адъювант для получения вакционных композиций, предназначенных для профилактики кокцидиозов

Формула изобретения

1. Адъювант вакцины, содержащий на 100% своей массы:

от 10 до 95% минерального масла, содержащего:

от 0,05 до 10% масс. углеводородных цепей, содержащих менее 16 атомов углерода;

от 0,05 до 5% масс. углеводородных цепей, содержащих более 28 атомов углерода;

и имеющего соотношение P/N, соответствующее соотношению массового количества углеводородных цепей парафинового типа к массовому количеству углеводородных цепей нафтенового типа, в интервале от 2,5 до 3;

для получения вакцинной композиции, предназначенной для профилактики кокцидиоза.

2. Адъювант по п.1 для получения вакцинной композиции, предназначенной для профилактики кокцидиоза у животных, предпочтительно у домашних птиц.

3. Адъювант по п.1, отличающийся тем, что соотношение P/N находится в интервале от 2,8 до 2,9.

4. Адъювант по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что он дополнительно содержит:

от 5 до 90% по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества.

5. Вакцина, предназначенная для профилактики кокцидиоза и содержащая адъювант, определенный по любому из пп. 1-4, а также по меньшей мере один антиген.

6. Вакцина по п.5, предназначенная для профилактики кокцидиоза у животных, предпочтительно у домашних птиц.

7. Вакцина по п.5 или 6, отличающаяся тем, что кокцидии выбраны из группы, состоящей из Eimeria, Isospora, Toxoplasma , Besnoitia, Neospora, и предпочтительно Eimera.

8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что она находится в виде эмульсии типа "вода в масле" (E/H).

9. Вакцина по п.5, отличающаяся тем, что антиген представляет собой рекомбинантный белок, содержащий последовательность 3-1 Eimera Acervulina.

10. Применение минерального масла для получения вакцины по любому из пп. 5-9, отличающееся тем, что указанное масло содержит на 100% своей массы:

от 0,05 до 10% углеводородных цепей, содержащих менее 16 атомов углерода;

от 0,05 до 5% углеводородных цепей, содержащих более 28 атомов углерода;

и имеет соотношение P/N, соответствующее соотношению массового количества углеводородных цепей парафинового типа к массовому количеству углеводородных цепей нафтенового типа, в интервале от 2,5 до 3.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новым адъювантам для получения вакцинных композиций, предназначенных для профилактики кокцидиозов у домашних птиц, вакцинным композициям, содержащим указанные адъюванты, а также к применению особого минерального масла для получения указанных адъювантов. Кокцидиозы представляют собой паразитарные заболевания, часто встречающиеся у домашних птиц.

Домашние птицы представляют собой домашних птиц, принадлежащих в общем случае к куриным или лапчатоногим и выращиваемых для получения мяса или яиц на приусадебном птичьем дворе или при промышленном разведении.

Под домашними птицами понимают цыплят, индеек, гусей, уток, цесарок, голубей, перепелов, фазанов, страусов.

Этиологический агент (или носитель заболевания) представляет собой простейший внутриклеточный паразит, называемый кокцидией и принадлежащий наиболее часто к роду Eimeria.

Существует несколько типов кокцидий для каждого вида птиц:

кокцидии цыплят: E. acervulina, E. necatrix, E. maxima, E. brunetti, E. tenella, E. mitis, E. praecox ;

кокцидии индеек: E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. dispersa, E. gallopavonis ;

кокцидии гусей: E. truncata (она может затрагивать также уток варварийской породы и лебедей), E. anseris;

кокцидии уток: Tyzzeria perniciosa , E. mulardi. Заболевание затрагивает, главным образом, гибридных уток;

кокцидии цесарок: E. numidia , E. grenieri (встречается наиболее часто, но со слабой патогенностью);

кокцидии голубей: E. labbeana.

Профилактика кокцидиоза основана на следующих решениях:

a) способ химиопрофилактики

Этот способ, в котором используют химические соединения типа антибиотиков, имеет следующие недостатки:

- риски развития аллергии у животных, подвергнутых лечению этими антибиотиками, в частности, по причине присутствия "примесей" или побочных продуктов, являющихся нежелательными в этих антибиотиках;

- риски развития резистентности к антибиотикам у особей, подвергнутых лечению;

- соблюдение жесткой регламентации;

- опорочивание репутации реализуемого на рынке мяса домашних птиц с риском лишения пользования марками качества, отвечающими выращиванию в "натуральных" условиях.

b) способ вакцинации с использованием "живых" вакцин

Вакцины, происходящие от живых аттенуированных вирусов, получают мультипликацией инфицирующих агентов в лаборатории до утраты ими естественным или искусственным путем или посредством мутации своего патогенного характера.

Полученные при этом штаммы неспособны в полной мере вызывать заболевание, которое они вызывали раньше.

Однако эти штаммы сохраняют свои антигены и свою способность индуцировать иммунные ответы.

Этот способ вакцинации позволяет после введения животным колонизировать пищеварительный тракт и избежать внедрения штаммов, обладающих факторами вирулентности.

Этот способ вакцинации имеет следующие недостатки:

- возможные рецидивы вирулентности;

- необходимость получать в больших количествах культуры потенциально патогенных бактерий;

- животные, вакцинированные по этому способу, могут экскретировать патогены, создавая, таким образом, потенциально патогенный источник в окружающей среде и, следовательно, возможности для диссеминации этих патогенов.

Таким образом, последний недостаток является причиной, по которой в случае разведения домашних птиц на открытом воздухе способ не может быть предпочтительным для вакцинации против кокцидиоза, представляющего собой паразитарное заболевание и, следовательно, легко передаваемого диссеминацией.

Противококцидиозные вакцины представляют собой ветеринарные лекарственные средства. Вследствие этого на них распространяется законодательство, относящееся к ветеринарным лекарственным средствам и, в свою очередь, связанное с законодательством о медицинских лекарственных средствах.

Во Франции разрешены три противококцидиозные вакцины: они представляют собой живые вакцины, полученные из "ранних" штаммов, являющихся ослабленными, но иммуногенными и защищающими в отношении видов, имеющихся в данном случае.

Эти три вакцины приемлемы только в отношении кур (Gallus gallus ), поскольку они содержат только виды, способные паразитировать на этом виде птиц, при этом не существует перекрестного иммунитета в отношении разных видов кокцидий.

c) стандартные способы вакцинации с неактивным или "инактивированным" антигеном

Эффективность существующих вакцин является неудовлетворительной, поскольку уровень клеточной компоненты иммунного ответа недостаточно высок для индуцирования эффективной защиты в особом случае паразитарных заболеваний, таких как, в частности, кокцидиоз.

Многие кДНК, кодирующие антигены Eimeria, описаны, и с некоторыми из них проводятся эксперименты по иммунизации. Развитие резистентности зависит также от генетического фона и способа введения (и адъюванта). Некоторые антигены проявили частичную защиту. Исследование относится к антигенам, являющимся общими для нескольких видов кокцидий: например, антиген GX3262, взаимодействующий с моноклональным антителом, распознающим антиген спорозоита, являющегося общим для семи видов кокцидий цыплят, индуцирует частичную защиту.

Таким образом, имеется потребность в улучшении этих инактивированных вакцинных композиций.

