штамм bacillus thuringiensis var. darmstadiensis n 25 в качестве средства комплексного воздействия на вредных жесткокрылых насекомых и фитопатогенные грибы

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. Darmstadiensis № 25, депонированный в коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии (Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения) под регистрационным номером RCAM01490, в качестве полифункционального средства защиты растений от вредных жесткокрылых насекомых и фитопатогенных грибов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для защиты растений от вредителей и болезней.

Защита селькохозяйственных растений овощных, зерновых и плодовых культур от болезней и вредных насекомых является серьезной экономической проблемой. Ежегодные потери сельского хозяйства достигают нескольких миллиардов рублей (Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., Патыка В.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis. Санкт-Петербург, Пушкин, 2009 г., 245 с.).

К числу наиболее опасных вредителей относятся жесткокрылые насекомые, в частности колорадский жук, который поражает картофель, баклажаны, томаты. Заселенность кустов пасленовых культур в разные годы может достигать 50-70%, а потери урожая 25-35%. Для борьбы с колорадским жуком часто используются химические инсектициды, которые не обладают избирательностью действия. Они могут накапливаться в окружающей среде и тем самым ухудшают экологическую обстановку. На основе бактерий группы Thuringiensis создан ряд энтомоцидных биопрепаратов: Лепидоцид, Битоксибациллин, Дендробациллин, Колорадо, однако они не охватывают целой группы массовых вредоносных видов жесткокрылых насекомых.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis spp. thuringiensis для производства экзотоксинсодержащих биоинсектицидов» по патенту № 2061376, заявка 93034131 с приоритетом от 07.07.1993 г., МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликовано 10.06.1996 г.

В патенте описан штамм бактерий Bacillus thuringiensis 16-T50, депонированный в ВКПМ под № В-6404, который получен из штамма 98 путем многоступенчатой селекции по признакам экзотоксинообразования, термостабильности спор и фагоустойчивости. Приведен пример получения культуральной жидкости на основе указанного штамма.

Известно изобретение «Штамм Bacillus thuringiensis - продуцент эндотоксина против жесткокрылых насекомых и способ его культивирования» по патенту № 2108384, заявка 95111008 с приоритетом от 27.06.1995 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 10.04.1998 г.

В патенте описан штамм бактерий Bacillus thuringiensis 16931, который выделен из мертвой озимой совки и депонирован в ВКПМ под № В-6649; описан также способ его культивирования. Показано, что этот штамм эффективен против жесткокрылых насекомых, в т.ч. против колорадского жука.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis H8, предназначенный для борьбы с жесткокрылыми насекомыми» по патенту № 2204598, заявка 2001128487 с приоритетом от 23.10.2001 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 20.05.2003 г.

В патенте описан штамм бактерий Bacillus thuringiensis H8, депонированный в ВКПМ № В-8057, который получен из штамма Bacillus thuringiensis H8 ВКПМ № В-6306 путем многоступенчатой селекции по признакам повышенного синтеза токсина против вредных жесткокрылых насекомых, в частности колорадского жука, и пониженного уровня спорообразования для предотвращения загрязнения окружающей среды спорами при применении биопестицида на основе этого штамма. Приведен пример получения культуральной жидкости на основе штамма ВКПМ В-8057.

Для борьбы с возбудителями болезней растений грибного или бактериального происхождения широко используются химические средства: Фундазол, Альто, Фоликур и др. Эффективность их не более 50-60% и они могут вызывать резистентность у возбудителей болезней, способны накапливаться в окружающей среде. В настоящее время в качестве альтернативных средств защиты растений интенсивно разрабатывается применение бактерий в качестве антагонистов фитопатогенов, т.е. используются биологические препараты, основу которых составляют метаболиты бактериального происхождения, проявляющие антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам: Флавобактерин, Мизорин, Агат-25, Бактофит и др. (Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Изучение действия биопрепаратов на основе Bacillus thuringiensis на фитопатогенные грибы. Вестник защиты растений, № 1, 2010. С.27-35).

