTP, 50 мМ MgSO₄, 100 нг pSMai140, 50 пикомолей праймера 995133, 50 пикомолей праймера 995111 и 2 единицы ДНК-полимеразы Pfx. Реакционные смеси инкубировали в EPPENDORF® MASTERCYCIER® 5333, при программировании на 30 циклов, каждый на 30 секунд при температуре 94°C, 30 секунд при температуре 55°C и 120 секунд при температуре 72°C (3 минуты для конечного удлинения).

Продукты реакции выделяли при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 806 п.н. вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Два указанных выше фрагмента ПЦР подвергали процедуре перекрывающейся ПЦР. Очищенные перекрывающиеся фрагменты использовали в качестве матриц для амплификации с использованием праймера 995103 (смысловой) и праймера 995111 (антисмысловой), описанных выше, для достижения точного слияния фрагмента размером 702 п.н., включающего промотор гена целлобиогидролазы I размером 209 п.н. Trichoderma reesei и ядерную последовательность эндоглюканазы V Humicola insolens, с фрагментом размером 806 п.н., включающим часть кодирующего участка для варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, по методу перекрывающейся ПРЦ.

Реакционные смеси для проведения амплификации (50 мкл) включают буфер для амплификации 1×Pfx, 10 мМ dNTP, 50 MgSO₄, по 2,5 мкл каждого из фрагментов (20 нг/мкл), 50 пикомолей праймера 995103, 50 пикомолей праймера 995111 и 2 единицы высокоочищенной ДНК-полимеразы Pfx. Реакционную смесь инкубируют в EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании для достижения начальной денатурации на 3 минуты при температуре 95ºC, с последующим проведением 30 циклов денатурации, каждый по 1 минуте, отжига в течение 1 минуты при температуре 60°C и последующего удлинения в течение 3 минут при температуре 72°C.

Продукты реакции выделяли при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, где полосу продукта размером 1,7 кбайт вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя.

Фрагмент размером 1,7 кбайт лигировали в векторе pCR®4 Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), в соответствии с инструкциями производителя. Затем конструкцию трансформировали в химически компетентные клетки E.coli ONE SHOT® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), в соответствии с рекомендациями производителя по проведению процедуры быстрой химической трансформации. Колонии отбирали и анализировали путем выделения плазмиды и последующего ее расщепления Hind III с высвобождением в ходе перекрывающейся ПЦР фрагмента размером 1,7 кбайт.

Плазмиду pSMai140 также расщепляли Hind III с целью линеаризации данной плазмиды. Оба расщепленных фрагмента объединяли в реакции лигирования с использованием набора для быстрого лигирования ДНК, в соответствии с инструкциями производителя, с получением pSaMe-F1 (фиг. 11).

Компетентные клетки E.coli XL1-Blue Subcloning-Grade (Stratagene, La Jolla, CA, USA) трансформировали лигирующим продуктом. Идентичность конструкции подтверждали путем секвенирования ДНК на участке промотора гена целлобиогидролазы I из Trichoderma reesei, сигнальной последовательности эндоглюканазы V из Humicola insolens, ядерной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens, сигнальной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens, последовательности варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae и терминирующей последовательности гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei из плазмид, выделенных и очищенных из трансформированных клеток E. coli. Один клон, содержащий рекомбинантную плазмиду, был обозначен как pSaMe-F1. Плазмида pSaMe-F1 включает промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei и сигнальную пептидную последовательность эндоглюканазы V из Humicola insolens , соединенные непосредственно с ядерным полипептидом эндоглюканазы V Humicola insolens, которые были непосредственно слиты с сигнальным пептидом эндоглюканазы V Humicola insolens , который, в свою очередь, был непосредственно соединен со зрелой кодирующей последовательностью варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae. Последовательность ДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность слитого белка варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae показаны на фиг. 12A, 12B, 12C и 12D (SEQ ID NO:25 и 26, соответственно).

Пример 10: Трансформация Trichoderma reesei RutC30 с использованием pSaMe-F1

В качалочные колбы, содержащие 25 мл среды YP с добавкой 2% глюкозы и 10 мМ уридина, инокулируют 5×10⁷ спор Trichoderma reesei RutC30. После инкубации в течение ночи примерно 16 часов при температуре 27°C и при качании со скоростью 90 об/мин, мицелий собирали с использованием одноразовой вакуумной фильтрующей системы. Мицелий промывали дважды с использованием 100 мл деионизированной воды и дважды в 1,2 М сорбита. Протопласты получали по процедуре, описанной в примере 6.

Смешивали два микрограмма ДНК pSaMe-F1, линеализированной с Pme I, 100 мкл протопластов Trichoderma reesei RutC30 и 50% ПЭГ (4000) и затем инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем добавили 3 мл STC, и все содержимое выливали на чашки COVE с добавкой 10 мМ уридина. Затем указанные чашки инкубировали при температуре 28°C. Трансформанты, которые начинали появляться к 6 дню, отбирали и переносили на чашки COVE2 для дальнейшего выращивания при температуре 28°C в течение 6 дней. В результате, было восстановлено двадцать два трансформанта Trichoderma reesei .

Трансформанты культивировали в качалочных колбах в среде для индукции целлюлазы и активность бета-глюкозидазы определяли по процедуре, описанной в пример 6. Множество трансформантов pSaMe-F1 демонстрировали активность бета-глюкозидазы. Один из трансформантов, обозначенный как Trichoderma reesei SaMeF1-9, продуцировал наивысшие количества бета-глюкозидазы и характеризовался активностью, превышающей в два раза активность штамма Aspergillus oryzae, экспрессирующего вариант бета-глюкозидазы(пример 9).

Тест на эндоглюканазную активность проводили по процедуре Beguin, 1983, Analytical Biochem. 131 (2): 333-336 наслаиванием карбоксиметилцеллюлозы (СМС). Пять мкг общего белка из пяти образцов бульона (которые характеризовались наивысшим уровнем бета-глюкозидазной активности) разбавляли нативным буфером для образцов (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и разделяли в 8-16% Трис-HCl геле CRITERION® (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) с использованием для разделения 10 X Трис/глицинового буфера (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), и затем гель наносили на поверхность чашки, содержащей 1% карбоксиметилцеллюлозы (СМС). После 1-часовой инкубации при температуре 37°C, гель окрашивали с использованием красителя 0,1% конго красный в течение 20 минут. Далее чашки обесцвечивали с использованием 1 M NaCl, с тем чтобы идентифицировать участки очищения, что указывало на наличие эндоглюканазной активности. Были видны две очищенных зоны, одна над зоной, соответствующей примерно 110 кДа, и одна - ниже зоны, соответствующей примерно 25 кДа. Предполагаемый размер белка эндоглюканазы V из Humicola insolens и слитого белка варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, составляет 118 кДа, если считать, что оба белка не расщеплялись и остались в форме одного полипептида; гликозилирование отдельного ядерного домена эндоглюканазы V и бета-глюкозидазы ведет к миграции индивидуальных белков в сторону более высокой молекулярной массы, чем это можно было прогнозировать на основе первичной последовательности. Если указанные два белка были расщеплены, то прогнозируемые размеры должны составлять: 24 кДа - для ядерного домена эндоглюканазы V из Humicola insolens и 94 кДа - для варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae. Поскольку выявлялась зона очищения на уровне 110 кДа, это указывало на то, что минимальная популяция слитого белка эндоглюканазы и бета-глюкозидазы остается интактной и сохраняется в виде одного крупного белка. Нижняя зона очищения отражает, скорей всего, эндогенную эндоглюканазную активность и, по всей видимости, дополнительно связана с частичным расщеплением ядерного домена эндоглюканазы V из Humicola insolens из бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae.

Полученные результаты показывают, что ядро эндоглюканазы V из Humicola insolens было активно, несмотря даже на то, что оно было связано с бета-глюкозидазой Aspergillus oryzae. Дополнительно, повышение активности бета-глюкозидазы, по всей видимости, связано с возросшей секрецией белка относительно эффективности секреции негибридной бета-глюкозидазы. При соединении последовательности варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae с ядром эффективно секретируемой эндоглюканазы V из Humicola insolens, достигается повышенная секреция бета-глюкозидазы.

