способы лечения воспалительных заболеваний ободочной кишки

Формула изобретения

1. Способ лечения язвенного колита или болезни Крона у нуждающегося в этом индивидуума, где способ включает введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества прикрепляющихся клеток, происходящих из плаценты, которые не дифференцируются в адипоциты или остеоциты, в результате чего происходит лечение язвенного колита или болезни Крона.

2. Способ п.1, где указанные прикрепляющиеся клетки экспрессируют один или более из CD73, CD90, CD29 или CD105.

3. Способ п.1, где указанные прикрепляющиеся клетки не экспрессируют CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34 или CD79.

4. Способ п.1, где указанные прикрепляющиеся клетки подавляют иммунную реакцию путем подавления активности T-клеток.

5. Способ п.1, где указанные прикрепляющиеся клетки получают из трехмерной (3D) культуры.

6. Способ по п.5, где указанная трехмерная (3D) культура включает 3D-биореактор.

7. Способ по п.5, где культивирование указанных прикрепляющихся клеток в указанной 3D культуре проводят с помощью перфузии.

8. Способ по п.5, где культивирование указанных прикрепляющихся клеток осуществляют в течение по меньшей мере 3 дней.

9. Способ по п.1, где указанные прикрепляющиеся клетки включают культивируемые клетки из плаценты в условиях 2-мерного (2D) культивирования.

10. Способ по п.9, где по меньшей мере 12% указанных прикрепляющихся клеток находятся в S и/или G2/M фазе пролиферации.

11. Применение прикрепляющихся клеток, происходящих из плаценты, которые не дифференцируются в адипоциты или остеоциты, для получения лекарственного средства для лечения язвенного колита или болезни Крона.

12. Применение п.11, где указанные прикрепляющиеся клетки экспрессируют один или более из CD73, CD90, CD29 или CD105.

13. Применение п.11, где указанные прикрепляющиеся клетки не экспрессируют CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34 или CD79.

14. Применение п.11, где указанные прикрепляющиеся клетки подавляют иммунную реакцию путем подавления активности T-клеток.

15. Применение п.11, где указанные прикрепляющиеся клетки получают из трехмерной (3D) культуры.

16. Применение по п.15, где указанная трехмерная (3D) культура включает 3D-биореактор.

17. Применение по п.15, где культивирование указанных прикрепляющихся клеток в указанной 3D культуре проводят с помощью перфузии.

18. Применение по п.15, где культивирование указанных прикрепляющихся клеток осуществляют в течение по меньшей мере 3 дней.

19. Применение по п.11, где указанные прикрепляющиеся клетки включают культивируемые клетки из плаценты в условиях 2-мерного (2D) культивирования.

20. Применение по п.19, где по меньшей мере 12% указанных прикрепляющихся клеток находятся в S и/или G2/M фазе пролиферации.

21. Продукт производства, включающий упаковочный материал, который включает этикетку для использования при лечении язвенного колита или болезни Крона, причем в упаковочный материал упаковано фармацевтически эффективное количество прикрепляющихся клеток, происходящих из плаценты, которые не дифференцируются в адипоциты или остеоциты.

22. Продукт производства п.21, где указанные прикрепляющиеся клетки экспрессируют один или более из CD73, CD90, CD29 или CD105.

23. Продукт производства п.21, где указанные прикрепляющиеся клетки не экспрессируют CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34 или CD79.

24. Продукт производства п.21, где указанные прикрепляющиеся клетки подавляют иммунную реакцию путем подавления активности T-клеток.

25. Продукт производства п.21, где указанные прикрепляющиеся клетки получают из трехмерной (3D) культуры.

26. Продукт производства по п.25, где указанная трехмерная (3D) культура включает 3D-биореактор.

27. Продукт производства по п.25, где культивирование указанных прикрепляющихся клеток в указанной 3D культуре проводят с помощью перфузии.

28. Продукт производства по п.25, где культивирование указанных прикрепляющихся клеток осуществляют в течение по меньшей мере 3 дней.

29. Продукт производства по п.21, где указанные прикрепляющиеся клетки включают культивируемые клетки из плаценты в условиях 2-мерного (2D) культивировния.

30. Продукт производства по п.29, где по меньшей мере 12% указанных прикрепляющихся клеток находятся в S и/или G2/M фазе пролиферации.

31. Продукт производства по п.21, дополнительно включающий иммуносупрессорный агент или противовоспалительный агент.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение, и известный уровень техники

Настоящее изобретение в некоторых вариантах его осуществления относится к способам лечения воспалительных заболеваний ободочной кишки с использованием прикрепляющихся клеток из жировой ткани или ткани плаценты и, более конкретно, но не исключительно, к способам лечения язвенного колита или болезни Крона с использованием прикрепляющихся клеток.

В развивающемся медицинском мире существует растущая потребность в больших количествах стволовых клеток взрослого человека с целью их пересадки и тканевой инженерии. Кроме того, лечение стволовыми клетками взрослого человека постоянно развивается в отношении терапии и лечения различных состояний, таких как гематопоетические нарушения, заболевание сердца, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, удар, ожоги, мышечная дистрофия, аутоиммунные нарушения, диабет и артрит.

В последние годы значительная активность сфокусирована на терапевтическом потенциале мезенхимальных стволовых клеток (MSCs) в плане их различного медицинского применения, включая репарацию тканей поврежденных органов, таких как мозг, сердце, кость и печень, и для поддержки трансплантаций костного мозга (BMT). MSCs, гетерогенная популяция клеток, полученных из, например, костного мозга, жировой ткани, плаценты и крови, способна к дифференцировке в различные типы зрелых мезенхимальных клеток (например, в ретикулярные эндотелиальные клетки, фибробласты, адипоциты, остеогенные клетки-предшественники), в зависимости от влияний различных биологически активных факторов. Соответственно, MSCs широко исследуются в регенеративной медицине в качестве основы для построения новых тканей, таких как кость, хрящ и жировая ткань для репарации повреждения или замещения патологических тканей и в качестве лечения генетических и приобретенных заболеваний. Более того, способность MSCs к мультипотентности, легкость их выделения и культивирования, а также их высокий потенциал экспансии ex vivo делает их привлекательным терапевтическим средством.

Воспалительное заболевание кишечника (IBD), группа воспалительных состояний толстого кишечника и тонкого кишечника включает болезнь Крона и язвенный колит и является хроническим, рецидивирующим и стихающим состоянием неизвестной природы, которое поражает, по меньшей мере, 1 из 1000 людей в западных странах.

Болезнь Крона (также известная как гранулематозный колит и регионарный энтерит), аутоиммунное заболевание, вызываемое поражающим воздействием иммунной системы на желудочно-кишечный тракт и индукцией воспаления в желудочно-кишечном тракте, представляет собой воспалительное заболевание, которое может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта от ротовой полости до ануса, вызывая широкий спектр симптомов. В первую очередь оно вызывает боль в брюшной полости, диарею, рвоту и потерю веса, но может также вызывать осложнения вне желудочно-кишечного тракта, такие как кожная сыпь, артрит и воспаление глаза. В настоящее время не существует известного лекарственного или хирургического лечения болезни Крона, и варианты лечения ограничиваются контролированием симптомов, поддержанием ремиссии и предотвращением рецидива (например, составы 5-аминосалициловой (5-ASA) кислоты, кортикостероиды, такие как преднизон и гидрокортизон, и иммуномодуляторы, такие как азатиоприн и меркаптопурин).

Язвенный колит, форма колита, представляет собой заболевание кишечника, конкретно толстого кишечника или ободочной кишки, которое включает характерные язвы или открытые раны в ободочной кишке. Главным симптомом активной формы заболевания является обычно постоянная диарея, смешанная с кровью. Современное лечение язвенного колита включает противовоспалительные лекарственные средства, иммуносупрессию и биологическое лечение, направленное на специфические компоненты иммунного ответа. Иногда необходима колэктомия (частичное или полное удаление толстой кишки путем хирургического вмешательства), и это рассматривается как лечение заболевания.

Okamoto et al. [Okamoto et al., выше] и Matsumoto et al. [Matsumoto et al., Gastroenterology (2005) 128: 1851-1867] продемонстрировали, что клетки, происходящие из костного мозга (BMDCs), могут возрождать популяцию эпителия желудочно-кишечного тракта человека после заболевания трансплантат против хозяина или образования язвы желудка после облучения и трансплантации костного мозга. Komori et al. 2005 [Komori et al., J Gastroenterol (2005) 40:591-599] также сообщали о временном увеличении эпителиальных клеток слизистой, происходящих из костного мозга, и миофибробластов в процессе заживления язв желудка и индуцированного тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS) колита у крыс. Кроме того, компания Osiris (www.osiris.com), специализирующаяся на клинической медицине, дает оценку Prochymal, продукту, происходящему из MSCs костного мозга, для лечения болезни Крона. Osiris в настоящее время проводит многоцентровое испытание для оценки безопасности и эффективности Prochymal для болезни Крона.

В публикации PCT № WO 2008/100498 раскрываются способы лечения заболеваний, связанных с иммунной системой (например, воспалительного заболевания кишечника, болезни трансплантат против хозяина), с использованием стволовых клеток плаценты или стволовых клеток пуповины. Раскрытые стволовые клетки происходят из плаценты млекопитающих, независимо от морфологии, маркеров клеточной поверхности или количества пересевов после первичного культивирования, и прикрепляются к субстрату тканевой культуры (например, к пластику для культивирования ткани или к покрытому фибронектином планшету для тканевой культуры).

В публикации США № 20080213227 раскрываются способы лечения аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний (например, воспалительного заболевания кишечника и болезни Крона) путем введения мезенхимальных стволовых клеток в эффективном количестве. Раскрытые мезенхимальные клетки могут быть получены из прикрепляющихся клеток костного мозга или периостальных клеток, или альтернативно из крови, кожи, пуповинной крови, мышцы, жировой ткани, кости или перихондрия.

В публикации PCT № WO 2007/108003 раскрываются способы клеточной экспансии, которые включают культивирование прикрепляющихся клеток из плаценты или жировой ткани в условиях трехмерного культивирования, которое поддерживает клеточную экспансию. Предлагаются также клетки, полученные таким образом, и варианты их применения.

Краткое изложение сущности изобретения

В соответствии с аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, предлагается способ лечения язвенного колита или болезни Крона у нуждающегося в этом индивидуума, причем способ включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества прикрепляющихся клеток из плаценты или жировой ткани, в результате чего происходит лечение язвенного колита или болезни Крона.

В соответствии с аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, предлагается применение прикрепляющихся клеток из плаценты или жировой ткани для получения лекарственного средства, идентифицированного как для лечения язвенного колита или болезни Крона.

В соответствии с аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается продукт производства, включающий упаковочный материал, который включает этикетку для использования при лечении язвенного колита или болезни Крона, причем в упаковочный материал упаковано фармацевтически эффективное количество прикрепляющихся клеток из плаценты или жировой ткани.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки включают позитивный маркер экспрессии, выбранный из группы, состоящей из CD73, CD90, CD29 и CD105.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки включают негативный маркер экспрессии, выбранный из группы, состоящей из CD3, CD4, CD45,

CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34 и CD79.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки способны подавлять иммунную реакцию.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, подавление иммунной реакции включает подавление активности Т-клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки получают из трехмерной (3D) культуры.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, трехмерная (3D) культура включает 3D-биореактор.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, культивирование прикрепляющихся клеток в 3D культуре производят в условиях перфузии.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, культивирование прикрепляющихся клеток производят в течение, по меньшей мере, трех дней.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, культивирование прикрепляющихся клеток производят до тех пор, пока, по меньшей мере, 10% прикрепляющихся клеток пролиферируют.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки включают профиль экспрессии генов, как описано в таблице 11.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения прикрепляющиеся клетки включают культивируемые клетки из плаценты или жировой ткани в условиях 2-х-мерного (2D) культивирования.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, по меньшей мере, 12% прикрепляющихся клеток находится в S и/или G2/M фазе пролиферации.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки включают профиль экспрессии генов, как описано в таблице 8.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки менее коммитированы в сторону остеогенной линии дифференцировки по сравнению с прикрепляющимися клетками, происходящими из костного мозга, при выращивании и обеспечении возможности дифференцироваться в тех же самых условиях.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, прикрепляющиеся клетки менее коммитированы в сторону адипогенной линии дифференцировки по сравнению с прикрепляющимися клетками, происходящими из костного мозга, при выращивании и обеспечении возможности дифференцироваться в тех же самых условиях.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, продукт производства кроме того, включает дополнительное лекарственное средство для лечения воспаления ободочной кишки.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, продукт производства дополнительно включает иммуносупрессорный агент.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, продукт производства дополнительно включает противовоспалительный агент.

Если не указано иначе, все технические и/или научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, что и обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой принадлежит изобретение. Хотя методы и вещества, сходные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы в практике или тестировании вариантов осуществления изобретения, иллюстративные методы и/или вещества описываются ниже. В случае конфликта должно контролироваться описание патента, включая определения. Кроме того, вещества, методы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для обязательного ограничения.

Краткое описание фигур

В настоящем документе только в качестве примера описаны некоторые варианты осуществления изобретения со ссылкой на сопровождающие фигуры. В настоящем разделе при конкретной ссылке на фигуры в подробностях подчеркивается, что представленные подробности даны в качестве примера и в целях иллюстративного обсуждения вариантов осуществления изобретения. В этом отношении описание, взятое вместе с фигурами, делает очевидным для специалистов в данной области техники, как варианты осуществления изобретения могут быть осуществлены на практике.

Фиг.1A-B представляют собой фигуры, изображающие анализ клеточного цикла 2D прикрепляющихся клеток плаценты, подходящих для применения в соответствии с настоящими указаниями (фиг.1A), или прикрепляющихся клеток, полученных в соответствии с указаниями патента WO/2007/108003, обозначенных как PLX (фиг.1B). Клетки фиксировали в 70% EtOH O.N, центрифугировали и ресуспендировали в растворе йодида пропидия (PI) и затем анализировали с помощью FACS.

Фиг.2 представляет собой гистограмму, изображающую экспрессию маркеров 2D прикрепляющихся клеток плаценты, подходящих для применения в соответствии с настоящими указаниями. Отмечается, что негативная экспрессия была зарегистрирована для CD11b, CD34, HLA-DR, CD14, CD19 и CD45, тогда как позитивная экспрессия была отмечена для CD29, CD73, CD90 and CD105.

Фиг.3 представляет собой гистограмму, изображающую снижение ответа клеток лимфоцитарного ряда под действием 2D прикрепляющихся клеток плаценты, подходящих для применения в соответствии с настоящими указаниями. Мононуклеарные клетки (MNCs) периферической крови (PB) стимулировали PHA (10 мкг/мл). Одну из четырех различных партий 2D прикрепляющихся клеток добавляли к стимулированным MNCs. По три параллельных из каждой группы высевали в 96-луночные планшеты.

Фиг.4A-F представляет собой фотографии, изображающие рост клеток костного мозга и плаценты в условиях остеогенной или адипогенной линий дифференцировки. Клетки, происходящие из костного мозга (фиг.4A-C), или клетки, происходящие из плаценты (фиг.4D-F), высевали в ростовой среде (фиг.4A и 4D), в среде для остеогенной дифференцировки (фиг.4B и 4E) или в среде для адипогенной дифференцировки (фиг.4C и 4F) в 24-луночном планшете, покрытом витронектином и коллагеном. Среду меняли каждые 3-4 дня. В конце периода роста клетки фиксировали, окрашивали и снимали, как подробно описано в последующем разделе примеров.

Фиг.5A-F представляет собой фотографии, изображающие рост клеток костного мозга и плаценты в модифицированных условиях остеогенной или адипогенной линий дифференцировки. Клетки, происходящие из костного мозга (фиг.5A-C), или клетки, происходящие из плаценты (фиг.5D-F), высевали в ростовой среде (фиг.5A и 5D), в среде для остеогенной дифференцировки (фиг.5B и 5E) или в среде для адипогенной дифференцировки (фиг.5C и 5F) в 24-луночном планшете, покрытом витронектином и коллагеном. Среду меняли каждые 3-4 дня. В конце периода роста клетки фиксировали, окрашивали и снимали, как подробно описано в последующем разделе примеров.

На фиг.6A-B изображен анализ клеточного цикла 3D прикрепляющихся клеток, полученных Plurix (обозначается как PLX, фиг.6B) and Celligen (PLX-C, фиг.6A). Клетки фиксировали в 70% EtOH O.N, центрифугировали и ресуспендировали в растворе йодида пропидия (PI) и затем анализировали с помощью FACS.

На фиг.7A-C изображена экспрессия типичных для фибробластов маркеров, но отсутствие экспрессии типичных для эндотелия маркеров на PLX-C. На фиг.7A изображена негативная экспрессия эндотелиального маркера CD31; на фиг.7B изображена негативная экспрессия эндотелиального маркера KDR; и на фиг.7C изображена позитивная экспрессия маркера фибробластов человека (D7-FIB). Отмечается, что красные гистограммы для изотипа IgG1 (ФИТЦ) представляют собой негативный контроль, тогда как синие гистограммы, представляют собой позитивно окрашенные клетки.

На фиг.8A-D изображена экспрессия стимуляторных и костимуляторных молекул на клетках PLX-C. На фиг.8A изображена экспрессия CD80 на PLX-C; на фиг.8B изображена экспрессия CD86 на PLX-C; на фиг.8C изображена экспрессия CD40 на PLX-C; и на фиг.8D изображена экспрессия HLA-A/B/C на PLX-C. Негативные контроли получали с флуоресцентными молекулами соответствующего изотипа. Отмечается, что красные гистограммы указывают на популяцию клеток, экспрессирующих маркер PLX-C, синие гистограммы указывают на популяцию клеток, экспрессирующих маркер костного мозга (BM), и зеленые гистограммы указывают на популяцию клеток, экспрессирующих маркер мононуклеарных клеток (MNC).

На фиг.9A-B изображено ингибирование пролиферации лимфоцитов под действием PLX-C. На фиг.9A изображены тесты смешанной реакции лимфоцитов (MLR), выполненные с 2×10⁵ мононуклеарными клетками (MNC, донор А), происходящими из периферической крови (PB), стимулированными равным количеством облученных (30 Дж/кг) MNCs, происходящих из PB (донор В), с последующим добавлением возрастающих количеств клеток PLX-C к культурам. Три параллельных из каждой группы высевали в 96-луночные планшеты. Скорость пролиферации измеряли по включению [³H]-тимидина; на фиг.9B изображены MNCs, происходящие из периферической крови (PB), стимулированные ConA (1,5 мг/мл). К культурам добавляли повышающиеся количества клеток PLX-C. Три параллельных из каждой группы высевали в 96-луночные планшеты. Скорость пролиферации измеряли по включению [³H]-тимидина.

На фиг.10A-C изображена регуляция PLX-C секреции провоспалительных и антивоспалительных цитокинов после совместного культивирования с клетками периферической крови. На фиг.10A-B изображена секреция IFN (фиг.10A) и TNF (фиг.10B) после совместного культивирования MNCs, происходящих от человека (выделенных из периферической крови), стимулированных ConA, с PLX-C; на фиг.10C изображена секреция IFN , TNF и ИЛ-10 после совместного культивирования MNCs, происходящих от человека (выделенных из периферической крови), стимулированных LPS, с PLX-C. Супернатанты собирали и подвергали анализу на цитокины с использованием ELISA.

Фиг.11 представляет собой гистограмму, изображающую макроскопическую оценку тканей ободочной кишки мышей с колитом по показателю Уоллеса. TNBS (мыши с моделированием колита), TNBS+5-ASA (мыши с колитом, которые получали лечение по золотому стандарту), TNBS+2D прикрепляющиеся клетки (партия 1) в/бр, TNBS+3D прикрепляющиеся клетки (PLX-C, партия 2) в/бр, TNBS+2D прикрепляющиеся клетки (партия 1) в/в и TNBS+3D прикрепляющиеся клетки (PLX-C, партия 2) в/в. Макроскопические оценки проводились вслепую двумя исследователями.

Фиг.12 представляет собой гистограмму, изображающую микроскопическую оценку тканей ободочной кишки мышей с колитом по показателю Ameho. TNBS (мыши с моделированием колита), TNBS + 5-ASA (мыши с колитом, которые получали лечение по золотому стандарту), TNBS+2D прикрепляющиеся клетки (партия 1) в/бр, TNBS+3D прикрепляющиеся клетки (PLX-C, партия 2) в/бр, TNBS+2D прикрепляющиеся клетки (партия 1) в/в и TNBS+3D прикрепляющиеся клетки (PLX-C, партия 2) в/в. Гистологические оценки проводились вслепую двумя исследователями.

Фиг.13 представляет собой гистограмму, изображающую уровень экспрессии мРНК ИЛ-1 в тканях ободочной кишки мышей с колитом. У мышей вызывали колит путем внутриректального введения TNBS и им вводили 2D или 3D (PLX-C) прикрепляющиеся клетки внутрибрюшинным или внутривенным путем. Суммарную РНК выделяли из тканей ободочной кишки различных экспериментальных групп и уровни экспрессии ИЛ-1 оценивали с помощью ОТ-ПЦР.

Фиг.14 представляет собой гистограмму, изображающую микроскопическую оценку тканей ободочной кишки крыс с колитом. У крыс вызывали колит путем введения TNBS внутрь ободочной кишки и им вводили PLX-C клетки внутрибрюшинным (в/бр) или внутривенным (в/в) путем.

Описание конкретных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение в некоторых вариантах его осуществления относится к способам лечения воспалительных заболеваний ободочной кишки с использованием прикрепляющихся клеток из жировой ткани или ткани плаценты и более конкретно, но не исключительно, к способам лечения язвенного колита или болезни Крона с использованием прикрепляющихся клеток.

Принципы и процесс настоящего изобретения могут быть лучше поняты при ссылке на фигуры и сопровождающие описания.

Перед подробным объяснением, по меньшей мере, одного варианта осуществления изобретения должно быть понятно, что изобретение необязательно ограничивается его применением в тех подробностях, которые изложены в последующем описании или проиллюстрированы в примерах. Допускаются другие варианты осуществления изобретения, или исполнения его на практике, или выполнения различными способами. Должно быть понятно также, что используемые в настоящем описании формулировки и терминология применяются с целью описания и не должны рассматриваться как ограничивающие.

При осуществлении настоящего изобретения на практике изобретатель настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что прикрепляющиеся клетки из тканей плаценты могут эффективно использоваться для лечения язвенного колита и болезни Крона.

Как показано в настоящем описании ниже и в последующем разделе примеров, изобретатель настоящего изобретения открыл путем сложных экспериментов, что прикрепляющиеся клетки, полученные из ткани плаценты или жировой ткани и прокультивированные в условиях 2D (пример 2) или 3D (примеры 1 и 3) культивирования, могут быть эффективно использованы для лечения воспаления ободочной кишки, такого как язвенный колит, как показано как на мышиной (пример 4), так и на крысиной (пример 5) экспериментальных моделях. Изобретатель настоящего изобретения показал, что внутривенное (в/в) или внутрибрюшинное (в/бр) введение 2D или 3D прикрепляющихся клеток настоящего изобретения приводит к существенному улучшению воспалительного состояния ткани ободочной кишки, определенного с помощью как макроскопической, так и микроскопической оценки ободочной кишки (фиг.11, 12 и 14). Этот противовоспалительный эффект был так же эффективен, как и золотой стандарт лечения с помощью 5-ASA. Взятые вместе указания настоящего изобретения описывают ценность противовоспалительного действия прикрепляющихся клеток настоящего изобретения и предлагают их применение для лечения воспалительных заболеваний ободочной кишки, таких как язвенный колит и болезнь Крона.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, предлагается способ лечения язвенного колита или болезни Крона у нуждающегося в этом индивидуума, причем способ включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества прикрепляющихся клеток из ткани плаценты или жировой ткани, осуществляя тем самым лечение язвенного колита или болезни Крона.

Используемый в настоящем описании термин «лечение» относится к предотвращению, лечению, обращению, ослаблению, облегчению, сведению к минимуму, подавлению или прекращению вредного влияния язвенного колита или болезни Крона. Специалисты в данной области техники должны понимать, что для оценки развития патологии могут быть использованы различные методы и тесты и сходно различные методы и тесты могут быть использованы для оценки ослабления, ремиссии или регрессии патологии.

Используемый в настоящем описании термин «язвенный колит» относится к патологическому состоянию кишечника, форме воспалительного заболевания кишечника (IBD), конкретно толстой кишки или ободочной кишки, которое включает характерные язвы или открытые бороздки в ободочной кишке. Заболевание язвенным колитом обычно диагностируется по следующим рецидивирующим симптомам - постоянной диарее, смешанной с кровью, с постепенным появлением. Язвенный колит в соответствии с указаниями настоящего изобретения относится к любой стадии или тяжести язвенного колита (например, к ремиссии заболевания или к острой форме заболевания).

Используемый в настоящем описании термин «болезнь Крона» относится к воспалительному состоянию, которое может затрагивать любую часть желудочно-кишечного тракта от ротовой полости до ануса, известному также как гранулематозный колит или регионарный энтерит, и представляет собой форму воспалительного заболевания кишечника (IBD). Болезнь Крона является типом аутоиммунного заболевания и обычно диагностируется по следующим рецидивирующим симптомам - боли в животе, диарее (которая может быть с примесью крови), рвоте, потере веса, кожной сыпи, артриту и воспалению глаз. Болезнь Крона в соответствии с указаниями настоящего изобретения относится к любой стадии или тяжести болезни Крона (например, к ремиссии заболевания, острой форме заболевания, рецидиву).

Применяемое в настоящем описании выражение «нуждающийся в этом индивидуум» относится к млекопитающему, предпочтительно к индивидууму, являющемуся человеком, мужской или женской особи любого возраста, у которого диагностирован вероятный или точный язвенный колит или болезнь Крона, например к индивидууму, который перенес воспалительное заболевание ободочной кишки. Диагностика язвенного колита или болезни Крона может включать любой диагностический тест, такой как, например, лабораторные тесты, эндоскопическую оценку, биопсию слизистой (для язвенного колита), осуществление рентгеноскопии с барием (для болезни Крона) и КТ или МРТ сканирование (для болезни Крона).

Следует понимать, что настоящее изобретение также предполагает лечение других воспалительных состояний ободочной кишки, включая, но не ограничиваясь этим, хронические воспалительные заболевания кишечника (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan 23; (1):16), глютеновую энтеропатию (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2):122) и илеит, с использованием прикрепляющихся клеток по настоящему изобретению.

Как указывалось в настоящем описании выше, способ в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения осуществляется путем введения индивидууму терапевтически эффективного количества прикрепляющихся клеток из плаценты или жировой ткани.

Применяемое в настоящем описании выражение «прикрепляющиеся клетки» относится к гомогенной или гетерогенной популяции клеток, рост которых зависит от прикрепления, т.е. для роста in vitro требуется прикрепление к поверхности.

Применяемое в настоящем описании выражение «жировая ткань» относится к соединительной ткани, которая включает жировые клетки (адипоциты).

Применяемый в настоящем описании термин «ткань плаценты» относится к любой части женского органа млекопитающих, который выстилает маточную стенку и в течение беременности является оболочкой плода, к которой он прикреплен через пуповину. После родов плацента изгоняется (и обозначается как послеродовая плацента). В иллюстративном варианте осуществления плацента относится к целой плаценте.

В соответствии с указаниями настоящего изобретения прикрепляющиеся клетки, происходящие из плаценты или жировой ткани, могут быть размножены с использованием двухмерных (2D) или трехмерных (3D) условий культивирования.

Применяемое в настоящем описании выражение «двухмерная культура» относится к культуре, в которой клетки помещены в условия, которые совместимы с клеточным ростом, наряду с тем, что клеткам позволяют расти в одной плоскости. Условия в двухмерной культуре изобретения создаются таким образом, чтобы делать возможным распространение прикрепляющихся клеток.