Разработка вакцин, являющихся инактивированными или содержащих очищенные антигены, является все более важной, поскольку позволяет максимально избегать нежелательных вторичных явлений у вакцинированных субъектов во время и после вакцинации. Однако улучшение качества антигенов происходит за счет ухудшения их иммуногенности. Именно по этой причине их сочетают с адъювантами, позволяющими усиливать иммунный ответ у вакцинированных субъектов.

Эти адъюванты имеют разную природу. Они могут, например, представлять собой липосомы, то есть эмульсии, содержащие по меньшей мере одну масляную фазу и по меньшей мере одну водную фазу, типа так называемых адъювантов Фрейнда, или, более часто, неорганические соли, нерастворимые в воде. Среди неорганических солей, используемых в качестве адъювантов вакцинных композиций, можно привести, например, гидроксид алюминия, нитрат церия, сульфат цинка, коллоидный гидроксид железа или хлорид кальция. Гидроксид алюминия представляет собой наиболее часто используемый адъювант. Эти неорганические соли, используемые в качестве адъювантов вакцинных композиций, описаны, в частности, в статье Rajesh K. Gupta и соавт. "Adjuvants, balance between toxicity and adjuvanticity", Vaccine, vol. 11, Issue 3, 1993, pages 993-306.

Недостатком приведенных выше адъювантов является низкая эффективность. Кроме того, известно, что гидроксид алюминия эффективно индуцирует только гуморальный, но не клеточный иммунитет. В то же время, они могут проявлять некоторую токсичность в отношении субъектов, подвергаемых обработке. В более частном случае, когда эти вакцинные композиции вводят субъектам, подлежащим вакцинации, можно наблюдать повреждения и другие местные реакции, такие как грануломы в точке инъекции.

Другие адъюванты, состоящие из солей двухвалентных или трехвалентных металлов или из симпатомиметических соединений, описаны соответственно в международных заявках, опубликованных под номерами WO 96/32964, WO 98/17311 и WO 98/15288.

Эмульсии представляют собой стабильные смеси, образованные системой двух несмешивающихся жидкостей, одна из которых распределена в другой в виде капель. Таким образом, эмульсии содержат масла, водную фазу и поверхностно-активные вещества, функцией которых является диспергирование одной из двух фаз в другой и получение макроскопически однородной и стабильной смеси. Эмульсии часто используют в качестве адъювантов иммунитета в вакцинных композициях.

Применение минеральных масел в качестве адъюванта вакцины известно в течение многих лет (Фрейнд, 1956, Герберт, 1967). Минеральные масла, используемые в качестве адъювантов вакцин, представляют собой жидкие углеводороды, получаемые перегонкой нефти и осуществлением последующих стадий обработки, таких как, например, обессеривание, деасфальтирование, экстракция ароматических соединений, экстракция восков, и других стадий конечной обработки. Исследования влияния качества масел на иммунный ответ осуществлялись постепенно и неполно. На практике, на состав минеральных масел сильно влияет географическое место происхождения используемой сырой нефти, а также способ (химизм и оборудование), используемый для их получения. Исследования, осуществленные с различными фракциями, были предназначены для оценки токсического действия в отношении производственного персонала, а не при использовании в отношении здоровья животных или человека. Исследования по оптимизации состава этих минеральных масел, основанные на макроскопических характеристиках (вязкость, температура плавления), были осуществлены с существующими промышленными минеральными маслами или с химически чистыми продуктами для лабораторного использования, не соответствующими ни определениям, ни характеристикам приемлемых исходных материалов. Таким образом, исследования, в том числе глубокие, осуществленные с промышленными минеральными маслами, определенными по параметрам, не отражающим их биологические свойства, имели и имеют следствием вариации характеристик при применении для вакцин в зависимости от происхождения партии минерального масла. Эти партии, хотя и соответствующие техническим условиям и аналитическим макроскопическим спецификациям и имеющие одно и то же коммерческое название, имеют составы, достаточно различающиеся, чтобы не обеспечивать одни и те же свойства вакцины. В то же время, вязкость эмульсий, полученных исходя из минеральных масел без оптимизации лекарственной формы, вызывала систематическую ошибку в интерпретации результатов.

Влияние распределения между линейными и циклическими цепями оценивали для исследования возможной токсичности при использовании минеральных масел в инъецируемой форме в предположении тератогенной роли циклических форм. Затем показатели токсичности идентифицировали как показатели, обусловленные ненасыщенными формами, полностью удаляемыми современными способами глубокого гидрирования.

Ранее не были осуществлены какие-либо исследования с целью оценки влияния соотношения компонентов линейного или циклического типа на качество иммунного ответа. Минеральные масла использовали в течение нескольких десятилетий в качестве адъювантов и для получения адъювантов, предназначенных для усиления эффективности иммунного ответа вакцин. На практике, антигены, предварительно эмульгированные в эмульсиях типа "вода в минеральном масле" (E/H) и введенные затем парентерально, вызывают существенно более интенсивные и продолжительные иммунные ответы (и, как следствие, защиту от патогенов).

Природа минерального масла, использованного для получения адъюванта, существенно влияет на интенсивность иммунологического ответа и на побочные реакции, связанные с инъекцией вакцины (местные и общие реакции).

Имеется два типа иммунных ответов:

- гуморальный иммунный ответ: реакция, возникающая в случае, когда лимфоциты B, обладающие специфическими рецепторами и стимулированные антигеном, дифференцируются в клоне плазмоцитов, которые начинают секретировать антитела. Эти антитела являются эффективными против патогенных агентов, циркулирующих в крови и лимфе. Кроме того, селективная активация лимфоцитов B придает организму клетки памяти с удлиненным временем полужизни, которые вмешиваются во вторичный иммунный ответ;

- клеточный иммунный ответ.

Гуморальная иммунная реакция помогает сети защиты распознавать и уничтожать свободные патогенные агенты, но именно реакция с клеточным опосредованием борется с патогенными агентами, уже внедрившимися в клетки. Главными активными факторами иммунитета с клеточным опосредованием являются лимфоциты T.

Лимфоциты T реагируют только с антигенными детерминантами, находящимися на поверхности клеток организма. Лимфоциты T распознают эти детерминанты благодаря своим рецепторам, то есть поверхностным белкам, внедренным в их плазматическую мембрану. Рецептор лимфоцита T распознает антиген, соединенный с одним из гликопротеинов CMH организма. Помимо своей роли в гуморальном ответе вспомогательные лимфоциты T могут также активировать другие типы лимфоцитов T для запуска реакций с клеточным опосредованием против антигенов. Цитотоксические лимфоциты T являются единственными клетками, способными убивать другие клетки (клетки, инфицированные внутриклеточными патогенными агентами).

Маслосодержащие адъюванты хорошо известны для усиления гуморальной компоненты иммунологического ответа (определяемого, в общем случае, по количественному определению иммуноглобулинов группы 1 или IGG1), тогда как получение ответов клеточных типов (косвенно определяемых по IGG2) очень затруднено.

Известно, что эмульсии E/H, дающие более сильные иммунные ответы, индуцируют также компоненту клеточного типа, но в меньшей степени, например, чем некоторые растворимые соединения (типа сапонинов или катионогенных поверхностно-активных веществ), считающиеся ответственными за ориентирование ответа на клеточные механизмы.

Эмульсии с водной сплошной фазой, в которых традиционно используют минеральные масла, имеющиеся в продаже, являются очень плохими активаторами клеточного ответа.