Пример 11: Конструирование вектора pSaMe-FX

Плазмиду pSaMe-FX конструировали при модификации pSaMe-F1. Плазмиду pSaMe-F1 расщепляли рестриктазами BstZ17 и EcoRI с получением фрагмента размером 1 кбайт, который содержал кодирующую последовательность варианта BG41 бета-глюкозидазы и фрагмент размером 9,2 кбайт, содержащий остаток плазмиды. Указанные фрагменты разделяли при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера, и фрагмент размером 9,2 кбайт вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя. Плазмиду pSMai135 также расщепляли с использованием Bst Z17 и Eco RI с получением фрагмента размером 1 кбайт, содержащего основания, гомологичные кодирующей последовательности варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, и фрагмента размером 8,5 кбайт, содержащего остаток плазмиды. Фрагмент размером 1 кбайт выделяли и очищали, как было указано выше.

Указанные фрагменты размером 9,2 кбайт и 1 кбайт объединили в реакции лигирования с использованием набора для быстрого лигирования ДНК по инструкциям производителя с получением pSaMe-FX, которая была идентична pSaMe-F1, за исключением того, что она содержала кодирующую последовательность зрелой бета-глюкозидазы зрелого типа, а не кодирующую последовательность зрелого варианта.

Компетентные клетки E . coli SURE® (Stratagene, La Jolla, CA, USA) трансформировали полученным продуктом лигирования. Идентичность конструкции была подтверждена при секвенировании ДНК плазмид, выделенных и очищенных из трансформированных клеток Е. coli, где было выявлено наличие промотора гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei , сигнальной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens , ядерной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens , сигнальной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens , кодирующей последовательности для зрелой бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae и терминаторной последовательности гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei. Один клон, содержащий рекомбинантную плазмиду, был обозначен как pSaMe-FX (фиг. 13). Последовательность ДНК и рассчитанная на ее основе аминокислотная последовательность слитого белка бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, показаны на фиг. 14A, 14B, 14C и 14D (SEQ ID NO:27 и 28, соответственно).

Пример 12: Трансформация и экспрессия трансформантов Trichoderma

Конструкцию pSaMe-FX линеаризовали с использованием Pme I и использовали для трансформации в штамм Trichoderma reesei RutC30, как описано в примере 10. Всего было получено 63 трансформанта в ходе одной трансформации. Трансформанты культивировали в качалочных колбах в среде для индукции целлюлазы и активность определяли по процедуре, описанной в примере 6. Множество трансформантов pSaMe-FX демонстрировали активность бета-глюкозидазы. Один трансформант, обозначенный как SaMe-FX16, демонстрировал двойную активность бета-глюкозидазы по сравнению с Trichoderma reesei SaMeF1-9 (Пример 10).

Пример 13: Анализ трансформантов Trichoderma reesei

Слитый белок конструировали по процедуре, описанной в примере 9, путем слияния ядерной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens (которая содержит собственную нативную сигнальную последовательность) со зрелой кодирующей последовательностью варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, связанной с сигнальной последовательностью эндоглюканазы V Humicola insolens. Полученная гибридная конструкция демонстрирует двукратное повышение активности секретированной бета-глюкозидазы по сравнению со зрелой кодирующей последовательностью варианта BG41 бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, соединенной с сигнальной последовательностью эндоглюканазы V Humicola insolens. Вторую гибридную конструкцию получают по процедуре, описанной в примере 11, где указанная конструкция состоит из ядерной последовательности эндоглюканазы V Humicola insolens (содержащей свою собственную сигнальную последовательность), слитой с кодирующей последовательностью бета-глюкозидазы дикого типа Aspergillus oryzae, соединенной с сигнальной последовательностью эндоглюканазы V Humicola insolens, и эта процедура приводила к еще большему повышению активности бета-глюкозидазы. Штамм, трансформированный гибридом на основе белка дикого типа, характеризовался двойным уровнем активности секретированной бета-глюкозидазы, по сравнению со штаммом, трансформированным слитым белком варианта BG41 бета-глюкозидазы.

Пример 14: Клонирование последовательности, кодирующей слитый белок бета-глюкозидазы в векторе экспрессии Aspergillus oryzae

Два синтетических олигонуклеотидных праймера, показанные ниже, были использованы для ПЦР-амплификации полноразмерной открытой рамки считывания из pSaMeFX, кодирующей слитый белок бета-глюкозидазы.

Прямой праймер для ПЦР:

5'-GGACTGCGCA GCATGCGTTC-3' (SEQ ID NO:69)

Обратный праймер для ПЦР:

5'-AGTTAATTAATTACTGGGCCTTAGGCAGCG -3' (SEQ ID NO:70)

Выделенная жирным шрифтом часть последовательности обозначает кодирующую последовательность. Подчеркивание «G» в прямом праймере обозначает введенное в основание изменение с целью создания сайта рестрикции Sph I. Оставшаяся часть последовательности характеризуется идентичностью по последовательности с сайтами вставки в pSaMeFX. Подчеркнутая часть последовательности в обратном праймере обозначает сайт рестрикции Pac I, добавленный для облегчения клонирования в векторе экспрессии pAILo2 (WO 04/099228).

Пятьдесят пикомолей каждого из указанных выше праймеров использовали в реакции ПЦР, где реакционные смеси содержали 50 нг pSaMeFX ДНК, буфер для амплификации 1×Pfx, 6 мкл 10 мМ смеси dATP, dTTP, dGTP и dCTP, 2,5 единицы ДНК-полимеразы PLATINUM® Pfx и 1 мкл 50 мМ MgSO₄ в конечном объеме 50 мкл. Использовали EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 для амплификации фрагмента, при программировании на 1 цикл при температуре 98°C в течение 2 минут; и 35 цикла, каждый при температуре 96°C в течение 30 секунд, при температуре 61°С в течение 30 секунд и при температуре 68°С в течение 3 минут. После 35 циклов, реакционные смеси инкубировали при температуре 68°С в течение 10 минут и затем охлаждали до температуры 10°С для дальнейшей обработки. Продукт реакции ПЦР размером 3,3 кбайт выделяли в ходе разделения в 0,8% GTG-агарозном геле (Cambrex Byproducts One Meadowlands Plaza East Rutherford, NJ, USA) с использованием TAE буфера и 0,1 мкг этидиумбромида на мл. ДНК визуализировали с помощью DARK READER (Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA), с тем чтобы избежать УФ-индуцированных мутаций. Полосу ДНК размером 3,3 кбайт вырезали одноразовым лезвием и очищали с использованием стаканов для центрифугирования ULTRAFREE®-DA (Millipore, Bilierica, MA, USA), в соответствии с инструкциями производителя.

Очищенный продукт ПЦР размером 3,3 кбайт клонировали в векторе pCR®4Blunt-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Четыре микролитра очищенного продукта ПЦР смешивали с 1 мкл 2 М раствора хлорида натрия и 1 мкл вектора TOPO®. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и затем использовали 2 мкл реакционной смеси для трансформации One Shot® TOP10 химически компетентных клеток Е. coli, в соответствии с инструкциями производителя. Три аликвоты, каждая по 83 мкл трансформирующей реакционной смеси с добавкой 100 мкг ампициллина на мл, распределяли по трем чашкам 2X YT размером 150 мм и инкубировали в течение ночи при температуре 37°С.

Восемь рекомбинантных колоний использовали для инокуляции жидких культур, содержащих 3 мл среды LB с добавкой 100 мкг ампициллина на мл. Плазмидную ДНК получали из указанных культур с использованием BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Для анализа клонов использовали расщепление рестрикционным ферментом Pac I. Плазмидную ДНК из каждого клона расщепляли с использованием Pac I и анализировали при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера. Все восемь клонов продемонстрировали ожидаемый характер расщепления после обработки рестриктазами и клоны 5, 6, 7 и 8 были отобраны для секвенирования с тем, чтобы подтвердить отсутствие мутаций в клонируемых вставках. Анализ последовательности на 5'- и 3'-концах показал, что все 4 клона содержали корректные последовательности. Клоны 5 и 7 были выбраны для дальнейшего секвенирования. Оба клона были секвенированы до значения Phred Q выше чем 40 с тем, чтобы гарантировать отсутствие ошибок, индуцированных ПЦР. Было показано, что клоны 5 и 7 содержат ожидаемую последовательность и клон 5 был выбран для повторного клонирования в pAlLo2.

Плазмидную ДНК из клона 5 линеаризовали путем расщепления Sph I. Далее линеаризированный клон подвергли сшивке по «тупым» концам путем добавления 1,2 мкл 10 мМ смеси из dATP, dTTP, dGTP и dCTP и 6 единиц ДНК-полимеразы Т4 (New England Bioioabs, Inc., Ipswich, MA, USA). Указанную смесь инкубировали при температуре 12°C в течение 20 минут и затем реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0,5 ЭДТА и нагревали при температуре 75°C в течение 20 минут для инактивации фермента. Фрагмент размером 3,3 кбайт, кодирующий белок слияния бета-глюкозидазы, был подвергнут очистке путем гель-электрофореза и ультрафильтрации, как описано выше.