Применяемое в настоящем описании выражение «трехмерная культура» относится к культуре, в которой клетки помещены в условия, которые совместимы с клеточным ростом, наряду с тем, что клеткам позволяют расти в более чем в одном слое. Вполне понятно, что окружение клетки in situ в живом организме (или в ткани) представляет собой трехмерную структуру. Клетки окружены другими клетками. Они поддерживаются в сложной сети волокон внеклеточного матрикса наноразмера, который позволяет создать различное местное микроокружение. Его внеклеточные лиганды опосредуют не только прикрепление к базальной мембране, но также доступ к разнообразным кровеносным и лимфатическим сосудам. Кислород, гормоны и питательные вещества переносятся к клеткам, а отходы удаляются. Условия в трехмерной культуре изобретения создаются таким образом, чтобы имитировать такое окружение, как это будет дополнительно проиллюстрировано ниже.

Должно быть понятно, что условия при двухмерном и трехмерном культивировании являются такими, чтобы делать возможным распространение прикрепляющихся клеток.

Применяемые в настоящем описании термины «распространяющиеся» и «распространение» относятся к поддержанию клеток по существу в отсутствие их дифференцировки и в конечном итоге в условиях клеточного роста, т.е. увеличения популяции клеток (например, по меньшей мере, в 2 раза) без дифференцировки, сопровождающей такое увеличение.

Применяемые в настоящем описании термины «поддерживающиеся» и «поддержание» относятся к возобновлению клеток по существу в отсутствие их дифференцировки, т.е. по существу к стабильной клеточной популяции без дифференцировки, сопровождающей такую стабильность.

Как указывалось, прикрепляющиеся клетки этого аспекта изобретения получают из жировой ткани или ткани плаценты.

Клетки плаценты могут быть получены из плаценты после доношенной беременности или плаценты после преждевременных родов. Плаценту предпочтительно собирают сразу после оттока крови. Плаценту предпочтительно перфузировали в течение периода времени, достаточного для удаления остаточных клеток. Используемый в настоящем описании термин «перфузировать» или «перфузия» относится к акту заливания или пропускания жидкости через или сквозь орган или ткань. Ткань плаценты может происходить от любого млекопитающего; например, источником ткани плаценты является человек. Подходящим источником ткани плаценты является плацента после доношенной беременности (например, через 1-6 часов), однако источник ткани или клеток плаценты или метод выделения ткани плаценты не является решающим для изобретения.

Прикрепляющиеся клетки, происходящие из плаценты, могут быть получены как из плодной (т.е. амниона или внутренних частей плаценты, см. пример 1), так и материнской (т.е. базальной децидуальной оболочки и выстилающей полость матки децидуальной оболочки) частей плаценты. Образцы ткани промывают в физиологическом буфере [например, в забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР) или буфером Хенкса]. Суспензии из единичных клеток делают путем обработки ткани гидролитическим ферментом (см. ниже) и/или измельчая и прокачивая кусочки ткани через нейлоновый фильтр или путем осторожного пипетирования (Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA) промывающим буфером.

Прикрепляющиеся клетки, происходящие из жировой ткани, могут быть выделены с помощью разнообразных методов, известных специалистам в данной области техники. Например, такие методы описаны в патенте США № 6153432. Жировая ткань может происходить от сальника/висцерального жира, жировой ткани молочной железы, гонад или других источников жировой ткани. Одним источником жировой ткани является жир сальника. У человека жировую ткань обычно выделяют путем липосакции.

Выделенные прикрепляющиеся клетки из плаценты или жировой ткани могут быть извлечены путем обработки ткани гидролитическими ферментами, такими как коллагеназа, трипсин и/или диспаза; и/или эффективными концентрациями гиалуронидазы или ДНКазы; и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА); при температуре между 25-50°С в течение периодов от 10 минут до 3 часов. Клетки можно затем пропустить через нейлоновый или марлевый фильтр с ячейками от 20 микрон до 1 мм. Клетки затем подвергают дифференциальному центрифугированию прямо в средах или через градиент Фиколла или Перколла или другой корпускулярный градиент. Клетки центрифугируют при скоростях от 100 до 3000 х g в течение периодов от 1 минуты до 1 часа при температуре между 4-50°С (см. патент США № 7078230).

В дополнение к прикрепляющимся клеткам, происходящим из плаценты или жировой ткани, в изобретении также предусматривается применение прикрепляющихся клеток из других тканевых источников, которые характеризуются фенотипом стромальных стволовых клеток (как далее будет описано в настоящем документе ниже). Тканевые источники, из которых могут быть извлечены прикрепляющиеся клетки, включают, но не ограничиваются этим, пуповинную кровь, кожу головы, волосяные фолликулы [например, как описано в патентной заявке США 20060172304], семенники [например, как описано в статье Guan K., et al., Nature. 2006 Apr 27;440(7088): 1199-203], слизистую носовой полости человека [например, как описано в статье Marshall, CT., et al., Histol Histopathol. 2006 Jun;21(6):633-43], эмбриональный желточный мешок [например, как описано в статье Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8;427(6970): 148-54] и амниотическую жидкость [Pieternella et al. (2004) Stem Cells 22:1338-1345], все источники, как известно, включают мезенхимальные стволовые клетки. Прикрепляющиеся клетки из этих тканевых источников могут быть выделены путем культивирования клеток на поверхности для прикрепления, изолируя таким способом прикрепляющиеся клетки от других клеток в исходной популяции.

Независимо от источника (например, плаценты или жировой ткани) извлечение клеток предпочтительно производится в стерильных условиях. После получения извлеченных клеток им дают возможность прикрепиться к веществу для прикрепления (например, с конфигурацией в виде поверхности) для выделения в результате этого прикрепившихся клеток. Культивирование затем происходит в условиях 2D (как описано в примере 2 раздела примеров), и клетки могут быть затем перенесены в условия 3D (как описано в примерах 1 и 3 раздела примеров).

Применяемый в настоящем описании термин «вещество для прикрепления» относится к синтетическому веществу, природному веществу или их сочетанию, нецитотоксичному (т.е. биологически совместимому), обладающему химической структурой (например, заряженными группами, экспонированными на поверхности), которая может удержать клетки на поверхности.

Примеры веществ для прикрепления, которые могут быть использованы в соответствии с этим аспектом изобретения, включают, но не ограничиваются этим, полиэфир, полипропилен, полиалкилен, полифторхлорэтилен, поливинилхлорид, полистирол, полисульфон, ацетат целлюлозы, стекловолокно, керамическую частицу, матригель, компонент внеклеточного матрикса (например, фибронектин, хондронектин, ламинин), коллаген, поли-L-молочную кислоту и инертное металлическое волокно.

Следует принимать во внимание, что высевание клеток плаценты или жировой ткани обычно производится при плотности в культуре 3±0,2×10³ клеток/см ². После высевания клеточные культуры обычно культивируют в инкубаторе для тканевых культур в условиях увлажнения с 5% CO₂ при 37°С.

Дальнейшие стадии очистки или обогащения стромальными стволовыми клетками могут быть произведены с использованием методов, которые хорошо известны в данной области техники (таких как с помощью FACS с использованием экспрессии маркеров стволовых клеток, как будет дополнительно описано в настоящем документе ниже).

Неограничивающие примеры основных сред, пригодных для культивирования в соответствии с изобретением, включают минимально необходимую среду Игла, ADC-1, LPM (не содержащую бычий сывороточный альбумин), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, среду BGJ (с или без модификации Fitton- Jackson), основную среду Игла (BME с добавлением соли основания Игла), модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM - без сыворотки), Yamane, IMEM-20, модифицированную Глазго среду Игла (GMEM), среду Leibovitz L-15, среду McCoy's 5A, среду M199 (M199E - с солью основания Игла), среду M199 (M199H - с солью основания Хенкса), минимально необходимую среду Игла (MEM-E - с солью основания Игла), минимально необходимую среду Игла (MEM-H - с солью основания Хенкса) и минимально необходимую среду Игла (MEM-NAA с заменимыми аминокислотами), среди многих других включающие среду 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Предпочтительной средой для использования по изобретению является DMEM. Эти и другие пригодные среды имеются в продаже среди прочих у GIBCO, Grand Island, N. Y., USA и Biological Industries, Bet HaEmek, Israel. Описание ряда этих сред суммировано в книге Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62 72, под редакцией William B. Jakoby and Ira H. Pastan, опубликованной Academic Press, Inc.

Среда может быть дополнена, например, сывороткой, такой как сыворотка плодов телят или других видов, и необязательно или альтернативно ростовыми факторами, витаминами (например, аскорбиновой кислотой), цитокинами, солями (например, B-глицерофосфатом), стероидами (например, дексаметазоном) и гормонами, например гормоном роста, эритропоетином, тромбопоетином, интерлейкином-3, интерлейкином-6, интерлейкином-7, колониестимулирующим фактором макрофагов, лигандом c-kit/фактором стволовых клеток, лигандом остеопротегерина, инсулином, инсулиноподобными факторами роста, эпидермальным фактором роста, фактором роста фибробластов, фактором роста нервов, цилиарным нейротрофическим фактором, фактором роста из тромбоцитов и морфогенным белком кости в концентрациях от пикограмм/мл до миллиграмм/мл.

Дополнительно признается также, что в культуральную среду могут быть добавлены дополнительные компоненты. Такие компоненты могут представлять собой антибиотики, противогрибковые агенты, альбумин, аминокислоты и другие компоненты, известные в области техники культивирования клеток. Кроме того, могут быть добавлены компоненты для увеличения процесса дифференцировки, когда это необходимо (см. дополнительно ниже).

Следует принимать во внимание, что в случае, когда прикрепляющиеся клетки изобретения вводятся индивидууму, являющемуся человеком, клетки и культуральная среда (например, с описанными выше добавками среды) должны быть по существу свободны от ксенобиотиков, т.е. лишены любых загрязнений животного происхождения, например микоплазмой. Например, культуральная среда может содержать добавки заместителей сыворотки, добавки сыворотки человека и/или факторов, полученных синтетическим или рекомбинантным путем.

Как указывалось, как только прикрепляющиеся клетки получены, их можно высевать в 2D или 3D окружение (см. примеры 1, 2 и 3 раздела примеров далее). Следует иметь в виду, что клетки могут быть перенесены на матрикс с 3D-конфигурацией непосредственно после выделения или, альтернативно, они могут быть высеяны в 3D окружение после условий 2D (как указывалось в настоящем описании выше).

Следует принимать во внимание, что в процессе культивирования в условиях 2D прикрепляющиеся клетки можно постоянно пересевать. В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения клетки могут быть пересеяны в течение, по меньшей мере, 4 пассажей, по меньшей мере, 5 пассажей, по меньшей мере, 6 пассажей, по меньшей мере, 7 пассажей или, по меньшей мере, 8 пассажей. Должно быть понятно, что клетки обычно пересевают, когда культура достигнет приблизительно 70-80% конфлюэнтности, обычно через 3-5 дней (1,5-2 удваиваний). Более того, при культивировании в условиях 2D клетки могут быть выращены в культуральной среде, лишенной добавок антибиотиков, по меньшей мере, от 2 пассажей, по меньшей мере, 3 пассажей или, по меньшей мере, 4 пассажей.

Таким образом, в случае 2D культуры культивирование производят в течение приблизительно, по меньшей мере, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 10 дней, 20 дней, месяца или даже более. Для увеличения количества клеток можно также производить пересевание. Должно быть понятно, что культуральная среда может быть заменена для того, чтобы продлить или улучшить условия культивирования.

2D прикрепившиеся клетки могут быть собраны, когда пролиферируют, по меньшей мере, приблизительно 12% клеток, во избежание неконтролируемой дифференцировки и старения.

2D прикрепившиеся клетки некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения включают, по меньшей мере, приблизительно 10%, 28%, 30%, 50%, 80% или более пролиферативно-активных клеток (как может быть оценено с помощью мониторинга S и/или G2/M фаз путем FACS).

Как указывалось, прикрепляющиеся клетки могут быть перенесены в 3D окружение.

Таким образом, веществу для прикрепления этого аспекта изобретения придается форма для 3D культивирования, обеспечивая тем самым матрикс для роста, который существенно повышает доступную поверхность контакта для прикрепления клеток так, что создается имитация инфраструктуры ткани (например, плаценты).

Для крупномасштабного получения культивирование может быть произведено в 3d биореакторе.

Примеры таких биореакторов включают, но не ограничиваются этим, биореактор с потоком вытеснения, биореактор с непрерывно перемешиваемым резервуаром, биореактор с неподвижным слоем, биореакторную систему CelliGen Plus® (New Brunswick Scientific (NBS) или биореакторную систему BIOFLO 310 (New Brunswick Scientific (NBS).

Как показано в примере 3 раздела примеров, биореактор Celligen способен осуществлять 3D экспансию прикрепляющихся клеток в контролируемых условиях (например, рН, температуры и уровня кислорода) и при постоянной перфузии средой для постоянного клеточного роста. Более того, в клеточных культурах можно проводить прямой мониторинг уровней концентрации глюкозы, лактата, глутамина, глутамата и аммония. Скорость потребления глюкозы и скорость образования лактата прикрепляющимися клетками дает возможность измерять скорость клеточного роста и определять время их сбора.

Другие 3D биореакторы, которые могут быть использованы в изобретении, включают, но не ограничиваются этим, биореактор с непрерывно перемешиваемым резервуаром, в котором культуральная среда непрерывно подается в биореактор, а продукт непрерывно выводится для поддержания постоянной во времени стационарной фазы в реакторе. Биореактор с перемешиваемым резервуаром с барабаном с волокнистой подложкой имеется в продаже, например, у New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, биореактор со стационарной подложкой, биореактор с подъемом потока воздуха, где воздух обычно подается через дно центральной дочерней трубы, поднимается вверх с образованием пузырьков и высвобождает отработавший газ на вершине колонны, биореактор с перфузией высеянных клеток с помощью полиактивных пен [как описано в статье Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)], биореактор с перфузией радиальными потоками с трубчатыми пористыми каркасами из поли-L-молочной кислоты (PLLA) [как описано в статье Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)]. Другие биореакторы, которые могут быть использованы по изобретению, описаны в патентах США № № 6277151, 6197575, 6139578, 6132463, 5902741 и 5629186.

Высевание клеток предпочтительно производится при 100000-1500000 клеток/мм в момент высевания. В иллюстративном варианте осуществления высевается суммарно 150±30×10 ⁶ клеток, высевается 3-5×10⁶ клеток/г носителя или высевается 0,015-0,1×10⁶ клеток/мл.

Культивирование производится в течение, по меньшей мере, приблизительно 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 10 дней, 20 дней, месяца или даже более. Должно быть понятно, что культивирование в биореакторе может удлинять этот период. Культивирование прикрепляющихся клеток в 3D культуре может производиться в условиях непрерывного потока культуральной среды. Для увеличения количества клеток может также производиться пересевание. Следует также принимать во внимание, что культуральная среда может быть заменена для продления или улучшения условий культивирования.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения культивирование прикрепляющихся клеток в 3D культуре может производиться в условиях перфузии культуральной среды. Обычно скорость перфузии определяется по концентрации глюкозы в культуральной среде прикрепляющихся клеток. Таким образом, в соответствии с указаниями настоящего изобретения культуральная среда может быть заменена, когда концентрация глюкозы составляет приблизительно 500 мг/л, приблизительно 550 мг/л или приблизительно 600 мг/л.

3D прикрепившиеся клетки могут быть собраны, когда пролиферируют, по меньшей мере, приблизительно 10% клеток, во избежание неконтролируемой дифференцировки и старения.

3D прикрепившиеся клетки некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения включают, по меньшей мере, приблизительно 10%, 28%, 30%, 50%, 80% или более пролиферативно-активных клеток (как может быть оценено с помощью мониторинга S и/или G2/M фаз путем FACS).

Прикрепившиеся клетки некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения могут включать, по меньшей мере, один «фенотип стромальных стволовых клеток».

Применяемый в настоящем описании термин «фенотип стромальной стволовой клетки» относится к структурному или функциональному фенотипу, типичному для стромальной (т.е. мезенхимальной) клетки, происходящей из костного мозга.

Применяемое в настоящем описании выражение «стволовая клетка» относится к клетке, которая не прошла окончательную дифференцировку.

Таким образом, например, клетки могут иметь веретенообразную форму. Альтернативно или дополнительно клетки могут экспрессировать маркер или набор маркеров (например, маркер поверхности), типичный для стромальных стволовых клеток. Примеры маркеров поверхности стромальных стволовых клеток (позитивных и негативных) включают, но не ограничиваются этим, CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD3-, CD4-, CD34-, CD45-, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CD11B-, CD14-, CD19-, CD79-, HLA-DR- и FMC7-. Другие маркеры стромальных стволовых клеток включают, но не ограничиваются этим, тирозингидроксилазу, нестин и H-NF.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения прикрепляющиеся клетки не экспрессируют Oct-4.

Должно быть понятно, что 2D прикрепляющиеся клетки ткани плаценты, созданные в соответствии с указаниями настоящего изобретения, обладают профилем экспрессии генов по существу, как описано в таблице 8 последующего раздела примеров. В то же время 3D прикрепляющиеся клетки ткани плаценты, созданные в соответствии с указаниями настоящего изобретения, обладают профилем экспрессии генов по существу, как описано в таблице 11 последующего раздела примеров.

В соответствии с иллюстративным вариантом осуществления 2D и 3D прикрепляющиеся клетки настоящего изобретения менее коммитированы к дифференцировке в сторону остеогенной или адипогенной линии по сравнению с прикрепляющимися клетками из костного мозга, растущими и дифференцирующимися в тех же самых условиях.

Примеры функциональных фенотипов, типичных для стромальных стволовых клеток, включают, но не ограничиваются этим, супрессорную активность в отношении Т-клеток (они не стимулируют Т-клетки, а наоборот, подавляют их) и активность, поддерживающую гематопоетические стволовые клетки.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения прикрепляющиеся клетки изобретения способны подавлять иммунную реакцию у индивидуума.

Применяемое в настоящем описании выражение «подавление иммунной реакции у индивидуума» относится к снижению или ингибированию иммунной реакции, возникающей у индивидуума в ответ на антиген (например, на чужеродную клетку или ее часть). Иммунный ответ, который может быть подавлен прикрепляющейся клеткой, включает гуморальные иммунные ответы и клеточные иммунные ответы, которые включают специфическое узнавание антигенов патогена с помощью антител и Т-лимфоцитов (пролиферации Т-клеток) соответственно.

Как показано в примерах 4-5 последующего раздела примеров, 2D и 3D прикрепляющиеся клетки настоящего изобретения, как обнаружено, индуцируют противовоспалительный эффект при воспалительных состояниях ободочной кишки. Должно быть дополнительно понятно, что этот эффект может быть опосредован самими клетками или секретируемым ими фактором, обладающим противовоспалительным действием даже в отсутствие клеток. Таким образом, прикрепляющиеся клетки настоящего изобретения предпочтительно могут быть использованы для лечения воспаления кишечника, такого как в случае язвенного колита и болезни Крона.

Выражение «введение индивидууму» относится к введению клеток изобретения в ткань-мишень. Клетки могут происходить от реципиента или от аллогенного или ксеногенного донора. Это выражение также охватывает «трансплантацию», «замещение клеток» или «пересадку» клеток изобретения индивидууму.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления изобретения прикрепляющиеся клетки можно вводить индивидууму любыми путями, известными специалисту в данной области техники, например путем внутривенного (в/в), внутримышечного (в/м) или внутрибрюшинного (в/бр) введения.

Клетки, которые можно вводить в соответствии с этим аспектом изобретения, включают описанные выше прикрепляющиеся клетки, которые можно культивировать в трехмерном или двухмерном окружении, а также их частично или окончательно дифференцированные мезенхимальные и немезенхимальные производные.

Методы получения линий дифференцировки конкретных клеток из стромальных стволовых клеток изобретения хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США № № 5486359, 5942225, 5736396, 5908784 и 5902741.

Клетки могут не подвергаться какому-либо воздействию или быть генетически модифицированными, так чтобы быть направленными в сторону интересующей линии дифференцировки (см. патентную заявку США № 20030219423).

Клетки могут происходить из аутологичного или неаутологичного источника (т.е. аллогенного или ксеногенного) из свежих или замороженных (например, криогенно законсервированных) препаратов.

Так как неаутологичные клетки могут индуцировать иммунную реакцию при введении в организм, разработано несколько подходов для снижения вероятности отторжения неаутологичных клеток. Они включают либо подавление иммунной системы реципиента, либо инкапсулирование неаутологичных клеток в изолирующие от иммунной системы, полупроницаемые мембраны перед трансплантацией.

Методы инкапсулирования обычно классифицируются как микрокапсулирование, включающее маленькие сферические наполнители, и макрокапсулирование, включающее более крупные листовые слоистые мембраны и мембраны из полых волокон (Uludag, H. et al. Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42: 29-64).

Методы получения микрокапсул известны в данной области техники и включают, например, раскрытые Lu MZ, et al., Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine). Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479- 83, Chang TM and Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60, и Lu MZ, et al., A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha- cyanocinnamylideneacetate). J Microencapsul. 2000, 17: 245-51.

Например, микрокапсулы получают путем комплексирования модифицированного коллагена с тройным сополимером оболочки-2-гидроксиэтилметилакрилатом (HEMA), метакриловой кислотой (MAA) и метилметакрилатом (MMA), что ведет к толщине капсулы 2-5 мкм. Такие микрокапсулы могут быть дополнительно инкапсулированы в дополнительные 2-5 мкм оболочки из тройного сополимера для того, чтобы придать отрицательный заряд гладкой поверхности и свести к минимуму абсорбцию белками плазмы Chia, S.M. et al. Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56).

Другие микрокапсулы создаются на основе альгината, морского полисахарида (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5: 665-8) или его производных. Например, микрокапсулы могут быть получены путем полиэлектролитного комплексирования полианионов альгината натрия и сульфата натрий-целлюлозы с поликатионом гидрохлорида поли(метилен-со-гуанидин)а в присутствии хлорида кальция.

Должно быть понятно, что инкапсулирование клеток улучшается, когда используются более мелкие капсулы. Таким образом, контроль качества, механическая стабильность, диффузионные свойства и активность in vitro инкапсулированных клеток улучшаются, когда размер капсулы снижается от 1 мм до 400 мкм (Canaple L. et al., Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002; 13:783-96). Более того, биокапсулы с нанопорами с хорошо контролируемым размером пор, настолько малым как 7 нм, с химически подогнанной поверхностью и точной микроконфигурацией, как обнаружено, создают успешное микроокружение для иммуноизоляции клеток (Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46).

Примеры иммуносупрессорных агентов, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются этим, метотрексат, циклофосфамид, циклоспорин, циклоспорин А, хлороквин, гидроксихлороквин, сульфасалазин (сульфасалазопирин), соли золота, D-пеницилламин, лефлуномид, азатиоприн, анакинра, инфликсимаб (REMICADE), этанерсепт, блокаторы TNF-альфа, биологический агент, мишенью которого являются воспалительные цитокины, и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAIDs). Примеры NSAIDs включают, но не ограничиваются этим, ацетилсалициловую кислоту, холинсалицилат магния, дифлунизал, салицилат магния, салсалат, салицилат натрия, диклофенак, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, индометацин, кетопрофен, кеторолак, меклофенамат, напроксен, набуметон, фенилбутазон, пироксикам, сулиндак, толметин, ацетаминофен, ибупрофен, ингибиторы Cox-2 и трамадол.

В зависимости от патологического состояния индивидууму можно вводить дополнительные химические лекарства (например, иммуномодуляторные, химиотерапевтические, противовоспалительные и т.д.) или клетки.

Для лечения воспалительных состояний ободочной кишки, включая язвенный колит и болезнь Крона, может быть использовано любое лечение, известное специалисту в данной области техники, включая, например, аминосалицилаты (например, месалазин, балсалазид, олсалазин), кортикостероиды (например, кортизон, преднизон, преднизолон, кортифем, гидрокортизон, метилпреднизолон, беклометазон, будесонид), иммуносупрессорные лекарства (например, меркаптопурин, азатиоприн, метотрексат, такролимус), биологическое лечение (например, инфликсимаб, визилизумаб), гепарин низкой молекулярной массы (LMWH), модификации диеты (например, волокна) и хирургическое вмешательство.

Индивидууму можно также вводить противовоспалительный агент, такой как, но, не ограничиваясь этим, алклофенак; алклометазона дипропионат; алгестона ацетонид; альфа-амилаза; амцинафал; амцинафид; амфенака натриевая соль; амиприлозы гидрохлорид; анакинра; аниролак; анитразафен; апазон; балсалазида динатриевая соль; бендазак; беноксапрофен; бензидамина гидрохлорид; бромелаины; броперамол; будесонид; карпрофен; циклопрофен; цинтазон; клипрофен; клобетазола пропионат; клобетазона бутират; клопирак; клотиказона пропионат; корметазона ацетат; кортодоксон; дефлазакорт; десонид; дезоксиметазон; дексаметазона дипропионат, диклофенака калиевая соль; диклофенака натриевая соль; дифлоразона диацетат; дифлумидона натриевая соль; дифлунизал; дифлупреднат; дифталон; диметилсульфоксид; дроциномид; эндрисон; энлимомаб; эноликама натриевая соль; эпиризол; этодолак; этофенамат; фелбинак; фенамол; фенбуфен; фенклофенак; фенклорак; фендорсал; фенпипалон; фентиазак; флазалон; флуазакорт; флуфенамовая кислота; флумизол; флунизолида ацетат; флуниксин; флуниксина меглумин; флуокортина бутил; фторметолона ацетат; флуквазон; флурбипрофен; флуретофен; флутиказона пропионат; фурапрофен; фуробуфен; галцинонид; галобетазола пропионат; галопредона ацетат; ибуфенак; ибупрофен; ибупрофена алюминиевая соль; ибупрофена пиконол; илонидап; индометацин; индометацина натриевая соль; индопрофен; индоксол; интразол; изофлупредона ацетат; изоксепак; изоксикам; кетопрофен; лофемизола гидрохлорид; ломоксикам; лотепреднола этабонат; меклофенамата натриевая соль; меклофенамовая кислота; меклоризона дибутират; мефенамовая кислота; мезаламин; мезеклазон; метилпреднизолона сулептанат; мотифлумат; набуметон; напроксен; напроксена натриевая соль; напроксол; нимазон; олсалазина натриевая соль; орготекин; орпаноксин; оксапрозин; оксифенбутазон; паранилина гидрохлорид; пентозана полисульфата натриевая соль; фенбутазона натрийглицерат; пирфенидон; пироксикам; пироксикама циннамат; пироксикама оламин; пирпрофен; предназат; прифелон; продоловая кислота; проквазон; проксазол; проксазола цитрат; римексолон; ромазарит; салколекс; салнацедин; салсалат; сангинария хлорид; секлазон; серметацин; судоксикам; сулиндак; супрофен; талметацин; талнифлумат; талосалат; тебуфелон; тенидап; тенидапа натриевая соль; теноксикам; тесикам; тесимид; тетридамин; тиопинак; тиксокортола пивалат; толметин; толметина натриевая соль; триклонид; трифлумидат; зидометацин; зомепирака натриевая соль.

В любом из описанных в настоящем документе методов клетки можно вводить либо как таковые, либо, предпочтительно, в виде части фармацевтической композиции, которая дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

Применяемый в настоящем описании термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату прикрепляющихся клеток изобретения (т.е. прикрепляющихся клеток из плаценты или жировой ткани, которые получены после 2D или 3D культивирования), с другими химическими компонентами, такими как фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Целью фармацевтической композиции является облегчение введения клеток индивидууму.

В настоящем описании далее термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителю, или разбавителю, который не вызывает существенного раздражения у индивидуума и не аннулирует биологическую активность и свойства вводимого соединения. Примерами носителей без ограничения являются пропиленгликоль, физиологический раствор, эмульсии и смеси органических растворителей с водой.

В настоящем описании термин «наполнитель» относится к инертному веществу, добавленному к фармацевтической композиции для дополнительного облегчения введения соединения. Примеры наполнителей без ограничения включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмалов, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения фармацевтический носитель представляет собой водный физиологический раствор соли.

