fc-варианты с измененным связыванием с fcrn

Формула изобретения

1. Полипептид, демонстрирующий увеличенное связывание с FcRn человека, указанный полипептид содержит вариант Fc полипептида Fc человеческого IgG, где указанный вариант Fc содержит изолейцин в положении 259 и фениаланин в положении 308, где указанный вариант Fc проявляет усиленное связывание с FcRn человека по сравнению с указанным полипептидом Fc человека, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabatet al.

2. Полипептид, демонстрирующий увеличенное связывание с FcRn человека, указанный полипептид содержит вариант Fc полипептида Fc человеческого IgG, где указанный вариант Fc содержит изолейцин в положении 259 и фениаланин в положении 308, где указанный полипептид дополнительно содержит одну или несколько из следующих модификаций: 428L, 434S, 307Q, 319L, 250I, где указанный вариант Fc проявляет усиленное связывание с FcRn человека по сравнению с указанным полипептидом Fc человека, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat et al.

3. Полипептид, содержащий вариант полипептида Fc, по любому из пп.1 и 2, где указанный полипептид представляет собой антитело, слитый с Fc белок или иммуноадгезин.

4. Полипептид, содержащий вариант полипептида Fc, по п.3, где указанный вариант содержит Fc область IgG1 или Fc область IgG2, или Fc область IgG3, или Fc область IgG4.

5. Полипептид, содержащий вариант полипептида Fc, по любому из пп.3-4, где указанный полипептид имеет более продолжительное время полужизни в сыворотке млекопитающего по сравнению с белком, содержащим область Fc дикого типа.

6. Полипептид, содержащий вариант полипептида Fc, по п.5, где указанное млекопитающее является человеком.

7. Полипептид, содержащий вариант полипептида Fc, по любому из пп.3-6, который является антителом, имеющим специфичность к антигену, выбранному из группы, состоящей из фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора некроза опухоли альфа (TNF- ), CD25, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и IgE.

8. Полипептид, содержащий вариант полипептида Fc, по любому из пп.3-7, предназначенный для использования в качестве лекарственного средства.

9. Клетка хозяин для продукции полипептида, содержащего вариант Fc, по любому из пп.1-8, указанная клетка хозяин содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий указанный вариант Fc, по любому из пп.1-8.

10. Способ получения полипептида, содержащего вариант Fc, по любому из пп.1-8, указанный способ включает обеспечение клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид, где указанная клетка культивируется в подходящих для экспрессии указанного полипептида условиях.

11. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, по любому из пп.1-8.

Описание изобретения к патенту

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании 35 U.S.С. 119 (е) в отношении USSN 60/951536, поданной 24 июля, 2007, и представляет собой частичное продолжение USSN 11/436266, поданной 17 мая, 2006, которая представляет собой частичное продолжение USSN 11/274065, поданной 14 ноября, 2005, обе из которых испрашивают приоритет на основании 35 U.S.С. 119 (е) в отношении USSN 60/627763, поданной 12 ноября, 2004; USSN 60/642886, поданной 11 января, 2005; USSN 60/649508, поданной 2 февраля, 2005; USSN 60/662468, поданной 15 марта, 2005; USSN 60/669311, поданной 6 апреля, 2005; USSN 60/681607, поданной 16 мая, 2005; USSN 60/690200, поданной 13 июня, 2005; USSN 60/696609, поданной 5 июля, 2005; USSN 60/703018, поданной 27 июля, 2005; и USSN 60/726453, поданной 12 октября, 2005, полное содержание которых включено в настоящее описание посредством отсылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка относится к оптимизированным вариантам иммуноглобулина IgG, инженерным способам их получения и их применению, в частности в терапевтических целях.