Вектор pAILo2 был линеаризован путем расщепления Nco I. Далее линеаризированный клон подвергли сшивке по тупым концам при добавлении 0,5 мкл 10 мМ смеси dATP, dTTP, dGTP и dCTP и 1 единицы ДНК-полимеразы I. Указанную смесь инкубировали при температуре 25°C в течение 15 минут и затем реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0,5 М ЭДТА и нагревали при температуре 75°C в течение 15 минут для инактивации фермента. После этого вектор подвергли расщеплению с использованием Pac I. Вектор с «тупыми» концами подвергли очистке путем гель-электрофореза и ультрафильтрации, как описано выше.

Клонирование фрагмента размером 3,3, кодирующего белок слияния бета-глюкозидазы, в линеаризованном и очищенном в векторе pAILo2, проводили с использованием набора для быстрого лигирования. Был использован образец данной реакционной смеси объемом 1 мкл для трансформации клеток E. coli XL10 SOLOPACK® Gold (Stratagene, La Jolla, CA, USA), в соответствии с инструкциями производителя. По окончании периода восстановления, две аликвоты по 100 мкл реакционной трансформирующей смеси с добавкой 100 мкг ампициллина на мл были внесены на две чашки 2X YT размером 150 мМ и далее инкубированы в течение ночи при температуре 37°С. Были выбраны восемь, предположительно, рекомбинантных клонов, в произвольном порядке, из соответствующих чашек и из каждого из них была выделена плазмидная ДНК с использованием набора BIOROBOT® 9600. Клоны 1-4 были выбраны для секвенирования pAILo2-специфичных праймеров для подтверждения того, что соединение вектор/вставка имеет корректную последовательность. Клон 3 характеризовался отличным соединением вектор/вставка и был обозначен как pAILo47 (фиг. 15).

С целью создания штамма для экспрессии без маркера провели расщепление рестрикционной эндонуклеазой для выделения из остатка конструкции экспрессии гена blaA , который придает резистентность к антибиотику ампициллину. Тридцать микрограмм pAILo47 подвергли расщеплению с использованием Pme I. Дале расщепленную ДНК подвергли очистке при проведении электрофореза в агарозном геле, как описано выше. Полосу ДНК размером 6,4 кбайт, содержащую конструкцию экспрессии, но утратившую ген blaA, вырезают лезвием из геля и очищают с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®.

Пример 15: Экспрессия слитого гена cel45A-cel3AHumicole insolens/Aspergillus oryzae в Aspergillus oryzae JaL355

Протопласты Aspergillus oryzae JaL355 (WO 00/240694) получали по методу Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6:1419-1422. Десять микролитров очищенной конструкции экспрессии в соответствии с примером 14 было использовано для трансформации протопластов Aspergillus oryzae JaL355. Трансформация Aspergillus oryzae JaL355 привела к получению примерно 90 трансформантов. Пятьдесят трансформантов были выделены для внесения на отдельные PDA чашки и далее инкубированы в течения пяти дней при температуре 34°C.

Сорок восемь сливающихся споровых культур из чашек промыли 3 мл 0,01% TWEEN® 80 и суспендию спор использовали для инокуляции в 25 мл среды MDU2BP в стеклянных качалочных колбах объемом 125 мл. Культуры трансформантов инкубировали при температуре 34°C при постоянном встряхивании со скоростью 200 об/мин. Через 5 дней аликвоты по 1 мл каждой из культур подвергли центрифугированию при 12000×g и собрали супернатанты. Пять мкл каждого супернатанта смешали с равным объемом 2Х буфера (10% бета-меркаптоэтанола) и внесли в 8%-16% Трис/глициновый SDS-PAGE гель размером 1,5 мм, с последующим окрашиванием красителем для белка BIO-SAFE® Coomassie Blue G250 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Профили культуральных бульонов в SDS-PAGE показали, что 33 из 48 трансформантов были способны к экспрессии нового белка с кажущимся молекулярным весом, который был очень близок к ожидаемому значению 118 кДа. Трансформант 21 демонстрировал наибольший выход и был выбран для дальнейших исследований.

Пример 16: Выделение одной споры из трансформанта 21 Aspergillus oryzae JaL355

Споры трансформанта 21 Aspergillus oryzae JaL355 распределили по чашке с PDA и инкубировали в течение 5 дней при температуре 34°C. Небольшую зону планшета со сливающимися спорами промыли 0,5 мл 0,01% TWEEN® 80 для ресуспендирования спор. Аликвоту 100 мкл суспензии спор разбавили до конечного объема 5 мл с использованием 0,01% TWEEN® 80. С помощью гемоцитометра определили концентрацию спор и далее провели разбавление до конечной концентрации, составляющей 0,1 спора на микролитр. Аликвоту разбавленной суспензии спор 200 мкл распределили по чашкам размером 150 мм с минимальной средой и инкубировали 2-3 дня при температуре 34°C. Появляющиеся колонии вырезали из чашек и переносили на чашки с PDA и инкубировали в течение 3 дней при температуре 34°C. Затем споры распределили по чашкам и инкубировали еще в течение 5 дней при 34°C.

Чашки со сливающимися спорами промыли 3 мл 0,01% TWEEN® 80 и использовали суспензию спор для инокуляции в 25 мл среды MDU2BP в стеклянных качалочных колбах на 125 мл. Культуру из одной споры инкубировали при температуре 34°C при постоянном встряхивании со скоростью 200 об/мин. Через 5 дней аликвоты по 1 мл каждой из культур подвергли центрифугированию при 12000×g и далее собрали их супернатанты. Пять мкл каждого супернатанта смешали с равным объемом 2Х буфера (10% бета-меркаптоэтанола) и вносили в 8%-16% Трис/глициновый гель SDS-PAGE толщиной 1,5 мм, с последующим окрашиванием кумасси-синим для белка BIO-SAFE® Coomassie Blue G250. Оценка профилей культуральных бульонов в SDS-PAGE показала, что все восемь трансформантов были способны к экспрессии слитого белка бета-глюкозидазы на очень высоком уровне, и одна из культур, обозначенная как Aspergillus oryzae JaL355AILo47, создавала наибольший выход.

Пример 17: Конструирование pCW087

Два синтетических олигонуклеотидных праймера, показанных ниже, были разработаны для ПРЦ амплификации полипептидного гена Thermoascus aurantiacus GH61A и плазмиды pDZA2-7 (WO 2005/074656). Прямой праймер приводит к образованию «тупого» 5'-конца и обратный праймер включает сайт Pac I на 3'-конце.

Прямой праймер:

5'-ATGTCCTTTTCCAAGATAATTGCTACTG-3' (SEQ ID NO:71)

Обратный праймер:

5'-GCTTAATTAACCAGTATACAGAGGAG-3' (SEQ ID NO:72)

Пятьдесят пикомолей каждого из указанных выше праймеров использовали в реакции ПРЦ, где реакционная смесь содержала 50 нг pDZA2-7, 1 мкл 10 мМ смеси dATP, dTTP, dGTP и dCTP, 5 мкл 10Х ACCUTAQ буфера для ДНК-полимеразы (Sigma-Aldrich, St. Louis. MO, USA) и 5 единиц ДНК-полимеразы ACCUTAQ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), в конечном объеме 50 мкл. Для амплификации фрагментов ДНК использовали EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333, при программировании на 1 цикл при температуре 95°С в течение 3 минут; 30 циклов, каждый по 45 минут при температуре 94°С, при температуре 55°С в течение 60 секунд и при температуре 72°C в течение 1 минуты 30 секунд. После завершения 25 циклов реакционную смесь инкубировали при температуре 72°С в течение 10 минут, и затем охлаждали при температуре 4°С до дальнейшей обработки. 3'-конец ПЦР фрагмента из Thermoascus aurantiacus GH61A расщепили с использованием Pac I. Продукт расщепления подвергли очистке с использованием набора для очистки MINELUTE (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Фрагмент GH61A непосредственно подвергли клонированию в pSMai155 (WO 2005/074647) с использованием «затупленного» сайта NcoI на 5'-конце и сайта Pac I на 3'-конце. Плазмиду pSMai155 расщепили с использованием NcoI и Pac I. Сайт NcoI был затем «затуплен» с использованием ферментов Кленова для заполнения в 5'-рецессивном сайте NcoI. Смесь для проведения реакции Кленова, которая включала 20 мкл реакционной расщепляющей смеси pSmai155 плюс 1 мМ смеси dNTP и 1 мкл фермента Кленова, инкубировали в течение небольшого периода времени при комнатной температуре. Только что линеаризированную плазмиду pSMai155 подвергли очистке с использованием набора для очистки MINELUTE Reaction Cleanup Kit, в соответствии с инструкциями производителя. Описанные реакции привели к созданию тупого 5'-конца и сайта Pac I на 3'-конце, совместимого с недавно созданным фрагментом GH61A. Далее указанный фрагмент GH61A клонировали в векторе экспрессии pSMai155 с использованием набора для быстрого лигирования ДНК (Roche, Indianapolis, IN, USA), в соответствии с инструкциями производителя. Компетентные клетки E. coli XL1-Blue Subcloning-Grade (Stratagene, La Jolla, CA, USA) подвергли трансформации указанным продуктом лигирования. Идентичность данной конструкции подтвердили при проведении секвенирования последовательности ДНК, кодирующей GH61A, из плазмид, полученных и очищенных из трансформированных клеток E.coli. Один клон E. coli, содержащий рекомбинантную плазмиду, был обозначен как pCW087-8.