Способы составления и введения лекарств могут быть найдены в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание, которое включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Фармацевтическую композицию можно вводить системно (как подробно описано в настоящем документе выше). Альтернативно, фармацевтическую композицию можно вводить местно, например путем инъекции фармацевтической композиции непосредственно в область ткани больного.

Фармацевтические композиции изобретении могут быть получены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, например посредством общепринятых процессов смешивания, растворения, гранулирования, создания драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения или лиофилизации.

Фармацевтические композиции для применения в соответствии с изобретением, таким образом, могут быть составлены традиционным способом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные агенты, которые облегчают процессинг активных ингредиентов в препаратах, которые могут быть использованы фармацевтически. Соответствующий состав зависит от выбранного пути введения.

Для инъекций активные ингредиенты фармацевтической композиции могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера, физиологический солевой раствор или замораживающая среда, содержащая криоконсерванты. Для введения через слизистую в составе используются пенетранты, подходящие для проникновения через барьер. Такие пенетранты обычно известны в данной области техники.

Определение терапевтически эффективного количества действительно находится в пределах способностей специалистов в данной области техники, особенно в свете предлагаемого в настоящем описании подробного раскрытия.

Для любого препарата, используемого в способах изобретения, терапевтически эффективное количество или доза может быть определена первоначально из тестов в клеточной культуре in vitro. Предпочтительно доза определяется на животной модели для достижения желаемой концентрации или титра. Такой состав может быть использован для более точного определения пригодных доз у людей.

Токсичность и терапевтическую эффективность активных ингредиентов, описанных в настоящем документе, можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур in vitro, в клеточных культурах или на экспериментальных животных. Данные, полученные из этих тестов in vitro и в клеточных культурах и из исследований на животных, могут быть использованы для определения диапазона дозировок для использования у человека. Дозировка может варьироваться в зависимости от применяемой формы дозирования и используемого пути введения. Точный состав, путь введения и дозировку может выбрать лечащий индивидуума врач, принимая во внимание состояние больного (см., например, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l).

Количество дозированного состава и интервал могут быть подобраны индивидуально до уровней активного ингредиента, которые достаточны для эффективной регуляции синтеза нейротрансмиттеров имплантированными клетками. Дозировки, необходимые для достижения желаемого эффекта, должны зависеть от индивидуальных характеристик и пути введения. Для определения концентраций в плазме могут быть использованы методы их детекции.

В зависимости от тяжести состояния и реакции на лечение дозирование может представлять собой однократное или многократное введение в течение курса лечения, продолжающегося от нескольких дней до нескольких недель или до достижения уменьшения патологического состояния.

Количество композиции для введения должно, конечно, зависеть от индивидуума, подвергаемого лечению, тяжести болезни, способа введения, решения врача, предписывающего лечение и т.д. Дозировка и установление времени лечения должны зависеть от тщательного и постоянного мониторинга изменения состояния индивидуума.

Модели воспалительных заболеваний ободочной кишки включают животные модели язвенного колита, такие как, но не ограничиваясь этим, колит, индуцированный тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), у крыс и мышей [Komori et al., J Gastroenterol (2005) 40: 591-599; и примеры 4-5 в настоящем описании ниже].

Композиции, включающие препарат изобретения, составленный с фармацевтически совместимым носителем, могут быть также получены, помещены в подходящий контейнер и снабжены этикеткой для лечения указанного состояния.

Композиции изобретения могут быть представлены, если это желательно, в упаковке или дозирующем устройстве, таких как одобренный FDA набор, который может содержать одну или более единиц лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать металлическую или пластиковую фольгу, как, например, блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями по введению. Упаковка или дозатор могут также снабжаться уведомлением, связанным с контейнером, в форме, предписанной правительственным учреждением, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических агентов, причем это уведомление отражает одобрение учреждением формы композиций или введения человеку или животным. Такое уведомление, например, может быть снабжено этикеткой с одобрением управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для предписания лекарств или вкладышем об одобрении продукта.

Прикрепляющиеся клетки изобретения могут быть подходящим образом составлены в виде фармацевтических композиций, которые могут быть подходящим образом упакованы в виде продукта производства. Такой продукт производства включает маркировку для использования при лечении язвенного колита или болезни Крона, упаковочный материал, в который упаковано фармацевтически эффективное количество прикрепляющихся клеток из плаценты или жировой ткани.

Должно быть понятно, что продукт производства может дополнительно включать добавочные лекарственные средства для лечения воспалительных состояний ободочной кишки, включая, например, противовоспалительные агенты, иммуномодуляторные агенты, противовоспалительные агенты и другие лекарственные средства для лечения воспалительных состояний ободочной кишки (как описано более подробно в настоящем документе выше).

Используемый в настоящем описании термин «приблизительно» относится к ±10%.

Термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий», «обладающий» и их однокоренные слова обозначают «включающий, но не ограничивающийся этим».

Термин «состоящий из» обозначает «включающий и ограничивающийся этим».

Термин «состоящий по существу из» означает, что композиция, способ или структура могут включать дополнительные ингредиенты, стадии и/или части, но только если дополнительные ингредиенты, стадии и/или части фактически не изменяют основных и новых характеристик заявляемых композиции, способа или структуры.

Применяемая в настоящем описании единственная форма «a», «an» и «the» включает ссылки на множественную, если в контексте ясно не указано иначе. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере, одно соединение» может включать множество соединений, включая их смеси.

На протяжении этой заявки различные варианты осуществления данного изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Должно быть понятно, что описание в формате диапазонов дается просто для удобства и краткости и не должно толковаться как жесткое ограничение объема изобретения. Соответственно, описание диапазона должно рассматриваться как необходимое раскрытие всех возможных подгрупп диапазона, а также индивидуальных цифровых величин в пределах диапазона. Например, описание такого диапазона, как от 1 до 6, должно рассматриваться как имеющее конкретно раскрытые подгруппы диапазона, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также индивидуальные числа в пределах диапазона, например 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применяется независимо от широты диапазона.

Всякий раз, когда в настоящем описании указывается цифровой диапазон, подразумевается, что он включает любые процитированные числа (дробные или целые) в пределах указанного диапазона. Выражения «размах диапазонов/диапазоны между», первое указывает число и второе указывает число, и «размах диапазонов/диапазоны от» первое указывает число «до», второй указывает число, они используются в настоящем описании взаимозаменяемо и подразумевают включение первого и второго указанных чисел и все дробные и целые числа между ними.

Применяемый в настоящем описании термин «способ» относится к образу действий, способам, методам и процедурам для осуществления данной задачи, включая, но не ограничиваясь этим, такие образ действия, способы, методы и процедуры, которые либо известны, либо легко разрабатываются на основе известных образа действий, способов, методов и процедур практикующими специалистами в химической, фармакологической, биологической, биохимической и медицинской областях техники.

Должно быть понятно, что определенные отличительные признаки изобретения, которые для ясности описываются в контексте отдельных вариантов осуществления, могут также предлагаться в сочетании в одном варианте осуществления. Наоборот, различные отличительные признаки изобретения, которые для краткости описываются в контексте одного варианта осуществления, могут также предлагаться отдельно или в любом подходящем более дробном сочетании или как это подходит для любого другого описанного варианта осуществления изобретения. Определенные отличительные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться как необходимые отличительные признаки этих вариантов осуществления до тех пор, пока вариант осуществления становится не эффективным без этих элементов.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, как определено в настоящем описании выше и как заявлено в разделе формулы изобретения ниже, находят экспериментальное подтверждение в последующих примерах.

ПРИМЕРЫ

В настоящий момент делается ссылка на последующие примеры, которые совместно с представленным выше описанием иллюстрируют изобретение в неограничивающей форме.

В целом используемая в настоящем описании номенклатура и применяемые в настоящем изобретении лабораторные методы включают молекулярные, биохимические, микробиологические методы и методы рекомбинантной ДНК. Такие методы полностью раскрыты в литературе. См., например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методы, представленные в патентах США № № 4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммунотесты широко описываются в патентной и научной литературе, см., например, патенты США № № 3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. L, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) и "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все они включены в качестве ссылки, как если бы полностью были изложены в настоящем описании. На всем протяжении настоящего документа предлагаются другие общие ссылки. Используемые в настоящем описании методы, как считается, должны быть хорошо известны в данной области техники и предлагаются для удобства читателя. Вся содержащаяся в них информация включена в настоящее описание в качестве ссылки.

ПРИМЕР 1

Методы создания 3D прикрепляющихся клеток из плаценты

Прикрепляющиеся клетки получали, как описано ранее (см. WO/2007/108003), в биореакторной системе, содержащей 3D носители, для получения 3D-прикрепляющихся клеток (обозначаемых в настоящем описании как PLX).

Материалы и экспериментальные процедуры

Прикрепляющиеся клетки из плаценты

Внутренние части доношенной плаценты (медицинский центр Bnei Zion, Haifa, Израиль) вырезали в стерильных условиях, промывали 3 раза буфером Хэнка и инкубировали в течение 3 часов при 37°С с 0,1% коллагеназой (1 мг/мл ткани; Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO). Путем мягкого пипетирования суспендированные клетки затем промывали DMEM с добавкой 10% FCS, смеси Pen-Strep-Nystatin (100 Ед/мл:100 мкг/мл:1,25 Ед/мл) и 2 мМ L-глутамина, высевали в сосуды 75 см² и инкубировали при 37°С в инкубаторе для клеточных культур в условиях увлажнения с 5% CO₂.

Двумерное (2D) выращивание клеток

Клеткам давали прикрепиться к поверхности пластика в течение 72 часов, после чего среду меняли через каждые 3-4 дня. После 2-3 пассажей клетки хранили при криогенной температуре, размораживали и высевали для повторного выращивания в сосудах. После достижения 60-80% конфлуентности клетки отделяли от сосуда для выращивания с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА и высевали в новые сосуды (обычно через каждые 3-5 дней) с проведением 2-5 дополнительных пассажей. После этого культивированные клетки собирали для анализа или для культивирования в биореакторах.

Биореактор PluriX ^TM Plug Flow

Биореактор PluriX ^TM Plug Flow (Pluristem, Haifa, Израиль; см. патент США № 6911201 и WO/2007/108003) загружали 1-100 мл 3-мерных пористых носителей (4 мм в диаметре), изготовленных из матрикса нетканого полотна или полиэфира. Эти носители способны обеспечить размножение большого количества клеток в относительно небольшом объеме. Стеклянная посуда была разработана и произведена Pluristem (Pluristem, Haifa, Израиль). Биореактор помещали в инкубатор при 37°С при скорости потока, регулируемой и отслеживаемой с помощью клапана и перистальтического насоса. Биореактор содержит порт для введения образца и инъекции, обеспечивающий последовательное высевание клеток. Культуральная среда с pH 6,7-7,4 поступала из резервуара. В резервуар вводили отфильтрованную газовую смесь, содержащую воздух/CO₂/O₂ в разных соотношениях в зависимости от плотности клеток в биореакторе. Доля O₂ доводилась по уровню растворенного О₂ на выходе биореактора, определяемого с помощью монитора. Газовую смесь направляли в резервуар через силиконовые трубки или диффузор (Degania Bet, Emek Hayarden, Израиль). Культуральную среду пропускали через сепарирующий контейнер, обеспечивающий сбор циркулирующих, неприкрепленных клеток. Циркуляция среды обеспечивалась перистальтическим насосом. Биореактор был дополнительно снабжен дополнительным портом для введения образца и контейнерами для непрерывной замены среды.

Получение 3D-прикрепленных клеток (PLX)

Неконфлуентные первичные 2D культуры прикрепленных клеток человека, выращенные, как описано выше, обрабатывали трипсином, промывали, ресуспендировали в DMEM с добавкой 10% FCS, смеси Pen-Strep-Nystatin (100 Ед/мл:100 мкг/мл:1,25 Ед/мл) и 2 мМ L-глутамина и высевали (10³-10⁵ клеток/мл) через порт для инъекций на 3D носители в стерильном биореакторе Plug Flow. Перед инокуляцией биореактор наполняли PBS-Ca-Mg (Biological Industries, Beit Ha'emek, Израиль), автоклавировали (120°С, 30 мин) и промывали средой для выращивания по Дульбекко, содержащей 10% инактивированную нагреванием сыворотку плодов телят и смесь Pen-Strep-Nystatin (100 Ед/мл:100 мкг/мл:1,25 Ед/мл). Скорость потока поддерживали на уровне 0,1-5 мл/мин. Процесс высевания включал прекращение циркуляции на 2-48 ч, что тем самым давало возможность клеткам осесть на носители. Биореактор поддерживали в условиях контролируемых температуры (37°С) и pH (pH 6,7-7,4) с помощью инкубатора, снабжаемого стерильным воздухом и CO ₂ по мере необходимости. Среду для выращивания меняли 2-3 раза в неделю. Циркулирующую среду заменяли свежей средой DMEM через каждые 4 часа - 7 дней. При плотности клеток 1×10 ⁶-1×10⁷ клеток/мл (после 12-40 дней выращивания) из биореактора удаляли всю среду и биореактор и носители промывали 3-5 раз ЗФР. 3D-прикрепленные клетки отделяли от носителей с помощью трипсина-ЭДТА (Biological Industries, Beit Ha'emek, Израиль; 3-15 минут при легком перемешивании, 1-5 раз) и затем ресуспендировали в DMEM и хранили при криогенной температуре.

ПРИМЕР 2

Методы получения 2D-прикрепляющихся клеток для использования в соответствии с настоящими указаниями и получения тем самым 2D прикрепляющихся клеток

Получали 2D прикрепляющиеся клетки, проявляющие свойства, отличные от свойств описанных выше 3D прикрепляющихся клеток (PLX, пример 1). После этого 2D прикрепленные клетки из костного мозга или плаценты выращивали в условиях, стимулирующих дифференцировку остеоцитов или адипоцитов.

Материалы и экспериментальные процедуры

Процесс получения 2D прикрепленных клеток

Получение ткани человека

Все плаценты были получены в родильном отделении с одобрения Комитета Хельсинки по медицинской помощи. Соответственно, все доноры плаценты подписывали информированное согласие, и производились скрининг доноров и тестирование доноров (IPC1). Сразу после получения плаценты от донора (во время процедуры кесарева сечения) ее помещали в стерильный пластиковый мешок и затем в пенопластовую коробку с мешочками льда. Плаценту вывозили и немедленно помещали в карантинную зону до получения разрешения для использования со стороны контроля качества (QC) и гарантирования качества (QA). Все последующие стадии получения производили в карантине, приспособленной чистой комнате до поступления утвержденных QC результатов теста на микоплазму, и клетки выделяли для 2D выращивания клеток.

Выделение и обработка прикрепляющихся клеток

Сначала плаценту разрезали на кусочки в асептических условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком, промывали буферным раствором Хэнка и инкубировали в течение 3 часов при 37°С с 0,1% коллагеназой (1 мг коллагеназы/мл ткани). Добавляли 2D клеточную среду (2D среда, включающая DMEM с добавлением 10% FBS, 0,25 мкг/мл фунгизона и 50 мкг/мл гентамицина) и переваренную ткань грубо фильтровали через стерильную металлическую сетку, собирали в стерильный стакан и центрифугировали (10 минут, 1200 об/мин, 4°С). С помощью легкого пипетирования суспендированные клетки затем промывали 2D средой с добавлением антибиотиков, высевали в 80 см² сосуды и инкубировали при 37°С в инкубаторе для тканевой культуры в условиях увлажнения с подачей 5% CO₂. Спустя 2-3 дня, в течение которых клеткам давали возможность прикрепиться к поверхности сосуда, клетки промывали ЗФР и добавляли 2-мерную среду.

Двумерное (2D) выращивание клеток

Перед первым пассажем образцы среды для выращивания в количестве 10% от общего количества сосудов в карантине объединяли и сдавали на тестирование микоплазмы (IPC2). Если обнаруживалось, что клетки негативны в отношении микоплазмы (набор EZ-PCR Micoplasma, Biological Industries, Israel), клетки освобождались из карантина. После 1-2 дополнительных пассажей клетки переносили в чистую комнату для получения 2D культуры (2DP). В комнате 2DP культивирование продолжали посредством еще 3-5 пассажей (отметим, что клетки выращивали в 2D среде с добавлением антибиотиков до пассажа 2, после чего выращивали в 2D среде без антибиотиков). После пассажа 4 отбирали образец IPC-3 для определения иммунологического фенотипа. На протяжении процесса культуры выращивали в инкубаторе для культуры ткани в условиях увлажнения с 5% CO₂ при 37°С. После в общей сложности 6-8 пассажей (9-16 удвоений клеток) клетки собирали и хранили при криогенной температуре в качестве запаса 2D клеток (2DCS).

Первый пассаж обычно проводили спустя 10-15 дней. Начиная с пассажа 2 вплоть до пассажа 6-8 клетки пассировали при достижении культурой 70-80% конфлуентности, обычно через 3-5 дней (1,5-2 удвоение). Клетки отделяли от сосудов с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА (4 минуты при 37°С) и высевали с получением плотности культуры 3±0,2×10³ клеток/см². Размер сосудов для тканевой культуры увеличивали в соответствии с продолжением пассажей. Процесс культивирования начинали в сосуде для культуры ткани 80 см², продолжали в 175 см², затем в 500 см² (утроенный сосуд) и, наконец, клетки высевали в клеточную фабрику из 10 подносов (6320 см²).

Перед хранением при криогенной температуре в конце периода выращивания 2DSC собирали среду для выращивания и получали образец для отсылки в сертифицированную GLP лабораторию для тестирования микоплазмы (IPC4).

Процедура криоконсервации запасаемого продукта 2D клеток

Для криоконсервации 2DCS 2D культивируемые клетки собирали в асептических условиях с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА. Клетки центрифугировали (1200 об/мин, 10 мин, 4°С), подсчитывали и ресуспендировали в 2D среде.

Для замораживания клеточные суспензии разбавляли 1:1 2D средой для замораживания (конечные концентрации составляли 10% ДМСО, 40% ЗФР и 50% 2D среды). Из одной плаценты получали приблизительно 1,5-2,5×10 ⁹ клеток. 4 мл клеток хранили при конечной концентрации 10×10⁶/мл в 5-мл полипропиленовых сосудах для криоконсервации. Сосуды помечали и переносили в морозильник с контролируемой скоростью охлаждения для процесса с постепенным снижением температуры (1°С/мин), после чего их переносили для хранения в газовую фазу морозильника на жидком азоте, находящегося в комнате для хранения с охлаждением. Этот материал обозначали как запасаемая партия 2D клеток (2DCS).

Анализ клеточного цикла

2D прикрепляющиеся клетки и клетки PLX фиксировали 70% EtOH O.N, центрифугировали и ресуспендировали в растворе пропидия йодида (PI), содержащем 2 мкг/мл PI (Sigma), 0,2 мг/мл РНКазы A (Sigma) и 0,1% (об./об.) тритона (Sigma) в течение 30 минут. Клеточный цикл анализировали с помощью FACS.

Матрица (микроматрица) для анализа экспрессии генов

Прикрепляющиеся клетки получали из доношенных плацент человека и размножали с помощью 2D культур или в соответствии с указаниями WO/2007/108003 (как подробно описано в примерах 1-2). Для дальнейшего анализа было получено по три разных партии клеток при использовании каждого из методов размножения.

Из клеток экстрагировали РНК (набор Qiagen-Rneasy micro) и наносили на матрицу Affymetrix экспрессии всего генома GeneChip® Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, California, США).

Анализ мембранных маркеров с помощью FACS

Клетки окрашивали моноклональными антителами, как описано ранее. Вкратце, 400000-600000 клеток суспендировали в 0,1 мл буфера для проточного цитометра в 5-мл пробирке для тестирования в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) в темноте с каждым из следующих моноклональных антител (MAbs): конъюгированным с FITC MAb против CD29 человека (eBioscience), конъюгированным с PE MAb против CD73 человека (Becton Dickinson), конъюгированным с PE MAb против CD105 человека (eBioscience), конъюгированным с PE MAb против CD90 человека (Becton Dickinson), конъюгированным с FITC MAb против CD45 человека (IQProducts), конъюгированным с PE MAb против CD19 человека (IQProducts), конъюгированным с PE MAb против CD14 человека (IQProducts), конъюгированным с FITC MAb против HLA-DR человека (IQProducts), конъюгированным с PE MAb против CD34 человека (IQProducts), конъюгированным с FITC MAb против CD31 человека (eBioscience), конъюгированным с FITC MAb против KDR человека (R&D systems), MAb против маркера фибробластов человека (D7-FIB) (ACRIS), конъюгированным с FITC MAb против CD80 человека (BD), конъюгированным с FITC MAb против CD86 человека (BD), конъюгированным с FITC MAb против CD40 человека (BD), конъюгированным с FITC MAb против HLA-ABC человека (BD), конъюгированным с FITC изотипом IgG1 (IQ Products), конъюгированным с PE изотипом IgG1 (IQ Products).

Клетки промывали дважды буфером для проточного цитометра, ресуспендировали в 500 мкл буфера для проточного цитометра и анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Coulter). Отрицательные контроли получали с флуоресцирующими молекулами соответствующего изотипа.

Анализ иммуномодуляции

Мононуклеарные клетки от человека (MNCs) выделяли из периферической крови. Суспензию 200000 MNCs на 200 мкл среды (среда RPMI 1640, содержащая 20% ЗФР на 96 лунок) стимулировали 10 мкг PHA/мл (SIGMA) в присутствии 20000 2D прикрепленных клеток в течение 5 дней в условиях увлажнения, 5% CO₂ при 37°С. Использовали 4 разные партии 2D прикрепленных клеток. Три повтора каждой группы высевали в 96-луночный планшет. В период последних 18 ч 5-дневного культивирования клетки подвергали импульсному воздействию 1 мкКи ³ H-тимидина и затем собирали на стекловолоконном фильтре. Захват тимидина количественно оценивали с помощью сцинтилляционного счетчика.

Индукция остеогенеза в 2D прикрепленных клетках

Остеогенез проводили в соответствии с набором для остеогенеза Chemicon (cat № scr028, Millipore, MA, США).

Среда для индукции остеогенеза

Готовили свежую среду для индукции остеогенеза перед каждой сменой среды с использованием компонентов набора (см. таблицу 1 ниже).

Таблица 1
Компоненты среды для остеогенеза
Компонент	Исходная концентрация	Количество	Конечная концентрация
DMEM с низким содержанием глюкозы (Invitrogen, Gibco)		8,7 мл	87%
Сыворотка (инактивированная нагреванием)		1 мл	10%
Дексаметазон	1 мМ	1 мкл	0,1 мкМ
Раствор аскорбиновой кислоты-2-фосфата	0,1 М	20 мкл	0,2 мМ
Раствор глицеро-2-фосфата	1 М	100 мкл	10 мМ
L-глутамин	Х 100	100 мкл	Х 1
Pen&Strep	Х 100	100 мкл	Х 1

Для получения 1 мМ раствора дексаметазона к 100 мкл 10 мМ раствора дексаметазона добавляли 900 мкл этанола. Исходный раствор хранили вместе с другими компонентами набора при -20°С. Сосуд с 50 мл сыворотки инактивировали нагреванием, разделяли на 5-мл аликвоты и хранили при -20°С до использования.

Покрытие 24-луночных планшетов для культивирования тканей

Смесь для покрытия, включающую 12 мкг/мл витронектина и 12 мкг/мл коллагена (оба входят в состав набора), готовили разбавлением каждого из них 1×ЗФР.

После этого смесь для покрытия добавляли в лунки для покрытия поверхностей лунки (готовили 5 лунок x 2 планшета). Планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После этого смесь для покрытия удаляли и лунки промывали ЗФР. Планшеты осушали непосредственно перед использованием.

Выращивание клеток

Клетки из плаценты (plc11-3-1) или клетки из костного мозга (BM108) помещали (200000 клеток на лунку) в 1 мл среды для выращивания, включающей DMEM (Invitrogen, Gibco), 10% FCS (Invitrogen, Gibco), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 45 мкг/мл гентамицина-IKA (Teva Medical) и 0,25 мкг/мл фунгизона (Invitrogen, Gibco). Клетки из плаценты (4 лунки × 2 планшета) или клетки из костного мозга (1 лунка × 2 планшета) выращивали до 100% конфлуентности (обычно в течение ночи) перед инициацией остеогенной дифференцировки.

После достижения клетками 100% конфлуентности среду для выращивания отсасывали и заменяли 1 мл среды для индукции остеогенеза (день 1 дифференцировки). Среду для индукции остеогенеза заменяли свежей средой каждые 2-3 дня на протяжении в общей сложности 14-17 дней.

В качестве контроля один из двух планшетов (для каждого типа клеток) инкубировали не со средой для остеогенной дифференцировки, а со средой для выращивания (описанной в настоящем описании выше).

На 17 день остеоциты фиксировали и окрашивали раствором ализаринового красного, как описано подробно ниже.

Протокол окрашивания

Окрашивание остеоцитов производили, начиная с осторожного отсасывания среды из каждой лунки (осторожного, чтобы не отсосать клетки). Затем клетки фиксировали инкубацией в охлажденном на льду 70% этаноле в течение 1 часа при комнатной температуре. Спирт затем осторожно отсасывали и клетки промывали дважды водой (5-10 минут на каждую промывку). Воду затем отсасывали и к клеткам добавляли раствор ализаринового красного (500-1000 мкл). Клетки инкубировали с раствором ализаринового красного при комнатной температуре в течение 30 минут. Ализариновый красный удаляли и клетки промывали 4 раза 1 мл воды и осушали после каждой промывки. Наконец, в каждую лунку добавляли 1-1,5 мл воды для предотвращения высыхания клеток. Планшеты микроскопически визуализировали с помощью инвертированного микроскопа Nikon.

Индукция остеогенеза в модифицированной среде для индукции остеогенеза (2D прикрепленные клетки)

Среду для индукции остеогенеза готовили заново перед каждой заменой среды с использованием компонентов, перечисленных в таблице 2 ниже, вместе с витамином D.

Таблица 2
Компоненты среды для остеогенеза
Компонент	Исходная концентрация	Количество	Конечная концентрация
DMEM с высоким содержанием глюкозы (Biological Industries, Bet Haemek, Израиль)		8,7 мл	87%
L-глутамин	Х 100	100 мкл	Х 1
Сыворотка (инактивированная нагреванием)		1 мл	10%
Дексаметазон (Chemicon)	10 мМ	10 мкл	10 мкМ
Раствор аскорбиновой кислоты-2-фосфата (Chemicon)	0,1 М	20 мкл	0,2 мМ
Раствор глицеро-2-фосфата (Chemicon)	1 М	100 мкл	10 мМ
Витамин D (Sigma)	10 мкМ	10 мкл	10 нМ
Гентамицин (Biological Industries, Bet Haemek, Израиль)	Х 100	100 мкл	Х 1

Сосуд с 50 мл сыворотки инактивировали нагреванием, разделяли на 5-мл аликвоты и хранили при -20°С до использования.

Покрытие 48-луночных планшетов для культивирования тканей

Смесь для покрытия, включающую 12 мкг/мл витронектина и 12 мкг/мл коллагена (оба от Chemicon), готовили разбавлением каждого из них 1×ЗФР.

После этого смесь для покрытия добавляли в лунки для покрытия поверхностей лунки (готовили 5 лунок × 2 планшета). Планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После этого смесь для покрытия удаляли и лунки промывали один раз ЗФР. Планшеты осушали непосредственно перед использованием.

Выращивание клеток

Клетки из плаценты (фетальные клетки PLC 8-2-1, PLC 15 3-4-2 или PLC 19-4-3-1) помещали (100000 клеток на лунку) в 0,5 мл среды для выращивания, включающей DMEM (Invitrogen, Gibco), 10% FCS (Invitrogen, Gibco), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 45 мкг/мл гентамицина-IKA (Teva Medical) и 0,25 мкг/мл фунгизона (Invitrogen, Gibco) (4 лунки × 2 планшета). Клетки из костного мозга (BM109) помещали (150000 клеток на лунку) в 0,5 мл среды для выращивания (как описано выше) (1 лунка × 2 планшета). Клетки выращивали до 10% конфлуентности (обычно в течение ночи) перед инициацией остеогенной дифференцировки.