Уровень техники

Антитела представляют собой иммунологические белки, которые связываются с конкретным антигеном. У большинства млекопитающих, включая людей и мышей, антитела образуются из парных тяжелых и легких полипептидных цепей. Каждая цепь состоит из индивидуальных доменов иммуноглобулина (Ig) и поэтому для таких белков используют общий термин «иммуноглобулин». Каждая цепь состоит из двух отдельных областей, называемых «вариабельными» и «константными» областями. Вариабельные области легкой и тяжелой цепи демонстрируют существенное различие последовательностей антител и являются ответственными за связывание с антигеном-мишенью. Константные области демонстрируют меньшее различие последовательностей и являются ответственными за связывание с рядом природных белков для стимулирования важных биохимических реакций. У людей существует пять различных классов антител, включая IgA (который включает подклассы IgA1 и IgA2), IgD, IgE, IgG (который включает подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) и IgM. Отличительным признаком данных классов антител являются их константные области, несмотря на то, что тонкие различия могут существовать в V-области. На фиг.1 показано антитело IgG1, используемое в настоящем описании в качестве примера для описания общих структурных признаков иммуноглобулинов. Антитела IgG представляют собой тетрамерные белки, состоящие из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Тяжелая цепь IgG состоит из четырех доменов иммуноглобулина, связанных от N- к С-концу в порядке VH-CH1-CH2-CH3, что относится к вариабельному домену тяжелой цепи, константному домену 1 тяжелой цепи, константному домену 2 тяжелой цепи и константному домену 3 тяжелой цепи, соответственно (также обозначаемая как VH-C 1-С 2-С 3, что относится к вариабельному домену тяжелой цепи, константному домену гамма 1, константному домену гамма 2 и константному домену гамма 3, соответственно). Легкая цепь IgG состоит из двух доменов иммуноглобулина, связанных от N- к С-концу в порядке VL-CL, что относится к вариабельному домену легкой цепи и константному домену легкой цепи, соответственно.