Пример 18: Конструирование pSaMe-Ta61A

Вектор экспрессии pSaMe-Ta61 был сконструирован при расщеплении плазмиды pMJ09 (WO 2005/056772), которая содержит селектируемый маркер amdS, с использованием Nsi I, который высвобождает фрагмент amdS размером 2,7 кбайт. Далее выделили фрагмент amdS размером 2,7 кбайт при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера и провели его очистку с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®.

Вектор экспрессии pCW087 расщепили Nsi I и выделили фрагмент размером 4,7 кбайт при проведении электрофореза в 1,0% агарозном геле с использованием TAE буфера с последующей очисткой с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®. Далее фрагмент amdS размером 2,7 кбайт был лигирован с векторным фрагментом размером 4,7 кбайт с использованием ДНК-лигазы Т4 (Roche, Indianapolis, IN, USA), в соответствии с протоколом производителя, с получением вектора экспрессии pSaMe-Ta61A. Плазмида pSaMe-Ta61A включает промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I Trichoderma reesei (CEL7A) в функциональной связи со зрелой кодирующей последовательностью Thermoascus aurantiacus GH61A.

Пример 19: Конструирование Trichoderma reesei штамма SaMe-MF268

Использовали совместную трансформацию для встраивания плазмид pSaMe-FX и pSaMe-Ta61A в Trichoderma reesei RutC30. Плазмиды pSaMe-FX и pSaMe-Ta61A были введены в Trichoderma reesei RutC30 путем ПЭГ-опосредованной трансформации (Penttila et al., 1987, supra). Каждая плазмида содержала ген amdS из Aspergillus nidulans, что позволяло трансформантам расти в ацетамиде в качестве единственного источника азота.

Trichoderma reesei RutC30 культивировали при температуре 27°C и при скорости качания 90 об/мин в 25 мл среды YP с добавкой 2% (вес/объем) глюкозы и 10 мМ уридина в течение 17 часов. Мицелий собирали фильтрованием с использованием одноразовой вакуумной системы фильтрации и промывали дважды деионизированной водой и дважды с использованием 1,2 М сорбита. Протопласты получали при суспендировании промытого мицелия в 20 мл 1,2 М сорбита, содержащего 15 мг GLUCANEX® (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark) на мл и 0,36 единиц хитиназы (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) на мл, с последующим инкубированием в течение 15-25 минут при температуре 34°C при осторожном встряхивании со скорость 90 об/мин. Протопласты собирали после центрифугирования в течение 7 минут при 400×g и промывали дважды холодным 1,2 M сорбитом. Количество протопластов подсчитывали в гемоцитометре и далее их ресуспендировали в STC до конечной концентрации 1×10⁸ протопластов на мл. Избыток протопластов хранили в контейнере Cryo 1°C для замораживания (Nalgene, Rochester, NY, USA) при температуре -80°С.

Примерно 4 мкг каждой из плазмид pSaMe-FX и pSaMe-Ta61A расщепили PmeI для удаления маркера резистентности к антибиотику ampR. После расщепления с использованием PmeI, полученные линеаризованные фрагменты разделяли в 1% агарозном геле с использованием TAE буфера для разделения разных фрагментов. Фрагмент размером 7,5 кбайт из pSaMe-FX и фрагмент размером 4,7 кбайт из pSaMe-Ta61A вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAQUICK®, в соответствии с инструкциями производителя. Указанные очищенные фрагменты содержат кассету селектируемого маркера amdS, промотор и терминатор гена cbh1 из Trichoderma reesei; дополнительно фрагмент включает ядерную последовательность EGV Humicola insolens/кодирующую последовательность гибрида BG Aspergillus oryzae, кодирующуюпоследовательность из T. aurantiacus GH61A. Фрагменты, использованные при трансформации, не содержат маркеров резистентности к антибиотику, поскольку фрагмент ampR был удален на стадии очистки в геле. Далее очищенные фрагменты добавляли к 100 мкл раствора протопластов и осторожно перемешивали, после чего добавляли 260 мкл ПЭГ буфера, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем добавляли STC (3 мл) и перемешивали, после чего раствор для трансформации вносили на чашки COVE для проведения селекции по amdS. Указанные чашки инкубировали при температуре 28°C в течение 5-7 дней. Далее, трансформанты подвергали субкультивированию на чашках с COVE2 и растили при температуре 28°C.

Провели субкультивирование свыше 400 трансформантов на свежих чашках, содержащих ацетамид, и оставили для спорообразования на 7 дней при температуре 28°C.

Трансформанты Trichoderma reesei культивировали в качалочных колбах с перегородкой на 125 мл, которые содержали 25 мл среды для индукции целлюлозы с pH 6,0, инокулировали споры трансформантов и инкубировали при температуре 28°C и 200 об/мин в течение 5 дней. В качестве контроля использовали Trichoderma reesei RutC30. Образцы культурального бульона отбирали на день 5. Один мл каждого из культуральных бульонов центрифугировали в микроцентрифуге со скоростью 15700×g в течение 5 минут и супернатант переносили в новые пробирки.

Проводили SDS-PAGE с использованием Трис-HCl гелей CRITERION® (5% разрешение) и системы CRITERION®. Пять мкл 5-дневных супернатантов (см. выше) суспендировали в буфере для образцов Laemmli с двойной концентрацией (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и кипятили в присутствии 5% бета-меркаптоэтанола в течение 3 минут. Далее, образцы супернатанта внесли на полиакриламидный гель и провели электрофорез с использованием в качестве разделяющего буфера 1X Трис/глицин/SDS (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Полученный гель окрашивали с использованием кумасси-красителя BIO-SAFE®. Трансформанты, которые демонстрировали экспрессию полипептида из Thermoascus aurantiacus GH61A и слитого белка, состоящего из ядерной последовательности эндоглюканазы V из Humicola insolens (Cel45A), слитой с бета-глюкозидазой Aspergillus oryzae, полосы которых были визуализированы в SDS-PAGE гелях, далее протестировали в реакциях гидролиза PCS для идентификации штаммов, продуцирующих бульон с наибольшей гидролитической эффективностью.

Пример 20: Идентификация Trichoderma reesei, штамм SaMe-MF268

Трансформанты, демонстрирующие экспрессию и полипептида Thermoascus aurantiacus GH61A, и слитого белка бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, культивировали в качалочных колбах с перегородками на 125 мл, содержащих 25 мл среды для индукции целлюлазы, при pH 6,0, в которую инокулировали споры трансформантов и инкубировали при температуре 28°C и 200 об/мин в течение 5 дней.

Культуральные бульоны из качалочных колб центрифугировали при 6000× g и далее профильтровали с использованием STERICUP EXPRESS (Millipore, Bedford, MA, USA) с размером пор 0,22 мкм до гидролиза. Активность культуральных бульонов определяли по их способности гидролизовать PCS и продуцировать сахара, выявляемые при химическом тестировании их восстановленных концов.

Кукурузная солома была подвергнута предварительной обработке в U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL), Boulder, CO, USA разбавленной серной кислотой. Для предварительной обработки были использованы следующие условия: 0,048 г серной кислоты/г сухой биомассы при температуре 190°C и при наличии 25 вес.% сухих веществ в течение примерно 1 минуты. Водонерастворимое твердое вещество в предварительно обработанной кукурузной соломе (PCS) содержало 59,2% целлюлозы, по результатам анализа ограниченного расщепления PCS с высвобождением глюкозы и целлобиозы. Перед проведением ферментативного гидролиза, PCS промывали большим объемом дважды деионизированной воды, сухой вес промытой водой PCS составлял 17,73%.