Известно также изобретение « Консорциум штаммов - антагонистов для борьбы с бактериальными и грибковыми болезнями растений» по патенту № 2149552, заявка 98111359 с приоритетом от 15.06.1998 г., МПК A01N 63/00, C12N 1/20, С12Р 39/00, опубликовано 27.05.2000 г.

Консорциум, состоящий из четырех штаммов почвенных бактерий-антагонистов: Bacillus polymixa, Bacillus thuringiensis, Pantoea agglomerans, Pantoea chlororatis, предназначен для получения препарата против бактериальных и грибных болезней растений. Препарат на основе указанного консорциума штаммов бактерий может быть использован для эффективного подавления развития серой гнили и мучнистой росы у томата и огурца, бактериального рака у клевера, сосудистого бактериоза у капусты, угловатой пятнистости у огурца, фузариозного увядания у томата, гельминтоспороза у ячменя, корневых гнилей у хлопчатника. Пестицидная активность препарата сравнима с активностью химических агентов.

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis, проявляющий фунгицидную активность, инсектицидную активность и подавляющий вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Ervina carotovorola» по патенту № 2347809, заявка 2007132825 с приоритетом от 31.08.2007 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано 27.02.2009 г.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis получен путем многоступенчатой селекции из материала, выделенного из природных образцов, и депонирован под номером ВКПМ В-9790. Этот штамм обладает множественной пестицидной активностью, а именно: инсектицидной и фунгицидной активностью против личинок жесткокрылых насекомых (колорадского жука, большого мучного хрущака, щавелевого и калинового листоедов), а также способностью подавлять проявления вирулентных свойств фитопатогенных бактерий Ervina carotovorola spp. carotovorola.

Известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis H10 № 109 (BtH₁₀ № 109) - продуцент бацикола, совмещающий инсектицидные и антифунгальные свойства (Кандыбин Н.В., Смирнов О.В., Барбашова Н.М. Новый энтомоцидный препарат со специфическим действием на жесткокрылых. // Материалы Всероссийского научно-производственного совещания, Краснодар 21-24 августа 1994 г. Ч. 2. Пущино, 1994. С.179-181) - прототип.

Результаты изучения влияния штамма бактерий Bacillus thuringiensis H10 № 109 (BtH₁₀ № 109) - продуцента бацикола на фитопатогенные грибы опубликованы в статьях:

- Гришечкина С.Д., Смирнов О.В., Кандыбин Н.В. Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillus thuringiensis // Микология и фитопатология. Том 36, вып.1, 2002 г., Грибы - возбудители болезней;

- Гришечкина С.Д., Смирнов О.В. Вегетационная и полевая оценка антифунгального эффекта Bacillus thuringiensis // Вестник защиты растений. Всероссийский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук. Санкт-Петербург, Пушкин, 2010 г. № 3. С 44-49.

Задачей заявляемого изобретения является получение штамма на основе экологически безопасной бактерии из группы Bacillus thuringiensis с полифункциональными свойствами: высокой инсектицидной и антифунгальной активностью в отношении широкой группы массовых вредоносных видов жесткокрылых насекомых и ростостимулирующим действием на растения, пригодного для создания высокоэффективного энтомоцидного препарата.

Задача решается тем, что в качестве средства для получения энтомоцидного препарата полифункционального действия с инсектицидной и антифунгальной активностью и ростостимулирующими свойствами используют штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25.

Штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 (BtH₁₀ № 25) выделен из трупов колорадского жука в Ленинградской области и депонирован 12.09.2012 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ) ГНУ ВНИСХМ под регистрационным номером RCAM01490, что подтверждается справкой о депонировании от 30.10.2012 г. (Справка прилагается).