После достижения клетками 100% конфлуентности среду для выращивания отсасывали и заменяли 0,5 мл среды для индукции остеогенеза (день 1 дифференцировки). Среду для индукции остеогенеза заменяли свежей средой каждые 2-3 дня на протяжении в общей сложности 26 дней.

В качестве контроля один из двух планшетов (для каждого типа клеток) инкубировали не со средой для остеогенной дифференцировки, а со средой для выращивания (описанной в настоящем описании выше).

На 26 день остеоциты фиксировали и окрашивали раствором ализаринового красного, как описано подробно ниже.

Протокол окрашивания

Окрашивание остеоцитов производили, начиная с осторожного отсасывания среды из каждой лунки (осторожного, чтобы не отсосать клетки). Затем клетки фиксировали инкубацией в охлажденном на льду 70% этаноле в течение 1 часа при комнатной температуре. Спирт затем осторожно отсасывали и клетки промывали дважды водой (5-10 минут на каждую промывку). Воду затем отсасывали и к клеткам добавляли раствор ализаринового красного (500-1000 мкл). Клетки инкубировали с раствором ализаринового красного при комнатной температуре в течение 30 минут. Ализариновый красный удаляли, и клетки промывали 4 раза 1 мл воды и осушали после каждой промывки. Наконец, в каждую лунку добавляли 1-1,5 мл воды для предотвращения высыхания клеток. Планшеты микроскопически визуализировали с помощью инвертированного микроскопа Nikon.

Индукция адипогенеза в 2D прикрепленных клетках

Адипогенез проводили в соответствии с набором для адипогенеза Chemicon (набор для адипогенеза Chemicon, cat № scr020, Millipore, MA, США).

Среда для индукции адипогенеза

Среды для индукции или поддержания адипогенеза готовили непосредственно перед каждой заменой среды с использованием компонентов, описанных в таблицах 3 и 4 ниже.

Таблица 3
Компоненты среды для индукции адипогенеза
Компонент	Исходная концентрация	Количество	Конечная концентрация
DMEM с низким содержанием глюкозы (Biological Industries, Bet Haemek, Израиль)		4,4 мл	90%
Сыворотка (инактивированная нагреванием)		0,5 мл	10%
Дексаметазон (Sigma)	10 мМ	0,5 мкл	1 мкМ
IBMX (Sigma)	0,5 М	5 мкл	0,5 мМ
Инсулин (Sigma)	10 мг/мл	5 мкл	10 мкг/мл
Индометацин (Sigma)	10 мМ	50 мкл	100 мкМ
Pen & Strep	Х 100	50 мкл	Х 1

Таблица 4
Компоненты среды для поддержания адипогенеза
Компонент	Исходная концентрация	Количество	Конечная концентрация
DMEM с низким содержанием глюкозы		4,4 мл	90%
Сыворотка (инактивированная нагреванием)		0,5 мл	10%
Инсулин (Sigma)	10 мг/мл	5 мкл	10 мкг/мл
Pen & Strep	Х 100	50 мкл	Х 1

Выращивание клеток

Клетки из плаценты (plc11-3-1) или клетки из костного мозга (BM108) помещали (200000 клеток на лунку) в 1 мл среды для выращивания, включающей DMEM (Invitrogen, Gibco), 10 % FCS (Invitrogen, Gibco), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 45 мкг/мл гентамицина-IKA (Teva Medical) и 0,25 мкг/мл фунгизона (Invitrogen, Gibco). Клетки из плаценты (4 лунки × 2 планшета) или клетки из костного мозга (1 лунка × 2 планшета) выращивали до 10% конфлуентности (обычно в течение ночи) перед инициацией адипогенной дифференцировки.

После достижения клетками 100% конфлуентности среду для выращивания отсасывали и заменяли 1 мл среды для индукции адипогенеза (день 1 дифференцировки). Среду для индукции адипогенеза заменяли свежей средой каждые 2-3 дня на протяжении в общей сложности 25 дней (как подробно описано в таблице 5 ниже в настоящем описании). Отметим, что монослои адипогенных клеток были чрезвычайно хрупкими и могли быть легко удалены с планшетов, в связи с чем замены среды производили путем аккуратных замен среды во избежание разрушения липидных капель.

В качестве контроля один из двух планшетов (для каждого типа клеток) инкубировали не со средой для адипогенной дифференцировки, а со средой для выращивания (описанной в настоящем описании выше).

Таблица 5
Схема адипогенной дифференцировки
День	Среда
1	Среда для индукции адипогенеза
3	Среда для индукции адипогенеза
5	Среда для индукции адипогенеза
7	Среда для поддержания адипогенеза
9	Среда для индукции адипогенеза
11	Среда для индукции адипогенеза
13	Среда для индукции адипогенеза
15	Среда для поддержания адипогенеза
17	Среда для индукции адипогенеза
19	Среда для индукции адипогенеза
21	Среда для индукции адипогенеза

На 25 день адипоциты фиксировали и окрашивали раствором масляного красного, как подробно описано ниже.

Протокол окрашивания

Окрашивание адипоцитов производили, начиная с осторожного отсасывания среды из каждой лунки (осторожного, чтобы не отсосать клетки). Затем клетки фиксировали инкубацией в 4% параформальдегиде в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Фиксатор затем осторожно отсасывали и клетки промывали три раза ЗФР (5-10 минут на каждую промывку). ЗФР затем отсасывали и клетки дважды промывали водой. После этого воду отсасывали и к клеткам добавляли раствор масляного красного (500-1000 мкл). Клетки инкубировали с раствором масляного красного при комнатной температуре в течение 50 минут. Раствор масляного красного удаляли и клетки промывали 4 раза 1 мл воды и осушали после каждой промывки. Наконец, в каждую лунку добавляли 1-1,5 мл воды для предотвращения высыхания клеток. Планшеты микроскопически визуализировали с помощью инвертированного микроскопа Nikon.

Получение раствора масляного красного

Использовали 0,25 г исходного масляного красного, который растворяли в 50 мл изопропанола путем инкубации 10-15 мин в бане при 37°С.

Для использования 30 мл исходного красителя смешивали с 20 мл DDW (оставляли на 10 минут и затем фильтровали через бумажный фильтр для кофе). Раствор масляного красного готовили заново для каждого использования.

Индукция адипогенеза в модифицированной среде для индукции адипогенеза (2D прикрепленные клетки)

Среду для индукции адипогенеза готовили заново перед каждой заменой среды с использованием компонентов, описанных в таблице 6 ниже.

Таблица 6
Компоненты среды для индукции адипогенеза
Компонент	Исходная концентрация	Количество	Конечная концентрация
DMEM с низким содержанием глюкозы		4,4 мл	90%
Сыворотка (инактивированная нагреванием)		0,5 мл	10%
Дексаметазон (Sigma)	1 мМ	5 мкл	1 мкМ
IBMX (Sigma)	0,5 М	5 мкл	0,5 мМ
Инсулин (Sigma)	10 мг/мл	5 мкл	10 мкг/мл
Индометацин (Sigma)	10 мМ	200 мкл	100 мкМ
Гентамицин (Biological Industries)		10 мкл

Выращивание клеток

Клетки из плаценты (фетальные клетки PLC 8-2-1, PLC 15 3-4-2 или PLC 19-4-3-1) помещали (100000 клеток на лунку) в 0,5 мл среды для выращивания, включающей DMEM (Invitrogen, Gibco), 10% FCS (Invitrogen, Gibco), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 45 мкг/мл гентамицина-IKA (Teva Medical) и 0,25 мкг/мл фунгизона (Invitrogen, Gibco) (5 лунок × 2 планшета).

Клетки из костного мозга (BM109) помещали (100000 клеток на лунку) в 0,5 мл среды для выращивания, включающей DMEM (Invitrogen, Gibco), 10% FCS (Invitrogen, Gibco), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 45 мкг/мл гентамицина-IKA (Teva Medical) и 0,25 мкг/мл фунгизона (Invitrogen, Gibco) (4 лунки × 2 планшета). Клетки выращивали до 100% конфлуентности (обычно в течение ночи) перед инициацией адипогенной дифференцировки.

После достижения клетками 100% конфлуентности среду для выращивания отсасывали и заменяли 0,5 мл среды для индукции адипогенеза (день 1 дифференцировки). Среду для индукции адипогенеза заменяли свежей средой каждые 2-3 дня на протяжении в общей сложности 3-4 недель.

В качестве контроля один из двух планшетов (для каждого типа клеток) инкубировали не со средой для адипогенной дифференцировки, а со средой для выращивания (описанной в настоящем описании выше).

На 26 день адипоциты фиксировали и окрашивали раствором масляного красного, как описано подробно ниже.

Протокол окрашивания

Окрашивание адипоцитов производили, начиная с осторожного отсасывания среды из каждой лунки (осторожного, чтобы не отсосать клетки). Затем клетки фиксировали инкубацией в 4% параформальдегиде в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Фиксатор затем осторожно отсасывали и клетки промывали три раза ЗФР (5-10 минут на каждую промывку). ЗФР затем отсасывали и клетки дважды промывали водой. После этого воду отсасывали и к клеткам добавляли раствор масляного красного (500-1000 мкл). Клетки инкубировали с раствором масляного красного при комнатной температуре в течение 50 минут. Раствор масляного красного удаляли и клетки промывали 3 раза 1 мл дважды дистиллированной воды и осушали после каждой промывки. Наконец, в каждую лунку добавляли 1-1,5 мл воды для предотвращения высыхания клеток. Планшеты микроскопически визуализировали с помощью инвертированного микроскопа Nikon.

Получение раствора масляного красного

Использовали 0,25 г исходного масляного красного, который растворяли в 50 мл изопропанола путем инкубации 10-15 мин в бане при 37°С.

Для использования 30 мл исходного красителя смешивали с 20 мл DDW (оставляли на 10 минут и затем фильтровали через бумажный фильтр для кофе). Раствор масляного красного готовили заново для каждого использования.

Результаты

Как показано в таблице 7 ниже, обработка 2D прикрепленных клеток, пригодных для использования в соответствии с настоящими указаниями, отличается от стадии 2D PLX (WO/2007/108003) в нескольких аспектах. Во-первых, в новую среду для культивирования 2D прикрепленных клеток антибиотики добавляли только во время начальной стадии культивирования (вплоть до пассажа 2). Кроме того, новые 2D прикрепленные клетки криоконсервировали лишь после 5-8 пассажей (т.е. в конце культуры), а не во время промежуточных стадий 2D роста, как в случае процесса PLX.

Таблица 7
Сравнение 2D прикрепленных клеток, пригодных для использования в соответствии с настоящими указаниями, с клетками, полученными для PLX в WO/2007/108003
Параметр	WO/2007/108003	2D прикрепленные клетки настоящих указаний
Сосуд для культуры ткани	80 см2 и 175 см2	175 см2, утроенные сосуды и Multi Tray
Среда с добавкой антибиотиков	На всех стадиях процесса	До пассажа 2 (включительно)
Криоконсервация 2DCS	После 2-3 пассажей, затем криоконсервировали, размораживали и высевали для вторичного выращивания в сосудах на протяжении 2-5 пассажей перед высевом в биореактор	После 2-3 пассажей, затем криоконсервировали и размораживали перед использованием
Контейнер для замораживания	2-мл криогенные сосуды	5-мл криогенные сосуды
Замораживаемый объем	1-1,5 мл	4 мл
Метод замораживания	Контейнер для замораживания (содержит изопропиловый спирт)	Морозильник с контролируемой скоростью

Изменения в процессе получения 2D прикрепленных клеток привели к изменениям в свойствах полученных клеток. Эти различия суммированы в настоящем описании ниже.

Анализ клеточного цикла 2D прикрепленных клеток по сравнению с 3D прикрепленными клетками WO/2007/108003 - 2D прикрепленные клетки сравнивали с 3D прикрепленными клетками для оценки распределения клеток между разными фазами клеточного цикла. Как ясно из фиг.1A-B, 2D прикрепленные клетки проявляли типичный пролиферативный профиль (распределение клеток между разными фазами клеточного цикла). Конкретно, 28% клеток находились в S и G2/M фазах (фиг.1A). Эти результаты показали, что клетки были собраны во время пролиферации и что условия культивирования поддерживали клеточный рост.

Напротив, 3D прикрепленные клетки проявляли меньшую скорость клеточной пролиферации. Менее 8% клеток находились в S и G2/M фазах (фиг.1B). Эти результаты показали, что клетки были собраны тогда, когда имел место низкий уровень пролиферации, и что условия в биореакторе были субоптимальными для поддержания клеточного роста.

Сравнение между 2D клетками, пригодными для использования в соответствии с настоящими указаниями, и клетками, полученными по указаниям WO/2007/108003, с помощью микроматриц. Анализ экспрессии генов с помощью микроматриц позволил одновременно отследить профили экспрессии всего генома прикрепленных клеток, полученных из плацент человека с доношенной беременностью, размноженных с помощью 2D культур или в соответствии с указаниями WO/2007/108003 (PLX, см. пример 1 в настоящем описании выше). Эти результаты позволили оценить молекулярный механизм, лежащий в основе фенотипического различия между клетками, полученными с помощью этих разных методов выращивания (см. таблицу 8 ниже).

Таблица 8
Экспрессия генов в 2D прикрепленных клетках, пригодных для использования в соответствии с настоящими указаниями, по сравнению с генами, экспрессированными PLX WO/2007/108003
Ген	2D против Plurix (кратность изменения)	Величина p (доведенная)
индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами	21,82	0,0401812
аргининаминопептидаза из лейкоцитов	14,56	3,88E-06
сигнальный пептид, домен CUB, EGF-подобный 3	10,82	0,0255115
гомолог 1 dickkopf (Xenopus laevis)	6,84	3,06E-07
интегрин, альфа 6	6,76	0,0411667
кератин 27 псевдоген 27	6,39	0,000224998
сходный с кератином, типа I цитоскелетный 18 (цитокерати	6,24	0,000304949
альдегиддегидрогеназа семейства 1, член A1	5,84	0,00145807
сопряженный с G-белками рецептор, семейство C, группа 5, член A	5,75	3,39E-05
фактор свертывания III (тромбопластин, тканевой фактор)	5,55	0,012192
ингибитор 3 циклинзависимой киназы (ассоциированный с CDK2 двойной	5,51	0,000732492
сопряженный с G-белками рецептор 126	5,50	0,00197635
содержащий домен DEP 1	5,41	0,000370513
белок 1, связывающий SH2-домен SHC	4,96	0,00430878
белок центросомы 55 кДа	4,78	0,0021952

индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами	4,66	0,0139777
NUF2, компонент NDC80 кинетохорного комплекса, гомолог (S. cere	4,61	0,00276524
mal, подобный белку дифференцировки T-клеток	4,44	0,00664216
индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами	4,42	0,00357376
член 18 семейства кинезина	4,33	0,00134108
холинергический рецептор, мускариновый 2	4,07	0,0320078
цикл деления клеток 2, от G1 к S и от G2 к M	4,06	0,0017111
не-SMC комплекс конденсина I, субъединица G	4,06	0,00537097
denticleless гомолог (Drosophila)	4,06	0,00141153
shugoshin-подобный 1 (S. pombe)	4,00	0,00101318
открытая рамка считывания 3 хромосомы 13	3,98	0,000548296
связывающая PDZ киназа	3,97	0,00784983
цитозольный белок 1 лимфоцитов (L-пластин)	3,97	0,0049584
WAS	3,96	0,00178153
циклин E2	3,94	0,000203389
катепсин C	3,93	0,00532262
интегрин, альфа 4 (антиген CD49D, альфа 4 субъединица VLA-4	3,91	0,0158411
KIAA0101	3,90	0,0105909
член 20A семейства кинезина	3,90	0,00582352
рецептору опиоидного фактора роста подобный 1	3,87	0,00114551

аниллин, связывающий актин белок	3,83	0,010923
катенин (ассоциированный с кадгерином белок), альфа-подобный 1	3,76	7,46E-05
гомолог 20 цикла деления клеток (S. cerevisiae)	3,70	0,00514206
diaphanous гомолог 3 (Drosophila)	3,69	0,00107709
семейство со сходством последовательности 111, член B	3,69	0,000125819
киназа A аврора	3,66	0,00632571
фактор роста фибробластов 7 (фактор роста кератиноцитов)	3,64	0,0328983
материнская эмбриональная киназа с лейциновой застежкой-молнией	3,63	0,00908391
ингибитор диссоциации Rho ГДФ (GDI) бета	3,63	0,00200066
белок N центромеры	3,62	0,000540143
MAD2 недостаточность остановки митоза-подобный 1 (дрожжи)	3,62	0,00488102
тимидилатсинтаза	3,61	0,00685584
циклин B2	3,60	0,016544
регулятор 4 сигнализации G-белков	3,59	0,00781061
открытая рамка считывания 173 хромосомы 6	3,58	0,00222408
рецептор опосредуемой гиалуронаном подвижности (RHAMM)	3,55	0,00467816
BUB1 почкования, не ингибируемого бензимидазолами, гомолог 1 (дрожжи	3,54	0,0108258
SPC25, компонент NDC80 кинетохорного комплекса, гомолог (S. ce	3,53	0,00568662
установление сцепления 1 гомолог 2 (S. cerevisiae)	3,52	0,000773033
циклин A2	3,51	0,00965934

регуляторная субъединица 2 протеинкиназы CDC28	3,51	0,0128024
кератин 18	3,47	0,000514523
рибонуклеотидредуктазы M2 полипептид	3,46	0,00834059
арилацетамиддеацетилаза-подобный 1	3,44	0,000902645
член 11 семейства кинезина	3,43	0,00915145
белок 11A, активирующий ГТФазу Rho	3,41	0,00834174
субъединица 1 комплекса GINS (гомолог Psf1)	3,39	0,00104515
discs, большой гомолог 7 (Drosophila)	3,38	0,0317074
протеинкиназа TTK	3,38	0,0112171
удаленный при лимфоцитарном лейкозе, 2	3,38	0,0109528
фактор репликации C (активатор 1) 3, 38 кДа	3,37	0,00109668
семейство 7 переносчиков растворенных веществ (транспортер катионных аминокислот	3,36	0,00688017
киназа с двойной специфичностью, регулируемая фосфорилированием тирозина (Y)	3,34	0,0234606
член 2C семейства кинезина	3,34	0,0059888
белок 8 теплового шока 22 кДа	3,32	0,0219583
polo-подобная киназа 1 (Drosophila)	3,30	0,0140309
подобный (птичьему) гомологу вирусного онкогена миелобластоза v-myb	3,28	0,0043878
трипсиноген C	3,28	0,00416276
тимидинкиназа 1, растворимая	3,27	0,00124134
НАД(Ф)H-дегидрогеназа, хинон 1	3,27	0,000282423

блок 2 высокомобильной группы	3,24	0,0196872
ассоциированный 2 с циклом деления клеток	3,24	0,0122226
фермент, редактирующий мРНК аполипопротеина B, каталитический полипеп	3,23	0,00308692
ингибитор серпиновой пептидазы, группа B (овальбумин), член	3,22	0,0190218
белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды (G-белок), гамма 11	3,22	0,00140559
открытая рамка считывания 23 хромосомы 15	3,21	0,000147331
член 14 семейства кинезина	3,19	0,00947901
трансмембранный белок 154	3,18	0,0045589
глицерокиназа	3,16	2,66E-05
KIAA1524	3,15	0,0380688
фактор свертывания XIII, полипептид B	3,14	0,0294465
Белок 2 плотных контактов (zona occludence 2)	3,13	0,00012562
nei эндонуклеаза VIII-подобный 3 (E. coli)	3,12	0,00115606
плекстрин 2	3,11	0,0304429
член 23 семейства кинезина	3,09	0,00790585
белок 1, активирующий ГТФазу Rac	3,09	0,00381613
белок 1, подобный фактору роста кератиноцитов	3,07	0,0300588
белок 1, подобный фактору роста кератиноцитов	3,07	0,0300588
белок 1, подобный фактору роста кератиноцитов	3,07	0,0300588
транскрипционный фактор 19 (SC1)	3,07	0,00109627

содержащий домен OCIA 2	3,07	0,00122147
белок, ассоциированный с метастазом рака легкого	3,06	0,00148024
транскрипционный фактор 19 (SC1)	3,05	0,00124327
транскрипционный фактор 19 (SC1)	3,05	0,00124327
белок 29, активирующий ГТФазу Rho	3,05	0,0466211
глюкозаминил(N-ацетил)трансфераза 1, основа 2 (бета-1,6-N-	3,05	0,0197148
фактор репликации C (активатор 1) 4, 37 кДа	3,04	0,00164152
белковый регулятор цитокинеза 1	3,01	0,0325664
трансформирующий, содержащий кислую двойную спираль белок 3	2,98	0,0014577
кандидат 5 подверженности раку	2,96	0,0330594
белок 1, ассоциированный с ядрышком и веретеном	2,96	0,00520875
циклин B1	2,96	0,0103092
трансмембранный белок 48	2,96	0,00458248
взаимодействующий с ZW10	2,95	1,88E-05
содержащий эндонуклеазный домен 1	2,95	0,000429245
гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1 (синдром Леша-Найхана	2,94	0,000634057
фукозидаза, альфа-L-2, плазмы	2,94	0,00540929
убиквитин-конъюгирующий фермент E2T (потенциальный)	2,93	0,00741886
липаза A, лизосомальная кислая, холестеринэстераза (болезнь Вольмана	2,92	0,0167385
виллин 2 (эзрин)	2,92	0,0131934
глицерокиназа	2,90	3,37E-06
домен с повтором WD 76	2,89	0,0023531

молекула CD97	2,89	0,00994045
открытая рамка считывания 24 хромосомы 18	2,89	0,00347442
топоизомераза (ДНК) II альфа 170 кДа	2,89	0,0321109
интегрин, альфа 3 (антиген CD49C, альфа 3 субъединица VLA-3	2,87	0,00574148
член A семейства со сходством последовательности 29	2,85	0,00111165
член 4A семейства кинезина	2,85	0,0114203
ассоциированный с BRCA1 домен 1 RING	2,85	0,000540414
сыворотка	2,84	0,0387246
гомолог RAD51 (гомолог RecA, E. coli) (S. cerevisiae)	2,83	0,000854739
анемия Фанкони, группа комплементации I	2,83	0,00464532
дигидрофолатредуктаза	2,82	0,00178879
гомолог класпина (Xenopus laevis)	2,81	0,00683624
орнитиндекарбоксилаза 1	2,81	0,00144868
антиген 5, ассоциированный со спермой	2,80	0,00906321
кластер гистонов 1, H3b	2,80	0,0304598
семейство АТФаз, содержащий домен AAA 2	2,79	0,00415258
белок KIAA0286	2,79	0,00130563
белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды (G-белок), альфа инги	2,76	0,00184597
BUB1 почкования, не ингибируемого бензимидазолами, гомолог 1 бета	2,74	0,0166047
дигидрофолатредуктазы псевдоген	2,74	0,00141306
содержащий домен brix 1	2,73	0,00471977

белок 2, ассоциированный с цитоскелетом	2,72	0,0030499
белок S28 рибосом митохондрий	2,72	0,00298194
полимераза (направляемая ДНК), эпсилон 2 (субъединица p59)	2,72	0,00479612
член A семейства со сходством последовательности 72	2,72	0,00143248
белок 2, связывающий EBNA1	2,70	0,00296292
сходный с белком SA рибосомы 40S (P40) (34	2,70	0,0385298
белок, связанный с адипозной дифференцировкой	2,70	0,000331751
тиоредоксинредуктаза 1	2,70	0,000197486
компонент 5 комплекса сохранения минихромосом	2,69	0,00475504
белок 1, связывающий Гиппель-Линдау	2,69	0,00329061
SCL	2,68	0,00390288
анемия Фанкони, группа комплементации D2	2,68	0,0281405
киназа 2, родственная NIMA (ген a никогда в митозе)	2,68	0,00289469
белок 19 с PHD пальцем	2,68	0,000177604
микросомальная глутатион S-трансфераза 1	2,68	0,041701
рак молочной железы 2 с ранним наступлением	2,68	0,00586847
не-SMC комплекс конденсина I, субъединица H	2,67	0,0216752
открытая рамка считывания 27 хромосомы 13	2,67	0,0234588
кластер гистонов 1, H2bg	2,67	0,000180822

не-SMC комплекс конденсина II, субъединица G2	2,66	0,0130322
белок I центромеры	2,64	0,0106816
стоматин	2,64	0,00387095
глутатион S-трансфераза омега 1	2,63	0,000648379
содержащий A домен, подобный протеинтирозинфосфатазе	2,62	0,0419644
белок, связывающий кальциклин	2,62	0,00524566
лиганд KIT	2,61	0,00641955
убиквитин-конъюгирующий фермент E2L 3	2,61	0,00343347
ингибитор серпиновой пептидазы, группа B (овальбумин), член	2,60	0,0030439
АТФаза, транспортирующая Ca++, плазматической мембраны 4	2,60	0,023011
TPX2, ассоциированный с микротрубочками, гомолог (Xenopus laevis)	2,60	0,0253137
взаимодействующий с рецептором тиреоидных гормонов 13	2,59	0,0118319
член Z семейства гистонов H2A	2,59	0,0129697
регуляторная субъединица 1B протеинкиназы CDC28	2,57	0,0107391
ассоциированный с циклом деления клеток 3	2,57	0,006289
компонент 8 комплекса сохранения минихромосом	2,57	0,000841489
транскрипционный фактор 2 E2F	2,55	0,0496479
белок, взаимодействующий с TIMELESS	2,55	0,00771062
компонент 4 комплекса сохранения минихромосом	2,54	0,00342054
polo-подобная киназа 4 (Drosophila)	2,53	0,00209633

член C1 семейства кинезина	2,53	0,00821937
дигидрофолатредуктаза	2,52	0,00307793
глицеро-3-фосфатдегидрогеназа 2 (митохондриальная)	2,52	0,00211969
индуцируемый TGF бета ядерный белок 1	2,51	0,0365579
интегрин, альфа 2 (CD49B, альфа 2 субъединица VLA-2 рецептора	2,51	0,0210165
белок, взаимодействующий с MLF1	2,51	0,0177203
белок 2 теплового шока 70 кДа	2,50	0,0215102
ворсистый и энхансер расщепления 1 (Drosophila)	2,50	0,000283509
АТФ-связывающая кассета, подсемейство C (CFTR	2,49	0,00382491
серглицин	2,48	0,0443487
домен sema, иммуноглобулиновый домен (Ig), короткий основной доме	2,47	0,008548
домен 1 с анкириновым повтором (сердечная мышца)	2,47	0,00911953
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,47	0,00859077
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,47	0,00859077
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,47	0,00859077
кластер гистонов 1, H1b	2,46	0,0470898
семейство со сходством последовательности 72, член A	2,46	0,00165234
связанный с мембраной содержащий домен O-ацилтрансферазы 1	2,46	0,01185
субстрат 8 пути рецептора эпидермального фактора роста	2,45	0,0194949

гомолог B ASF1 антисайленсной функции 1 (S. cerevisae)	2,45	0,00543408
открывающий цитокинез 11	2,44	0,00697577
семейство со сходством последовательности 72, член A	2,44	0,00162905
белок 2, родственный актину	2,44	0,000288443
ЦТФ-синтаза	2,43	8,80E-05
фосфопротеин 1 M-фазы	2,43	0,0271814
регуляторная субъединица 1B протеинкиназы CDC28	2,43	0,0145263
кластер гистонов 1, H2ai	2,43	0,0161621
нуклеосомный связывающий домен 2 высокомобильной группы	2,42	0,0030536
белок 1A теплового шока 70 кДа	2,42	0,00734287
белок 1A теплового шока 70 кДа	2,42	0,00674816
карнитинпальмитоилтрансфераза 1A (печень)	2,41	0,00170894
нейрофиламент, средний полипептид 150 кДа	2,41	0,0190611
трансмембранный белок 62	2,41	0,00761064
киназа 1, родственная коровьей оспе	2,40	0,0233182
геминин, ингибитор репликации ДНК	2,40	0,00167629
фосфоглюкомутаза 2	2,40	0,00818204
ламин B1	2,40	0,0477748
кератин 18	2,40	0,000112551
глухота, аутосомный доминантный 5	2,39	0,00235481
протеасомы (просомы, макропэйна) субъединица, типа бета, 9 (lar	2,39	0,0202595
протеасомы (просомы, макропэйна) субъединица, типа бета, 9 (lar	2,39	0,0202595