PCS в количестве 1 кг суспендировали примерно в 20 литров дважды деионизированной воды и после осаждения PCS воду декантировали. Указанную процедуру повторили до достижения pH промывочной воды выше 4,0, и в этот момент времени содержание восстанавливающихся сахаров было ниже, чем 0,06 г на литр. Для тестирования малого объема (например, 1 мл) осевшую взвесь просеивали через сито с размером пор 100 меш для корректности подтверждения работы пипеток. Определяли процентное содержание сухого веса в промытой PCS при сушке образца в печи 105°C в течение 24 часов (до достижения постоянного веса) и сравнивали полученные значения с сырым весом.

Гидролиз PCS проводили в объеме 1 мл в 96-луночных планшетах с глубокими ячейками (Axygen Scientific), которые закрывали при нагревании с использованием автоматического устройства для запечатывания планшетов ALPS 300 (ABgene Inc., Rochester, NY, USA). Концентрация PCS составляла 10 г на литр в 50 мМ ацетате натрия при pH 5,0. Гидролиз PCS проводили при температуре 50°C без дополнительного перемешивания, за исключением момента отбора образца, как это было описано ранее. Каждую реакцию проводили в тройном повторе. Высвобожденные восстанавливающиеся сахара анализировали с использованием в качестве реагента гидразида п-гидроксибензойной кислоты (PHBAH), как будет описано ниже.

В каждую из ячеек 96-луночных планшетов с глубокими ячейками вносили пипеткой PCS в объеме 0,8 мл (12,5 г на литр в воде) и затем добавляли 0,10 мл 0,5М ацетата натрия при pH 5,0, после чего добавляли 0,10 мл разбавленного раствора фермента для инициализации реакции с достижением конечного объема реакционной смеси 1,0 мл и концентрации PCS, равной 10 г на литр. Планшеты запечатывали. Реакционную смесь перемешивали при переворачивании луночных планшетов в начале гидролиза и перед отбором образцов в каждой временной точке. В каждой точке отбора образцов планшеты встряхивали и затем указанный планшет подвергали центрифугированию (SORVALL® RT7 с ротором RTH-250) при 2000 об/мин в течение 10 минут, затем отбирали 20 мкл гидролизата (супернатанта) и добавляли к 180 мкл 0,4% NaOH в 96-луночном микропланшете. Далее разбавляли раствор для остановки реакции с достижением соответствующего диапазона количеств восстанавливающихся сахаров, при необходимости. Количество высвобожденных восстанавливающихся сахаров оценивали с использованием в качестве реагента гидразида пара-гидроксибензойной кислоты (PHBAH, Sigma, 4-гидроксибензилгидразид): 50 мкл реагента PHBAH (1,5%) смешивали с 100 мкл образца в 96-луночном планшете THERMOWELL с V-образным дном (Costar 6511), инкубировали на нагревательном блоке для планшетов в течение 10 минут при температуре 95°C и затем добавляли к каждой ячейке по 50 мкл дважды деионизированной воды, перемешивали и 100 мкл переносили в ячейки другого 96-луночного планшета с плоским дном (Costar 9017) и определяли поглощение при длине волны 410 нм. Количество восстанавливающегося сахара вычисляли с использованием калибровочной кривой на глюкозу, построенной в тех же условиях. Процент преобразования целлюлозы в восстанавливающиеся сахара вычисляли следующим образом:

% преобразования = количество восстанавливающихся сахаров (мг/мл)/ (количество добавленной целлюлозы (мг/мл)×1,11).

Коэффициент 1,11 используется для перевода полученного значения весового количества, полученного при гидролизе целлюлозы в глюкозу.

После тестирования эффективности гидролиза 1 мл PCS, наилучшие варианты выращивали в ферментере в двойном повторе, по приведенному ниже протоколу. Сто мл среды вносили в качалочные колбы на 500 мл. Среда для качалочных колб включала, в расчете на литр, 20 г декстрозы, 10 г твердого замоченного зерна, 1,45 г (NH₄)₂SO₄, 2,08 г KH₂ PO₄, 0,36 г CaCl₂, 0,42 г MgSO₄ ·7H₂O и 0,42 мл раствора металлических микроэлементов. Раствор микроэлементов включал, в расчете на литр, 216 г FeCl₃·6H₂O, 58 г ZnSO₄·7H₂O, 27 г MnSO ₄·H₂O, 10 г CuSO₄· 5H₂O, 2,4 г H₃BO₃ и 336 г лимонной кислоты. В качалочную колбу инокулировали две мерных дозы ? из твердой чашечной культуры Trichoderma reesei SMA135-04 и инкубировали при температуре 28°C на угловой качалке со скоростью 200 об/мин в течение 48 часов. Использовали пятьдесят мл бульона для качалочной колбы для инокуляции в 3-литровый ферментер, содержащий 1,8 литров среды для проведения периодической ферментации, где указанная среда включала, в расчете на литр, 30 г целлюлозы, 4 г декстрозы, 10 г твердого замоченного зерна, 3,8 г (NH ₄)₂SO₄, 2,8 г KH₂PO ₄, 2,64 г CaCl₂, 1,63 г MgSO₄×7Н ₂О, 1,8 мл пеногасителя и 0,66 мл раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов включал, в расчете на литр, 216 г FeCl ₅·6H₂O, 58 г ZnSO₄ ·7H₂O, 27 г MnSO₄· H₂O, 10 г CuSO₄·5H₂ O, 2,4 г H₃BO₃ и 336 г лимонной кислоты. Среда, вводимая в ферментер со скоростью от 0 до 4 г/час в течение 165 часов, состояла из декстрозы и целлюлозы. Резервуар ферментера поддерживали в условиях температуры 28°C и контролируемого pH, значение которого устанавливали на уровне 4,75+/-0,1. Воздух подавали в резервуар ферментера со скоростью 1 ед. объемн. жидкости/мин. и бульон перемешивали с помощью импеллера Раштона, скорость вращения которого составляла от 1100 до 1300 об/мин.

Определяли общую концентрацию белка и бульоны использовали для повторного тестирования в реакции гидролиза 50 г PCS, по приведенной ниже процедуре. Перед каждым экспериментом из концентрированных растворов фермента, которые хранились при температуре 4°C, делали свежее разведение фермента.

Гидролиз PCS проводили в колбах Эрленмейера с закручивающимися крышками на 125 мл (VWR, West Chester, PA, USA) с использованием общей массы реакционной среды 50 г, в соответствии с протоколом для аналитического определения NREL Laboratory Analytical Protocol #008. В рамках данного протокола, гидролиз PCS (примерно 11,4% в PCS и 6,8% целлюлозы в водном 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,0) проводили с использованием разных количеств вносимого белка (где указанное количество выражали в виде мг белка на грамм целлюлозы), отобранных из 2-литровых образцов ферментируемого бульона, как описано выше. Тестирование гидролизирующей способности PCS проводили при 50°С с использованием угловой мешалки со скоростью 150 об/мин, а также инкубатора INNOVA® 4080 (New Brunswick Scientific Edison, NJ, USA). Аликвоты отбирали в ходе гидролиза в точках 72, 120 и 168 часов, центрифугировали и жидкий супернатант фильтровали через мембраны с размером 0,45 мкМ MULTISCREEN® HV (Millipore, Billerica, MA, USA) при центрифугировании со скоростью 2000 об/мин в течение 10 минут в центрифуге для планшетов SORVALL® RT7 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA. USA). Если образцы сразу не использовали, то фильтрованные сахаросодержащие аликвоты хранили при температуре -20°С. Концентрации сахара в образцах, разбавленных в 0,005 М H ₂SO₄, определяли после элюции с использованием 0,005 M H₂SO₄ со скоростью течения 0,4 мл в минуту из колонки AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) размером 4,6×250 мм при температуре 65°С, при количественном подсчете путем интеграции сигналов глюкозы и целлобиозы, по данным регистрации индекса отражения в системе для проведения ВЭЖХ CHEMSTATION® AGILENT® 1100 HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) и при проведении калибровки по чистым сахарным образцам. Полученные эквиваленты использовали для расчета процента преобразования целлюлозы в ходе каждой проводимой реакции.

Степень преобразования целлюлозы в глюкозу плюс целлобиозные сахара (конверсия, %) вычисляли с использованием следующего уравнения:

Преобразование _(%)=(количество глюкозы+целлобиозы×1,053)_(мг/мл) ×100× 162/(количество целлюлозы_(мг/мл)×180)=

(количество глюкозы+целлобиозы×1,053)_(мг/мл) ×100/(количество целлюлозы_(мг/мл)×1,111)

В данном уравнении коэффициент 1,111 отражает увеличение веса за счет преобразования целлюлозы в глюкозу, а коэффициент 1,053 отражает увеличение веса за счет преобразования целлобиозы в глюкозу.