На практике, на тип ответа, порождаемого вакцинами, влияет структура антигена, а также способ, которым он вводится в иммунную систему посредством адъювантов. Адъюванты оказывают разное действие на иммунный ответ, поскольку они могут индуцировать иммунный ответ с большей или меньшей продолжительностью, с преобладающим характером клеточного или гуморального типа.

Иммунитет с клеточным опосредованием является важным и, возможно, даже существенным для защиты от внутриклеточных бактерий, вирусов и большей части паразитов. Он выступает в большей части механизмов вакцинной защиты в дополнение к гуморальному ответу.

Можно, например, классифицировать способность адъюванта индуцировать иммунологический ответ клеточного типа для вакцинной композиции, содержащей его, сравнивая соотношение IGG1/IGG2, определенное после парентерального введения вакцинной композиции, содержащей его, соответствующим субъектам с разными периодами в зависимости от дня вакцинации указанных субъектов. Чем больше будет это соотношение, тем больше адъювант будет ориентировать иммунный ответ вакцинной композиции в сторону гуморальной компоненты. Значение соотношения IGG1/IGG2, близкое к единице, можно рассматривать в качестве признака иммунного ответа вакцинной композиции, уравновешенного между двумя его компонентами. Значение соотношения IGG1/IGG2, меньшее единицы, будет характерным для иммунного ответа вакцинной композиции с преобладанием клеточной компоненты.

Задачей настоящего изобретения является разработка адъюванта для получения вакцинных композиций, предназначенного для улучшения клеточной компоненты иммунного ответа и сохраняющего при этом хороший уровень гуморальной компоненты. Таким образом, имеется потребность в получении адъювантов вакцин, имеющих уравновешенный иммунный ответ и возможно с преобладанием клеточной компоненты. Кроме того, вакцины, полученные с адъювантом, являющимся объектом настоящего изобретения, должны быть в достаточной степени безвредными.

С этой целью, настоящее изобретение относится к адъюванту вакцины, содержащему на 100% своей массы:

от 10 до 95% и предпочтительно от 20 до 90% минерального масла, содержащего:

от 0,05 до 10% масс. углеводородных цепей, содержащих менее 16 атомов углерода;

от 0,05 до 5% масс. углеводородных цепей, содержащих более 28 атомов углерода;

и имеющего соотношение P/N, соответствующее соотношению массового количества углеводородных цепей парафинового типа к массовому количеству углеводородных цепей нафтенового типа, в интервале от 2,5 до 3;

для получения вакцинной композиции, предназначенной для профилактики кокцидиоза.

В то же время, к вариантам осуществления настоящего изобретения может относиться одна или несколько из следующих характеристик:

адъювант, определенный выше, для получения вакцинной композиции, предназначенной для профилактики кокцидиоза у животных, в частности у домашних птиц;

адъювант, определенный выше и отличающийся тем, что соотношение P/N находится в интервале от 2,5 до 3 и предпочтительно в интервале от 2,8 до 2,9;

адъювант, определенный выше и отличающийся тем, что он дополнительно содержит:

от 5 до 90% по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества и предпочтительно от 5 до 50%.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретения относится к вакцине, предназначенной для профилактики кокцидиоза и содержащей адъювант, определенный выше, а также по меньшей мере один антиген.

В то же время, к вариантам осуществления настоящего изобретения может относиться одна или несколько из следующих характеристик:

вакцина, определенная выше и предназначенная для профилактики кокцидиоза у животных, предпочтительно у домашних птиц;

вакцина, определенная выше и отличающаяся тем, что кокцидии выбраны из группы, состоящей из Eimeria , Isospora, Toxoplasma, Besnoitia, Neospora и предпочтительно Eimera;

вакцина, определенная выше и отличающаяся тем, что она находится в виде эмульсии типа "вода в масле" (E/H);

вакцина, определенная выше и отличающаяся тем, что антиген представляет собой рекомбинантный белок, содержащий последовательность 3-1 Eimera Acervulina .

Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к применению минерального масла для получения определенной выше вакцины, отличающемуся тем, что указанное масло содержит на 100% своей массы:

от 0,05 до 10% углеводородных цепей, содержащих менее 16 атомов углерода;

от 0,05 до 5% углеводородных цепей, содержащих более 28 атомов углерода;

и имеет соотношение P/N, соответствующее соотношению массового количества углеводородных цепей парафинового типа к массовому количеству углеводородных цепей нафтенового типа, в интервале от 2,5 до 3 и предпочтительно в интервале от 2,8 до 2,9.

Композиция по настоящему изобретению может также предпочтительно содержать одно или несколько эмульгирующих поверхностно-активных веществ. Последнее вещество имеет липофильный или гидрофильный характер, определяемый значением HLB (гидрофильно-липофильный баланс) в интервале от 1 до 19.

Такое поверхностно-активное вещество может включать:

алкилполигликозид или смесь алкилполигликозидов формулы R_a-(O)-Zn, где R _a представляет собой линейный или разветвленный насыщенный алифатический радикал, содержащий от 4 до 24 атомов углерода, Z представляет собой остаток сахара, предпочтительно глюкозы, и n находится в интервале от 1 до 5 и предпочтительно в интервале от 1,1 до 2;

сапонины;

сложные эфиры сорбитана, такие как, например, сорбитанолеат, сорбитанстеарат, сорбитанпальмитат, сорбитанлаурат;

сложные эфиры маннитана, такие как, например, маннитанолеат, маннитанстеарат, маннитанпальмитат, маннитанлаурат;

сложные эфиры сорбитана, полиоксиэтилированные от 5 до 20 моль этиленоксида, такие как, например, сорбитанолеат, этоксилированный 20 моль этиленоксида;

сложные эфиры маннитана, полиоксиэтилированные от 5 до 20 моль этиленоксида, такие как, например, маннитанолеат, этоксилированный 20 моль этиленоксида;

лецитины;

полиоксиэтилированные алканолы, такие как, например, соединения, реализуемые компанией UNIQEMA под названием BRIJ и более предпочтительно BRIJ 21 и BRIJ 221;

полимерные поверхностно-активные вещества, содержащие полиоксиэтиленовые и полиоксипропиленовые блоки, такие как соединения, реализуемые компанией BASF под названием PLURONICS;

полигидроксистеараты полигликоля или полиглицерина, такие как, например, продукты, реализуемые компанией UNIQEMA под названием HYPERMER B246, ARLACEL P 135.

Под антигеном понимают любую молекулу, которая обладает иммуногенными свойствами и может индуцировать специфический иммунный ответ. Эти антигены могут представлять собой инактивированные патогены, такие как, например, инактивированные бактерии, молекулы, выделенные из патогенов, молекулы, полученные генетической рекомбинацией микроорганизмов.