протеасомы (просомы, макропэйна) субъединица, типа бета, 9 (lar	2,39	0,0202595
открытая рамка считывания 31 хромосомы 12	2,39	0,0173089
изоцитратдегидрогеназа 3 (NAD+) альфа	2,39	0,00297129
вилкоголовый блок M1	2,38	0,0203154
трансмембранный белок 106C	2,38	0,000214223
гипотетический белок LOC729012	2,38	0,000446087
белок 1 с PHD пальцем	2,37	0,010191
белок L15 рибосом митохондрий	2,37	0,0306092
вставочный 2 эластиновых микрофибрилл	2,37	0,0192072
гипотетический белок DKFZp762E1312	2,37	0,00726778
ретинобластома-подобный 1 (p107)	2,36	0,00319946
ингибитор пути тканевого фактора (ассоциированный с липопротеином	2,36	0,0356227
онкоген с последовательностью 2, трансформирующий эпителиальные клетки	2,36	0,000571152
кристаллин, зета (хинонредуктаза)	2,36	0,0370884
домен hect и RLD4	2,36	0,00679184
нуклеосомный связывающий домен 2 высокомобильной группы	2,36	0,00384071
гомолог A цикла деления клеток 25 (S. pombe)	2,36	0,000341692
тимопоэтин	2,35	0,0223176
индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами	2,34	0,0177928
синдром Блума	2,34	0,0209259
фосфатаза 1 с двойной специфичностью	2,34	0,00211272
фактор элонгации, РНК-полимераза II, 2	2,34	0,0130017

полипептид 16 кДа малого ядерного рибонуклеопротеина D1	2,34	0,0334665
CDC45 цикл деления клеток 45-подобный (S. cerevisiae)	2,33	0,00735977
экзонуклеаза 1	2,33	0,00739393
подобный рибосомальному белку L39	2,33	0,00429384
кластер гистонов 1, H2bh	2,33	0,0377748
полипептид M1 рибонуклеотидредуктазы	2,33	0,000170076
гомолог сульфиредоксина 1 (S. cerevisiae)	2,32	5,14E-05
фактор 2 множественной недостаточности свертывания	2,31	0,0116892
протеасомы (просомы, макропэйна) субъединица, типа альфа, 3	2,31	0,0195874
рибонуклеаза H2, субъединица A	2,30	0,00669936
компонент 10 комплекса сохранения минихромосом	2,29	0,0037925
белок 1B теплового шока 70 кДа	2,28	0,0048959
белок 1B теплового шока 70 кДа	2,28	0,0054404
белок 1B теплового шока 70 кДа	2,28	0,0054404
АТФаза, Na+	2,28	0,000381464
гипотетический белок LOC201725	2,28	0,000313319
катепсин L1	2,27	0,0314419
ассоциированный 5 с циклом деления клеток	2,27	0,01021
RAB8B, член семейства онкогена RAS	2,27	0,00417066
SPC24, компонент NDC80 кинетохорного комплекса, гомолог (S. ce	2,27	0,00287227
гамма-глутамилгидролаза (конъюгаза, фолиполигаммаглутамил	2,26	0,0195219

гомолог C цикла деления клеток 25 (S. pombe)	2,25	0,0169914
mutS гомолог 2, рак ободочной кишки неполипозного типа 1 (E. coli)	2,25	0,00578953
металлотионеин 1L (ген	2,25	0,00709646
гомолог регулятора биогенеза рибосом RRS1 (S. cerevisiae)	2,24	0,0120061
ассоциированный 8 с циклом деления клеток	2,24	0,00619878
shugoshin-подобный 2 (S. pombe)	2,24	0,000852557
гомолог оборота мРНК 4 (S. cerevisiae)	2,24	0,00373104
ST6 (альфа-N-ацетилнейраминил-2,3-бета-галактозил-1,	2,24	0,00830766
гомолог 2 онкогена v-ets вируса эритробластоза E26 (птичьего)	2,23	0,0364123
фактор репликации C (активатор 1) 2, 40 кДа	2,23	0,00768959
киназа 7, родственная NIMA (ген a никогда в митозе)	2,23	0,00159114
основная лейциновая застежка-молния и домены W2 2	2,23	0,0190782
кластер гистонов 1, H2bf	2,23	0,0124279
фактор 1A инициации трансляции эукариот, X-связанный	2,23	0,00330183
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,22	0,0164234
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,22	0,0164234
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,22	0,0164234
полимераза (РНК) III (направляемая ДНК), полипептид G	2,22	0,0298794

фосфатидилинозитол-4-фосфат 5-киназа, тип II, альф	2,22	0,00964099
протеасомы (просомы, макропэйна) 26S субъединица, АТФаза, 6	2,22	0,024269
трансформирующий в опухоль гипофиза 1	2,21	0,0485166
кластер гистонов 2, H3d	2,21	0,0102932
сульфидхинонредуктаза-подобный (дрожжи)	2,21	0,0473641
серглицин	2,20	0,00880325
рибосомальный белок L22-подобный 1	2,20	0,00335381
мембранный белок, пальмитоилированный 1, 55 кДа	2,20	0,000396285
семейство 24 переносчиков растворенных веществ (натрий	2,20	0,0328774
STAM-связывающий белок-подобный 1	2,20	0,0181743
белок 1 с повтором WD и блоком HMG связывания ДНК	2,20	0,0034833
подобный CSE1 сегрегации хромосом 1 (дрожжи)	2,20	0,0013662
комплекс узнавания ориджина, подобный субъединице 6 (дрожжи)	2,20	0,00182466
фактор транскрипции A, митохондриальный	2,19	0,0110092
компонент 8 экзосомы	2,19	0,00132017
митохондриальный рибосомальный белок L1	2,19	0,0361058
сфингомиелинсинтаза 2	2,19	0,0020701
дезоксицитидинкиназа	2,18	0,00101444
семейство со сходством последовательности 29, член A	2,18	0,00469407
открытая рамка считывания 167 хромосомы 6	2,18	0,0011095

фосфатаза 11 с двойной специфичностью (РНК	2,18	0,00426788
белок 45 с блоком F	2,18	0,00510098
родственный ras субстрат 2 токсина ботулизма C3 (семейство rho, sma	2,17	0,0292466
белок 5, связывающий FK506	2,17	0,0193805
рак молочной железы 1, с ранним наступлением	2,17	0,0180553
ядерный фактор I	2,17	0,0010313
тиоредоксин	2,17	0,009636
4A, содержащий домен SH2	2,16	0,0323646
индуцируемый TGF бета ядерный белок 1	2,16	0,00285964
взаимодействующий с PSMC3 белок	2,16	0,00766442
открытая рамка считывания 14 хромосомы 3	2,15	0,0377617
кольцевой палец 5 группы polycomb	2,15	0,000294142
белок 27 кДа центросомы	2,15	0,00931602
семейство со сходством последовательности 64, член A	2,14	0,0019785
кислый (обогащенный лейцином) ядрышковый фосфопротеин семейства 32, м	2,14	0,0300263
стерин-O-ацилтрансфераза (ацил-коэнзим A:холестерин аци	2,14	0,0193637
фактор, ассоциированный с белком, связывающим блок TATA (TBP), РНК-поли	2,13	0,00514451
комплекс узнавания ориджина, подобный субъединице 5 (дрожжи)	2,13	0,049697
псевдоген белка 1, активирующего ГТФазу Rac	2,13	0,000269488
гомолог LSM5, ассоциированного с U6 малой ядерной РНК (S. cerevisia	2,13	0,00264664

компонент 7 комплекса сохранения минихромосом	2,13	0,0457691
протоонкоген met (рецептор фактора роста гепатоцитов)	2,13	0,0318147
содержащий тройной мотив 25	2,13	0,0456344
открытая рамка считывания 34 хромосомы 13	2,13	0,000702936
содержащий пататин-подобный фосфолипазный домен 4	2,13	0,0168306
компонент 6 комплекса сохранения минихромосом	2,12	0,0161279
гомолог внутрижгутикового транспорта 80 (Chlamydomonas)	2,12	0,0247286
пептидилпролилизомераза F (циклофилин F)	2,12	0,00093846
UTP15, U3 малый ядрышковый рибонуклеопротеин, гомолог (S. c	2,12	0,00482559
TAF9B РНК-полимераза II, белок, связывающий блок TATA (TBP)-ас	2,12	0,0170365
TAF9B РНК-полимераза II, белок, связывающий блок TATA (TBP)-ас	2,12	0,0170365
сайт интеграции 2B экотропного вируса	2,12	0,0171408
3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфатсинтаза 2	2,12	1,43E-05
протеасомы (просомы, макропэйна) активатора субъединица 2, (PA28	2,12	0,00609885
металлопептидаза ADAM с мотивом тромбосподина типа 1,	2,12	0,0102751
эндонуклеаза 1, специфичная в отношении структуры щитка	2,12	0,006882
S100 связывающий кальций белок A3	2,12	0,0324073
гомолог RAD18 (S. cerevisiae)	2,11	0,0016685

компонент 3 комплекса сохранения минихромосом	2,11	0,0018389
компонент 3 экзосомы	2,11	0,0249115
цистеинил-тРНК-синтаза 2, митохондриальная (предположительно)	2,11	0,00564558
глутамат-цистеинлигаза, модифицирующая субъединица	2,11	0,00378868
содержащий домен brix 1	2,11	0,00981178
член 22 семейства кинезина	2,11	0,0192406
UTP11-подобный, U3 малый ядрышковый рибонуклеопротеин (дрожжи)	2,10	0,0132794
гомолог B вирусного онкогена v-ral лейкоза обезьян (родственный ras	2,10	0,012225
гомолог мейотических делений ядра 1 (S. cerevisiae)	2,10	0,00164447
фенилаланин-тРНК-синтаза, субъединица бета	2,10	0,000245973
сходный с убиквитин-конъюгирующим ферментом E2S (убикви	2,10	0,000415822
содержащий домен с двойной спиралью 68	2,10	0,00227586
рецептор ламинина B	2,10	0,000151784
болезнь Ниманна-Пика, тип C1	2,10	0,0108117
гидроксистероиддегидрогеназа-подобный 2	2,09	3,71E-05
RMI1, опосредуемая RecQ нестабильность генома 1, гомолог (S. cerev	2,09	0,00294705
гиперэкспрессируемый в карциноме ободочной кишки-1	2,09	0,015322
гипотетический белок FLJ20425	2,09	0,0174225
примаза, полипептид 1, 49 кДа	2,09	0,00801018

открытая рамка считывания 121 хромосомы 20	2,09	0,0146323
ассоциированный с микротрубочками серин	2,08	0,00536974
дифференцировка эндотелия, сфинголипидный сопряженный с G-белками	2,08	0,0132848
гомеоблок A9	2,08	0,00520942
белок L центромеры	2,08	0,000880856
гомолог ассоциированного с ядрышковым комплексом 3 (S. cerevisiae)	2,07	0,000373346
фактор роста фибробластов 7 (фактор роста кератиноцитов)	2,07	0,0173208
регулятор 1 обогащенного цистеином трансмембранного BMP (подобный хордину)	2,07	0,0267286
нуклеопорин 155 кДа	2,07	0,00218453
белок FLJ20105	2,06	0,0127979
молекула CD44 (Индийская группа крови)	2,06	0,000651436
полимераза (направляемая ДНК), альфа 2 (субъединица 70 кДа)	2,06	0,0033903
подобный 2 (птичьему) гомологу вирусного онкогена миелобластоза v-myb	2,06	0,00989416
комплекс узнавания ориджина, подобный субъединице 1 (дрожжи)	2,06	0,00207753
гипотетический белок FLJ25416	2,06	0,000177531
член 22 семейства кинезина	2,06	0,0242075
белок 1 теплового шока 60 кДа (шаперонин)	2,06	0,0327412
компонент 2 комплекса сохранения минихромосом	2,05	0,0021347

фумарилацетоацетатгидролаза (фумарилацетоацетаза)	2,05	3,88E-05
псевдоген глицерокиназы 3	2,05	0,0103203
пигментная дегенерация сетчатки 2 (X-связанная рецессивная)	2,05	0,0264185
киназа 1 с мотивом (UHM), гомологичным U2AF	2,05	0,0255167
шаперонин содержащий TCP1, субъединица 5 (эпсилон)	2,04	0,00125909
АТФаза, транспортирующая H+, лизосомальная 34 кДа, V1 субъединица D	2,04	0,0317453
фактор терминации транскрипции, РНК-полимераза II	2,04	0,000393489
сукцинат-CoA-лигаза, образующая ГДФ, бета субъединица	2,04	0,0028167
ингибитор 1B циклин-зависимой киназы (p27, Kip1)	2,04	0,00183021
тирозин-3-монооксигеназа	2,04	0,00021508
кофактор, необходимый для активации транскрипции Sp1, субъе	2,04	0,00141809
содержащий 3 домен гликозилтрансферазы 8	2,03	0,022868
гомолог процессинга рибосомальной РНК 15 (S. cerevisiae)	2,03	0,0274884
гликогенин 1	2,03	0,0224317
гипотетический белок FLJ40869	2,03	0,00444509
ядерный антиген пролиферирующих клеток	2,03	0,0031727
содержащий 12 домен стерильного альфа мотива	2,03	0,0232188
открытая рамка считывания 59 хромосомы 16	2,03	0,00185191

кофилин 2 (мышца)	2,03	0,0459235
фактор 2 инициации трансляции эукариот, субъединица 2 бет	2,03	0,0139947
фактор сборки хроматина 1, субъединица B (p60)	2,03	0,0119687
гомолог Zwilch, ассоциированного с кинетохором (Drosophila)	2,02	0,000725107
АТФ-связывающая кассета, подсемейство E (OABP), член 1	2,02	0,00454751
гомолог LSM3, ассоциированного с U6 малой ядерной РНК (S. cerevisia	2,02	0,0199824
содержащий мотив IQ активирующий ГТФазу белок 3	2,02	0,0495882
тубулин, альфа 1c	2,02	0,00862586
гомолог DBF4 (S. cerevisiae)	2,01	0,0458795
белок 1, связывающий предшественник белка амилоида бета	2,01	0,000910538
гомолог 1 супрессора раскраски 2-9 (Drosophila)	2,01	0,00224324
гомолог комплекса 7 THO (Drosophila)	2,01	0,0047251
боковой амиотрофический склероз 2 (юношеский) хромосомная ре	2,01	0,0484466
нуклеопорин 37 кДа	2,01	0,00652747
ядрышковый белок 11	2,01	0,000852662
АТФ-синтаза, транспортирующая H+, митохондриальный комплекс F0	2,01	0,00866627
кластер гистонов 1, H2ai	2,01	0,0129155
фитоцерамидаза, щелочная	2,01	0,0157729
примаза, полипептид 2A, 58 кДа	2,01	0,00290097
белок B1, сходный с высокомобильной группой (высокомобиль	2,00	0,000363158

подобный 3 управляющему (Drosophila)	-2,00	0,00386667
УДФ-N-ацетил-альфа-D-галактозамин:полипептид N-ацетилга	-2,01	0,0268634
белок с кольцевым пальцем 122	-2,01	0,0236621
хромодоменная геликаза ДНК-связывающий белок 3	-2,01	6,39E-05
центаурин, гамма-подобное семейство, член 10 псевдоген	-2,01	8,70E-05
открытая рамка считывания 10 хромосомы 7	-2,01	0,00738442
открытая рамка считывания 111 хромосомы 6	-2,01	0,0104492
центаурин, гамма-подобное семейство, член 10 псевдоген	-2,01	0,000334818
область 1 хромосомы синдрома Прадера-Вилли	-2,01	0,0415526
KIAA1245	-2,01	0,0186309
гомолог пероксидазина (Drosophila)	-2,01	0,00219049
антиген меланомы семейства D, 4	-2,02	0,0263076
антиген меланомы семейства D, 4	-2,02	0,0263076
глюкозидаза, альфа, кислая (болезнь Помпе, бо запасания гликогена	-2,02	0,000418401
рецептор 1 фосфолипазы A2, 180 кДа	-2,03	0,00069343
содержащий 2 домен гликозилтрансферазы 8	-2,03	0,0173546
KIAA1546	-2,03	0,000255634
протокадгерин бета 9	-2,03	0,0285124
семейство с доменом TBC1, член 3B	-2,03	0,000414974
sushi, нидогена и EGF-подобные домены 1	-2,03	0,00161129

фактор 1, сшивающий микротрубочки-актин	-2,04	0,00216
семейство с областью, содержащей остановку нейробластомы	-2,04	0,0213393
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,04	0,0182674
подобный трансдуцину энхансер расщепления 4 (E(sp1) гомолог, Drosop	-2,04	0,0164153
семейство 22 переносчиков растворенных веществ (транспортер органических катионов),	-2,05	0,0137275
сосед Punc E11	-2,05	0,0184739
белок 5, связывающий инсулиноподобный фактор роста	-2,05	0,011614
KIAA1245	-2,06	0,0185376
рецептор витамина D (1,25-дигидроксивитамина D3)	-2,06	0,000192208
CLL B-клеток	-2,06	0,00343507
KIAA1305	-2,06	0,00813727
KIAA1245	-2,06	0,0185609
центаурин, гамма-подобное семейство, член 10 псевдоген	-2,07	3,08E-05
семейство с доменом TBC1, член 3B	-2,07	0,00141297
сходный с членом 3 семейства с доменом TBC1 (Rab ГТФаза-	-2,08	0,00105098
маннозидаза, альфа, класс 2B, член 1	-2,08	0,000353303
обогащенный цистеином ингибитор PAK1	-2,08	0,000125336
мидлин 1 (Опица	-2,08	0,00130803
малая ядрышковая РНК, H	-2,09	0,017124
урокортин 2	-2,09	0,00172263

семейство остановки нейробластомы, член 11	-2,09	0,0138065
коллаген, тип VI, альфа 3	-2,09	2,09E-06
семейство остановки нейробластомы, член 11	-2,09	0,0148372
гипотетический белое LOC646870	-2,09	0,0117625
кальсинтенин 3	-2,09	0,00300887
белок 2, связывающий кортактин	-2,09	2,28E-05
гликопротеин 2A синаптических пузырьков	-2,10	0,00704212
сходный с динамином-1 (D-100) (динамин, мозг) (B-дин	-2,10	0,0190733
сходный с динамином-1 (D-100) (динамин, мозг) (B-дин	-2,10	0,0190733
сходный с членом 3 семейства с доменом TBC1 (Rab ГТФаза-	-2,10	0,00108467
гомолог 2 Notch (Drosophila) N-концу-подобный	-2,10	0,0193058
ассоциированный 5 с перестройкой матрикса	-2,11	0,000317637
компонент 1 комплемента, подкомпонент s	-2,11	0,0395863
декарбоксилаза цистеинсульфиновой кислоты	-2,11	0,00428211
гипотетический белок FLJ36144	-2,11	0,00958437
гипотетический белок FLJ36144	-2,11	0,00958437
дигидропиримидиназа-подобный 3	-2,12	0,0165203
энхансер проколлагена C-эндопептидазы	-2,12	0,0039236
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,12	0,00720508
семейство с доменом TBC1, член 3B	-2,12	0,00122924

коллаген, тип VII, альфа 1 (буллезный эпидермолиз, дистр	-2,13	0,00109233
версикан	-2,14	0,023885
рецептор маннозы, C тип 2	-2,14	0,00012142
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,14	0,00767095
динамин 1	-2,15	0,00139674
семейство с доменом TBC1, член 3B	-2,16	0,00130459
белок 21A с пальцем PHD	-2,17	0,00980401
центаурин, гамма-подобное семейство, член 10 псевдоген	-2,17	0,000180846
гомолог 3 slit (Drosophila)	-2,17	0,02844
трансформирующий ген 1 нейроэпителиальных клеток	-2,18	0,0109689
циклин L2	-2,18	0,00093459
сходный с dJ402H5.2 (новый белок, сходный с во	-2,18	0,00621503
phospholipase D family, member 3	-2,18	1,17E-05
collagen, type VIII, alpha 1	-2,19	0,00187242
циклин L2	-2,19	0,00109621
протокадгерин бета 14	-2,20	0,0103892
металлопептидаза 2 матрикса (желатиназа A, желатиназа 72 кДа,	-2,20	5,59E-05
лизилоксидаза-подобный 4	-2,21	0,0120148
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,21	0,00977719
регулятор транскрипции 1, содержащий домен WW	-2,21	0,0379899
содержащий домен PDZ с пальцем RING 3	-2,21	0,00931014

открытая рамка считывания 37 хромосомы 14	-2,21	0,0182453
мозг и острый лейкоз, цитоплазматический	-2,22	0,0476919
кальциевый канал, потенциал-зависимый, L тип, альфа 1C суб	-2,22	0,0189661
онкоген jun	-2,23	7,21E-05
интерлейкин 19	-2,23	0,0310328
центаурин, гамма-подобное семейство, член 10 псевдоген	-2,23	0,000595086
центаурин, гамма-подобное семейство, член 10 псевдоген	-2,23	0,000595086
---	-2,24	0,00666187
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин b, макрогольджин (с	-2,24	0,0164005
открытая рамка считывания 51 хромосомы 15	-2,24	0,0123547
сходный с динамином-1 (D100) (динамин, мозг) (B-дин	-2,24	0,0123547
сходный с динамином-1 (D100) (динамин, мозг) (B-дин	-2,24	0,0123547
белок 1, связывающий AE	-2,25	0,000105628
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,26	0,00770626
трансмембранный белок 16A	-2,27	0,0481085
гипотетический LOC399844	-2,27	0,000491694
окуломедин	-2,27	0,00778869
белок 1, родственный липопротеиду низкой плотности (альфа-2-макрогло	-2,28	4,26E-05
фибронектиновый обогащенный лейцином трансмембранный белок 2	-2,28	0,0135122
белок транспорта фосфолипидов	-2,29	0,00999206

сходный с динамином-1 (D100) (динамин, мозг) (B-дин	-2,29	0,0122573
SATB с гомеоблоком 2	-2,31	0,039781
сходный с членом 3 семейства с доменом TBC1 (Rab ГТФаза-	-2,32	0,000870285
гомолог 1 чириканья (Drosophila)	-2,32	0,00450824
молекула CD24	-2,34	0,0340122
химерин (химаерин) 1	-2,35	0,0287031
AHA1, активатор АТФазы белка теплового шока 90 кДа гомолог	-2,37	0,00979472
гомолог 1 двухвостости C (Drosophila)	-2,38	0,0347162
семейство 6 переносчиков растворенных веществ (транспортер нейромедиаторов, та	-2,38	0,00729635
белок глобулы жира молока-EGF фактор 8	-2,39	0,000987073
протеинкиназа 1 WNK с недостаточностью лизина	-2,40	1,57E-05
малая ядрышковая РНК, H	-2,41	0,00843141
гомолог 3 чириканья (Drosophila)	-2,42	0,000165552
2B с доменами SH3 и PX	-2,42	0,0244357
содержащий 1 повтор WD и блок SOCS	-2,44	0,0387851
гипотетический белок PRO2012	-2,45	0,00756704
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,46	0,00320764
белок 2, ассоциированный с микрофибриллами	-2,47	0,0152901
коллаген, тип XII, альфа 1	-2,47	0,000204664
ST6 бета-галактозамид альфа-2,6-сиалилтрансфераза 2	-2,47	0,0216987

белок, взаимодействующий с тиоредоксином	-2,48	0,0135494
белок 2, связывающий латентный трансформирующий фактор роста бета	-2,49	4,08E-05
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,49	0,00603583
подобный белку 1, связывающему формин	-2,50	0,00290401
экспрессируемый у матери 3	-2,52	0,0112259
PTK7 протеинтирозинкиназа 7	-2,54	0,000116114
компонент H1 рибонуклеазы P РНК	-2,57	0,0156126
белок, содержащий повтор sushi, связанный с X 2	-2,58	0,0253856
родственный сортилину содержащий домен VPS10 рецептор 2	-2,58	0,00936311
сходный с кДНК RIKEN 11100118M03	-2,59	0,00516476
содержащий 2 домен пиридоксальзависимой декарбоксилазы	-2,60	0,00683647
Enah	-2,61	0,0077547
аспорин	-2,62	0,000659873
малая специфичная в отношении тельца Кажала РНК 17	-2,63	0,0301336
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,67	0,00988632
sushi, фактора фон Виллебранда типа A, EGF и пентраксина дом	-2,69	2,23E-05
протеинтирозинфосфатаза, рецепторного типа, U	-2,69	0,0270428
коллаген, тип V, альфа 1	-2,70	0,0166427
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,73	0,0018339
трансформер-2 альфа	-2,74	0,012256

белок 2, родственный дистрофину	-2,79	0,0137557
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a, 8A	-2,80	0,0111179
коллаген, тип VI, альфа 2	-2,81	0,0149554
трансформирующий фактор роста, бета 3	-2,81	0,0287865
трофинин	-2,82	0,00298044
гипотетический белок MGC24103	-2,86	0,0346673
супервиллин	-2,87	0,0412717
металлопептидаза ADAM с мотивом тромбосподина типа 1,	-2,90	0,0113968
член 26B семейства кинезина	-2,91	0,00363199
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,91	0,00160273
трихоринофалангеальный синдром 1	-2,94	0,00557712
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,96	0,00111223
малая ядрышковая РНК, C	-2,96	0,00666866
гомеоблок A2	-2,97	0,0435423
гомеоблок 5 без дистальной части	-3,00	0,000640157
dachsous 1 (Drosophila)	-3,00	0,00697244
малая ядрышковая РНК, C	-3,06	0,0274043
малая ядрышковая РНК, C	-3,06	0,0274043
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,09	0,00583397
малая ядрышковая РНК, C	-3,14	0,0104491
малая ядрышковая РНК, C	-3,14	0,0104491
белок, содержащий повтор sushi, связанный с X	-3,16	0,00370941
белок 521 с цинковым пальцем	-3,17	0,00668815

белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,17	0,00117582
открытая рамка считывания 3 хромосомы 9	-3,18	0,00410177
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a, 8B	-3,18	0,0121417
гемицентрин 1	-3,21	0,0461603
малая ядрышковая РНК, C	-3,24	0,00765575
последовательность синдрома 1 Калльманна	-3,25	0,000548703
тенасцин C (hexabrachion)	-3,26	8,26E-05
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,29	0,00282604
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,34	0,00263888
гомеоблок B2	-3,36	0,00665994
сходный с белком, взаимодействующим с комплексом ядерной поры	-3,41	0,0187322
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,46	0,00354416
холестерин-25-гидроксилаза	-3,51	0,0445558
белок 144 с цинковым пальцем	-3,52	0,0135334
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,55	0,00316496
кальбиндин 2, 29 кДа (кальретинин)	-3,56	0,0290743
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,58	0,00032839
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,60	0,000414309
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,62	0,00283418

белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,64	0,000213956
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,66	0,000377834
KIAA1641	-3,69	0,0191782
УДФ-N-ацетил-альфа-D-галактозамин:полипептид-N-ацетилга	-3,72	0,00964109
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,73	0,000352007
содержащий 17 обогащенный лейцином повтор	-3,75	0,0263961
открытая рамка считывания 3 хромосомы 9	-3,80	0,0233723
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-3,82	0,00368967
нейротримин	-3,87	3,78E-06
протеинтирозинфосфатаза, рецепторный тип, N	-4,02	0,0294569
KIAA1641	-4,02	0,00659194
---	-4,06	0,00488845
KIAA1641	-4,16	0,0170531
интегрин, альфа 11	-4,16	0,000390317
KIAA1641	-4,27	0,013175
odz, odd Oz	-4,28	0,00172671
трансмембранный белок 119	-4,34	0,00801387
содержащий 2 домен плексина	-4,44	0,031799
семейство генов гомолога ras, член J	-4,59	0,00197982
гомеоблок B3	-4,60	0,0354368
сходный с белком KIAA0220	-4,72	0,0302619
член 2 семейства рафтлина	-4,79	0,0260454

белок 1 пути сигнализации, индуцируемого WNT1	-5,99	0,000672342
кластерин	-6,40	0,0303973
ингибитор серпиновой пептидазы, группа F (альфа-2 антиплазми	-6,47	0,00362941
сульфатаза 2	-6,58	5,88E-05
гефестин	-6,74	0,0123141
молекула адгезии 2 контактов	-7,33	0,0306758
содержащий 1 домен фибронектина типа III	-7,46	0,0334696
саркогликан, дельта (35 кДа ассоциированный с дистрофином гликопротеи	-7,69	0,000881984
цистатин SN	-8,27	0,0496433
белок 4, ассоциированный с микрофибриллами	-8,67	0,00155578
бигликан	-8,70	0,00161284
трансмембранный, индуцируемый андрогеном в простате РНК	-10,54	0,000100935
карбоксипептидаза E	-12,48	0,00738131

Характеристика мембранных маркеров на 2D прикрепленных клетках, пригодных для использования в соответствии с настоящими указаниями - поверхностные антигены, экспрессируемые 2D прикрепленными клетками, оценивали с использованием моноклональных антител. Эти клетки представляли собой стабильно прикрепленные клетки, которые размножались in vitro без утраты фенотипа и без проявления признаков изменений кариотипа. Анализ мембранных маркеров 2D прикрепленных клеток с помощью проточной цитометрии показал высокую долю клеток, экспрессирующих CD105, CD73, CD90 и CD29. Более того, высокая доля клеток не экспрессировала CD45, CD34 и маркеры поверхности CD19, CD11b, CD14 и HLA-DR (фиг.2).