Вариабельная область антитела содержит антигенсвязывающие детерминанты молекулы и таким образом определяет специфичность антитела в отношении антигена-мишени. Вариабельная область так названа из-за того что она больше всего отличается по своей последовательности от других антител в пределах одного класса. Большая часть вариабельности последовательностей встречается в гипервариабельных участках (CDR). Существует всего 6 CDR, на тяжелую и легкую цепь приходится по три области, обозначаемые VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3. Вариабельная область за пределами CDRs называется каркасной областью (FR). Несмотря на то, что она не такая разнообразная как CDR, вариабельность последовательностей действительно встречается в области FR между различными антителами. В целом, данная характерная структура антител обеспечивает устойчивый каркас (область FR), на основе которого значительное различие в связывании антигенов (CDR) может быть выявлено иммунной системой с приобретением специфичности в отношении широкого круга антигенов. Существует ряд структур высокого разрешения для множества фрагментов вариабельной области различных организмов, некоторые из которых не связаны с антигеном, и некоторые из которых находятся в комплексе с антигеном. Последовательность и структурные признаки вариабельных областей антитела хорошо охарактеризованы (Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279, полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки), а консервативные признаки антител облегчили развитие множества технологий создания антител (Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Например, можно трансплантировать CDRs одного антитела, например, антитела мыши, в каркасную область другого антитела, например, антитела человека. Указанный способ называется в данной области техники «гуманизацией» и позволяет получать менее иммуногенные лекарственные средства на основе антител из антител нечеловеческого происхождения. Фрагменты, содержащие вариабельную область, могут существовать при отсутствии других областей антитела, включая, например, антигенсвязывающий фрагмент (Fab), включающий VH-C 1 и VH-CL, вариабельный фрагмент (Fv), включающий VH и VL, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), включающий VH и VL, связанные в одной и той же цепи, а также множество других фрагментов вариабельной области (Little et al., 2000, Immunol Today 21:364-370, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Область Fc антитела взаимодействует с рядом рецепторов и лигандов Fc, передавая ряд важных функциональных возможностей, называемых «эффекторными функциями». Для IgG область Fc, как показано на фиг.1 и 2, содержит домены Ig С 2 и С 3 и N-концевой шарнир, ведущий в С 2. Важное семейство рецепторов Fc для класса IgG представляет собой гамма рецепторы Fc (Fc R). Данные рецепторы опосредуют взаимодействие между антителами и клеточным «звеном» иммунной системы (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). У людей данное семейство белков включает Fc RI (CD64), включая изоформы Fc RIa, Fc RIb и Fc RIc; Fc RII (CD32), включая изоформы Fc RIIa (включая аллотипы H131 и R131), Fc RIIb (включая Fc RIIb-1 и Fc RIIb-2) и Fc RIIc; и Fc RIII (CD16), включая изоформы Fc RIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и Fc RIIIb (включая аллотипы Fc RIIIb-NA1 и Fc RIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Данные рецепторы, как правило, содержат внеклеточный домен, который опосредует связывание с Fc, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, который может опосредовать какое-либо сигнальное явление внутри клетки. Эти рецепторы экспрессируются во множестве иммуноцитов, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В-клетки, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, естественные киллерные (ЕК) клетки и Т-клетки. При образовании комплекса Fc/Fc R происходит рекрутирование указанных эффекторных клеток к участкам связанного антигена, как правило, приводящее к явлениям передачи сигнала внутри клеток и важным последующим иммунным ответам, таким как высвобождение медиаторов воспаления, активация В-клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Способность опосредовать цитотоксические и фагоцитарные эффекторные функции представляет собой возможный механизм, посредством которого антитела разрушают целевые клетки. Опосредуемая клетками реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc Rs, распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем вызывают лизис указанной клетки-мишени, называется «антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC)» (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Опосредуемая клетками реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc Rs, распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем вызывают фагоцитоз указанной клетки-мишени, называется «антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз (ADCP)». Ряд структур был создан с использованием внеклеточных доменов Fc Rs человека, включая Fc RIIa (код доступа в pdb 1H9V, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (код доступа в pdb 1FCG, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), Fc RIIb (код доступа в pdb 2FCB, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095-1103, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки); и Fc RIIIb (код доступа в pdb 1E4J, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Все Fc Rs связываются с одной и той же областью Fc, в N-концевой области домена С 2 и предшествующем шарнире, показанном на фиг.1. Данное взаимодействие хорошо структурно охарактеризовано (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) и некоторые структуры Fc человека, связанного с внеклеточным доменом Fc RIIIb человека были установлены (код доступа в pdb 1E4K, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (коды доступа в pdb 1IIS и 1IIX, полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), а также структура комплекса Fc/Fc RI IgE человека (код доступа в pdb 1F6A, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Garman et al., 2000, Nature 406:259-266, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Реакция эффекторной функции может быть модифицирована посредством варианта в области Fc (Lazar et al. 2006 Proc. Nat. Acad. Sci USA. 103(111):4005-4010, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Различные подклассы IgG обладают разными значениями аффинности к Fc Rs, при этом IgG1 и IgG3, как правило, существенно лучше связываются с рецепторами по сравнению с IgG2 и IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Все Fc Rs связываются с одной и той же областью Fc IgG, но с различными значениями аффинности: Kd обладающего высокой аффинностью рецептора Fc RI для IgG1 равна 10^-8 М^-1, в то время как обладающие низкой аффинностью рецепторы Fc RII и Fc RIII в целом связываются при 10^-6 и 10^-5 соответственно. Внеклеточные домены Fc RIIIa и Fc RIIIb являются на 96% идентичными; однако Fc RIIIb не содержит внутриклеточный сигнальный домен. Кроме того, в то время как Fc RI, Fc RIIa/c и Fc RIIIa представляют собой позитивные регуляторы активации, инициируемой иммунным комплексом, характеризующиеся наличием внутриклеточного домена, который содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM), Fc RIIb содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM), и, следовательно, является ингибирующим. Таким образом, первые рецепторы называются «активирующими рецепторами», а Fc RIIb называется «ингибирующим рецептором». Указанные рецепторы также отличаются по профилям и уровням экспрессии в различных иммуноцитах. Еще один уровень сложности представляет собой наличие ряда полиморфизмов Fc R в протеоме человека. Конкретный важный полиморфизм, обладающий клинической значимостью, представляет собой V158/F158 Fc RIIIa. IgG1 человека связывается с более высоким значением аффинности с аллотипом V158, чем с аллотипом F158. Было показано, что данное отличие в аффинности и, вероятно, его влияние на ADCC и/или ADCP является важным фактором эффективности антитела анти-СВ20, ритуксимаба (Ритуксан (Rituxan®), BiogenIdec). Пациенты с аллотипом V158 положительно реагируют на лечение ритуксимабом; однако, пациенты с аллотипом F158, обладающим более низким значением аффинности, слабо реагируют (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Приблизительно 10-20% людей являются гомозиготными V158/V158, 45% являются гетерозиготными V158/F158 и 35-45% людей являются гомозиготными F158/F158 (Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Таким образом, 80-90% людей обладают низким иммунным ответом, т.е. они имеют, по меньшей мере, один аллель F158 Fc RIIIa.