Минеральные масла получают дистилляцией и последующим глубоким гидрированием продуктов нефтяного производства. Они состоят из химических соединений группы насыщенных алканов. Для такого типа соединений число атомов углерода (n) в общем случае составляет более 9 и менее 30, что при 25°C придает им вид жидкостей. В данном случае говорят о жидких парафинах. Твердые парафины состоят из химических соединений группы алканов, в которых n составляет более 30 и может достигать 50, что при 25°C придают им вид твердых веществ. Жидкие парафины или минеральные масла представляют собой прозрачные жидкости без запаха, динамическая вязкость которых может варьировать от 2 миллипаскаль·секунда (мПа·с) до 1 паскаль·секунда. Динамическая вязкость минеральных масел непосредственно связана со средней длиной углеродных цепей алканов, составляющих указанные минеральные масла. Алканы с более длинными углеводородными цепями ответственны за более высокие значения динамической вязкости. Соответствующие соединения могут находиться в виде линейных или линейно-разветвленных углеводородных цепей (объединенных под названием "парафины", P) или циклических соединений (нафтеновые соединения, N), но во всех случаях в виде насыщенных соединений (без двойных связей, удаленных во время обработки гидрированием). Вязкость, температура плавления и температура кипения непосредственно связаны с числом атомов углерода, содержащихся в углеводородной цепи. Таким образом, белое минеральное масло может отличаться интервалом кипения, динамической вязкостью, средним числом атомов углерода, а также соотношением P/N линейных и разветвленных молекул и количества молекул циклических соединений (определенным по методике DIN 51378). Следует отметить, что показатель динамической вязкости может быть искусственно изменен смешиванием двух разных фракций.

ПРИМЕРЫ

I) ПЕРВАЯ ЧАСТЬ

Приведенные далее примеры позволяют выявить адъювантные свойства композиций по настоящему изобретению.

В этой работе исследование адъювантных свойств различных подробно проанализированных масел позволило выявить новые оригинальные композиции, охарактеризованные предельными показателями, установленными способом хроматографии.

Исследование, осуществленное с экспериментальными вакцинными композициями на первой стадии с составами, находящимися в виде эмульсий "вода в масле" (E/H), позволило установить оптимальные условия получения иммунных ответов, уравновешенных между двумя его компонентами, и иммунного ответа с преобладающей клеточной компонентой для составов, хорошо переносимых мышами. Продолжение экспериментальных исследований, осуществленных с другими типами составов и различными животными, позволило выявить, что адъювантные композиции, являющиеся объектом настоящего изобретения, обеспечивают лучшие иммунологические ответы как качественно, так и количественно.

В приведенных далее примерах выбранные минеральные масла характеризуются:

легкой фракцией (FC), выраженной в процентах и соответствующей содержанию компонентов, имеющих число атомов углерода C<16;

тяжелой фракцией (FC), выраженной в процентах и соответствующей содержанию компонентов, имеющих число атомов углерода C>28;

молекулярным распределением (RM) (выраженным числом атомов углерода C), рассчитанным как центр тяжести кривой в интервале от C16 до C28, характеризуемым выраженным через единицы площади коэффициентом фракций C16-C20, отнесенным к 18 атомам углерода, от 20 до 24 атомов углерода, отнесенным к 22 атомам углерода, и от 24 до 28 атомов углерода, отнесенным к 26 атомам C;

соотношением P/N (полученным по стандартной методике DIN 51378).

Характеристики различных испытуемых масел приведены в таблице 1.

Таблица 1 Группа масел, синтезированных и проанализированных для биологических испытаний
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N
1	13,7	20,6	3,3	1,78
2	4,9	21,5	7,1	1,86
3	4,2	20,5	1,5	1,86
4	4,4	21,6	4,7	1,86
5	47,7	18,4	0,5	1,86
6	0,3	22,2	9,6	2,03
7	30	18,3	0,6	2,19
8	16	21,8	10	2,13
9	2	19,3	2,2	2,85
10	48,2	18,4	0,6	1,86
11	8,6	20,7	2,4	1,94
12	20,8	21,9	8,7	1,86

ИССЛЕДОВАНИЕ С ЭМУЛЬСИЯМИ "ВОДА В МАСЛЕ" E/H

Композицию реализуют на модели типа неполного адъюванта Фрейнда (IFA), используемого с содержанием 50% в вакцинной эмульсии, которая благодаря простоте своего состава (15% маннидмоноолеата+85% минерального масла) обеспечивает надлежащее сравнение.

Биологические свойства вакцин, составленных таким образом (50% IFA+50% изотонического раствора яичного альбумина, 10 г/доза; 1 доза=100 мкл эмульсии), сравнивали на мышиной модели в плане показателей безвредности (таблица 2) и эффективности в отношении гуморального или клеточного ответа.

Безвредность оценивают, наблюдая за местом инъекции в течение 7 дней после вакцинации и квалифицируя местные реакции (RL) по шкале от 0 до 4. Значения от 0 до 2 являются приемлемыми (речь идет максимум о маслянистом налете без алопеции, отсутствии пальпируемого уплотнения и видимого места инъекции); значения более 2 рассматриваются как нежелательные и неприемлемые (речь идет о некрозах, алопеции, пальпируемых уплотнениях). Результаты сведены в таблицу 2; минеральные масла, испытанные при получении композиции E/H, были классифицированы в зависимости от их FC. Из таблицы очень хорошо видно, что композиции E/H, содержащие минеральные масла, имеющие FC<13,7, являются приемлемыми для получения вакцинных композиций, используемых в инъецируемой форме.

Таблица 2 Оценка безвредности различных масел
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	RL
1	13,7	20,6	3,3	1,78	2,5
2	4,9	21,5	7,1	1,86	0,5
3	4,2	20,5	1,5	1,86	0
4	44	21,6	4,7	1,86	0,5
5	47,7	18,4	0,5	1,86	4
6	0,3	22,2	9,6	2,03	0
7	30	18,3	0,6	2,19	3

8	16	21,8	10	2,13	2,5
9	2	19,3	2,2	2,85	0
10	48,2	18,4	0,6	1,86	4
11	8,6	20,7	2,4	1,94	0,5
12	20,8	21,9	8,7	1,86	3

Затем полученные составы испытывали в отношении их иммунологической эффективности на мышиной модели. Составы, дающие неприемлемые реакции, отбрасывали. В таблицах 3 и 4 показаны полученные титры антител в сравнении по отношению к гидроксиду алюминия (твердый неорганический адъювант, используемый в ветеринарии и медицине). Титры приведены для 14/28/42/56/90-го дня после дня осуществления первой инъекции в отношении гуморального (IGG1) и клеточного (IGG2) ответов. Вторую инъекцию составов осуществляли через 28 дней после определения титров антител. Результаты в отношении долгосрочного ответа (90 дней) указывают на сильную корреляцию между пониженными значениями для тяжелой фракции и интенсивностью гуморального ответа в 90-й день. Ответ значительно меньше в случае, когда содержание этой фракции превышает 4,7% (7,1 и 9,6%).

Эти результаты доказывают, что минеральное масло для адъюванта вакцины в виде эмульсии E/H, содержащее менее 10% фракции FC, менее 5% фракции FL и имеющее соотношение P/N, превышающее или равное 1,9, индуцирует хороший ответ клеточного типа.

Таблица 3 Ответ антитела типа IgG1 против OVA на мышиной модели для различных масел после инъекции в виде эмульсии E/H в зависимости от времени
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J14	J28	J42	J56	J90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	9600	16000	128000	128000	128000
3	4,2	20,5	1,5	1,86	9600	16000	128000	256000	256000
4	4,4	21,6	4,7	1,86	9600	16000	128000	256000	256000
6	0,3	22,2	9,6	2,03	9600	16000	64000	64000	64000
9	2	19,3	2,2	2,85	9600	16000	128000	256000	256000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	9600	16000	128000	256000	256000
AlOH					16000	4800	4800	2400	2400

Таблица 4 Ответ антитела типа IgG2 против OVA на мышиной моделидля различных масел после инъекции в виде эмульсии E/H
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J14	J28	J42	J56	J90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	9600	16000	48000	48000	48000
3	4,2	20,5	1,5	1,86	9600	16000	48000	48000	48000
4	4,4	21,6	4,7	1,86	9600	16000	48000	48000	48000
6	0,3	22,2	9,6	2,03	9600	16000	128000	256000	256000
9	2	19,3	2,2	2,85	9600	16000	128000	256000	256000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	9600	16000	128000	256000	256000
AlOH					16000	4800	4800	2400	2400

ИССЛЕДОВАНИЕ C ЭМУЛЬСИЯМИ С ВОДНОЙ СПЛОШНОЙ ФАЗОЙ

Были испытаны два типа лекарственных форм, представляющих собой эмульсии с водной сплошной фазой (множественная эмульсия E/H/E и микроэмульсия H/E).