Штамм BtH₁₀ № 25 обладает выраженными энтомоцидными свойствами против жесткокрылых насекомых - фитофагов. Выявлены также антифунгальные и ростостимулирующие свойства штамма.

Штамм BtH ₁₀ № 25 характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства.

Вегетативные клетки грамположительные, палочковидной формы размером 1,2-1,5×2,5-4,5 мкм, единичные с перитрихиальным типом жгутикования. Образуют наряду со спорой параспоральный кристалл тетрагональной, бипирамидальной или овоидной формы размером 0,2-0,6×0,3-0,8 мкм (длина края). Споры овальные, субтерминальные размером 0,6-0,8×1,4-1,6 мкм. В клетке образуется одна спора и один кристалл эндотоксина. В рыбном бульоне (РБ) рост хороший, образует пленку. При выращивании штамма на рыбном агаре (РА) через 48 ч при 28-30°С образует колонии плоские, шероховатые серовато-белого цвета неправильной округлой формы, непрозрачные. Диаметр колоний 8-10 мм. На ломтиках картофеля рост умеренный серовато-зеленого цвета. При культивировании в жидких питательных средах штамм растет при температуре 20-36°С (оптимум 28-32°С) и при показателе кислотности среды рН 6,2-8,0 (оптимум 6,8-7,2) со встряхиванием на качалке 220 об/мин. Образование спор и кристаллов эндотоксина заканчивается через 60-72 часов роста.

Биохимические свойства.

Факультативный анаэроб.

Хорошо развивается на средах, содержащих органический азот: пептон, гидролизат казеина, рыбный бульон, кормовые дрожжи.

Из глюкозы, мальтозы, целлобиозы образует кислоту, но не газ. Не усваивает галактозу, арабинозу, маннозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, раффинозу, манит, сорбит, дульцит, инозит, инулин.

Гидролизует эскулин и крахмал, салицин не расщепляет, цитрат натрия не использует в качестве единственного источника углерода. Образует амилазу, протеиназу, каталазу и нитратредуктазу. Не образует лецитиназу, уреазу, лизиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, индол и сероводород.

Пигмента не образует.

Штамм продуцирует водорастворимый термостабильный экзотоксин.

Антигенные свойства.

Дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (идентифицирован по этой реакции и по классификации Bacillus thuringiensis (1962, 1967, 1990) H. de Barjack. По серологическим свойствам относится к 10 серотипу Bacillus thuringiensis.

Штамм устойчив к основным производственным фагам: М, К, Э-5, Д₂-Д₅.

По показателям вирулентности, токсичности и токсигенности штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 (BtH₁₀ № 25) не патогенен для теплокровных животных, относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Штамм BtH₁₀ № 25 растет на питательных дрожжеполисахаридных средах на основе соевой муки, кукурузного крахмала, кормовых дрожжей.

Штамм хранится на скошенном рыбном агаре в пробирках при 4-5°С с периодическим пересевом 1 раз в 6 месяцев, в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах и методом криоконсервирования в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM).

Штамм BtH ₁₀ № 25 проявляет инсектицидную активность против ряда опасных вредителей сельскохозяйственных культур - жесткокрылых насекомых (Coleoptera), таких как: колорадский жук, крестоцветные и хлебные блошки, пьявица, землянично-малинный долгоносик, гречишный долгоносик, рапсовый цветоед, листоеды (горчичный, рапсовый, хреновый, капустный и ильмовый) и др.

Штамм BtH₁₀ № 25 характеризуется широким спектром антифунгальной активности и подавляет развитие целого ряда фитопатогенных грибов: Botrytis cinerea Pers., Pythium spp., Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, Verticillum dahliae Kleb., Rhizoctonia solani Kuhn, Alternaria alternata (Fries), Keissl, Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary, Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., F.oxysporum (Schlecht.), Snyd. et Hans., F. solani App. et Wr.

На основе штамма BtH₁₀ № 25 разработана технология получения нового энтомоцидного биопрепарата.

Пример получения препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25.