Иммуномодуляция 2D прикрепляющимися клетками - Затем исследовали иммуногенность 2D прикрепляющихся клеток. Как показано на фиг.3, четыре разные партии 2D прикрепляющихся клеток были способны снижать пролиферацию лимфоцитов, вызываемую митогенными стимулами фитогемагглютинина (PHA), по данным измерений включения тимидина.

Индукция остеоцитов - остеоцитная дифференцировка прикрепленных клеток из плаценты или костного мозга в среде для индукции остеогенеза приводила к дифференцировке более 50% клеток из костного мозга, как это было продемонстрировано позитивным окрашиванием ализариновым красным (фиг.4B). Напротив, ни одна из клеток из плаценты не проявляла каких-либо признаков остеогенной дифференцировки (см. фиг.4B и 4E и таблицу 9 ниже).

Таблица 9
Итог дифференцировки
	BM108+ BM109	PLC-11-3-1	PLC-8-2-1	Plc-15-3-4-2	Plc 4-3-1
Остеоциты	+++	-	-	-	-
Адипоциты	+++	-	-	-	-

Затем, 2D прикрепленные клетки, берущие начало из костного мозга или плаценты, стимулировали к дифференцировке в модифицированной остеогенной среде, включающей витамин D и более высокие концентрации дексаметазона, соответствующей предшествующим указаниям по модификации протокола остеогенной дифференцировки [Parloni et al. (2008) Stem Cells 26(2): 300-11]. Как следует из результатов, более 50% клеток из костного мозга подвергались дифференцировке в остеоциты, как это было продемонстрировано позитивным окрашиванием ализариновым красным (см. фиг.5B). Однако ни одна из клеток из плаценты не проявляла каких-либо признаков остеогенной дифференцировки (см. фиг.5E и таблицу 9 выше в настоящем описании).

Индукция адипоцитов - дифференцировка в адипоциты 2D прикрепленных клеток из плаценты или костного мозга в среде для индукции адипоцитов приводила к дифференцировке более 50% клеток из костного мозга (см. фиг.4C), как это демонстрируется позитивным окрашиванием масляным красным и типичными морфологическими изменениями (например, накоплением жировых капелек в цитоплазме). Напротив, ни одна из клеток из плаценты не дифференцировалась в адипоциты (см. фиг.4F и таблицу 9 выше в настоящем описании).

Затем, 2D прикрепленные клетки, берущие начало из костного мозга или плаценты, стимулировали к дифференцировке в адипоциты в модифицированной среде, включающей более высокий уровень индометацина, соответствующей предшествующим указаниям по модификации протокола адипоцитной дифференцировки [Parloni et al. (2007), выше]. Как следует из результатов, более 50% клеток из костного мозга подвергались дифференцировке в адипоциты (см. фиг.5C), как это было продемонстрировано позитивным окрашиванием масляным красным и типичными морфологическими изменениями (например, накоплением жировых капелек в цитоплазме). Напротив, ни одна из клеток из плаценты не проявляла морфологических изменений, типичных для адипоцитов (см. фиг.5F и таблицу 9 выше в настоящем описании).

ПРИМЕР 3

Методы создания 3D прикрепленных клеток, пригодных для использования в соответствии с настоящими указаниями, и созданные с их помощью 3D прикрепленные клетки

Были получены 3D прикрепленные клетки (PLX-C), которые проявляют свойства, отличные от свойств описанных выше 3D прикрепленных клеток (PLX, пример 1).

Материалы и экспериментальные процедуры

Проточный биореактор с затвором Celligen ^TM

Получение 3D прикрепленных клеток для использования по настоящему изобретению с помощью Celligen ^TM (PLX-C клеток) состояло из нескольких основных стадий. Процесс начинался с получения плаценты при плановом родоразрешении посредством кесарева сечения в срок.

Затем из целых плацент выделяли прикрепляющиеся клетки, выращивали в сосудах для тканевой культуры (2D культуры), собирали и хранили в жидком азоте в качестве запаса 2D-клеток (2DCS), подходящее количество 2DCS размораживали, промывали и высевали на носители в биореакторах для дальнейшего выращивания в виде 3D-культуры. После 4-21 дней выращивания в биореакторах клетки собирали и криоконсервировали в газовой фазе жидкого азота как PLX-C.

Получение ткани человека

Все полученные плаценты поступали из родильного отделения с одобрения Комитета Хельсинки по медицинской помощи. Соответственно, все доноры плаценты подписывали информированное согласие, и производились скрининг доноров и тестирование доноров (IPC1). Сразу после получения плаценты от донора (во время процедуры кесарева сечения) ее помещали в стерильный пластиковый мешок и затем в пенопластовую коробку с мешочками льда. Плаценту вывозили и немедленно помещали в карантинную зону до получения разрешения для использования со стороны контроля качества (QC) и гарантирования качества (QA). Все последующие стадии получения производили в карантине, приспособленной чистой комнате до поступления утвержденных QC результатов теста на микоплазму, и клетки выделяли для 2-мерного выращивания.

Выделение и обработка прикрепляющихся клеток

Сначала ткань целой плаценты разрезали на кусочки в асептических условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком, промывали буферным раствором Хэнка и инкубировали в течение 3 часов при 37°С с 0,1% коллагеназой (1 мг коллагеназы/мл ткани). Добавляли 2D клеточную среду (2D среда, включающая DMEM с добавлением 10% FBS, 0,25 мкг/мл фунгизона и 50 мкг/мл гентамицина), и переваренную ткань грубо фильтровали через стерильную металлическую сетку, собирали в стерильный стакан и центрифугировали (10 минут, 1200 об/мин, 4°С). С помощью легкого пипетирования суспендированные клетки затем промывали 2D-средой с добавлением антибиотиков, высевали в 80 см² сосуды и инкубировали при 37°С в инкубаторе для тканевой культуры в условиях увлажнения с подачей 5% CO₂. Спустя 2-3 дня, в течение которых клеткам давали возможность прикрепиться к поверхности сосуда, клетки промывали ЗФР и добавляли 2D-среду.

Двумерное (2D) выращивание клеток

Перед первым пассажем образцы среды для выращивания в количестве 10% от общего количества сосудов в карантине объединяли и сдавали на тестирование микоплазмы (IPC2). Если обнаруживалось, что клетки негативны в отношении микоплазмы (набор EZ-PCR Micoplasma, Biological Industries, Израиль), клетки освобождались из карантина. После 1-2 дополнительных пассажей клетки переносили в чистую комнату для получения 2D (2DP). В комнате 2DP культивирование продолжали посредством еще 3-5 пассажей (отметим, что клетки выращивали в 2D-среде с добавлением антибиотиков до пассажа 3, после чего клетки выращивали в 2D-среде без антибиотиков). После пассажа 4 отбирали образец IPC-3 для определения иммунологического фенотипа. На протяжении процесса культуры выращивали в инкубаторе для культуры ткани в условиях увлажнения с 5% CO₂ при 37°С. После в общей сложности 6-8 пассажей (9-16 удвоений клеток) клетки собирали и хранили при криогенной температуре в качестве запаса 2D-клеток (2DCS).

Первый пассаж обычно проводили спустя 10-15 дней. Начиная с пассажа 2 вплоть до пассажа 6-8 клетки пассировали при достижении культурой 70-80% конфлуентности, обычно через 3-5 дней (1,5-2 удвоений). Клетки отделяли от сосудов с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА (4 минуты при 37°С) и высевали с получением плотности культуры 3±0,2×10 ³ клеток/см². Размер сосудов для тканевой культуры увеличивали в соответствии с продолжением пассажей. Процесс культивирования начинали в сосуде для культуры ткани 80 см², продолжали в 175 см², затем в 500 см² (утроенный сосуд) и, наконец, клетки высевали в клеточную фабрику из 10 подносов (6320 см²).

Перед криоконсервацией в конце периода выращивания 2DSC собирали среду для выращивания и получали образец для отсылки в сертифицированную GLP лабораторию для тестирования микоплазмы (IPC4).

Процедура криоконсервации запасаемого продукта 2D-клеток

Для криоконсервации 2DCS 2D-культивируемые клетки собирали в асептических условиях с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА. Клетки центрифугировали (1200 об/мин, 10 мин, 4°С), подсчитывали и ресуспендировали в 2D-среде.

Для замораживания клеточные суспензии разбавляли 1:1 2D-средой для замораживания (конечные концентрации составляли 10% ДМСО, 40% ЗФР и 50% 2D-среды). Из одной плаценты получали приблизительно 1,5-2,5×10⁹ клеток. 4 мл клеток хранили при конечной концентрации 10×10⁶ /мл в 5-мл полипропиленовых сосудах для криоконсервации. Сосуды помечали и переносили в морозильник с контролируемой скоростью охлаждения для процесса с постепенным снижением температуры (1°С/мин), после чего их переносили для хранения в газовую фазу морозильника на жидком азоте, находящегося в комнате для хранения с охлаждением. Этот материал обозначали как запасаемая партия 2D-клеток (2DCS).

Инициация процедур трехмерного (3D) культивирования

Для инициации 3D культуры подходящее количество (150±30×10⁶) клеток из 2DCS размораживали в комнате 2DP и промывали средой 3D (DMEM с 10% FBS и 20 мМ Hepes) для удаления ДМСО перед высеванием в заранее подготовленные биореакторные системы. Содержимое каждого сосуда 2DCS пипетировали и разбавляли 1:9 предварительно нагретой (37°С) 3D-средой. Клетки центрифугировали (1200 об/мин, 10 мин, 4°С) и вновь ресуспендировали в 50-100 мл предварительно нагретой (37°С) 3D-среды в 250-мл стерильной бутыли. Отбирали образец, и клетки подсчитывали с помощью красителя трипанового синего для определения количества и жизнеспособности клеток. Клеточную суспензию переносили в вытяжном шкафу с ламинарным потоком в 0,5-л бутыль для высевания. Из бутыли для высевания клеточную суспензию переносили под действием силы тяжести через стерильные трубки в биореактор.

Получение прикрепленных клеток в биореакторе CelliGen (PLX-C)

Описание биореактора

Фазу выращивания 3D проводили с использованием биореакторной системы CelliGen Plus® или BIOFLO 310 [(New Brunswick Scientific (NBS)]. Биореакторную систему использовали для культивирования клеточной культуры, условия в которой были пригодны для высоких концентраций клеток. Процесс культивирования осуществляли с использованием биореактора в режиме перфузии. Биореактор лабораторного масштаба был собран из двух основных систем - контрольной системы и самого биореактора (сосуда и дополнительного оборудования). Параметры процесса отслеживались и контролировались с помощью контрольной консоли, которая включала соединительные устройства для зондов, мотор и насосы, контуры регулирования растворенного кислорода (DO), pH, перфузии и встряхивания (с помощью мотора), систему контроля газов, систему циркуляции воды и нагревания для контроля температуры и интерфейс для оператора. Параметры контролируемого процесса (такие как температура, pH, DO и т.д.) можно было вывести на интерфейс оператора и отслеживать с помощью сконструированного контроллера.

Процедура выращивания клеточной культуры в биореакторах

Как отмечалось в разделе выше настоящего описания, 150±30×10⁶ клеток из криоконсервированных 2DCS размораживали, промывали и высевали в стерильный биореактор. Биореактор содержал 30-50 г носителей (дисков FibraCel®, NBS), изготовленных из полиэфира и полипропилена, и 1,5±0,1 л 3D-среды. Среду для выращивания в биореакторе хранили при следующих условиях: 37°С, 70% растворенного кислорода (DO) и pH 7,3. Отфильтрованные газы (воздух, CO₂, N₂ и O₂) вводились как определялось контрольной системой для поддержания величины DO на уровне 70% и величины pH на уровне 7,3. В течение первых 24 часов среду перемешивали при 50 оборотах в минуту (об/мин) и повышали скорость до 200 об/мин на 2 день. В течение первых 2-3 дней клетки выращивали в пакетном режиме. Перфузию начинали, когда концентрация глюкозы в среде снижалась ниже 550 мг/л. Среду качали из контейнера для подачи в биореактор с использованием стерильной силиконовой трубки. Все соединения трубок производили под ламинарным потоком с использованием стерильных разъемов. Перфузию доводили ежедневно для поддержания концентрации глюкозы постоянной на уровне приблизительно 550±50 мг/л. Каждые 1-2 дня отбирали образец среды для выращивания для определения концентрации глюкозы, лактата, глутамина, глутамата и аммония (анализатор BioProfile 400, Nova Biomedical). Отношение скорости потребления глюкозы и скорости образования лактата клеточной культурой давало возможность измерить скорость клеточного роста. Эти параметры использовали для определения времени сбора на основе собранных экспериментальных данных.

Сбор выращенных 3D клеток PLX-C из биореактора

Процесс сбора клеток начинали в конце фазы роста (4-10 дней). Отбирали два образца среды для выращивания. Один образец готовили для отправки в сертифицированную GLP лабораторию для тестирования микоплазмы в соответствии со стандартами USP и Eu, а другой образец переносили в морозильник с контролируемой скоростью замораживания для процесса постепенного снижения температуры (1°С/мин), после чего его переносили для хранения в газовой фазе морозильника на жидком азоте, расположенного в комнате для хранения при охлаждении, на случай необходимости повторного тестирования микоплазмы. Эти образцы среды рассматривались как часть тестирования микоплазмы конечного продукта и результаты рассматривались как часть критериев для освобождения продукта.

Выращенную 3D культуру собирали в ламинарной области класса-100 в комнате 3DP следующим образом:

Содержимое сосуда биореактора удаляли в пустой контейнер через трубку за счет силы тяжести. Сосуд открывали путем удаления верхней крышки и носители асептически переносили с помощью стерильного пинцета из бункера в верхнюю корзиночную сетку. После этого сосуд биореактора закрывали и вновь наполняли 1,5 л предварительно нагретого ЗФР (37°С). Скорость встряхивания увеличивали до 150 об/мин в течение 2 минут. ЗФР удаляли с помощью трубки под давлением или под действием силы тяжести в пустой сосуд. Процедуру промывки повторяли дважды.

Для отделения клеток от носителей в сосуд биореактора добавляли 1,5 л предварительно нагретого до 37°С раствора трипсина-ЭДТА (трипсин 0,25%, ЭДТА 1 мМ) и носители встряхивали в течение 5 минут при 150 об/мин, 37°С. Клеточную суспензию собирали в 5-л стерильный контейнер, содержащий 250 мл ЗФР. Клеточную суспензию разделяли между 4500-мл стерильными пробирками для центрифугирования и отбирали образец для тестирования микоплазмы. Закрытые центрифужные пробирки переносили через активную зону 3DP для переноса в комнату для заполнения класса 10000 (FR1), в которой клетки асептически разносили и криоконсервировали в качестве PLX-C.

Анализ клеточного цикла

Клетки PLX-C, полученные с помощью Celligen, и клетки PLX, полученные с помощью Plurix, фиксировали 70% EtOH O.N, центрифугировали и ресуспендировали в растворе пропидия йодида (PI), содержащем 2 мкг/мл PI (Sigma), 0,2 мг/мл РНКазы A (Sigma) и 0,1% (об./об.) тритона (Sigma) в течение 30 минут. Клеточный цикл анализировали с помощью FACS.

Матрица (микроматрица) для анализа экспрессии генов

Прикрепляющиеся клетки получали из доношенных плацент человека и размножали c помощью Plurix или Celligen. Для дальнейшего анализа было получено по три разных партии клеток при использовании каждого из методов размножения.

Из клеток экстрагировали РНК (набор Qiagen-Rneasy micro) и наносили на матрицу Affymetrix экспрессии всего генома. микроматрица представляла собой GeneChip® Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, California, США).

Анализ мембранных маркеров с помощью FACS

Клетки окрашивали моноклональными антителами, как описано ранее. Вкратце, 400000-600000 клеток суспендировали в 0,1 мл буфера для проточного цитометра в 5-мл пробирке для тестирования в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) в темноте с каждым из следующих моноклональных антител (MAbs): конъюгированным с FITC MAb против CD29 человека (eBioscience), конъюгированным с PE MAb против CD73 человека (Becton Dickinson), конъюгированным с PE MAb против CD105 человека (eBioscience), конъюгированным с PE MAb против CD90 человека (Becton Dickinson), конъюгированным с FITC MAb против CD45 человека (IQProducts), конъюгированным с PE MAb против CD19 человека (IQProducts), конъюгированным с PE MAb против CD14 человека (IQProducts), конъюгированным с FITC MAb против HLA-DR человека (IQProducts), конъюгированным с PE MAb против CD34 человека (IQProducts), конъюгированным с FITC MAb против CD31 человека (eBioscience), конъюгированным с FITC MAb против KDR человека (R&D systems), MAb против маркера фибробластов человека (D7-FIB) (ACRIS), конъюгированным с FITC MAb против CD80 человека (BD), конъюгированным с FITC MAb против CD86 человека (BD), конъюгированным с FITC MAb против CD40 человека (BD), конъюгированным с FITC MAb против HLA-ABC человека (BD), конъюгированным с FITC изотипом IgG1 (IQ Products), конъюгированным с PE изотипом IgG1 (IQ Products).

Клетки промывали дважды буфером для проточного цитометра, ресуспендировали в 500 мкл буфера для проточного цитометра и анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Coulter). Отрицательные контроли получали с флуоресцирующими молекулами соответствующего изотипа.

Реакция смешанных лимфоцитов (MLR)

2×10 ⁵ MNC из периферической крови (PB) (от донора A) стимулировали равным количеством облученных (3000 рад) MNCs из PB (от донора B). К культурам добавляли PLX-Cs в возрастающем количестве. Три повтора каждой группы высевали в 96-луночные планшеты. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% ЗФР. Планшеты импульсно метили 1 мкКи ³H-тимидина в течение последних 18 час 5-дневного культивирования. Клетки собирали на стекловолоконном фильтре и захват тимидина количественно определяли с помощью сцинтилляционного счетчика.

Для окрашивания CFSE клетки PB-MNC окрашивали на CFSE (Molecular Probes) для измерения пролиферации перед культивированием. Клетки собирали через 5 дней и интенсивность окрашивания CFSE определяли с помощью проточной цитометрии.

ELISA

ELISA проводили, как описано ранее. Вкратце, MNCs (выделенные из периферической крови) стимулировали 5 мкг/мл ConA (Sigma), 0,5 мкг/мл LPS (SIGMA) или 10 мкг/мл PHA (SIGMA) в присутствии PLX-C в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37°С. Собирали супернатанты и подвергали их анализу на цитокины с использованием наборов ELISA для IFN (DIACLONE), TNF (DIACLONE) и IL-10 (DIACLONE).

Результаты

Изменения в получении с помощью Celligen по сравнению с Plurix дали несколько важных различий (суммированных в таблице 10 ниже).

Таблица 10
Сравнение системы Plurix (WO/2007/108003) и системы Celligen (указания настоящего изобретения)
Параметр	WO/2007/108003	3D прикрепленные клетки настоящих указаний	Улучшение
Рабочий объем (мл)	280	1500	Увеличенный масштаб процесса. Более высокий уровень продукции в настоящих указаниях (2-8 удвоений популяции)
Масса носителя (г)	1,4	30	Увеличенный масштаб процесса в настоящих указаниях
Конфигурация основы	Коническая 50-мл колонка	Цилиндрическая упакованная основа	Настоящие указания - лучшее протекание среды и питательных веществ. WO/2007/108003 - неэффективное протекание из-за узкой формы выходного отверстия конической структуры Лучшая однородность потока среды. Образование каналов в plurix
Концентрация клеток при посеве (клеток/г носителя)	3×106 клеток/г носителя	5×106 клеток/г носителя	Лучшее взаимодействие между клетками в настоящих указаниях

Концентрация клеток при посеве (клеток/мл)	0,015×106 клеток/мл	0,1×106 клеток/мл	Лучшее взаимодействие между клетками в настоящих указаниях
Процедура посева	Посев при малом объеме среды в течение 24 час с последующим добавлением среды до конечного рабочего объема	Посев при конечном рабочем объеме при перемешивании	WO/2007/108003 - неоднородное распределение клеточной культуры внутри основы с носителем Недостаточный объем среды в первые 24 часа процесса. Ведет к неподходящим рабочим условиям (кислая среда)
Длительность фазы получения	14-21 день	4-10 дней	Лучшее качество продукта. Эффективный процесс сбора. Лучший выход. Меньшая стоимость процесса в настоящих указаниях
Режим операции	Повторяющаяся пакетная замена среды дважды в неделю	Режим перфузии - скорость доводили в соответствии с концентрацией глюкозы (среду меняли при концентрации глюкозы 550±50 мг/л	Настоящие указания - умеренные изменения условий, касающихся состава среды на протяжении процесса Непрерывное удаление токсичных агентов, продуцируемых клетками. При пакетном режиме -меньшая концентрация незаменимых питательных веществ (лимитирующих факторов) Меньше осколков клеток
Процедура сбора	Сбор в 50-мл пробирки Обработка трипсином 3 цикла	Сбор внутри биореактора Обработка трипсином 1 цикл	Настоящие указания - более эффективный процесс Сбор производится в закрытой системе. 1 цикл обработки трипсином - лучшее качество клеток.

Встряхивание	Циркуляция среды между резервуарным контейнером и колонкой с помощью перистальтического насоса	Поднимающая клетки крыльчатка	Настоящие указания - среда протекает через упакованную основу - лучшее снабжение культуры питательными веществами и кислородом. Однородность среды улучшает другие контуры регулирования (темп., DO, pH)
Температурный контроль	Получение производилось внутри инкубатора. Непрямой температурный контроль (камеры инкубатора). Теплообмен через границу контакта с воздухом	Прямой контроль в оперативном режиме. Теплообмен через водяную рубашку.	Настоящие указания - более точное измерение температуры культуры. Быстрый ответ. Малое время для достижения установочной точки.
Отслеживание температуры	Ручное. Непрямое водное отслеживание температуры.	Прямое отслеживание в оперативном режиме	Настоящие указания - лучшее отслеживание и контроль процесса. Быстрый ответ на неисправности
Отслеживание DO	Отсутствует	Отслеживание в оперативном режиме	Настоящие указания - лучшее отслеживание и контроль процесса. Быстрый ответ на неисправности
Контроль DO	Отсутствует. Введение только воздуха	Прямой контроль в оперативном режиме заданной установочной точки с использованием воздуха, O2 и N2.	Настоящие указания - лучший контроль уровня DO. Лучшее поддержание заданных рабочих условий

Контроль и отслеживание pH	Лишь визуальное отслеживание (феноловый красный как часть среды)	Контроль и отслеживание в оперативном режиме	Настоящие указания - лучший контроль уровня pH. Лучшее поддержание заданных рабочих условий
Аэрация	Лишь барботирование	Аппликация (барботирование как вариант)	WO/2007/108003 - аэрация барботированием создает пену, которая может повреждать клетки.

Изменения в процессе получения привели к изменениям в свойствах полученных прикрепленных клеток. Эти различия суммированы ниже.

Анализ клеточного цикла PLX, полученных с помощью Plurix, по сравнению с PLX-C, полученных с помощью Celligen

Клетки PLX-C, полученные с помощью Celligen, сравнивали с клетки PLX, полученными с помощью Plurix, для оценки распределения клеток между разными фазами клеточного цикла. Как ясно из фиг.6A-B, клетки PLX-C, размноженные с помощью Celligen, проявляли типичный пролиферативный профиль (распределения клеток между разными фазами клеточного цикла). Конкретно, 28% клеток находились в фазах S и G2/M (фиг.6A). Эти результаты показали, что клетки были собраны во время пролиферации и что условия биореактора Celligen поддерживали клеточный рост.

Сравнение клеток, полученных с помощью Plurix и Celligen, с использованием микроматриц

Анализ экспрессии генов с помощью микроматриц позволил одновременно отследить профили экспрессии всего генома прикрепляющихся клеток, полученных из плацент человека с доношенной беременностью, размноженных с помощью Plurix (PLX) или Celligen (PLX-C). Эти результаты позволили оценить молекулярный механизм, лежащий в основе фенотипического различия между клетками, полученными с помощью этих разных методов выращивания (см. таблицу 11 ниже).