Микроэмульсия "масло в воде"

Адъювантный состав содержит на 100% своей массы 40% масс. гидрофильного поверхностно-активного вещества (полисорбат 80) и 60% масс. испытуемого минерального масла; масляную фазу, составленную таким образом, эмульгируют при комнатной температуре гомогенизатором высокого давления в присутствии водной фазы, содержащей антиген (OVA); масляную фазу, полученную выше, используют в количестве 10% масс. в конечной вакцинной композиции (OVA, 10 мкг/доза, 100 мкл на инъекцию); в испытании осуществляют контрольный опыт с гидроксидом алюминия. Результаты представлены в таблице 5. Низкая интенсивность ответа IGG1 прямо коррелирует с присутствием фракции FL, которая ингибирует краткосрочный (28 дней, J28) и долгосрочный (90 дней, J90) ответы.

Аналогичным образом в таблице 6 приведены титры для IGG2.

Результаты указывают на корреляцию между соотношением P/N и ответом IGG2; составы 6 и 9 отличаются от других составов.

Таблица 5 Ответ антитела типа IgG1 против OVA на мышиной модели для различных масел в виде микроэмульсии H/E в зависимости от времени
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J14	J28	J42	J56	J90
2	4,9	21,5	7,1	1,9	12800	16000	96000	48000	48000
3	4,2	20,5	1,5	1,9	9600	48000	128000	256000	256000
4	4,4	21,6	4,7	1,9	12800	48000	128000	128000	128000
6	0,3	22,2	9,6	2,0	4800	16000	48000	48000	32000
9	2,0	19,3	2,2	2,8	6400	48000	32000	128000	128000
11	8,6	20,7	2,4	1,9	9600	48000	128000	256000	256000
AlOH					16000	4800	4800	2400	2400

Таблица 6 Ответ антитела типа IgG2 против OVA на мышиной модели для различных масел в виде микроэмульсии H/E в зависимости от времени
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J14	J28	J42	J56	J90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	400	12000	24000	4000	400
3	4,2	20,5	1,5	1,86	600	16000	24000	1000	1000
4	4,4	21,6	4,7	1,86	150	8000	8000	1000	1000
6	0,3	22,2	9,6	2,03	4800	16000	32000	8000	4000
9	2	19,3	2,2	2,85	1600	32000	48000	96000	96000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	600	16000	24000	1000	4000
AlOH					150	150	150	300	300

Сравнение соотношений IgG1/IgG2 ясно указывает на разницу в характеристике ответа групп, вакцинированных с маслом 9 и с меньшим значением с маслом 6, по сравнению с другими маслами (таблица 7).

Таблица 7 Соотношение IgG1/IgG2 против OVA на мышиной модели для различных масел в виде микроэмульсии H/E в зависимости от времени
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J14	J28	J42	J56	J90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	32	1	4	12	120
3	4,2	20,5	1,5	1,86	16	3	5	256	256
4	4,4	21,6	4,7	1,86	85	6	16	128	128
6	0,3	22,2	9,6	2,03	1	1	2	6	8
9	2	19,3	2,2	2,85	4	2	1	1	1
11	8,6	20,7	2,4	1,94	16	3	5	256	64
AlOH					107	32	32	8	8

Множественная эмульсия "вода в масле-вода" (E/H/E):

Адъювантный состав в данном случае представляет эфир ангидроманнитоктадеценоата с гидрофильно-липофильным балансом (HLB)=9, диспергированный в количестве 15% масс. в испытуемом минеральном масле. Вакцинную композицию готовят, смешивая при 30°C одну массовую часть адъюванта с одной массовой частью антигенной среды (водная фаза), содержащей антиген OVA.

Испытание на мышах. Результаты испытания на мышах в отношении ответов IGG1 и ответов IGG2 представлены в таблицах 8 и 9, соответственно. Касательно клеточного ответа изменение значений ответов IGG2 указывает на то, что масло 9 индуцирует интенсивный и длительный ответ, в частности, после 28 дней.

Испытание на модели с коровами. В данном случае испытывали те же самые вакцины на 5 коровах, которым подкожно вводили по 2 мл; при этом сравнивали составы 9 и 11. Результаты представлены в таблице 10. Какой-либо разницы в отношении титров IGG1 установлено не было (данные не представлены). Сильный адъювантный эффект наблюдали по отношению к антигену, используемому индивидуально. Ответ IGG2 был очень интенсивным с маслом 9, низким с маслом 11 и отсутствовал в случае антигена, используемого индивидуально.

Таблица 8 Ответ антитела типа IgG1 против OVA на мышиной модели для различных масел в виде эмульсии E/H/E в зависимости от времени
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J14	J28	J42	J56	J90
2,0	4,9	21,5	7,1	1,9	16000	32000	64000	64000	64000
3,0	4,2	20,5	1,5	1,9	16000	64000	128000	128000	128000
4,0	4,4	21,6	4,7	1,9	16000	64000	128000	128000	128000

6,0	0,3	22,2	9,6	2,0	16000	64000	64000	64000	64000
9,0	2,0	19,3	2,2	2,8	16000	64000	128000	128000	128000
11,0	8,6	20,7	2,4	1,9	16000	64000	128000	128000	128000
AlOH					16000	4800	4800	2400	2400

Таблица 9 Ответ антитела типа IgG2 против OVA на мышиной модели для различных масел в виде эмульсии E/H/E в зависимости от времени
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J14	J28	J42	J56	J90
2	4,9	21,5	7,1	1,86	400	12000	24000	4000	400
3	4,2	20,5	1,5	1,86	400	12000	24000	4000	400
4	4,4	21,6	4,7	1,86	400	12000	24000	4000	400
6	0,3	22,2	9,6	2,03	400	4000	12000	4000	400
9	2	19,3	2,2	2,85	9600	16000	128000	256000	256000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	300	600	1200	1200	1200
AlOH					150	150	150	300	300

Таблица 10 Ответ антитела типа IgG2A против OVA на модели с коровами для масел 9 и 11 в виде эмульсии E/H/E в зависимости от времени
Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	J0	J28	J60	J140
9	2	19,3	2,2	2,85	-	600	6000	10000
11	8,6	20,7	2,4	1,94	-	10	600	2000

Под улучшением клеточной компоненты иммунного ответа понимают:

A) получение иммунного ответа, характеризующегося соотношением IgG1/IgG2 в интервале от 0,25 до 4;

B) получение иммунного ответа, клеточная компонента которого также является интенсивной, а именно характеризуется титром IgG2, превышающим или равным 32000, после повторной вакцинации, осуществляемой после 28 дней, и после определения титра IGG2 на эту дату (вторичный и долгосрочный ответ).