Сначала в колбах (1 л) готовят дрожжеполисахаридную питательную среду следующего состава, %: мука соевая - 2,5; крахмал кукурузный - 2,5; дрожжи кормовые - 0,5; K₂HPO ₄ - 0,3; MgSO₄×7H₂O - 0,02; CaCl₂×2H₂O - 0,01; остальное (до 100) - вода. До стерилизации рН среды - 7,4-7,8.

Подготовленную среду разливают в колбы Эрленмейера по 40-50 мл и стерилизуют в автоклаве при температуре +(120-125)°С в течение 30 минут. После стерилизации рН среды 6,8-7,2. Стерильную питательную среду охлаждают до 30-35°С и засевают культурой штамма из пробирки, для чего в пробирку с культурой на скошенном РА вносят 5-8 мл стерильной воды или физиологического раствора. Этой же пипеткой осторожно растирают культуру, взбалтывают до гомогенной суспензии и вносят в колбы по 0,2-0,5 мл. Культуру в колбах выращивают на качалке при 220-250 об/мин и температуре 28-30°С в течение 56-72 часов до полного высыпания спор и образования кристаллов эндотоксинов (проверку осуществляют мироскопированием). Выращенную в колбах культуральную жидкость штамма BtH₁₀ № 25 используют для засева среды в ферментерах.

Для выращивания культуры в ферментере может быть использована любая дрожжеполисахаридная питательная среда, оптимально - того же состава, который был использован для получения культуральной жидкости в колбах Эрленмейера (состав указан выше). В ферментере любой емкости, заполненном на 50% водой, сначала растворяли соли, затем заваривали расчетное количество кукурузного крахмала при 80-85°С, охлаждали до 40°С, добавляли расчетное количество соевой муки, кормовых дрожжей и перемешивали с водой в течение 20 минут. Доводили рН среды до 8,0 с помощью 40% едкого натра (каустической соды). Затем питательную среду нагревали до 80-85°С, выдерживали температуру в течение 30 минут и стерилизовали при 1 атм в течение 1 часа, после чего охлаждали до температуры 32-35°С. Перед внесением посевного материала из ферментера брали пробу среды для контроля стерильности. При просмотре под микроскопом в поле зрения не должно быть наличия микроорганизмов.

После этого в питательную среду в ферментере вносили 1-2% культуральной жидкости из колб Эрленмейера.

Процесс выращивания культуры в ферментере вели при 28-30°С, непрерывном перемешивании среды при помощи мешалки, давлении в ферментере 0,2-0,4 атм и соответствующей аэрации:

с 0-3 час - только перемешивание;

с 3-12 час - 0,5 V воздуха/V среды/мин;

с 12-42 час - 1,0 V воздуха/V среды/мин;

с 42 час до окончания ферментации - 0,5 V воздуха/V среды/мин.

То есть процесс ферментации проводили в условиях высокой аэрации и закончили при достижении содержания свободных спор и кристаллов эндотоксинов до 80-90% от общего количества включений при их соотношении 1:1. Титр спор определяли общепринятым методом серийных разведений. При этом титр спор штамма BtH ₁₀ № 25 в полученном препарате составляет не менее (3,8-4,0)·10 ⁹ спор/мл при отсутствии посторонней микрофлоры и вирулентного фага.

Таким образом был получен биопреперат на основе штамма BtH₁₀ № 25, представляющий собой жидкость, легко разбавляемую водой до необходимой рабочей концентрации, удобной для применения серийной опрыскивающей аппаратуры. Технология его производства не требует больших энергозатрат, необходимых для сушки при получении препаратов сухой формы.

Были проведены лабораторные испытания инсектицидной эффективности препарата на основе штамма BtH ₁₀ № 25 по отношению к массовым насекомым - фитофагам сельскохозяйственных культур.