Перекрывающийся, но отдельный участок Fc, показанный на фиг.1, служит в качестве границы для белка комплемента C1q. Подобно тому как связывание Fc/Fc R опосредует ADCC, связывание Fc/C1q опосредует комплементзависимую цитотоксичность (CDC). C1q образует комплекс с сериновыми протеазами C1r и C1s с образованием комплекса С1. C1q может связываться с шестью антителами, несмотря на то, что связывание с двумя IgG является достаточным для активации каскада реакций комплемента. Подобно взаимодействию Fc с Fc R, различные подклассы IgG обладают разной аффинностью к C1q, при этом IgG1 и IgG3 как правило существенно лучше связываются с Fc Rs, чем IgG2 и IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

В IgG участок Fc между доменами Cg2 и Cg3 (фиг.1) опосредует взаимодействие с неонатальным рецептором FcRn, связывание с которым возвращает подвергшееся эндоцитозу антитело из эндосомы обратно в кровоток (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Данный процесс, сопряженный с нарушением фильтрации почек вследствие большого объема полноразмерной молекулы, приводит к подходящему времени полужизни антител в сыворотке в диапазоне от одной до трех недель. Связывание Fc с FcRn также играет ключевую роль в транспорте антитела. Сайт связывания в области Fc для FcRn также представляет собой участок, в котором связываются бактериальные белки А и G. Прочное связывание данными белками, как правило, используют в качестве способа очистки антител путем применения аффинной хроматографии с белком А или белком G в ходе очистки белка. Таким образом, точность данного участка в области Fc имеет важное значение как для клинических свойств антител, так и для их очистки. Имеющиеся структуры комплекса Fc/FcRn крысы (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки) и комплексов Fc с белками А и G (Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al., 1995, Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481, все полностью включены в настоящее описание посредством отсылки), дают представление о взаимодействии Fc с указанными белками. Рецептор FcRn также ответственен за перенос IgG в кишечник новорожденных и в просвет эпителия кишечника у взрослых (Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol., 2000, 18:739-766; Yoshida et al., Immunity, 2004, 20(6):769-783, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки).

Исследования доменов Fc крысы и человека продемонстрировали важное значение некоторых остатков Fc для связывания FcRn. Последовательности крысы и человека обладают примерно 64% идентичности последовательностей в областях Fc (остатки 237-443 согласно нумерации Kabat et al.). См. фиг.3, 4 и 5 на предмет выравниваний Fc крыса/человек, тяжелая цепь FcRn и легкая цепь FcRn (бета-2-микроглобулин). Была создана модель комплекса Fc/FcRn человека исходя из имеющейся структуры комплекса Fc/FcRn крысы (Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Последовательности крысы и человека содержат некоторые общие остатки, имеющие ключевое значение для связывания FcRn, например Н310 и Н435 (Medesan et al., 1997 J. Immunol. 158(5):221-7; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Однако во многих положениях белки человека и крысы содержат разные аминокислоты, обеспечивающие указанным остаткам в последовательности человека отличным окружением и возможно отличной идентичностью, чем в последовательности крысы. Указанная вариабельность ограничивает способность передавать особенности одного гомолога другому гомологу.

В Fc мышей случайная мутация и отбор на основе фагового дисплея по сайтам Т252, Т254 и Т256 приводит к тройному мутанту T252L/T254S/T256F, обладающему 3,5-кратным повышением аффинности к FcRn и 1,5-кратным увеличением времени полужизни в сыворотке (Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15(7):637-640, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Нарушение взаимодействия Fc/FcRn посредством мутаций в положениях 253, 310 и 435 также приводит к уменьшению времени полужизни in vivo (Medesan et al J. Immunol. 1997 158(5):2211-7, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

На основе кристаллических структур комплекса Fc/FcRn крысы были идентифицированы остатки Fc, имеющие важное значение для связывания FcRn (Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994); Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001), оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Первоначальная структура комплекса Fc/FcRn было установлена в 1994 году при разрешении 6 Å (таблица 2а, Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994), полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Структура более высокого разрешения, установленная в 2001 году Marin et al, представила более детальное изображение положений боковых цепей (Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001), полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Данная кристаллическая структура Fc крысы, связанного с FcRn крысы, была установлена с использованием димера Fc с одним мономером, содержащим мутации T252G/I253G/T254G/H310E/H433E/H435E, нарушающие связывание FcRn, и одним мономером, содержащим мономер Fc дикого типа.