А. Соотношение IgG1/IgG2

a) В случае вакцинных адъювантов, находящихся в виде эмульсии E/H/E, получены следующие экспериментальные результаты IgG1/IgG2 :

для масла 6: 40 (J14), 16 (J28), 5,3 (J42), 16 (J56) и 160 (J90);

для масла 11: 53,3 (J14), 107 (J28), 107 (J42), 107 (J56) и 107 (J90);

для масла 9: 1,7 (J14), 4 (J28), 1 (J42), 0,5 (J56) и 0,5 (J90).

Масло 9 позволяет получить соотношение IgG1/IgG2 в интервале от 0,25 до 4 до и после повторной вакцинации в день J28 (для сведения, вакцинацию, осуществляемую в день J28, производят после определения иммунного ответа).

b) В случае вакцинных адъювантов, находящихся в виде микроэмульсии H/E, в описании настоящего изобретения представлены следующие экспериментальные результаты IgG1/IgG2:

для масла 6: 1 (J14), 1 (J28), 2 (J42), 6 (J56) и 8 (J90);

для масла 11: 16 (J14), 3 (J28), 5 (J42), 256 (J56) и 64 (J90);

для масла 9: 4 (J14), 2 (J28), 1 (J42), 1 (J56) и 1 (J90).

Для масла 9 соотношение IgG1/IgG2, находящееся в интервале от 0,25 до 4, во всех случаях определяли до повторной вакцинации в день J28, и оно оставалось постоянным во времени.

Для масла 6 соотношение IgG1/IgG2, находящееся в интервале от 0,25 до 4, также определяли до повторной вакцинации (первичный ответ), но оно не сохранялось во времени при определении вторичного ответа (после повторной вакцинации в день J28) и долгосрочного ответа (J90).

Для масла 11 соотношение IgG1/IgG2, находящееся в интервале от 0,25 до 4, не наблюдали ни в случае вторичного ответа, ни в случае долгосрочного ответа.

c) В случае вакцинных адъювантов, находящихся в виде эмульсии E/H, в описании настоящего изобретения представлены следующие экспериментальные результаты IgG1/IgG2:

для масла 9: 1 (J14), 1 (J28), 1 (J42), 1 (J56) и 1 (J90).

Все зарегистрированные результаты показывают хорошие значения соотношения IgG1/IgG2.

B. Интенсивность ответов IgG2

a) В случае вакцинных адъювантов, находящихся в виде эмульсии E/H/E, получены следующие экспериментальные результаты IgG2 (таблица 9):

a. для масла 6: (J14), 4000 (J28), 12000 (J42), 4000 (J56) и 400 (J90);

b. для масла 11: 300 (J14), 600 (J28), 1200 (J42), 1200 (J56) и 1200 (J90);

c. для масла 9: 9600 (J14), 16000 (J28), 128000 (J42), 256000 (J56) и 256000 (J90).

Масло 9 обеспечивает получение интенсивного клеточного ответа (согласно определенным выше показателям) после повторной вакцинации, осуществляемой после 28 дней.

b) В случае вакцинных адъювантов, находящихся в виде микроэмульсии H/E, в описании настоящего изобретения представлены следующие экспериментальные результаты IgG2 (таблица 6):

a. для масла 6: 4800 (J14), 16000 (J28), 32000 (J42), 8000 (J56) и 4000 (J90);

b. для масла 11: 600 (J14), 16000 (J28), 24000 (J42), 1000 (J56) и 40000 (J90);

c. для масла 9: 1600 (J14), 32000 (J28), 48000 (J42), 96000 (J56) и 96000 (J90).

Масло 9 обеспечивает получение интенсивного клеточного ответа (согласно определенным выше показателям) в случае вторичного ответа (после повторной вакцинации) и в случае долгосрочного ответа (J90).

c) В случае вакцинных адъювантов, находящихся в виде эмульсии E/H, в описании настоящего изобретения представлены следующие экспериментальные результаты IgG2 (таблица 4):

a. для масла 9: 9600 (J14), 16000 (J28), 128000 (J42), 256000 (J56) и 256000 (J90).

Все зарегистрированные результаты показывают хорошие значения ответа IgG2.

Эти результаты хорошо показывают, что композиция минерального масла, предназначенного для использования в качестве адъюванта инъецируемой вакцины, являющегося объектом настоящего изобретения, например, масла 9, имеющего следующие характеристики:

FC<10%, FL<5%;

P/N находится в интервале от 2,5 до 3 (в данном случае составляет приблизительно 2,85);

гарантирует хорошую безвредность, хорошую эффективность в отношении гуморального ответа и сильный клеточный ответ в случаях эмульсий E/H и E/H/E и микроэмульсии H/E.

II) ВТОРАЯ ЧАСТЬ

Серия испытаний 1. Экспериментальная работа с моделью "цыпленок"

В рамках осуществленных экспериментальных исследований эффективность ответа для каждого состава основан на следующих показателях:

a) титр антитела в сыворотке;

b) инфильтрация белых кровяных клеток к месту инъекции;

c) испытание на вирулентность, состоящее во введении животным 10000 ооцист штамма Emeria Acervulina через две недели после обработки, и сравнение:

а. привеса животных;

b. числа экскретируемых паразитов.

В таблице 11 описаны различные испытанные составы.

Таблица 11
Группа	A	B	C	D	E	F
Эмульсия	E/H	E/H	E/H/E	E/H/E	CFA	Без эмульсии
Масло	1	2	1	2	Стандартное минеральное	Без масла

Масла, использованные в экспериментальных испытаниях, охарактеризованы в приведенной ниже таблице.

Номер масла	FC (<C16)	RM	FL (>C28)	P/N	RL
Стандартное минеральное	4,9	21,5	7,1	1,86	0,5
Масло 1 (H1)	2	19,3	2,2	2,85	0
Масло 2 (H2)	8,6	20,7	2,4	1,94	0,5

Композиции групп A и B, а именно эмульсии E/H1 (группа A) и эмульсии E/H2 (группа B), содержат на 100% своей массы:

30% масс. водной фазы, содержащей антиген и воду;

70% масс. маслосодержащего адъюванта, содержащего на 100% своей массы:

15% масс. маннитанолеата;

85% масс. масла (масло 1 или масло 2).

Антиген, белок 3-1 E, содержится в этих композициях в таком количестве, что доза инъецируемой композиции содержит 50 мкг антигена, причем объем дозы инъецируемой композиции составляет 100 мкл.

Композиции групп C и D, а именно микроэмульсии E/H1/E (группа C) и микроэмульсии E/H2/E (группа D), содержат на 100% своей массы:

90% масс. водной фазы, содержащей антиген и воду;

10% масс. маслосодержащего адъюванта, содержащего на 100% своей массы:

40% масс. сорбитанолеата, этоксилированного 20 моль этиленоксида (полисорбат 80);

60% масс. масла (масло 1 или масло 2).

Антиген, белок 3-1 E, содержится в этих композициях в таком количестве, что доза инъецируемой композиции содержит 50 мкг антигена, причем объем дозы инъецируемой композиции составляет 100 мкл.

На уровне титров антител в сыворотке все испытанные группы имели значительные и эквивалентные сывороточные титры антител за исключением группы, содержавшей только белок (группа F). Гуморальный ответ, полученный для каждой из групп, имеет высокий и удовлетворительный уровень (результаты не представлены).