Лабораторные определения энтомоцидной активности препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 проводили на личинках колорадского жука 2-го возраста. При этом корм (листья картофеля) обрабатывали водной суспензией штамма в концентрациях 5, 1 и 0,2%. В каждый вариант опыта сажали по 25 личинок колорадского жука 2-го возраста (в четырехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH₁₀ № 109 (Бацикол) и BtH₁ 800 (Битоксибациллин жидкий, без сушки), при тех же концентрациях. Учет гибели личинок колорадского жука проводили на 7 день.

Содержание экзотоксина в препарате определяли на личинках комнатной мухи по следующей методике.

Препарат на основе штамма BtH₁₀ № 25 в количестве 20 мл центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Полученный фугат автоклавировали при давлении 0,1 МПа и температуре 105°С в течение 20 мин. Затем готовили разведения препарата: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32, что соответствует концентрациям 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкл/г корма. Каждую концентрацию испытывали в четырех параллельных определениях.

Для испытания в стеклянную банку вместимостью 200 мл вносили: 2 мл препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 соответствующего разведения; 11 мл 2,5%-водной суспензии сухого молока; 7 г стерилизованных пшеничных отрубей. В контрольном опыте в банки вместо разведенного препарата вносили 2 мл стерильной воды. Корм с соответствующими разведениями препарата в каждой банке тщательно перемешивали и помещали туда по 25 личинок комнатной мухи, отверстия банок завязывали бязью и содержали в термостате при температуре (28±1)°С и относительной влажности 70-85%. На 5-е сутки выбирали пупарии и оставляли в тех же условиях до вылета мух.

Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH₁₀ № 109 (Бацикол) и BtH₁ 800 (Битоксибациллин жидкий, без сушки), при тех же концентрациях.

Активность экзотоксина оценивали по числу погибших на 8 день мух с поправкой на гибель в контроле определяли по формуле:

Х=(К-В)/К×100, где

К - количество мух, вылетевших в контроле;

В - количество мух, вылетевших в опыте.

По результатам указанных выше лабораторных опытов для каждого случая был определен показатель ЛК₅₀ - доза препарата (в %, в мкл/г корма, в кг, в мл и пр.), которая вызывает 50% гибели насекомых.

Значение ЛК₅₀ рассчитывали по формуле Кербера (см., например, монографию «ЭКОЛОГИЯ BACILLUS THURINGIENSIS» авторов В.Ф.Патыка, Т.И., Патыка, Киев, изд. ПГАА, 2007 г., 217 стр.):

Lg ЛК ₅₀=lg С_м- ( L₁-0,5),

где С_м - максимальная из испытанных концентраций;

- логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведений);

L₁ - сумма отношений числа насекомых, которые погибли от данной концентрации, к общему числу насекомых, которые подверглись действию этой концентрации.

Результаты энтомоцидной активности и образования экзотоксина (значения ЛК ₅₀), полученные в указанных опытах, для препаратов на основе штамма BtH₁₀ № 25, штамма-прототипа BtH₁₀ № 109 (Бацикол) и аналога BtH₁ 800 (Битоксибациллин жидкий, без сушки), представлены в таблице 1.

Таблица 1
Биологическая активность штаммов на основе BtH
Препарат на основе штамма	Энтомоцидная активность: ЛК50, для L2 колорадского жука, %	Содержание экзотоксина: ЛК50 для L2 комнатной мухи, мкл/г корма
BtH10 № 25	0,27	2,98
BtH10 № 109	0,38	4,79
BtH1 № 800	0,29	3,05

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что препарат на основе штамма BtH₁₀ 25 по энтомоцидной активности для личинок колорадского жука в 1,4 раза эффективнее препарата на основе штамма-прототипа BtH ₁₀ 109, а по содержанию экзотоксина он превосходит его в 1,6 раза. Сравнение штамма BtH₁₀ 25 со штаммом BtH ₁ 800 показывает, что по энтомоцидной активности и по содержанию экзотоксина они являются близкими аналогами.