Описанные выше результаты реакций гидролиза PCS, проводимых в колбах по 50 г, проиллюстрированы в Таблице 1. Один штамм, который продуцировал наилучший по данному качеству бульон, был обозначен как Trichoderma reesei SaMe-MF268.

Таблица 1 Процент преобразования в сахара через 168 часов Процент преобразования (глюкоза плюс целлюлоза) в расчете на внесенный белок.
Обозначение бульона-штамма	2,5 мг/г целлюлозы	4,0 мг/г целлюлозы
XCL-461-SaMe-MF268	66,29	80,08
XCL-465-SaMe-MF268	69,13	82,80
XCL-462-SaMe-MF330	62,98	77,99
XCL-466-SaMe-MF330	63,34	77,90
XCL-463-SaMe-MF377	64,03	78,45
XCL-467-SaMe-MF377	64,19	79,06

Пример 21: Получение бульонов Trichoderma reesei, содержащих полипептид GH61A Thermoascus aurantiacus и слитый белок бета-глюкозидазы Apergillus oryzae

Образцы ферментативного бульона, полученные по процедуре примера 20, осветляют путем удаления клеточных остатков при центрифугировании в течение примерно 20 минут при 9500×g. Осветленные образцы бульона далее фильтровали с использованием полиэфирсульфоновой мембраны с размером пор 0,22 мкм MILLEX® GP Express (Millipore, Bedford, MA. USA). Далее профильтрованные бульонные образцы обессоливали с использованием колонки для обессоливания HIPREP 26/10 (AKTA , GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). В обессоленном материале определяли концентрацию белка с использованием набора для тестирования белка BCA^TM (Pierce, Rockford, IL, USA), где бычий сывороточный альбумин был использован в качестве стандартного белка и рассчитывали количество белка в отфильтрованном бульоне. Аликвоты образцов в типичном случае анализировали в 8-16% SDS-PAGE гелях CRITERION (Bio-Rad, Hercules, CA; 200 V в течение 1 часа), и в процедуру разделения включали стандарты с определенными значениями молекулярного веса PRECISION PLUS PROTEIN (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Гели окрашивали кумасси красителем BIO-SAFE для визуализации белка (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и далее обесцвечивали деионизированной водой. Оценивали количества полипептида GH61A Thermoascus aurantiacus и слитого белка, содержащего ядерный белок Humicola insolens GH45 и бета-глюкозидазу Apergilius oryzae, на основе количественной оценки картин окрашенных гелей и с учетом размера пика, полученного после проведения капиллярного электрофореза EXPERION (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Пример 22: Повышение целлюлолитической активности бульона от Trichoderma reesei, содержащего слитый белок бета-глюкозидазы Apergillus oryzae при объединении с ионами металла и полипептидом GH61A Thermoascus aurantiacus

Проводили предварительную обработку кукурузной соломы в U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) с использованием разбавленной серной кислоты. Для предварительной обработки были использованы следующие условия: 1,4 вес.% серной кислоты при температуре 195°C в течение 4,5 минут. В связи с ограниченным расщеплением, в случае избытка целлюлазных ферментов, водонерастворимые твердые материалы в предварительно обработанной кукурузной соломе (PCS) содержали 59,2% целлюлозы. Перед проведением ферментативного гидролиза, PCS промывали большим объемом деионизированной воды до удаления растворимой кислоты и сахаров. Сухой вес промытой водой PCS составлял, по данным анализа, 19,16%.

Гидролиз PCS проводили в колбах Эрленмейера с закручивающимися крышками на 125 мл (VWR, West Chester, PA, USA), с использованием общей массы реакционной среды 50 г, в соответствии с протоколом проведения лабораторных анализов (NREL Laboratory Analytical Protocol # 008). В соответствии с данным протоколом, гидролиз PCS (примерно 11,3% в PCS и 6,7% целлюлозы в водном 50 мМ натрий-ацетатном буфере pH 5,0) проводили при наличии разных количеств белка (где указанные количества выражали в мг белка на грамм целлюлозы) в ферментативном бульоне от Trichoderma reesei, содержащем полипептид GH61A из Thermoascus aurantiacus, который усиливает целлюлолитическую активность, и слитый белок бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae, т.е. без добавления ионов двухвалентного металла и при их добавлении до конечной концентрации 10 мМ в форме, проиллюстрированной в Таблице 1. Тестирование гидролизующей способности PCS проводили при температуре 50°C на угловой качалке со скоростью 150 об/мин и с использованием инкубатора INNOVA® 4080 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA). Аликвоты образцов отбирали в ходе гидролиза в точках 72 и 120 часов. Далее аликвоты центрифугировали и жидкий супернатант фильтровали через мембраны MULTISCREEN® HV с размером пор 0,45 мкм в ходе центрифугирования со скоростью 2000 об/мин в течение 15 минут с использованием центрифуги для планшетов SORVALL® RT7. Если образцы сразу не использовались, то отфильтрованные, содержащие сахар аликвоты хранили при температуре -20°C. Концентрации сахара в образцах, разбавленных в 0,005 M H ₂SO₄, измеряли после элюции 0,005 M H₂ SO₄ со скоростью 0,4 мл в минуту с колонки AMINEX® HPX-87H размером 4,6×250 мм при температуре 65°C, и проводили количественный подсчет путем интегрирования сигналов глюкозы и целлобиозы на основе регистрации индекса отражения с использованием системы для проведения ВЭЖХ CHEMSTATION®. AGILENT® 1100 HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) при калибровке по чистым сахарным образцам. Полученные эквиваленты использовали для расчета процента преобразования целлюлозы в каждой из проводимых реакций.

Степень преобразования целлюлозы в сахара, глюкозу и целлобиозу (преобразование, %) вычисляли по следующему уравнению:

Преобразование _(%)=(глюкоза+целлобиоза×1,053)_(мг/мл)×100×162/ (целлюлоза_(мг/мл)×180)=

(глюкоза+целлобиоза×1,053) _(мг/мл)×100/(целлюлоза_(мг/мл)×1,111)

В данном уравнении коэффициент 1,111 отражает увеличение веса за счет преобразования целлюлозы в глюкозу, а коэффициент 1,053 отражает увеличение веса за счет преобразования целлобиозы в глюкозу. Целлюлозу в PCS определяли путем ограниченного расщепления в PCS, приводящего к высвобождению глюкозы и целлобиозы.

Перед каждым экспериментом делали свежие разведения фермента на основе концентрированных растворов фермента, которые хранили при температуре 4°C.

Результаты, приведенные в Таблице 2, показывают, что добавление 10 мМ MnSO₄ повышает уровень преобразования в глюкозу в большей степени, чем это наблюдалось, при наличии эквивалентных количеств одного ферментативного бульона с уровнями белка от 4 до 8 мг/г целлюлозы. Аналогично, CaCl₂, MgCl₂ или CoCl₂ , добавленные в количестве 10 мМ, повышали преобразование в глюкозу относительно уровней, которые наблюдались при использовании эквивалентных количеств одного ферментативного бульона при наличии белка от 4 до 8 мг/г целлюлозы. Добавление других солей двухвалентного металла, таких как 10 мМ ZnCl₂ или FeSO₄ , или добавление 10 мМ ЭДТА, хелатора двухвалентных катионов, снижало выход глюкозы и целлюбиозы. Результаты 72-часового гидролиза проиллюстрированы на фиг. 16.

Таким образом, добавление 10 мМ MnSO₄, CaCl₂, MgCl ₂ или CoCl₂ к растворам, содержащим целлюлазу, повышало выход глюкозы и целлобиозы при гидролизе кукурузной соломы (PCS), предварительно обработанной кислотой, по сравнению с вариантом добавления солей других металлов.