Уровень инфильтрации белых кровяных клеток к месту инъекции, интенсивность локальной инфильтрации белых кровяных клеток (лимфоцитов и макрофагов) оценивали по косвенной иммунофлуоресценции на срезах тканей для различных групп.

Биопсийные материалы получали от 3 животных из каждой группы по месту инъекции с целью получения образцов кожи этих животных. Биопсию осуществляли на следующий день после второй иммунизации животных или через 28 дней после первой иммунизации. Иммунизация состояла в инъекции смеси профилина и испытуемых композиций. Контрольный опыт, состоявший во введении профилина без вакцинной среды, осуществляли в тех же самых опытных условиях. Образцы, полученные таким образом, немедленно замораживали в среде жидкого азота и хранили при температуре -20°C. Затем фрагменты каждого образца размером 5 мкм помещали на подложки, предварительно очищенные и промытые в ацетоне в течение 20 минут при температуре 4°C, и "фиксировали" 10%-й лошадиной сывороткой в течение 20 минут при температуре 20°C. Прибавляли антитела CD8 цыпленка, разбавленные с соотношением 1/200, и затем полученную смесь инкубировали при комнатной температуре (20°C) в течение 2 часов. Далее подложки промывали фосфатным буферным раствором и инкубировали со вторичным антителом IgG цыпленка "Alexa Fluor 488-labeled antichicken" (реализуемым компанией Carlsbad под названием Invitrogen) с разведением 1/500 в течение 2 часов при комнатной температуре (20°C). Затем подложки приводили в контакт с реактивом для колориметрического обнаружения Fluoromount-G и наблюдали под электронным микроскопом (реализуемым компанией Carl Zeiss под названием LSM 510 META).

По этой методике квалифицировали визуализацию клеток CD8+ оценками по следующей шкале:

оценка "0": отсутствие наблюдаемых пятен клеток CD8+;

оценка "+": наблюдение наличия, с низкой плотностью, клеток CD8+;

оценка "++": наблюдение большого наличия, с высокой плотностью, клеток CD8+;

оценка "+++": наблюдение очень большого наличия, с очень высокой плотностью, клеток CD8+.

Чем более значительны количество и плотность лимфоцитов и макрофагов, наблюдаемых по месту инъекции, тем большей способностью вызывать эффективный иммунный ответ может обладать испытуемая вакцина.

Полученные результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12
Группа	A	B	C	D	E	F
Адъювант	E/H1	E/H2	E/H1/E	E/H2/E	CFA	Без адъюванта
Антиген	Да	Да	Да	Да	Да	Да
Лимфоцит	+++	+	++	++	+	0

Макрофаг

++

+

+

+

+

0

По сравнению с вакциной, содержащей адъювант предшествующего уровня техники (группа E), вакцины по настоящему изобретению улучшают продуцирование лимфоцитов в месте инъекции в случае групп D, C и A; тогда как в отношении макрофагов только вакцина по настоящему изобретению группы A обеспечивает улучшение продуцирования макрофагов, и другие вакцины по настоящему изобретению позволяют получить результаты по продуцированию макрофагов в месте инъекции, сходные с результатами для вакцины, содержащей адъювант предшествующего уровня техники.

При испытании на вирулентность эффективная защита, индуцируемая вакциной, будет затрагивать только животных, которые:

покажут привес, сходный по сравнению с контрольными особями, не подвергнутыми вакцинации и испытанию;

покажут уменьшение паразитарной нагрузки (оцениваемой по числу экскретируемых паразитов) по сравнению с подвергнутыми испытанию и невакцинированными животными.

В общем случае, испытание на вирулентность состоит во введении точной и регулируемой дозы патогенного агента, против которого животные были предварительно вакцинированы. Защиту, индуцируемую экспериментальными вакцинами, оценивают по различным показателям в зависимости от модельного животного и вида патогена.

В период, следующий за испытанием на вирулентность, контролировали два главных показателя:

привес животных через 10 дней после инфицирования;

уменьшение числа экскретируемых патогенов.

Привес животных через 10 дней после инфицирования

В таблице 13 кратко представлены результаты, полученные при инфицировании и вакцинации цыплят против кокцидиоза птиц (использованный штамм представлял собой Emeria acervulina). Патогенность этого штамма является значительной и выражается в изменении привеса инфицированных животных.

Таблица 13 Привес в разных группах после испытания на вирулентность
Группа	A	B	C	D	E	F	G	H
Эмульсия	E/H1	E/H2	E/H1/E	E/H2/E	CFA	Без адъюванта	Без вакцины	Без вакцины
Антиген	Да	Да	Да	Да	Да	Да	Нет	Нет
Испытание на вирулентность	10000 ооцист Emeria acervulina							Без испытания
Привес через десять дней после испытания (г)	834	798	802	740	773	735	730	850

Можно видеть, что в отношении животных, подвергнутых испытанию, вакцинация без адъюванта не индуцирует защиту в плане привеса: контрольные группы без адъюванта (группа F) и без вакцины (группа G) показали сходные результаты.

По сравнению с животными, подвергнутыми испытанию и невакцинированными (группа G), вакцины по настоящему изобретению, содержащие адъювант на основе масел H1 и H2, обеспечивают значительные привесы за исключением вакцин группы D.

По сравнению с вакциной, содержащей адъювант предшествующего уровня техники (группа E), вакцины по настоящему изобретению индуцируют больший привес за исключением вакцины, находящейся в виде эмульсии E/H2/E (группа D).

Необходимо также отметить, что вакцины по настоящему изобретению, содержащие адъювант на основе масла 1, индуцируют привес более значительный, чем вакцины по настоящему изобретению, содержащие адъювант на основе масла 2.

В случае вакцин по настоящему изобретению из группы A привес меньше только на 1,9% по сравнению с привесом животных, не подвергнутых испытанию.

В то же время, в случае каждого из рассмотренных минеральных масел (H1 или H2) можно отметить, что экспериментальные вакцины, составленные в виде эмульсии "вода/масло", кажется, оказывают большее защитное действие, чем вакцины в виде эмульсии "вода/масло/вода":

в случае масла 1 привес для вакцины в виде эмульсии E/H1 (группа A) составляет 834 г, и приращение привеса равно 99 г по сравнению с животными из группы без адъюванта (группа F), тогда как для вакцины в виде эмульсии E/H1/E привес (группа C) составляет 802 г, и приращение привеса равно 67 г по сравнению с животными из группы без адъюванта (группа F);

в случае масла 2 привес для вакцины в виде эмульсии E/H2 (группа B) составляет 798 г, и приращение привеса равно 63 г по сравнению с животными из группы без адъюванта (группа F), тогда как для вакцины в виде эмульсии E/H2/E привес (группа D) составляет 740 г, и приращение привеса равно 5 г по сравнению с животными из группы без адъюванта (группа F).

Уменьшение числа экскретируемых патогенов

Полученные результаты представлены в таблице 14.

Результаты выражены в уменьшении числа экскретируемых ооцист (чем больше инфицированность животных, тем больше они экскретируют патогенов и, следовательно, тем меньше они были защищены).

Таблица 14
Группа	A	B	C	D	E	F
Адъювант	E/H1	E/H2	E/H1/E	E/H2/E	CFA	Без адъюванта
Антиген	Да	Да	Да	Да	Да	Да
Среднее число экскретируемых патогенов (X10E8)	1,42	2,75	2,54	3,09	2,13	2,86
Среднее квадратичное отклонение	0,23	0,52	0,8	0,39	0,49	0,36

Таким образом, по сравнению с контрольной группой F (антиген без адъюванта) вакцины по настоящему изобретению индуцируют уменьшение среднего числа экскретируемых патогенов.