Были проведены лабораторные опыты по определению инсектицидной активности штамма ВТН₁₀ № 25 в отношении листоедов (Chrysomelidae): рапсового, капустного, хренового, восточного горчичного, ильмового.

Сначала способом, описанным выше в Примере, получали препарат на основе штамма ВТН₁₀ № 25, который затем разводили дистиллированной водой до концентраций: 1,0; 0,2 и 0,04%. Листья рапса, хрена, горчицы, капусты, ильма окунали в препарат в чашках Петри в соответствующих разведениях. После подсушивания черенки листьев обматывали влажным тампоном, помещали в пенициллиновые флаконы с водой и переносили в кристаллизаторы. На листья каждого варианта растения сажали по 25 личинок соответствующих листоедов, кристаллизаторы покрывали марлей или бязевой салфеткой. Опыты ставили при комнатной температуре, каждый вариант опыта в трехкратной повторности. Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH ₁₀ № 109 (Бацикол) при тех же концентрациях. Инсектицидность штаммов оценивали по количеству (дозе) препарата, вызывающему 50% гибели личинок (ЛК₅₀) на 5-е сутки опыта. Результаты опытов приведены в таблице 2.

Таблица 2
Инсектицидная активность штаммов BtH10 в отношении листоедов
Препарат на основе штамма	Доза препарата, вызывающего 50% гибели личинок, (ЛК50), %
	Восточный горчичный листоед	Рапсовый листоед	Капустный листоед	Хреновый листоед	Ильмовый листоед
BtH10 № 25	0,062	0,056	0,05	0,06	0,07
BtH 10 № 109	0.086	0,077	0,064	0,08	0,09

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой энтомоцидной активности штамма BtH₁₀ № 25 против личинок листоедов на разных культурах. При этом активность штамма BtH₁₀ № 25 в 1,3-1,4 раза превосходит активность штамма-прототипа BtH₁₀ № 109.

Эффективность препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 была также проверена в полевых условиях на картофеле против колорадского жука в хозяйствах Ленинградской области: ЗАО «Предпортовый», ОПХ «Суйда», а также Ставропольского края (СТАЗР) на площади 1 га; 0,5 га и 3 га соответственно.

Посевы картофеля, заселенные колорадским жуком с соотношением личинок по возрастам: L₁=58,6%; L ₂=36,5%; L₃=4,9%, обрабатывали жидким препаратом, полученным описанным выше в Примере способом на основе штамма ВТН₁₀ № 25. Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препараты на основе штамма-прототипа BtH₁₀ № 109 (Бацикол) и штамма-аналога BtH₁ 800 (Битоксибациллин жидкий, без сушки), при тех же концентрациях. Среднее значение личинок на 25-ти кустах учитывали до обработки и на 5-й и 10-й дни после обработки. Обработку выполняли тракторным опрыскивателем, доза препарата 15-20 л/га, расход рабочей жидкости 400 л/га. Результаты полевых опытов в хозяйствах Ленинградской области и Ставропольского края приведены в таблице 3.

Таблица 3
Эффективность препаратов на основе штаммов BtH на картофеле против колорадского жука в полевых опытах
Препарат на основе штамма	Площадь, га	Доза препарата, л/га	Гибель личинок, %:
			через 5 суток	через 10 суток
ЗАО «Предпортовый» Ленинградской обл.
BtH10 № 25	1,0	20,0	80,2	98,9
BtH10 № 109	1,0	20,0	60,4	88,4
BtH1 № 800	1,0	20,0	63,5	89,2
ОПХ «Суйда» Ленинградской обл.
BtH10 № 25	0,5	15,0	75,9	99,1
BtH10 № 109	0,5	15,0	68,5	86,5
BtH1 № 800	0,5	15,0	64,7	87,3
Ставропольский край (СТАЗР)
BtH10 № 25	3,0	15,0	83,5	97,9
BtH10 № 109	3,0	15,0	70,1	86,3
BtH1 № 800	3,0	15,0	72,3	88,0
Контроль без обработки				Увеличение численности в 1,52 раза

Данные таблицы 3 свидетельствуют о высокой эффективности препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 против колорадского жука, превышающей эффективность препаратов на основе штаммов-аналогов.