Таблица 11
Экспрессия генов в клетках Plurix (WO/2007/108003) по сравнению с клетками Celligen (указания настоящего изобретения)
Ген	Celligen против Plurix (кратность изменения)	Величина p (доведенная)
индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами	17,52	0,0401812
альдегиддегидрогеназы семейство 1, член A1	16,76	0,00145807
аргининаминопептидаза из лейкоцитов	13,99	3,88E-06
кератин 27 псевдоген 27	12,25	0,000224998
сходный с кератином, типа I цитоскелетный 18 (цитокерати	11,83	0,000304949
сопряженный с G-белками рецептор, семейство C, группа 5, член A	10,35	3,39E-05
интегрин, альфа 6	9,84	0,0411667
сопряженный с G-белками рецептор 126	8,73	0,00197635
фактор свертывания III (тромбопластин, тканевой фактор)	7,36	0,012192

ингибитор диссоциации Rho ГДФ (GDI) бета	7,36	0,00200066
сигнальный пептид, домен CUB, EGF-подобный 3	7,20	0,0255115
индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами	7,09	0,0139777
гомолог 1 dickkopf (Xenopus laevis)	7,06	3,06E-07
НАД(Ф)H-дегидрогеназа, хинон 1	6,63	0,000282423
кератин 18	6,46	0,000514523
рецептору опиоидного фактора роста подобный 1	5,96	0,00114551
mal, подобный белку дифференцировки T-клеток	5,95	0,00664216
нейрофиламент, средний полипептид 150 кДа	5,86	0,0190611
содержащий домен DEP 1	5,82	0,000370513
катепсин C	5,72	0,00532262
WAS	5,47	0,00178153
ингибитор серпиновой пептидазы, группа B (овальбумин), член	5,44	0,0190218
семейство 7 переносчиков растворенных веществ (транспортер катионных аминокислот	5,33	0,00688017
индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повто	5,18	0,00357376
NUF2, компонент NDC80 кинетохорного комплекса, гомолог (S. cere	5,05	0,00276524
белок 1, связывающий SH2-домен SHC	4,95	0,00430878
тиоредоксинредуктаза 1	4,86	0,000197486
белок, ассоциированный с метастазом рака легкого	4,85	0,00148024
белок 29, активирующий ГТФазу Rho	4,85	0,0466211

гомолог 20 цикла деления клеток (S. cerevisiae)	4,80	0,00514206
семейство со сходством последовательности 111, член B	4,63	0,000125819
связывающая PDZ киназа	4,54	0,00784983
установление сцепления 1 гомолог 2 (S. cerevisiae)	4,53	0,000773033
гуанилатсвязывающий белок 4	4,47	0,000215944
липаза A, лизосомальная кислая, холестеринэстераза (болезнь Вольмана	4,42	0,0167385
член 20A семейства кинезина	4,39	0,00582352
KIAA0101	4,28	0,0105909
ингибитор 3 циклинзависимой киназы (ассоциированный с CDK2 двойной	4,25	0,000732492
тимидилатсинтетаза	4,23	0,00685584
открытая рамка считывания 3 хромосомы 13	4,18	0,000548296
киназа A аврора	4,16	0,00632571
nei эндонуклеаза VIII-подобный 3 (E. coli)	4,14	0,00115606
белок центросомы 55 кДа	4,13	0,0021952
рецептор 1 (лектиноподобный) окисленного липопротеина низкой плотности	4,11	0,0205198
denticleless гомолог (Drosophila)	4,05	0,00141153
аниллин, связывающий актин белок	4,01	0,010923
рибонуклеотидредуктазы M2 полипептид	3,98	0,00834059
домен 1 с анкириновым повтором (сердечная мышца)	3,93	0,00911953
транскрипционный фактор 19 (SC1)	3,89	0,00109627
кератин 18	3,89	0,000112551

не-SMC комплекс конденсина I, субъединица G	3,88	0,00537097
циклин E2	3,87	0,000203389
трипсиноген C	3,86	0,00416276
малая ядрышковая РНК, C	3,81	0,0334484
белок 2 плотных контактов (zona occludence 2)	3,81	0,00012562
член 18A семейства кинезина	3,78	0,00134108
член 2C семейства кинезина	3,77	0,0059888
shugoshin-подобный 1 (S. pombe)	3,76	0,00101318
polo-подобная киназа 1 (Drosophila)	3,75	0,0140309
тимидинкиназа 1, растворимая	3,73	0,00124134
транскрипционный фактор 19 (SC1)	3,73	0,00124327
транскрипционный фактор 19 (SC1)	3,73	0,00124327
гомолог класпина (Xenopus laevis)	3,71	0,00683624
субъединица 1 комплекса GINS (гомолог Psf1)	3,69	0,00104515
микросомальная глутатион S-трансфераза 1	3,67	0,041701
арилацетамиддеацетилаза-подобный 1	3,67	0,000902645
SPC25, компонент NDC80 кинетохорного комплекса, гомолог (S. ce	3,65	0,00568662
интегрин, альфа 4 (антиген CD49D, альфа 4 субъединица VLA-4	3,62	0,0158411
катенин (ассоциированный с кадгерином белок), альфа-подобный 1	3,57	7,46E-05
discs, большой гомолог 7 (Drosophila)	3,56	0,0317074
подобный (птичьему) гомологу вирусного онкогена миелобластоза v-myb	3,55	0,0043878
серглицин	3,54	0,0443487

белок N центромеры	3,53	0,000540143
циклин A2	3,53	0,00965934
белок 8 теплового шока 22 кДа	3,52	0,0219583
домен sema, иммуноглобулиновый домен (Ig), короткий основной доме	3,49	0,008548
белок 11A, активирующий ГТФазу Rho	3,49	0,00834174
анемия Фанкони, группа комплементации I	3,43	0,00464532
BUB1 почкования, не ингибируемого бензимидазолами, гомолог 1 (дрожжи	3,42	0,0108258
специфичный для яичников кислый белок	3,42	0,00334641
холинергический рецептор, мускариновый 2	3,41	0,0320078
цикл деления клеток 2, от G1 к S и от G2 к M	3,41	0,0017111
белковый регулятор цитокинеза 1	3,39	0,0325664
компонент 5 комплекса сохранения минихромосом	3,38	0,00475504
антиген 5, ассоциированный со спермой	3,37	0,00906321
материнская эмбриональная киназа с лейциновой застежкой-молнией	3,34	0,00908391
малая ядрышковая РНК, C	3,33	0,0298703
карнитинпальмитоилтрансфераза 1A (печень)	3,33	0,00170894
сходный с убиквитин-конъюгирующим ферментом E2S (убикви	3,33	0,000415822
член 11 семейства кинезина	3,33	0,00915145
киназа 7, родственная NIMA (ген a никогда в митозе)	3,33	0,00159114
металлопептидаза ADAM с мотивом тромбосподина типа 1,	3,32	0,0102751

трансформирующий, содержащий кислую двойную спираль белок 3	3,31	0,0014577
циклин B1	3,29	0,0103092
MAD2 недостаточность остановки митоза-подобный 1 (дрожжи)	3,28	0,00488102
дигидрофолатредуктаза	3,28	0,00178879
содержащий 3 NIPA-подобный домен	3,27	0,00164708
ассоциированный 2 с циклом деления клеток	3,26	0,0122226
фермент, редактирующий мРНК аполипопротеина B, каталитический полипеп	3,26	0,00308692
циклин B2	3,25	0,016544
содержащий эндонуклеазный домен 1	3,24	0,000429245
дигидрофолатредуктазы псевдоген	3,23	0,00141306
АТФаза, Na+	3,23	0,000381464
фактор репликации C (активатор 1) 3, 38 кДа	3,23	0,00109668
домен с повтором WD 76	3,22	0,0023531
плекстрин 2	3,17	0,0304429
белок 1, активирующий ГТФазу Rac	3,17	0,00381613
белок 19 с PHD пальцем	3,17	0,000177604
удаленный при лимфоцитарном лейкозе, 2	3,15	0,0109528
белок I центромеры	3,15	0,0106816
ассоциированный с BRCA1 домен 1 RING	3,14	0,000540414
регулятор 4 сигнализации G-белков	3,13	0,00781061
STAM-связывающий белок-подобный 1	3,11	0,0181743
гомолог сульфиредоксина 1 (S. cerevisiae)	3,10	5,14E-05

открытая рамка считывания 23 хромосомы 15	3,08	0,000147331
протеинкиназа TTK	3,08	0,0112171
не-SMC комплекс конденсина II, субъединица G2	3,08	0,0130322
виллин 2 (эзрин)	3,07	0,0131934
стоматин	3,06	0,00387095
содержащий A домен, подобный протеинтирозинфосфатазе	3,06	0,0419644
ингибитор серпиновой пептидазы, группа B (овальбумин), член	3,05	0,0030439
член 4A семейства кинезина	3,05	0,0114203
гипотетический белок DKFZp762E1312	3,05	0,00726778
убиквитин-конъюгирующий фермент E2S	3,04	0,00118205
гидроксистероиддегидрогеназа-подобный 2	3,03	3,71E-05
семейство АТФаз, содержащий домен AAA 2	3,01	0,00415258
TPX2, ассоциированный с микротрубочками, гомолог (Xenopus laevis)	3,00	0,0253137
кластер гистонов 1, H4d	3,00	0,030183
член 23 семейства кинезина	2,99	0,00790585
белок 2 теплового шока 70 кДа	2,99	0,0215102
комплекс узнавания ориджина, подобный субъединице 1 (дрожжи)	2,99	0,00207753
дигидрофолатредуктаза	2,98	0,00307793
рецептор опосредуемой гиалуронаном подвижности (RHAMM)	2,97	0,00467816
3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфатсинтаза 2	2,97	1,43E-05

глицеро-3-фосфатдегидрогеназа 2 (митохондриальная)	2,95	0,00211969
белок 1, ассоциированный с ядрышком и веретеном	2,95	0,00520875
diaphanous гомолог 3 (Drosophila)	2,95	0,00107709
член 14 семейства кинезина	2,94	0,00947901
кластер гистонов 1, H1b	2,93	0,0470898
белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды (G-белок), альфа инги	2,92	0,00184597
компонент 8 комплекса сохранения минихромосом	2,92	0,000841489
кандидат 5 подверженности раку	2,92	0,0330594
лейкотриена B4 12-гидроксидегидрогеназа	2,92	0,000685452
глутамат-цистеинлигаза, модифицирующая субъединица	2,91	0,00378868
вилкоголовый блок M1	2,91	0,0203154
белок, связанный с адипозной дифференцировкой	2,90	0,000331751
связанный с мембраной содержащий домен O-ацилтрансферазы 1	2,90	0,01185
убиквитин-конъюгирующий фермент E2T (потенциальный)	2,90	0,00741886
ассоциированный 3 с циклом деления клеток	2,89	0,006289
интегрин, альфа 3 (антиген CD49C, альфа 3 субъединица VLA-3	2,88	0,00574148
фактор свертывания XIII, полипептид B	2,88	0,0294465
гомолог RAD51 (гомолог RecA, E. coli) (S. cerevisiae)	2,87	0,000854739
АТФ-связывающая кассета, подсемейство C (CFTR	2,87	0,00382491

семейство со сходством последовательности 29, член A	2,85	0,00111165
4A, содержащий домен SH2	2,84	0,0323646
мембранный белок, пальмитоилированный 1, 55 кДа	2,84	0,000396285
регуляторная субъединица 1B протеинкиназы CDC28	2,84	0,0107391
взаимодействующий с PSMC3 белок	2,84	0,00766442
вставочный 2 эластиновых микрофибрилл	2,84	0,0192072
топоизомераза (ДНК) II альфа 170 кДа	2,83	0,0321109
трансмембранный белок 106C	2,82	0,000214223
кластер гистонов 1, H3b	2,80	0,0304598
открытая рамка считывания 24 хромосомы 18	2,80	0,00347442
субстрат 8 пути рецептора эпидермального фактора роста	2,79	0,0194949
нуклеосомный связывающий домен 2 высокомобильной группы	2,78	0,0030536
SCL	2,78	0,00390288
домен hect и RLD4	2,78	0,00679184
гомолог B ASF1 антисайленсной функции 1 (S. cerevisae)	2,77	0,00543408
взаимодействующий с рецептором тиреоидных гормонов 13	2,76	0,0118319
ассоциированный 8 с циклом деления клеток	2,75	0,00619878
член C1 семейства кинезина	2,74	0,00821937
нуклеосомный связывающий домен 2 высокомобильной группы	2,73	0,00384071
орнитиндекарбоксилаза 1	2,73	0,00144868

подобный 2 (птичьему) гомологу вирусного онкогена миелобластоза v-myb	2,71	0,00989416
лиганд KIT	2,70	0,00641955
киназа с двойной специфичностью, регулируемая фосфорилированием тирозина (Y)	2,70	0,0234606
гомолог внутрижгутикового транспорта 80 (Chlamydomonas)	2,70	0,0247286
трансмембранный белок 48	2,69	0,00458248
белок 2, связывающий EBNA1	2,69	0,00296292
взаимодействующий с ZW10	2,69	1,88E-05
экзонуклеаза 1	2,68	0,00739393
транскетолаза (синдром Вернике-Корсакова)	2,68	1,92E-05
рецептор 1 соматостатина	2,68	0,0144901
изоцитратдегидрогеназа 3 (NAD+) альфа	2,67	0,00297129
белок 2, ассоциированный с цитоскелетом	2,67	0,0030499
компонент 4 комплекса сохранения минихромосом	2,67	0,00342054
ингибитор 1 связывания ДНК, доминантно-негативный спираль-петля-спи	2,66	0,036485
регуляторная субъединица 1B протеинкиназы CDC28	2,66	0,0145263
кератин 18	2,66	8,40E-05
молекула CD97	2,66	0,00994045
открытая рамка считывания 173 хромосомы 6	2,64	0,00222408
содержащий BTB (POZ) домен 3	2,62	0,0166824
глухота, аутосомный доминантный 5	2,62	0,00235481

белок KIAA0286	2,62	0,00130563
анемия Фанкони, группа комплементации D2	2,61	0,0281405
polo-подобная киназа 4 (Drosophila)	2,60	0,00209633
рибонуклеотидредуктазы M1 полипептид	2,60	0,000170076
малик-фермент 1, НАДФ(+)-зависимый, цитозольный	2,59	0,0435444
не-SMC комплекс конденсина I, субъединица H	2,59	0,0216752
S100 связывающий кальций белок A3	2,58	0,0324073
убиквитин-конъюгирующий фермент E2L 3	2,57	0,00343347
BUB1 почкования, не ингибируемого бензимидазолами, гомолог бета	2,56	0,0166047
глицерокиназа	2,55	2,66E-05
TAF9B РНК-полимераза II, белок, связывающий блок TATA (TBP)-ас	2,54	0,0170365
TAF9B РНК-полимераза II, белок, связывающий блок TATA (TBP)-ас	2,54	0,0170365
кластер гистонов 1, H2bg	2,52	0,000180822
блок 2 высокомобильной группы	2,52	0,0196872
киназа 2, родственная NIMA (ген a никогда в митозе)	2,50	0,00289469
обогащенный пролином 11	2,50	0,0357125
миопалладин	2,49	0,0255088
содержащий домен brix 1	2,49	0,00471977
ассоциированный 5 с циклом деления клеток	2,49	0,01021
фукозидаза, альфа-L-2, плазмы	2,49	0,00540929
циклинзависимая киназа 2	2,49	0,00250724
рецептор ламина B	2,49	0,000151784

гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1 (синдром Леша-Найхана	2,49	0,000634057
содержащий тройной мотив 25	2,47	0,0456344
протеасомы (просомы, макропэйна) субъединица, типа бета, 9 (lar	2,46	0,0202595
протеасомы (просомы, макропэйна) субъединица, типа бета, 9 (lar	2,46	0,0202595
протеасомы (просомы, макропэйна) субъединица, типа бета, 9 (lar	2,46	0,0202595
сфингомиелинсинтаза 2	2,46	0,0020701
трансмембранный белок 62	2,45	0,00761064
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа	2,44	0,00278311
белок 1 с PHD пальцем	2,44	0,010191
ретинобластома-подобный 1 (p107)	2,44	0,00319946
KIAA1524	2,43	0,0380688
ST6 (альфа-N-ацетилнейраминил-2,3-бета-галактозил-1,	2,43	0,00830766
кофилин 2 (мышца)	2,43	0,0459235
гипотетический белок LOC201725	2,42	0,000313319
гомолог A цикла деления клеток 25 (S. pombe)	2,42	0,000341692
рак молочной железы 1 с ранним наступлением	2,41	0,0180553
трансальдолаза 1	2,41	0,00199537
гомолог оборота мРНК 4 (S. cerevisiae)	2,41	0,00373104
глюкозаминил(N-ацетил)трансфераза 1, основа 2 (бета-1,6-N-	2,41	0,0197148
регулятор 1 обогащенного цистеином трансмембранного BMP (подобный хордину)	2,41	0,0267286

ингибитор пути тканевого фактора (ассоциированный с липопротеином	2,40	0,0356227
открытая рамка считывания 59 хромосомы 16	2,40	0,00185191
гликогенин 1	2,39	0,0224317
трансмембранный белок 154	2,39	0,0045589
подобный 1 антигену канальцево-интерстициального нефрита	2,39	0,00510812
ЦТФ-синтаза	2,38	8,80E-05
фенилаланин-тРНК-синтаза, субъединица бета	2,38	0,000245973
геминин, ингибитор репликации ДНК	2,38	0,00167629
ламин B1	2,37	0,0477748
SPC24, компонент NDC80 кинетохорного комплекса, гомолог (S. ce	2,36	0,00287227
глутатионредуктаза	2,36	0,00353875
подобный 1 рибосомальному белку L22	2,36	0,00335381
фумарилацетоацетатгидролаза (фумарилацетоацетаза)	2,36	3,88E-05
малая ядрышковая РНК, C	2,35	0,0188991
семейство со сходством последовательности 64, член A	2,35	0,0019785
онкоген с последовательностью 2, трансформирующий эпителиальные клетки	2,35	0,000571152
полимераза (направляемая ДНК), эпсилон 2 (субъединица p59)	2,34	0,00479612
глицерокиназа	2,34	3,37E-06
глутатион-S-трансфераза M2 (мышца)	2,33	0,0402076
фактор элонгации, РНК-полимераза II, 2	2,33	0,0130017
тиоредоксин	2,33	0,009636

полимераза (направляемая ДНК), альфа 2 (субъединица 70 кДа)	2,32	0,0033903
рак молочной железы 2 с ранним наступлением	2,32	0,00586847
CDC45 цикл деления клеток 45-подобный (S. cerevisiae)	2,32	0,00735977
член Z семейства гистонов H2A	2,32	0,0129697
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,31	0,0164234
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,31	0,0164234
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,31	0,0164234
гомолог ассоциированного с ядрышковым комплексом 3 (S. cerevisiae)	2,30	0,000373346
АТФаза, транспортирующая Ca++, плазматической мембраны 4	2,30	0,023011
компонент 7 комплекса сохранения минихромосом	2,30	0,0457691
белок, взаимодействующий с TIMELESS	2,29	0,00771062
белок 1, связывающий Гиппель-Линдау	2,28	0,00329061
родственный ras субстрат 2 токсина ботулизма C3 (семейство rho, sma	2,28	0,0292466
тимопоэтин	2,28	0,0223176
пептидилпролилизомераза F (циклофилин F)	2,28	0,00093846
молекула клеточной адгезии активированных лейкоцитов	2,27	0,00242163
кольцевой палец 5 группы polycomb	2,27	0,000294142
белок 1, активирующий ГТФазу Ran	2,27	9,68E-05
фактор репликации C (активатор 1) 4, 37 кДа	2,26	0,00164152

тубулин, бета 2C	2,26	0,000346744
компонент 10 комплекса сохранения минихромосом	2,26	0,0037925
семейство гистонов H2B, член S	2,25	0,000885505
гамма-глутамилгидролаза (конъюгаза, фолилполигаммаглутамил	2,25	0,0195219
фактор терминации транскрипции, РНК-полимераза II	2,25	0,000393489
полимераза (направляемая ДНК), дельта 2 регуляторная субъединица 50 к	2,25	0,0123823
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,25	0,00859077
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,25	0,00859077
транспортер 1, АТФ-связывающая кассета, подсемейство B (MDR	2,25	0,00859077
кластер гистонов 1, H2bf	2,25	0,0124279
фактор 1A инициации трансляции эукариот, X-связанный	2,24	0,00330183
фосфоглюкомутаза 2	2,24	0,00818204
D3,D2-еноил-CoA-изомераза пероксисом	2,24	0,00148722
индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами	2,24	0,0177928
экспрессируемый 1 в G-2 и S-фазу	2,23	0,0241887
компонент 2 комплекса сохранения минихромосом	2,23	0,0021347
член A семейства со сходством последовательности 72	2,23	0,00143248
RMI1, опосредуемая RecQ нестабильность генома 1, гомолог (S. cerev	2,23	0,00294705
белок FLJ20105	2,23	0,0127979

фактор 2 множественной недостаточности свертывания	2,22	0,0116892
фитоцерамидаза, щелочная	2,22	0,0157729
содержащий домен с двойной спиралью 68	2,22	0,00227586
открывающий цитокинез 11	2,21	0,00697577
полипептид альфа фактора роста из тромбоцитов	2,21	0,00176418
N-ацетилсфингозинамидогидролаза (нелизосомальная церами	2,20	0,00728536
белок 2, ассоциированный с киназой S-фазы (p45)	2,20	0,00230153
полимераза (РНК) III (направляемая ДНК), полипептид G (32 кДа)	2,20	0,0298794
белок 1, взаимодействующий с подобным 6 фактору АДФ-рибозилирования	2,20	0,00139745
кластер гистонов 1, H2bh	2,19	0,0377748
комплекс узнавания ориджина, подобный субъединице 5 (дрожжи)	2,19	0,049697
регуляторная субъединица 2 протеинкиназы CDC28	2,19	0,0128024
кластер гистонов 1, H4c	2,19	0,0112695
гипотетический белок LOC729012	2,19	0,000446087
полипептид 39 с блоком DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)	2,19	0,000340561
фактор сборки хроматина 1, субъединица B (p60)	2,18	0,0119687
белок, взаимодействующий с MLF1	2,18	0,0177203
ассоциированный с микротрубочками серин	2,18	0,00536974
последовательность B, родственная полипептиду MHC класса I	2,18	0,0165406
shugoshin-подобный 2 (S. pombe)	2,18	0,000852557

субъединица 6 COP9 конститутивного фотоморфогенного гомолога (Arab	2,18	0,000793512
метилентетрагидрофолатдегидрогеназа (НАДФ+ зависимая)	2,18	0,00119726
открытая рамка считывания 167 хромосомы 6	2,18	0,0011095
трансформирующий опухоль гипофиза 1	2,17	0,0485166
рибонуклеаза H2, субъединица A	2,17	0,00669936
рентгеновская репарация, дополняющая недостаточную репарацию в китайском хом	2,16	0,0369865
мембранный белок, пальмитоилированный 5 (MAGUK p55 подсемейство мемб	2,16	0,00211873
кариоферин альфа 2 (RAG группа 1, импортин альфа 1)	2,16	0,000650645
содержащий домен гомологии с плекстрином, семейство A (фосфои	2,15	0,0256434
подобный рибосомальному белку L39	2,15	0,00429384
кариоферин альфа 2 (RAG группа 1, импортин альфа 1)	2,15	0,000700649
связывающий белковый предшественник амилоида бета (A4), семейство B, м	2,15	0,00201004
компонент 3 комплекса сохранения минихромосом	2,14	0,0018389
кластер гистонов 1, H2ai	2,14	0,0129155
открытая рамка считывания 34 хромосомы 13	2,14	0,000702936
гомолог RAD18 (S. cerevisiae)	2,14	0,0016685
белок 1 с повтором WD и блоком HMG связывания ДНК	2,13	0,0034833
сульфидхинонредуктаза-подобный (дрожжи)	2,13	0,0473641

открытая рамка считывания 63 хромосомы 16	2,12	0,000804179
фосфопротеин 1 M-фазы	2,12	0,0271814
компонент 6 комплекса сохранения минихромосом	2,12	0,0161279
гомеоблок A9	2,11	0,00520942
фактор роста фибробластов 9 (активирующий глию фактор)	2,10	0,0475844
гомолог C цикла деления клеток 25 (S. pombe)	2,10	0,0169914
открытая рамка считывания 64 хромосомы 9	2,10	0,0265979
киназа 1 с мотивом (UHM), гомологичным U2AF	2,09	0,0255167
фактор репликации C (активатор 1) 2, 40 кДа	2,09	0,00768959
гипотетический белок LOC440894	2,09	0,0103358
малого ядрышкового рибонуклеопротеина D1 полипептид 16 кДа	2,09	0,0334665
подобный CSE1 сегрегации хромосом 1 (дрожжи)	2,09	0,0013662
биосинтез фосфатидилинозитолгликанового якоря, класс W	2,09	0,0151967
белок O центромеры	2,09	0,00397056
семейство со сходством последовательности 20, член B	2,09	0,00460031
гипотетический белок FLJ40869	2,09	0,00444509
белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды (G-белок), гамма 11	2,08	0,00140559
белок, связывающий кальцициклин	2,08	0,00524566
АТФ-связывающая кассета, подсемейство E (OABP), член 1	2,08	0,00454751

молекула CD44 (Индийская группа крови)	2,08	0,000651436
компонент 8 экзосомы	2,08	0,00132017
семейство со сходством последовательности 102, член B	2,08	0,025743
кластер гистонов 2, H3d	2,07	0,0102932
семейство со сходством последовательности 33, член A	2,07	0,000318673
анемия Фанкони, группа комплементации B	2,07	0,000255109
член 22 семейства кинезина	2,07	0,0192406
кластер гистонов 1, H2ai	2,07	0,0161621
киназа 1, родственная коровьей оспе	2,06	0,0233182
субъединица 7 комплекса интегратора	2,06	0,000841371
эндонуклеаза 1, специфичная в отношении структуры щитка	2,06	0,006882
гипотетический белок FLJ25416	2,06	0,000177531
эктопический сайт 2B интеграции вируса	2,06	0,0171408
пигментная дегенерация сетчатки 2 (X-связанная рецессивная)	2,05	0,0264185
белок центромеры L	2,05	0,000880856
кофактор, необходимый для активации транскрипции Sp1, субъе	2,04	0,00141809
открытая рамка считывания 121 хромосомы 20	2,04	0,0146323
семейство со сходством последовательности 72, член A	2,04	0,00162905
семейство со сходством последовательности 72, член A	2,04	0,00165234
фактор 1A инициации трансляции эукариот, X-связанный	2,04	0,00520549
фактор элонгации, РНК-полимераза II, 2	2,03	0,0458007

АТФаза, Na+	2,03	0,0189108
кластер гистонов 1, H3a	2,03	0,0244273
содержащий домен brix 1	2,03	0,00981178
содержащий домен sushi 1	2,03	0,0258164
эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролаза 6 (предполагаема	2,03	0,00423628
фруктозамин-3-киназа	2,03	0,00470972
синдром Блума	2,02	0,0209259
тубулин, альфа 1c	2,01	0,00862586
транскрипционный фактор 2 E2F	2,01	0,0496479
компонент 2 экзосомы	2,01	0,00649147
член 22 семейства кинезина	2,01	0,0242075
гомолог LTV1 (S. cerevisiae)	2,01	0,00812652
дигидролипоамид-S-ацетилтрансфераза (компонент E2 пирув	2,01	0,00179011
гомолог B вирусного онкогена v-ral лейкоза обезьян (родственный ras	2,01	0,012225
домен 3 с кольцевым пальцем и повтором WD	2,01	0,0013797
аннексин A1	2,01	0,0173578
гомолог 2 elaC (E, coli)	2,00	0,00266504
альдегиддегидрогеназа семейства 9, член A1	2,00	0,00911609
тубулин, альфа 4a	2,00	0,0435427
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,00	0,00111223
окуломедин	-2,01	0,00778869
сходный с киназой SMG-1, родственной PI-3-киназе	-2,01	0,0356628

аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,01	0,00770626
содержащий повтор спектрина, ядерная оболочка 1	-2,01	0,00438469
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,01	0,00117582
sushi, нидоген и EGF-подобные домены 1	-2,01	0,00161129
интегрин, альфа V (рецептор витронектина, альфа полипептид	-2,02	0,00252702
ингибитор 2B циклинзависимой киназы (p15, ингибирует CDK4)	-2,04	0,0150268
подобный лизилоксидазе 4	-2,04	0,0120148
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,04	0,000213956
кальций	-2,04	0,00657494
кальсинтенин 3	-2,04	0,00300887
молекула клеточной адгезии 1	-2,05	0,0261129
семейство 22 переносчиков растворенных веществ (транспортер органических катионов),	-2,05	0,0137275
содержащий домен RUN и FYVE 3	-2,05	0,00387265
глюкозидаза, альфа, кислая (болезнь Помпе, бо запасания гликогена	-2,05	0,000418401
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,05	0,00988632
обогащенный пролином коактиватор 1 ядерных рецепторов	-2,06	0,0039587
мембранная металлоэндопептидаза	-2,06	0,0152684
белок 21A с пальцем PHD	-2,06	0,00980401
белок, активирующий ГТФазу Rho	-2,06	0,00705186
гомеоблок B6	-2,06	0,00301714

белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,07	0,00032839
рецептор 1 фосфолипазы A2, 180 кДа	-2,07	0,00069343
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,08	0,000352007
гомолог 3 slit (Drosophila)	-2,08	0,02844
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,09	0,000414309
циклинзависимая киназа 6	-2,09	0,0456892
динамин 1	-2,09	0,00139674
jumonji, обогащенный AT домен взаимодействия 1B	-2,09	0,00861002
связывающий кальций и содержащий двойную спираль домен 1	-2,09	0,00370041
рецептор инсулиноподобного фактора роста 1	-2,09	0,00114467
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,10	0,000377834
молекула CD82	-2,10	0,0175517
бромодомен, соседний с доменом цинкового пальца, 2B	-2,10	9,88E-05
---	-2,10	0,00666187
синаптотагмин XI	-2,11	0,0129428
KIAAA1546	-2,11	0,000255634
протоонкоген jun B	-2,12	0,0120169
палец CXXC 6	-2,12	0,0277527
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,14	0,00282604
гомолог Cdon (мышь)	-2,15	0,0350357
CLL B-клеток	-2,15	0,00343507

белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,15	0,00263888
гомолог 1 вирусного онкогена v-abl лейкоза Абельсона мышей	-2,16	0,0136688
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,16	0,00583397
гомолог 1 супрессора опухолей FAT (Drosophila)	-2,18	0,0158766
трансформирующий-2 альфа	-2,18	0,012256
химерин (химаерин) 1	-2,18	0,0287031
белок глобулы жира молока-EGF фактор 8	-2,18	0,000987073
рецептор витамина D (1,25-дигидроксивитамина D3)	-2,19	0,000192208
нейробластома, супрессор образования опухоли 1	-2,20	0,00090639
содержащий домен jumonji 1A	-2,20	0,0188513
протеинкиназа 1 WNK с недостаточностью лизина	-2,21	1,57E-05
протокадгерин бета 14	-2,21	0,0103892
белок 2, связывающий кортактин	-2,21	2,28E-05
регулятор транскрипции 1, содержащий домен WW	-2,22	0,0379899
циклин L1	-2,22	0,00831474
ядерный фактор активированных T-клеток, цитоплазматический, кальцин	-2,22	0,00786451
гомолог 1 pellino (Drosophila)	-2,23	0,00939357
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,24	0,00603583
открытая рамка считывания 10 хромосомы 7	-2,26	0,00738442
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a-подобный псевдоген	-2,27	0,00320764

РНК 17, специфичная для тельца Каджала	-2,27	0,0301336
белок 2, связывающий латентный трансформирующий фактор роста бета	-2,29	4,08E-05
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a, 8A	-2,29	0,0111179
ингибин, бета A (активин A, активина AB альфа полипептид)	-2,29	0,00877271
семейство 41 переносчиков растворенных веществ, член 2	-2,30	0,00453672
вилкоголовый блок P1	-2,30	0,0463138
металлопептидаза 14 матрикса (вставленная в мембрану)	-2,31	1,93E-05
транскрипционный фактор 4	-2,31	0,0367869
онкоген jun	-2,32	7,21E-05
ген 1, трансформирующий нейроэпителиальные клетки	-2,33	0,0109689
аспорин	-2,33	0,000659873
гомолог вирусного онкогена v-fos FBJ остеосаркомы мышей	-2,35	0,0138624
эфрин-B2	-2,36	0,00611474
содержащий 1 повтор WD и блок SOCS	-2,36	0,0387851
сходный с dJ402H5,2 (новый белок, сходный с во	-2,36	0,00621503
содержащий серин домен PX	-2,38	0,000927628
коллаген, тип VII, альфа 1 (буллезный эпидермолиз, распр	-2,38	0,00109233
белок 1, связывающий AE	-2,39	0,000105628
гомолог пероксидазина (Drosophila)	-2,40	0,00219049
кальциевый канал, потенциал-зависимый, L тип, альфа 1C суб	-2,41	0,0189661

область 1 хромосомы синдрома Прадера-Вилли	-2,45	0,0415526
мидлин 1 (Опица	-2,45	0,00130803
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,45	0,00354416
открытая рамка считывания 54 хромосомы 1	-2,47	0,0186089
трансмембранный белок 16A	-2,48	0,0481085
содержащий основной домен спираль-петля-спираль, класс B, 2	-2,49	0,00270257
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,50	0,00316496
транскрипционный фактор 1, родственный runt (острый миелоидный лейко	-2,50	0,000607387
белок 292 с цинковым пальцем	-2,50	0,029832
фибронектиновый обогащенный лейцином трансмембранный белок 2	-2,51	0,0135122
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,51	0,00283418
управляемый потенциалом калиевый канал, подсемейство G, член 1	-2,54	0,0244306
интерлейкин 19	-2,34	0,0310328
трансформирующий фактор роста, бета 3	-2,54	0,0287865
дигидропиримидиназа-подобный 3	-2,55	0,0165203
аутоантиген гольджи, подсемейство гольджин a, 8B	-2,56	0,0121417
гипотетический белок PRO2012	-2,57	0,00756704
гомеоблок 2 SATB	-2,57	0,039781
t-комплекса 11 (мышь)-подобный 2	-2,57	0,0324227
белок 122 с цинковым пальцем	-2,57	0,0236621

открытая рамка считывания 57 хромосомы 8	-2,59	0,00261522
металлопептидаза ADAM с мотивом тромбосподина типа 1,	-2,60	0,0113968
sushi, фактора фон Виллебранда типа A, EGF и пентраксина дом	-2,63	2,23E-05
ST6 бета-галактозамид альфа-2,6-сиалилтрансфераза 2	-2,64	0,0216987
родственный сортилину содержащий домен VPS10 рецептор 2	-2,65	0,00936311
протокадгерин бета 9	-2,66	0,0285124
открытая рамка считывания 13 хромосомы 5	-2,67	0,00410172
Enah	-2,68	0,0077547
содержащий 2 домен зависимой от пиридоксаля декарбоксилазы	-2,69	0,00683647
сходный с белком, взаимодействующим с комплексом ядерной поры	-2,70	0,0187322
белок, взаимодействующий с комплексом ядерной поры	-2,70	0,00368967
трансмембранный белок 119	-2,70	0,00801387
открытая рамка считывания 37 хромосомы 14	-2,70	0,0182453
белок, содержащий повтор sushi, X-сцепленный 2	-2,71	0,0253856
содержащий домен PDZ с пальцем RING 3	-2,71	0,00931014
коллаген, тип XII, альфа 1	-2,72	0,000204664
ассоциированный 5 с перестройкой матрикса	-2,72	0,000317637
коллаген, тип V, альфа 1	-2,72	0,0166427
белок 2, родственный дистрофину	-2,72	0,0137557

АТФ-связывающая кассета, подсемейство A (ABC1), член 1	-2,73	0,00131361
трофинин	-2,77	0,00298044
гомолог 3 cornichon (Drosophila)	-2,78	0,0261738
подобный белку 1, связывающему формин	-2,78	0,00290401
мозг и острый лейкоз, цитоплазматический	-2,78	0,0476919
протеинтирозинфосфатаза, рецепторного типа, U	-2,80	0,0270428
гипотетический белок MGC24103	-2,82	0,0346673
индуцируемый интерфероном с доменом 1 геликазы C	-2,83	0,0024839
белок транспорта фосфолипидов	-2,84	0,00999206
немедленный ранний ответ 3	-2,87	0,0152127
немедленный ранний ответ 3	-2,87	0,0152127
домен 12 металлопептидазы ADAM (мелтрин альфа)	-2,87	0,000870288
гликопротеин 2A синаптического пузырька	-2,88	0,00704212
открытая рамка считывания 3 хромосомы 9	-2,88	0,00410177
белок, взаимодействующий с тиоредоксином	-2,90	0,0135494
ранний ростовой ответ 1	-2,93	0,000425035
малая ядрышковая РНК, C	-2,94	0,00666866
малая ядрышковая РНК, C	-2,95	0,00765575
немедленный ранний ответ 3	-2,99	0,0167309
белок 1, родственный липопротеиду низкой плотности (альфа-2-макрогло	-2,99	4,26E-05
гомолог 1 двухвостости C (Drosophila)	-2,99	0,0347162

гомеоблок B2	-3,03	0,00665994
малая ядрышковая РНК, C	-3,10	0,0274043
малая ядрышковая РНК, C	-3,10	0,0274043
металлопептидаза 2 матрикса (желатиназа A, желатиназа 72 кДа,	-3,13	5,59E-05
KIAA1641	-3,14	0,00659194
коллаген, тип VI, альфа 3	-3,14	2,09E-06
гомеоблок A2	-3,15	0,0435423
2B с доменами SH3 и PX	-3,15	0,0244357
коллаген, тип VI, альфа 2	-3,16	0,0149554
открытая рамка считывания 3 хромосомы 9	-3,21	0,0233723
малая ядрышковая РНК, C	-3,24	0,0104491
малая ядрышковая РНК, C	-3,24	0,0104491
---	-3,27	0,00488845
УДФ-N-ацетил-альфа-D-галактозамин:полипептид N-ацетилга	-3,35	0,00964109
холестерин-25-гидроксилаза	-3,38	0,0445558
KIAA1641	-3,40	0,013175
белок 144 с цинковым пальцем	-3,40	0,0135334
версикан	-3,41	0,023885
подобный 2 ангиопоэтину	-3,42	0,0245161
KIAA1641	-3,44	0,0170531
гомолог B вирусному онкогену остеосаркомы мыши FBJ	-3,54	0,00025573
сходный с кДНК RIKEN 1110018M03	-3,59	0,00516476
ранний ростовой ответ 2 (гомолог Krox-20, Drosophila)	-3,62	0,00821813

dashcous 1 (Drosophila)	-3,63	0,00697244
член 26B семейства кинезина	-3,64	0,00363199
гомеоблок 5 без дистальной части	-3,66	0,000640157
сходный с белком KIAA0220	-3,69	0,0302619
рецептор инсулиноподобного фактора роста 1	-3,71	3,42E-05
протеинтирозинфосфатаза, рецепторного типа, N	-3,77	0,0294569
KIAA1641	-3,85	0,0191782
белок, содержащий повтор sushi, сцепленный с X	-3,85	0,00370941
белок 2, ассоциированный с микрофибриллами	-3,91	0,0152901
компонент 1 комплемента, подкомпонент s	-3,97	0,0395863
молекула CD24	-3,99	0,0340122
гомеоблок B3	-4,02	0,0354368
трихоринофалангеальный синдром I	-4,02	0,00557712
последовательность синдрома Калльманна 1	-4,04	0,000548703
содержащий обогащенный лейцином повтор 17	-4,09	0,0263961
содержащий 2 домен плексина	-4,32	0,031799
PTK7 протеинтирозинкиназа 7	-4,42	0,000116114
супервиллин	-4,43	0,0412717
белок 521 с цинковым пальцем	-4,58	0,00668815
кальбиндин 2, 29 кДа (кальретинин)	-4,77	0,0290743
семейство генов гомолога ras, член J	-4,79	0,00197982
интегрин, альфа 11	-4,80	0,000390317

odz, odd Oz	-5,05	0,00172671
белок 32 c блоком F	-5,52	0,0212957
член 2 семейства рафтлина	-5,72	0,0260454
кластерин	-5,74	0,0303973
нейротримин	-5,79	3,78E-06
белок 1 пути сигнализации, индуцируемого WNT1	-5,86	0,000672342
белок 5, связывающий инсулиноподобный фактор роста	-6,34	0,011614
сульфатаза 2	-6,34	5,88E-05
белок 4, ассоциированный с микрофибриллами	-6,93	0,00155578
молекула адгезии 2 контактов	-7,07	0,0306758
содержащий 1 домен фибронектина типа III	-7,29	0,0334696
саркогликан, дельта (35 кДа ассоциированный с дистрофином гликопротеи	-7,37	0,000881984
гефэстин	-7,53	0,0123141
ингибитор серпиновой пептидазы, группа F (альфа-2 антиплазми	-7,66	0,00362941
цистатин SN	-7,96	0,0496433
гемицентин 1	-8,18	0,0461603
тенасцин C (hexabrachion)	-8,32	8,26E-05
бигликан	-8,62	0,00161284
трансмембранный, индуцируемая андрогеном в простате РНК	-11,20	0,000100935
карбоксипептидаза E	-11,22	0,00738131

Экспрессия клеточных маркеров на клетках PLX-C

Антигены поверхности, экспрессируемые PLX-C, тестировали с использованием моноклональных антител. Результаты показали, что клетки PLX-C характеризовались позитивными маркерами: CD73, CD29 и CD105 и негативными маркерами: CD34, CD45, CD19, CD14 и HLA-DR (данные не показаны). Описания по тесту на иммунный фенотип были установлены как: 90% для всех позитивных маркеров и 3% для всех негативных маркеров.

Более того, как показано на фиг.7A-B, культуры PLX-C не экспрессировали эндотелиальных маркеров, как продемонстрировано по негативному окрашиванию на два эндотелиальных маркера CD31 и KDR. Однако экспрессия на PLX-C маркера, типичного для фибробластов, была очевидной (экспрессия D7-fib, фиг.7C).

Иммуногенность и иммуномодуляторные свойства клеток PLX-C

Так как PLX-C состоят из прикрепляющихся клеток, происходящих из плаценты, предполагается, что они экспрессируют HLA типа I, который экспрессируются всеми клетками организма, и, как известно, индуцируют аллореактивный иммунный ответ. HLA типа II и другие костимуляторные молекулы обычно экспрессируются только на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APCs).

Для того чтобы оценить иммуногенность полученных клеток PLX-C, осуществляли оценку экспрессии костимуляторных молекул на поверхности их клеточных мембран. Анализ FACS показал отсутствие CD80, CD86 и CD40 на мембранах клеток PLX-C (фиг.8A-C). Более того, PLX-C экспрессировали низкие уровни HLA класса I при определении с помощью окрашивания на HLA A/B/C (фиг.8D). Экспрессия стимуляторных и костимуляторных молекул была сходной с MSCs, происходящими из костного мозга (BM) (как показано на фиг.8A-D).

Для дополнительного исследования иммуногенности, а также иммуномодуляторных свойств клеток PLX-C осуществляли тесты по смешанной лимфоцитарной реакции (MLR). Как показано на фиг.9A-B, клетки PLX-C и избегают аллоузнавания, и снижают ответ Т-клеток при измерении по включению тимидина. Более того, снижение пролиферации лимфоцитов (оцениваемое по измерению имп/мин) было тем больше, чем больше росло количество клеток PLX-C (дозозависимым образом). PLX-C также снижали пролиферацию лимфоцитов после митогенных стимулов, таких как конкавалин A (Con A, фиг.9B) и фитогемагглютинин (PHA), и после неспецифической стимуляции анти-CD3, анти-CD28 (данные не представлены).

Для исследования механизма действия, с помощью которого PLX-C осуществляют иммуномодуляцию пролиферации лимфоцитов, и для рассмотрения опосредуется ли это действие межклеточным взаимодействием или секрецией цитокинов, мононуклеарные клетки (MNCs), происходящие из PB, стимулировали PHA с использованием метода межлуночного переноса (который предотвращает контакт между клетками, но позволяет цитокинам диффундировать между двумя компартментами). Результаты показали, что ингибирование пролиферации поддерживалось, даже когда контакт между клетками ингибировался (данные не представлены).

Секреция цитокинов

Как описано в настоящем документе выше, LX-C снижают скорость пролиферации лимфоцитов, очевидно, через растворимые факторы. Дальнейшее исследование цитокинов, секретируемых лимфоцитами в ответ на PLX-C, осуществляли для выяснения механизма действия PLX-C. Как изображено на фиг.10A-B, культивирование мононуклеарных клеток с PLX-C слегка снижало секрецию провоспалительного цитокина INF и резко снижало секрецию TNF (даже в присутствии низких количеств PLX-C). Кроме того, после стимуляции липополисахаридом (LPS) секреция ИЛ-10 MNCs, происходящими из PB, повышалась в присутствии PLX-C, тогда как уровень секреции TNF снижался дозозависимым образом (фиг.10C).

Следует принимать во внимание, что клетки PLX-C по указаниям настоящего изобретения были также способны осуществлять хоминг в ишемических тканях после внутримышечного или внутривенного введения мышам (данные не представлены).

ПРИМЕР 4

Противовоспалительное действие клеток PLX-C in vivo в мышиной модели острого колита

Материалы и экспериментальные методы

TNBS модель воспаления кишечника

Колит индуцировали у восприимчивых линий грызунов путем внутриректального закапывания гаптенизирующего вещества TNBS (тринитробензолсульфоновой кислоты) в этаноле. Использование TNBS в этаноле основано на предшествующих сообщениях о том, что этанол требуется для разрушения барьера слизистой, тогда как TNBS гаптенизирует аутологичные или микробные белки ободочной кишки, придавая им иммуногенность в отношении иммунной системы хозяина [Wirtz et al., Nature Protocols (2007) 2(3): 541-546].

Кратко, для индукции колита мышей анестезировали в течение 90-120 минут и им вводили внутриректально TNBS (40 мкл, 150 мг/кг), растворенной в 1:1 смеси 0,9% NaCl в 100% этаноле. Контрольные мыши получали 1:1 смесь 0,9% NaCl в 100% этаноле или физиологический раствор с использованием того же самого метода.

Мышей забивали через 5 дней после введения TNBS для оценки противовоспалительного действия терапевтических клеток (PLX-C клеток) по настоящему изобретению. Введение PLX-C оценивали при внутривенном (в/в) введении или при внутрибрюшинном (в/бр) введении клеток через 1 день после индукции колита.

Животные

В этих экспериментах использовали мышей C57b16. Суммарно использовали 90 мышей, которые были подразделены на 9 следующих групп:

1) 10 контрольных мышей (не получавших никакого лечения)

2) 10 контрольных мышей + партия 1 PLX-C-I в/бр (2*10⁶ клеток)

3) 10 контрольных мышей + партия 1 PLX-C-I в/в (1*10⁶ клеток)

4) 10 мышей TNBS (мышей с моделью колита)

5) 10 мышей TNBS + 5-аминосалициловая кислота (5-ASA)

6) 10 мышей TNBS + партия 1 PLX-C-I в/в (1*10⁶ клеток)

7) 10 мышей TNBS + партия 1 PLX-C-I в/бр (2*10 ⁶ клеток)

8) 10 мышей TNBS + партия 2 PLX-C-I в/в (1*10⁶ клеток)

9) 10 мышей TNBS + партия 2 PLX-C-I в/в (2*10⁶ клеток)

Получение 2D прикрепляющихся клеток, происходящих из плаценты

Как подробно описано в примере 2 в настоящем описании выше.

Получение 3D прикрепляющихся клеток, происходящих из плаценты (клеток PLX-C)

Как подробно описано в примере 3 в настоящем описании выше.

Носитель

В качестве контрольного носителя использовали PlasmaLyte, содержащий 5% альбумин.

Тесты и оценка

Осуществляли макроскопическую и гистологическую оценки колита в образцах ободочной кишки, собранных от мышей различных экспериментальных групп через 5 дней после введения TNBS. Макроскопическую и гистологическую оценки проводились вслепую двумя исследователями.

Макроскопический анализ

Ободочную кишку каждой мыши исследовали под препаровальной лупой (увеличение × 5) для оценки макроскопических повреждений в соответствии с критериями Уоллеса. По показателю Уоллеса оценивали макроскопические повреждения по шкале от 0 до 10 на основе признаков, отражающих воспаление, таких как гиперемия, утолщение кишечника и распространение изъязвления.

Таблица 12
Показатель Уоллеса
Показатель	Критерии макроскопической оценки
0	Без воспаления
1	Гиперемия без изъязвлений
2	Гиперемия с утолщением слизистой без изъязвлений
3	1 изъязвление без утолщения стенки ободочной кишки
4	2 или более мест изъязвления или воспаления
5	2 или более мест изъязвления или воспаления с распространением более 1 см
6	1 место изъязвления или воспаления более 2 см
7	1 место изъязвления или воспаления более 3 см
8	1 место изъязвления или воспаления более 4 см
9	1 место изъязвления или воспаления более 5 см
10	1 место изъязвления или воспаления более 6 см

Гистологический анализ

Для гистологической оценки в соответствии с критериями Ameho использовали образец ободочной кишки, расположенный точно на 2 см выше анального отверстия. Эта классификация (по шкале от 0 до 6) принимала во внимание степень воспалительного инфильтрата, наличие эрозии, изъязвление или некроз и глубину и поверхностное распространение повреждений.

Таблица 13
Критерии Ameho
Показатель	Критерии гистологической оценки
0	Без изменений
1	Средние мукозные и/или субмукозные воспалительные инфильтраты с отеком. Немногочисленные эрозии слизистой. Целостность мышечной слизистой.
2	Те же критерии, что и по шкале 1, но более 50% среза
3	Большой воспалительный инфильтрат с областью изъязвления по всей ободочной кишке
4	Те же критерии, что и по шкале 3, но более 50% среза
5	Обширные изъязвления с клеточным некрозом
6	Обширные изъязвления с клеточным некрозом, но более 50% среза

Молекулярный анализ колита

Количественная оценка экспрессии мРНК ИЛ-1 бета

Суммарную РНК выделяли из цельных тканей ободочной кишки мышей с использованием набора Rneasy (Macherey Nagel, Hoerdt, France) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную оценку РНК проводили с использованием спектрофотометрии. После обработки при 37°С в течение 30 минут 20-50 единицами ДНКазы I, свободной от РНКазы (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA), использовали олиго-dT праймеры (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) для синтеза одноцепочечной кДНК. мРНК количественно оценивали при использовании SYBR green Master Mix (Applera, Courtaboeuf, France) со специфическими для мыши олигонуклеотидами для ИЛ-1 : S: 5'-gATCCACACTCTCCAgCTgCA-3' (SEQ ID NO: 1) и AS: 5'-CAACCAACAAgTgATATTCTCCATg-S' (SEQ ID NO: 2) в GeneAmp Abiprism 7000 (Applera, Courtaboeuf, France). Калибровку проводили при каждом тестировании и включали контроли без матрицы. Каждый образец наносили в трех повторах. Интенсивность красителя SYBR green анализировали с использованием компьютерной программы Abiprism 7000 SDS (Applera, Courtaboeuf, France). Все результаты нормализовали на не подверженный влиянию ген домашнего хозяйства -актин (олигонуклеотиды для -актина: S: 5'-gggTCAgAAggATTCCTATg-3' SEQ ID NO: 3; AS: 5' ggTCTCAAACATgATCTggg-3' SEQ ID NO: 4).

Результаты

Как подробно описано в настоящем документе выше, мышей забивали на 5 день после индукции колита с помощью внутриректального введения TNBS на день 0 и прикрепляющиеся клетки вводили на 1 день. Мышам вводили либо 2D прикрепляющиеся клетки (в настоящем описании далее партия 1) или PLX-C прикрепляющиеся клетки (в настоящем описании далее партия 2), полученные из плаценты 1 или плаценты 2 соответственно. После забоя мышей проводили макроскопическую и микроскопическую оценки ободочной кишки.

Как представлено на фиг.11, мыши, получавшие в/в инъекцию 2D или PLX-C клеток (партия 1 или 2, соответственно), демонстрировали существенное улучшение воспалительного состояния ткани ободочной кишки, как представлено по показателю Уоллеса. Это противовоспалительное действие было настолько же эффективным, что и золотой стандарт лечения 5-ASA). Должно быть понятно, что и в/бр введение 2D прикрепляющихся клеток (партия 1) также приводило к удовлетворительному улучшению показателя Уоллеса на мышиной модели колита.

Микроскопическая оценка ободочной кишки показала, что введение клеток PLX-C (партия 2) либо в/бр, либо в/в путями существенно снижало воспаление ободочной кишки на гистологическом уровне по сравнению с мышами TNBS (как представлено по показателю Ameho, фиг.12). Улучшение у групп с этим лечением было значительно лучше по сравнению с группами TNBS, получавшими лечение 5-ASA.

Далее, суммарную РНК выделяли из тканей ободочной кишки и оценивали уровни экспрессии ИЛ-1 с помощью ОТ-ПЦР (как подробно описано в настоящем документе выше). Как очевидно из результатов (фиг.13), в/в введение клеток PLX-C (партия 2) существенно снижало уровень экспрессии ИЛ-1 в тканях ободочной кишки. Должно быть понятно, что, хотя уровни экспрессии РНК ИЛ-1 снижались несущественно при в/бр введении (2D или 3D прикрепляющихся клеток, партии 1 и 2, соответственно) и в/в введении (2D прикрепляющихся клеток, партия 1), введение как PLX-C, так и 2D клеток тем не менее приводило к существенному снижению воспаления на основе оценок на макроскопическом и микроскопическом уровне у мышей с колитом.

Взятые вместе эти результаты продемонстрировали, что введение прикрепляющихся клеток плаценты настоящего изобретения (2D и 3D PLX-C клеток) ведет к существенному улучшению воспалительного состояния ободочной кишки в мышиной модели острого колита.

ПРИМЕР 5

Противовоспалительное действие клеток PLX-C in vivo в крысиной модели острого колита

Материалы и экспериментальные методы

TNBS модель воспаления кишечника

У крыс вызывали колит путем введения внутрь ободочной кишки 22 мг TNBS, растворенной в 1:1 смеси EtOH и воды. Через 24 часа после индукции колита крысам вводили препараты в соответствии с исследуемым типом лечения.

Крысы, используемые в этом исследовании, были подразделены на три экспериментальные группы (как подробно описано ниже). Через одиннадцать дней после индукции колита всех крыс забивали и повреждение ободочной кишки оценивали как микроскопически, так и макроскопически.

День введения TNBS обозначали как день 0, клетки PLX-C вводили на день 1 и крыс забивали на 11 день.

Животные

В этих экспериментах использовали 12 самок крыс Lewis (100-120 г). Суммарно использовали 12 крыс, которые подразделяли на 4 следующих группы:

1) 4 крысам вводили в/бр 5×10⁶ клеток PLX-C-I

2) 4 крысам вводили в/в 5×10⁶ клеток PLX-C-I

3) 2 крысы получали в/бр PlasmaLyte (контрольная группа)

4) 2 крысы получали в/в PlasmaLyte (контрольная группа)

Получение прикрепляющихся клеток, происходящих из плаценты (клеток PLX-C)

Клетки получали, как подробно описано в примере 3 в настоящем описании выше.

Макроскопическая оценка повреждения ободочной кишки

Макроскопическую оценку повреждения ободочной кишки проводили в соответствии со следующими критериями:

0 - без повреждения

1 - гиперемия, но без язв

2 - фиброз, но без язв

3 - изъязвление/некроз менее 1 см

4 - изъязвление/некроз менее 2 см

5 - изъязвление/некроз более 2 см

Микроскопическая (гистологическая) оценка повреждения ободочной кишки

Микроскопическую оценку повреждения ободочной кишки проводили в соответствии со всеми следующими критериями (A+B+C+D):

A. Распространение изъязвления:

0 - без язвы

1-2 - небольшие язвы (менее 3 мм)

3-5 большие язвы (более 3 мм)

B. Субмукозная инфильтрация:

0 - нет

1 - слабая

2-3 - умеренная

4-5 - тяжелая

C. Абсцессы крипт:

0 - нет

1-2 - редкие

3-5 - диффузные

D. Толщина стенки (мкм):

0 - менее 470

1 - менее 600

2 - менее 700

3 - менее 800

4 - менее 900

5 - более 900

Результаты

Как очевидно из фиг.14, введение 3D прикрепляющихся клеток настоящего изобретения (клеток PLX-C) ведет к существенному улучшению микроскопических показателей (по гистологической оценке) острого колита у крыс.

Хотя изобретение описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, несомненно, что многообразные альтернативные варианты, модификации и вариации должны быть очевидны специалистам в данной области техники. Соответственно, подразумевается охват всех таких альтернативных вариантов, модификаций и вариаций, которые соответствуют духу и попадают в широкий объем прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в настоящий документ в полном объеме при описании, в той же степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент или патентная заявка были бы конкретно и индивидуально указаны как включаемые в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, цитирование или обозначение любой ссылки в этой заявке не должно толковаться как допущение того, что такая ссылка пригодна в качестве уровня предшествующей техники для настоящего изобретения. В той степени, в которой используются заголовки разделов, они не должны толковаться как обязательно ограничивающие.