Были проведены исследования мутаций в Fc человека в некоторых остатках, имеющих важное значение для связывания с FcRn, и данные исследования продемонстрировали увеличенное время полужизни в сыворотке. В Fc 1 человека Hinton et al. индивидуально подвергли мутации три остатка в другие 19 обычных аминокислот. Hinton et al. обнаружили, что некоторые мутанты, двойной мутант, повышали аффинность к связыванию FcRn (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216. Hinton et al. Journal of Immunology 2006, 176:346-356, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Две мутации обладали увеличенным временем полужизни у обезьян. Shields et al. подвергли мутации остатки практически исключительно в А1а и исследовали их связывание с FcRn и Fc R (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Dall'Acqua et al. использовали фаговый дисплей для отбора мутаций Fc, которые связывали FcRn с повышенной аффинностью. (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Выбранные последовательности ДНК преимущественно представляли собой двойные и тройные мутанты. Dall'Acqua et al. экспрессировали белки, кодируемые многими выбранными последовательностями, и были обнаружены некоторые, которые связывались с FcRn более прочно, чем в случае Fc дикого типа.

Для введения антител и слитых с Fc белков в качестве лекарственных средств необходимы инъекции с заданной частотой, связанной с клиренсом и параметрами времени полужизни белка. Более продолжительное время полужизни in vivo позволяет реже осуществлять инъекции или уменьшать дозу, что очевидно является преимуществом. Несмотря на то, что полученные в прошлом мутации в домене Fc привели к получению некоторых белков, обладающих повышенной аффинностью к связыванию FcRn и увеличенным временем полужизни in vivo, данные мутации не определили оптимальные мутации и увеличенное временя полужизни in vivo.

Одним из признаков области Fc является консервативное N-связанное гликозилирование, происходящее по N297, показанном на фиг.1. Данный углевод или олигосахарид, как его иногда называют, играет ключевую структурную и функциональную роль для антитела и представляет собой одну из основных причин, по которой антитела должны быть получены с использованием систем экспрессии млекопитающих (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477; и Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979-989, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки).

Антитела были получены для терапевтического использования. Типичные публикации, относящиеся к таким видам терапии, включают Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410, McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833 и Cobleigh et al., 1999, J din Oncol 17:2639-2648, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. В настоящее время для противораковой терапии любое небольшое снижение в уровне смертности означает успех. Некоторые варианты IgG, указанные в настоящем описании, увеличивают способность антител ограничивать дальнейший рост или разрушать по меньшей мере частично целевые раковые клетки.

Противоопухолевая активность антител реализуется посредством увеличения их способности опосредовать цитотоксические эффекторные функции, такие как ADCC, ADCP и CDC. Примеры включают Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446 и Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

IgG1 человека представляет собой чаще всего используемое в терапевтических целях антитело и в связи с этим было проведено большинство поисковых исследований. Однако различные изотипы класса IgG, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, обладают уникальными физическими, биологическими и клиническими свойствами. В данной области техники существует необходимость создания улучшенных вариантов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Также существует необходимость создания указанных вариантов для улучшения связывания с FcRn и/или увеличения времени полужизни in vivo, no сравнению с нативными полипептидами IgG. Кроме того, существует необходимость комбинирования вариантов, обладающих улучшенными фармакокинетическими свойствами, с вариантами, содержащими модификации, для улучшения эффективности посредством измененного связывания FсгаммаR. Настоящая заявка соответствует этим и другим потребностям.