Были проведены также вегетационно-полевые испытания препаратов на основе штамма BtH₁₀ № 25, полученного указанным выше способом, штамма-прототипа BtH₁₀ № 109 и штамма-аналога BtH₁ № 800 на землянике до цветения против землянично-малинного долгоносика на участке площадью 100 м². Использовали ручной опрыскиватель, расход препарата - 10 л/га, расход рабочей жидкости - 400 л/га. Поражение растений земляники долгоносиком учитывали до обработки и на 10-й, 20-й дни после обработки препаратом.

Результаты опыта приведены в таблице 4.

Таблица 4
Эффективность препаратов на основе штаммов BtH против землянично-малинного долгоносика
Препарат на основе штамма	Поражение земляники, %
	До обработки	10-й день	20-й день
BtH10 № 25	6,1	6,8	9,4
BtH 10 № 109	5,9	7,9	14,4
BtH 1 № 800	5,8	14,7	23,5
Контроль (без обработки)	5,3	18,9	28,2

Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о высокой активности препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 против землянично-малинного долгоносика. Поражение земляники долгоносиком при ее обработке препаратом на основе штамма BtH ₁₀ № 25 в 1,5 раза ниже, чем при обработке препаратом на основе штамма-прототипа BtH₁₀ № 109, в 2,5 раз ниже, чем при обработке препаратом на основе штамма BtH₁ № 800, и в 3 раза ниже в сравнении с контролем.

Для оценки инсектицидной активности препарата, полученного на основе штамма BtH₁₀ № 25 указанным выше в Примере способом, против различных видов жесткокрылых насекомых на сельскохозяйственных культурах были проведены полевые опыты. Испытания против крестоцветных блошек, капустного листоеда и капустной совки проводили на участках по 20 м² с брюквой, рапсом, капустой, хреном и на хрене - против хренового листоеда. Для обработки использовали ручной опрыскиватель, расход препарата - 8-12 л/га, расход рабочей жидкости - 400 л/га. Эффективность штамма оценивали по % гибели насекомых на 5-й и 10-й дни после обработки растений препаратом. Результаты опыта приведены в таблице 5.

Таблица 5
Эффективность препарата на основе штамма BtH10 № 25 против различных видов насекомых на сельскохозяйственных культурах
Насекомые	Культура	Доза расхода препарата, л/га	Гибель насекомых, %
			на 5-й день	на 10-й день
Крестоцветные блошки (род Phyllotreata)	Брюква	12	73,4	95,7
	рапс	12	71,6	94,5
Капустная совка (Mamestra brassicae L.)	Капуста	10	89,3	100
Капустный листоед (Phaedon cochleariae F.)	Капуста	8	82,5	98,9
	хрен	10	79,9	99,6

Данные таблицы 5 свидетельствуют о высокой инсектицидной активности препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 против различных видов насекомых на различных сельскохозяйственных культурах.

Антифунгальную активность штамма BtH ₁₀ № 25 против различных фито-патогенных грибов определяли методом агаровых блоков в чашках Петри (Методы экспериментальной микологии / под ред. В.И.Билай. Киев, 1982.). Препарат на основе штамма BtH₁₀ № 25, полученный указанным выше в Примере способом, вносили в расплавленную и охлажденную до 40°С среду Чапека. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 10-суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препараты на основе штамма-прототипа BtH₁₀ № 109 (Бацикол) и BtH₁ 800 (Битоксибациллин жидкий, без сушки) при тех же концентрациях.