Таблица 2:
Эксперимент	Смесь ферментов и металла	Фактическое содержание биомассы (вес.%)	Фактическое содержание целлюлозы (вес.%)	Фактическое содержание общего белка мг/г целлюлозы	Преобразование, 72 часа	Преобразование, 120 часов
1	SaMe MF268	11,32	6,70	4,00	74,10	84,62
2	SaMe MF268	11,32	6,70	6,00	84,59	91,94
3	SaMe MF268	11,32	6,70	8,00	88,68	95,20
7	SaMe MF268 Ca++	11,32	6,70	4,00	74,79	86,14
8	SaMe MF268 Ca++	11,32	6,70	6,00	85,77	95,11
9	SaMe MF268 Ca++	11,32	6,70	8,00	89,54	96,29
10	SaMe MF268 Mg++	11,32	6,70	4,00	75,31	87,08
11	SaMe F268 Mg++	11,32	6,70	6,00	86,99	95,12
12	SaMe MF268 Mg++	11,32	6,70	8,00	90,49	97,56
13	SaMe MF268 Mn++	11,32	6,70	4,00	79,30	86,77
14	SaMe MF268 Mn++	11,33	6,70	6,00	91,65	95,23
15	SaMe MF268 Mn++	11,32	6,70	8,00	98,03	98,70
16	SaMe MF268 Zn++	11,32	6,70	4,00	56,00	63,38
17	SaMe MF268 Zn++	11,32	6,70	6,00	65,79	75,03
18	SaMe MF268 Zn++	11,32	6,70	8,00	74,88	84,22
19	SaMe MF268 Fe++	11,32	6,70	4,00	33,80	35,83
20	SaMe MF268 Fe++	11,32	6,70	6,00	42,50	44,88
21	SaMe MF268 Fe++	11,32	6,70	8,00	49,74	50,21
22	SaMe MF268 Co++	11,33	6,70	4,00	75,98	85,88
23	SaMe MF268 Co++	11,32	6,70	6,00	87,86	94,33
24	SaMe MF268 Co++	11,32	6,70	8,00	94,26	97,05
25	SaMe MF268 ЭДТА	11,31	6,69	4,00	57,94	65,94
26	SaMe MF268 ЭДТА	11,32	6,70	6,00	67,67	74,35
27	SaMe MF268 ЭДТА	11,32	6,70	8,00	72,85	77,69

Пример 23: Повышение целлюлолитической активности обессоленного бульона от Trichoderma reesei с содержанием бета-глюкозидазы Apergillus oryzae при объединении его с ионами металла специфично для смесей, содержащих полипептид GH61A

Полипептид GH61A из Thermoascus aurantiacus, усиливающий целлюлолитическую активность, был получен рекомбинантными методами в Aspergillus oryzae JaL250, в соответствии с процедурой, описанной в WO 2005/074656. Грибной бульон, экспрессирующий бета-глюкозидазу Aspergillus oryzae и целлюлазу из Trichoderma reesei , получали рекомбинантными методами в штамме Trichoderma reesei SMA135-04. Ферментацию проводили с использованием каждого их указанных белков по приведенной ниже процедуре.

Для ферментаций, включающих Aspergillus oryzae, в качалочные колбы на 500 мл добавляли 100 мл среды для качалочных колб. Среда для качалочных колб включала, в расчете на литр, 50 г сахарозы, 10 г KH₂PO₄, 0,5 г CaCl₂, 2 г MgSO₄·7H₂O, 2 г K₂ SO₄, 2 г мочевины, 10 г дрожжевого экстракта, 2 г лимонной кислоты и 0,5 мл раствора металлических микроэлементов. Раствор микроэлементов включал в, расчете на литр, 13,8 г FeSO ₄·7H₂O, 14,3 г ZnSO₄ ·7H₂O, 8,5 г MnSO₄· Н₂О, 2,5 г CuSO₄·5H₂ O, и 3 г лимонной кислоты. В качалочную колбу инокулировали две пробы из твердой чашечной культуры Aspergillus oryzae и проводили инкубацию при температуре 34°C на угловой качалке со скоростью 200 об/мин в течение 24 часов. Использовали пятьдесят мл бульона для качалочных колб для инокуляции в 3-литровый резервуар для ферментации, содержащий 1,8 литров среды для проведения периодической ферментации, которая включала, в расчете на литр, 10 г дрожжевого экстракта, 24 г сахарозы, 5 г (NH₄)₂SO ₄, 2 г KH₂PO₄, 0,5 г CaCl₂ ·2H₂O, 2 г MgSO₄· 7H₂O, 1 г лимонной кислоты, 2 г K₂SO ₄, 0,5 мл пеногасителя и 0,5 мл раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов включал, в расчете на литр, 13,8 г FeSO ₄·7H₂O, 14,3 г ZnSO₄ ·7H₂O, 8,5 г MnSO₄· H₂O, 2,5 г CuSO₄·5H₂ O, и 3 г лимонной кислоты. Подаваемая для ферментации среда включала мальтозу и пеногаситель. Указанную среду для ферментации вводили дозами со скоростью от 0 до 4,4 г/л/час в течение 185 часов. Резервуар для проведения ферментации поддерживали при температуре 34°C и в условиях контролируемого pH, который устанавливали на уровне 6,1+/-0,1. Воздух подавали в резервуар со скоростью 1 ед. объемн. жидкости/мин и бульон перемешивали импеллером Раштона со скоростью 1100-1300 об/мин.

Ферментации, включающие Trichoderma reesei, проводили по процедуре примера 20.

Образцы неочищенного бульона осветляли за счет удаления клеточных остатков путем центрифугирования в течение примерно 20 минут при 9500×g. Осветленные образцы бульона далее фильтровали с использованием полиэфирсульфоновой мембраны с размером пор 0,22 мкм MILLEX® GP Express . Далее профильтрованные бульонные образцы обессоливали с использованием колонки для обессоливания HIPREP 26/10. Концентрации белка определяли в обессоленном материале с помощью набора для анализа белка BCA^TM, где в качестве стандартного белка использовали бычий сывороточный альбумин и рассчитывали количество белка в фильтрованном бульоне. Аликвоты образцов в типичном случае анализировали в 8-16% SDS-PAGE гелях CRITERION (200 V в течение 1 часа), с использованием стандартов на молекулярный вес PRECISION PLUS PROTEIN . Гели окрашивали кумасси красителем BIO-SAFE для визуализации белка (и далее обесцвечивали деионизированной водой). Белки также подвергали обессоливанию согласно указанной выше процедуре, для удаления ионов металла, растворенных в ферментативных бульонах, что в таблицах 3-4 обозначено соответствующим индексом ds.

Гидролиз PCS проводили в колбах Эрленмейера с закручивающимися крышками на 125 мл с использованием общей массы реакционной среды 50 г, в соответствии с протоколом лабораторного анализа NREL (NREL Laboratory Analytical Protocol #008). В рамках данного протокола, гидролиз PCS (примерно 11,3% в PCS и 6,7% целлюлозы в водном 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,0) проводили при наличии постоянного количества общего белка (которое выражали в виде мг фермента на грамм целлюлозы) в ферментативном бульоне от Trichoderma reesei, который содержал бета-глюкозидазу Aspergillus oryzae, при добавлении и без добавления полипептида GH61A из Thermoascus aurantiacus, а также без добавления ионов двухвалентного металла и при их добавлении до конечной концентрации 1 мМ в форме, показанной в таблице 2. Тестирование гидролизующей способности PCS проводили по процедуре, описанной в примере 22. Степень преобразования целлюлозы в сахара, глюкозу, плюс целлобиозу (% преобразования) рассчитывали с использование уравнения, описанного в примере 22.

Перед каждым экспериментом делали свежие разведения фермента на основе концентрированных растворов ферментов, которые хранили при температуре 4°C.

Результаты, приведенные в Таблице 3, показывают, что добавление только 1 мМ двухвалентных катионов не повышает уровень преобразования глюкозы относительно варианта, проводимого с эквивалентными количествами ферментативного бульона без включения полипептида GH61A Thermoascus aurantiacus, усиливающего целлюлолитическую активность. Аналогично, включение полипептида GH61A без добавления катионов двухвалентного металла не повышало уровень преобразования глюкозы. Результаты 72-часового гидролиза проиллюстрированы на графике на фиг. 17.

Таким образом, добавление 1 мМ MnSO₄ или CaCl₂ к растворам, содержащим целлюлазу, в сочетании с полипептидом GH61A Thermoascus aurantiacus, усиливающим целлюлолитическую активность, повышало выход глюкозы и целлобиозы при гидролизе предварительно обработанной кислотой кукурузной соломы (PCS). Указанное повышение зависело от наличия полипептида GH61A Thermoascus aurantiacus. Добавление 1 мМ других металлов, таких как Zn⁺⁺ и Fe⁺⁺, или хелатирование металлов при добавлении 1 мМ ЭДТА снижало выход глюкозы и целлобиозы при гидролизе предварительно обработанной кислотой кукурузной соломы (PCS).