По сравнению с группой E (антиген+адъювант предшествующего уровня техники) вакцина по настоящему изобретению группы 1 обеспечивает уменьшение среднего числа экскретируемых патогенов.

Кроме того, среднее квадратичное отклонение для группы A является наименьшим, что указывает на более однородный ответ вакцинированных животных. Этот показатель представляет собой важный пункт, поскольку это означает, что индивидуальная чувствительность в отношении биологического ответа животных нивелируется благодаря эффективности вакцины.

ВЫВОДЫ ИЗ ИСПЫТАНИЯ 1

Вакцины, содержащие адъюванты по настоящему изобретению, обеспечивают улучшенный иммунный ответ и лучшую эффективность для профилактики кокцидиоза у домашних птиц.

С другой стороны, вакцина по настоящему изобретению, находящаяся в виде эмульсии E/H1, в которой масло H1 характеризуется соотношением P/N>2, имеет в качестве преимущества стимулирование повышенного продуцирования белых кровяных клеток по месту инъекции, и совмещение, выявленное в испытании на вирулентность со штаммом Emeria Acervulina , более высокого привеса и очень существенного уменьшения экскреции ооцист.

Серия испытаний 2. С учетом серии испытаний 1 и выводов из них о том, что лучшие показатели отмечены у вакцины, содержащей:

рекомбинантный белок, содержащий последовательность 3-1 Eimera Acervulina;

масло 1;

воду;

систему поверхностно-активных веществ;

и находящейся в виде эмульсии E/H, авторами осуществлены два типа испытаний на вирулентность:

испытание на вирулентность со штаммом Emeria Acervulina (AE);

испытание на вирулентность со штаммом Emeria Tenella (ET).

Испытуемые композиции, а именно эмульсии E/H1, содержат на 100% своей массы:

30% масс. водной фазы, содержащей антиген и воду;

70% масс. маслосодержащего адъюванта, содержащего на 100% своей массы:

15% масс. маннитанолеата;

85% масс. масла (масло 1 или масло 2).

Антиген, белок 3-1 E, содержится в этих композициях в таком количестве, что доза инъецируемой композиции содержит 30 мкг антигена, причем объем дозы инъецируемой композиции составляет 100 мкл.

Идентификация перекрестной защиты, расширяющей свойства испытуемой экспериментальной вакцины. На практике, индуцированный иммунный ответ клеточного типа обеспечивает также защиту против различных штаммов паразитов.

Используемая доза белка составляет 30 мкг/мл. Испытание на вирулентность осуществляют введением по 10000 ооцист каждой птице (таблица 15).

Затем у животных контролируют показатели привеса, антител, пролиферации лимфоцитов селезенки после повторной стимуляции антигенами или митогенами (для количественного определения клеточного ответа) и защиты при испытании на вирулентность.

E. acervulina является умеренно патогенной.

Повреждения локализуются в тонком кишечнике, главным образом в двенадцатиперстной кишке, вначале в виде пятен, а затем в виде белесых полосок на слизистой = повреждения в виде "лестницы". Повреждения вызываются ооцистами.

E. tenella представляет собой наиболее патогенный вид кокцидий, причем повреждения вызываются шизонтами.

Повреждения локализованы в слепой кишке, которая наполнена кровью, может прорываться или иметь гангренозную форму. Тушка может быть анемичной. Смертность часто бывает высокой.

В таблице 15 описаны различные испытанные группы.

У вакцинированных цыплят в разных группах контролировали следующие показатели:

a) привес;

b) продуцирование антител (серологически);

c) оценивание интенсивности локальной инфильтрации белых кровяных клеток (лимфоцитов) способом косвенной иммунофлуоресценции в пробах спленоцитов селезенки, осуществляемой через 48 ч после вакцинации (или иммунизации). Эта иммунизация состояла во введении смеси профилина и испытуемых композиций. Контрольный опыт, состоявший во введении профилина без вакцинной среды, осуществляли в тех же самых опытных условиях. Использованная методика идентична описанной выше методике, использованной для проб кожи животных, и включает:

хранение отобранных образцов спленоцитов при -20 °C;

нанесение проб спленоцитов на подложки и промывка в ацетоне в течение 20 минут при 20°C;

прибавление антител CD8, разбавленных с соотношением 1/200, с последующей инкубацией в течение 2 часов при 20°C;

промывку полученных подложек фосфатным буферным раствором с последующей инкубацией со вторичным антителом IgG цыпленка "Alexa Fluor 488-labeled antichicken" с разведением 1/500 в течение 2 часов при комнатной температуре (20°C);

приведение в контакт с реактивом для колориметрического обнаружения Fluoromount-G;

наблюдение под электронным микроскопом (реализуемым компанией Carl Zeiss под названием LSM 510 META).

По этой методике квалифицировали визуализацию клеток CD8+ (лимфоцитов) оценками по следующей шкале:

оценка "0": отсутствие наблюдаемых пятен клеток CD8+;

оценка "+": наблюдение наличия, с низкой плотностью, клеток CD8+;

оценка "++": наблюдение большого наличия, с высокой плотностью, клеток CD8+;

оценка "+++": наблюдение очень большого наличия, с очень высокой плотностью, клеток CD8+;

d) число экскретируемых ооцист.

Результаты:

привес: группы, вакцинированные вакциной, находящейся в виде эмульсии E/H1, характеризуются привесом, сходным с привесом, наблюдаемым в других группах (результаты не представлены);

серология: повышенное продуцирование антител, превышающее продуцирование, наблюдаемое в группах, вакцинированных вакциной, содержащей в качестве адъюванта CFA, и продуцирование, наблюдаемое в группах, вакцинированных вакциной, не содержащей адъювант (результаты не представлены);

пролиферация лимфоцитов: более высокие оценки получили группы H и I, вакцинированные вакциной, находящейся в виде эмульсии E/H и содержащей адъювант с маслом H1.

Группа	A	B	C	D	E	F	G	H	I
Оценка пролиферации лимфоцитов	0	0	0	0	0	0	0	++	++

число экскретируемых ооцист:

В таблицах 16 и 17 приведены числа экскретируемых ооцист для групп, подвергнутых испытанию на вирулентность с Emeria Acervulina и Emeria Tenella.

Таблица 16 Результаты экскреции после испытания на вирулентность со штаммом EA
Группа	B	D	F	H
Среднее значение (Х 10E8)	3,44	3,33	3,30	2,71
Среднее квадратичное отклонение	0,50	0,67	0,89	0,27

Таблица 17 Результаты экскреции после испытания на вирулентность со штаммом ET
Группа	C	E	G	I
Среднее значение (Х 10E8)	1,49	1,20	1,11	0,95
Среднее квадратичное отклонение	0,23	0,27	0,42	0,13

С обоими штаммами группы, вакцинированные вакциной, содержащей адъювант на основе масла H1, показывают среднее значение экскреции меньше значения, наблюдаемого в группах, вакцинированных вакциной, содержащей адъювант предшествующего уровня техники (CFA). Такая же ситуация имеет место при сравнении с группами, вакцинированными вакциной, не содержащей адъювант (группы D и E).