Диаметр колоний гриба измеряли через 3 суток. Ингибирующую активность рассчитывали по формуле:

Х=(Д_к-Д_о)/Д _к×100, где

Х - степень ингибирования роста колоний гриба, см;

Д_к и Д _о - диаметр колоний гриба в контроле и опыте соответственно.

Результаты опыта представлены в таблице 6.

Таблица 6
Антифунгальная активность препаратов на основе штаммов BtH
Вид фитопатогенного гриба	Ингибирование роста колоний гриба через 3 сут., %
	BtH10 № 25	BtH10 № 109	BtH1 № 800
Botrytis cinerea Pers	100	83	42
Pythium spp.	86	70	23
Bipolaris sorokiniana	75	61	11
Verticillum dahliae Kleb.	52	49	0
Rhizoctonia solani Kuhn	43	28	9
Alternaria alternata (Fries), Keissl	36	31	0
Fusarium avenaceum (Fr.) (Sacc)	51	44	0
Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans.	53	49	0
F.solani App. et Wr.	26	19	0

Из результатов, представленных в таблице 6, следует, что антифунгальный эффект препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 на 14-17% выше, чем препарата на основе штамма-прототипа BtH₁₀ № 109, и в несколько раз превосходит эффект от препарата на основе штамма 1-го серотипа BtH₁ № 800 по всем представленным видам фитопатогенов. При этом 100% эффект ингибирования роста гриба возникает при действии препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25 на гриб Botrytis cinerea - возбудителя серой гнили.

В вегетационных опытах на томатах (сорт «Грибовский») на инфекционном фоне антифунгальный эффект штамма BtH₁₀ № 25 против гриба Fusarium oxysporum составил 70%, в то время как в контроле пораженность растений достигала 100%.

Оценку фиторегуляторной активности штамма BtH₁₀ № 25, т.е. его способности оказывать на растения ростостимулирующее действие, проводили в лабораторных опытах. Семена сельскохозяйственных растений: томата, капусты, салата, огурца, кабачка перед посевом замачивали на 3 часа в препарате на основе штамма BtH₁₀ № 25, полученном описанным выше в Примере способом, для сравнения - в препарате на основе штамма-прототипа BtH₁₀ № 109, а в контроле - в воде. После замачивания семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги при температуре 26°С и влажности 86%.

Через 5 дней учитывали всхожесть семян, через 3 недели контролировали длину ростков и корней. Результаты опыта представлены в таблице 7.

Таблица 7
Фиторегуляторная активность препаратов на основе штаммов BtH 10 при предпосевном замачивании семян сельскохозяйственных культур
Культу- ра	% к контролю
	Всхожесть семян		Высота проростков		Длина корней
	BtH10 № 25	BtH10 № 109	BtH10 № 25	BtH10 № 109	BtH10 № 25	BtH10 № 109
Томат	104	94	156	143	112	110
Капуста	98	96	149	140	158	150
Салат	110	107	123	113	136	128
Кабачки	135	121	159	140	162	144
Свекла	108	98	103	98	114	102
Огурцы	115	110	104	101	121	106

Результаты испытаний препарата на основе штамма BtH₁₀ № 25, представленные в таблице 7, показали, что этот штамм не обладает фитотоксичностью. Более того, он стимулирует всхожесть семян, рост проростков и корней растений, т.е. обладает ростостимулирующим свойством. При этом фиторегуляторная (ростостимулирующая) активность заявляемого штамма BtH₁₀ № 25 на 3-19% больше, чем у штамма-прототипа BtH₁₀ № 109.

Таким образом, заявляемый штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 (BtH₁₀ № 25) обладает полифункциональными свойствами: высокой инсектицидной и антифунгальной активностью в отношении широкой группы массовых вредоносных видов жесткокрылых насекомых и ростостимулирующим действием на растения и пригоден для производства высокоэффективного энтомоцидного биопрепарата для защиты сельскохозяйственных культур от вредных массовых насекомых-фитофагов и грибов-фитопатогенов.