Таблица 3
Эксперимент	Смесь ферментов и металла	Преобразование 72 часа	Преобразование 120 часов
56	dsSMA135	54,42	62,65
58	dsSMA135 Ca++	55,48	61,52
60	dsSMA135 Mn++	45,19	60,11
62	dsSMA135 ЭДТА	49,65	59,52
64	dsSMA135 Zn++	37,61	43,59
65	dsSMA135 + GH61A	56,97	76,41
66	dsSMA135 + GH61A Ca++	63,23	77,79
67	dsSMA135 + GH61A Mn++	67,43	84,02
68	dsSMA135 + GH61A ЭДТА	49,03	57,49
69	dsSMA135 + GH61A Zn++	47,39	58,01

Пример 24: Повышение целлюлолитической активности бульона от Trichoderma reesei, содержащего белок слияния бета-глюкозидазы Apergillus oryzae и полипептид GH61A Thermoascus aurantiacus в сочетании с MnSO₄и MgCl₂

Полипептид GH61A Thermoascus aurantiacus, усиливающий целлюлолитическую активность, и слитый белок, состоящий из ядерного белка GH45A Humicola insolens в сочетании с бета-глюкозидазой Aspergillus , получали рекомбинантными методами в Trichoderma reesei SaMe MF268, как описано в примере 20.

Образцы неочищенного бульона осветляли путем удаления клеточных остатков центрифугированием в течение примерно 20 минут при 9500×g. Затем осветленные образцы бульона фильтровали с использованием полиэфирсульфоновой мембраны MILLEX® GP Express с размером пор 0,22 мкм. Далее профильтрованные бульонные образцы обессоливали с использованием колонки для обессоливания HIPREP 26/10. Концентрации белка определяли в обессоленном материале с помощью набора для анализа белка BCA^TM, где в качестве стандартного белка использовали бычий сывороточный альбумин и рассчитывали получение белка в фильтрованном бульоне. Аликвоты образцов в типичном случае анализировали в 8-16% SDS-PAGE гелях CRITERION (200 В в течение одного часа) с использованием стандартов на молекулярный вес PRECISION PLUS PROTEIN . Гели окрашивали кумасси красителем BIO-SAFE для визуализации белка (и затем обесцвечивали деионизированной водой). Белки также подвергали обессоливанию по указанной выше процедуре для удаления ионов металла, растворенных в ферментативных бульонах.

Гидролиз PCS проводили в колбах Эрленмейера с закручивающимися крышками на 125 мл с использованием общей массы реакционной смеси 50 г, в соответствии с протоколом лабораторного анализа NREL (NREL Laboratory Analytical Protocol #008). Согласно данному протоколу, гидролиз PCS (примерно 11,3% в PCS и 6,7% целлюлозы в водном 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,0) проводили при наличии постоянного количества общего белка (которое выражали в виде мг фермента на грамм целлюлозы) в обессоленном или не обессоленном ферментативном бульоне от Trichoderma reesei , содержащем слитый белок бета-глюкозидазы Aspergillus oryzae , и без полипептида GH61A Thermoascus aurantiacus, при повышенной конечной концентрации MnO₄ и MgCl₂ , как показано в Таблице 4. Тестирование гидролизующей способности PCS проводили по процедуре, описанной в примере 22. Степень преобразования целлюлозы в сахара, глюкозу и целлобиозу, (% преобразования) рассчитывали с использованием уравнения, приведенного в примере 22.

Перед каждым экспериментом делали свежие разведения ферментов на основе концентрированных растворов ферментов, которые хранились при температуре 4°C.

Результаты, приведенные в таблице 4, показывают, что добавление возрастающей концентрации MnSO₄ и MgCl_2, от 0,001, 0,01, 0,1, 1 или до 10 мМ повышает уровень преобразования глюкозы относительно результата, наблюдаемого при использовании эквивалентных количеств Trichoderma reesei SaMe MF268 без MnSO₄. Аналогично, добавление MnSO₄ в возрастающих концентрациях, составляющих 0,001, 0,01, 0,1, 1, или 10 мМ, не приводит к повышению, вплоть до концентрации 1 мМ, при добавлении к обессоленному ферментативному бульону от Trichoderma reesei SaMe MF268. Результаты 72 часового гидролиза проиллюстрированы на фиг. 18.

Таким образом, добавление MnSO₄ и MgCl₂ , каждого из ионов металла до конечной концентрации 0,001, 0,01, 0,1, 1 или 10 мМ, к раствору, содержащему ферментативный бульон от Trichoderma reesei SaMe MF268, повышало выход глюкозы и целлобиозы при гидролизе предварительно обработанной кислотой кукурузной соломы (PCS). Добавление MnSO₄ и MgCl ₂ до конечной концентрации 1 мМ или 10 мМ к растворам, содержащим обессоленный ферментативный бульон от Trichoderma reesei SaMe MF268, повышало, таким образом, выход глюкозы и целлобиозы при гидролизе предварительно обработанной кислотой кукурузной соломы (PCS).

Таблица 4
Эксперимент	Смесь ферментов и металла	Фактическое содержание биомассы (вес.%)	Фактическое содержание целлюлозы (вес.%)	Фактическое содержание общего белка, мг/г целлюлозы	Преобразование 72 часа	Преобразование 120 часов
46	SaMe MF268 SaMe MF268	11,32	6,70	4,03	69,20	80,61
47	0,01 мМ ионы SaMe MF268 0,1	11,32	6,70	4,03	73,56	82,98
48	0,1 мМ ионы SaMe MF268	11,31	6,69	4,03	74,59	84,82
49	1 мМ ионы SaMe MF268	11,21	6,63	4,03	75,62	84,56
50	10 мМ ионы	10,23	6,09	4,03	76,02	84,45
51	dsSaMe MF268 dsSaMe MF268	11,32	6,70	4,02	70,93	79,11
52	0,01 мМ ионы dsSMe MF268	11,32	6,70	4,02	71,16	83,63
53	0,1 мМ ионы dsSaMe MF268	11,31	6,69	4,02	70,88	83,30
54	1 мМ ионы dsSaMe MF268	11,21	6,63	4,02	74,90	83,22
55	10 мМ ионы	10,29	6,09	4,02	74,17	79,01

Депонирование биологического материала

Приведенный ниже биологический материал был депонирован на условиях Будапештского Договора в Коллекции запатентованных культур для сельскохозяйственного применения в Северном региональном исследовательском Центре в штате Иллинойс (Northern regional research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604), и указанному материалу были присвоены следующие номера доступа:

Депонированный штамм	Номер доступа	Дата депонирования
Штамм E. coli pEJG120	NRRL B-30699	19 декабря 2003 г.
Штамм E. coli pTter61C	NRRL B-30823	21 января 2005 г.
Штамм E. coli pTer61D	NRRL B-30812	21 января 2005 г.
Штамм E. coli pTer61E	NRRL B-30814	21 января 2005 г.
Штамм E. coli pTer61G	NRRL B-30811	21 января 2005 г.
Штамм E. coli pDZA2-7	NRRL B-30704	30 января 2004 г.
Штамм E. coli pTr3337	NRRL B-30878	20 сентября 2005 г.
E. coli TOP10 (pEJG113)	NRRL B-30695	17 октября 2003 г.
E. coli TOP10 pKKAB	NRRL B-30860	8 июля 2005 г.
NN049573	DSM 14240	19 апреля 2001 г.

Штаммы были депонированы в соответствии с условиями, которые гарантировали, что доступ к культурам будет возможен в ходе рассмотрения данной патентной заявки для тех, кто получит разрешение представителя Отдела патентов и Товарных Знаков, и такие лица должны соответствовать условиям, установленным в 37 C.F.R. §1.14 и 35 U.S.C. §122. Указанные депозиты представляют собой по существу чистые культуры депонированных штаммов. Указанные депозиты доступны по запросу в соответствии с патентными законодательствами других стран, где зарегистрированы авторы данной патентной заявки или их правопреемники. Однако следует понимать, что доступность к депозиту не отменяет необходимости лицензии для целей практического применения настоящего изобретения в обход патентных прав, предоставляемых правительственным соглашением.

Настоящее изобретение, представленное в тексте описания и в формуле изобретения, не ограничивается по тематике специфическими аспектами, указанными конкретно в данном описании, поскольку все эти аспекты были приведены лишь в качестве иллюстрации возможностей настоящего изобретения. Любые эквивалентные аспекты рассматриваются как входящие в область настоящего изобретения. Фактически, различные модификации настоящего изобретения, в дополнение к тем, что были показаны и явно описаны в заявке, станут очевидными для специалистов в данной области на основе приведенного описания. Такие модификации также входят в область предлагаемой формулы изобретения. На случай возникновения спорных вопросов, в текст настоящего изобретения включены определения, которые могут использоваться для разрешения таких конфликтов.

Содержание различных работ, приведенных в настоящем описании, включено в настоящее описание полностью в качестве ссылки.