Раскрытие изобретения

Настоящая заявка относится к Fc-вариантам исходного полипептида, содержащим по меньшей мере одну модификацию в области Fc указанного полипептида. В различных вариантах осуществления вариантные полипептиды демонстрируют измененное связывание с FcRn по сравнению с исходным полипептидом. В некоторых вариантах модификация может быть выбрана из группы, включающей: 246Н, 246S, 247D, 247Т, 248Н, 248Р, 248Q, 248R, 248Y, 249Т, 249W, 250Е, 250I, 250Q, 250V, 251D, 251E, 251H, 251I, 251K, 251M, 251N, 251T, 251V, 251Y, 252Q, 252Y, 253L, 253T, 253V, 254H, 254L, 254N, 254T, 254V, ^254N, 255E, 255F, 255H, 255K, 255S, 255V, 256E, 256V, 257A, 257C, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257Q, 257R, 257S, 257T, 257V, 257W, 257Y, 258R, 258V, 259I, 279A, 279D, 279C, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280H, ^281A, ^281D, ^281S, ^281T, 282D, 282F, 282H, 282I, 282T, 283F, 283I, 283L, 283Y, 284H, 284K, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284Y, 285S, 285V, 286D, 286#, 286L, 287H, 287S, 287V, 287Y, 288H, 288Q, 288S, 305H, 305T, 306F, 306H, 306I, 306N, 306T, 306V, 306Y, 307D, 307P, 307Q, 307S, 307V, 307Y, 308C, 308D, 308E, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308Q, 308P, 308R, 308S, 308W, 308Y, 309F, 309H, 309N, 309Q, 309V, 309Y, 310K, 310N, 310T, 311A, 311L, 311P, 311T, 311V, 311W, 312H, 313Y, 315E, 315G, 315H, 315Q, 315S, 315T, 317H, 317S, 319F, 319F, 319L, 339P, 340P, 341S, 374H, 374S, 376H, 376L, 378H, 378N, 380A, 380T, 380Y, 382H, 383H, 383K, 383Q, 384E, 384G, 384H, 385A, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385S, 385T, 385V, 385W, 385Y, 386E, 386K, 387#, 387A, 387H, 387K, 387Q, 389E, 389H, 426E, 426H, 426L, 426N, 426R, 426V, 426Y, 427I, 428F, 428L, 429D, 429F, 429K, 429N, 429Q, 429S, 429T, 429Y, 430D, 430H, 430K, 430L, 430Q, 430Y, 431G, 431H, 431I, 431P, 431P, 431S, 432F, 432H, 432N, 432S, 432V, 433E, 433P, 433S, 434A, 434F, 434H, 434L, 434M, 434Q, 434S, 434Y, 435N, 436E, 436F, 436L, 436V, 436W, 437E, 437V, 438H и 438K, где нумерация приведена согласно Индексу EU у Kabat et al., и ^ означает инсерцию после указанного положения, и # означает делецию указанного положения.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 250Q/252Y, 250Q/256E, 250Q/286D, 250Q/308F, 250Q/308Y, 250Q/311A, 250Q/311V, 250Q/380A, 250Q/428L, 250Q/428F, 250Q/434H, 250Q/434F, 250Q/434Y, 250Q/434A, 250Q/434M и 250Q/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 250E/252Y, 250Е/256Е, 250E/286D, 250E/308F, 250E/308Y, 250Е/311А, 250E/311V, 250Е/380А, 250E/428L, 250E/428F, 250Е/434Н, 250E/434F, 250E/434Y, 250Е/434А, 250Е/434М и 250E/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 252Y/250Q, 252Y/250E, 252Y/256E, 252Y/286D, 252Y/308F, 252Y/308Y, 252Y/311A, 252Y/311V, 252Y/380A, 252Y/428L, 252Y/428F, 252Y/434H, 252Y/434F, 252Y/434Y, 252Y/434A, 252Y/434M и 252Y/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 256E/250Q, 256Е/250Е, 256E/252Y, 256E/286D, 256E/308F, 256E/308Y, 256Е/311А, 256E/311V, 256Е/380А, 256E/428L, 256E/428F, 256Е/434Н, 256E/434F, 256E/434Y, 256Е/434А, 256Е/434М и 256E/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 286D/250Q, 286D/250E, 286D/252Y, 286D/256E, 286D/308F, 286D/308Y, 286D/311A, 286D/311V, 286D/380A, 286D/428L, 286D/428F, 286D/434H, 286D/434F, 286D/434Y, 286D/434A, 286D/434M и 286D/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 308F/250Q, 308F/250E, 308F/252Y, 308F/256E, 308F/286D, 308F/311A, 308F/311V, 308F/380A, 308F/428L, 308F/428F, 308F/434H, 308F/434F, 308F/434Y, 308F/434A, 308F/434M и 308F/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 308Y/250Q, 308Y/250E, 308Y/252Y, 308Y/256E, 308Y/286D, 308Y/311A, 308Y/311V, 308Y/380A, 308Y/428L, 308Y/428F, 308Y/434H, 308Y/434F, 308Y/434Y, 308Y/434A, 308Y/434M и 308Y/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 311A/250Q, 311А/250Е, 311A/252Y, 311А/256Е, 311A/286D, 311A/308F, 311A/308Y, 311А/380А, 311A/428L, 311A/428F, 311А/434Н, 311A/434F, 311A/434Y, 311А7434А, 311А/434М и 311A/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 311V/250Q, 311V/250E, 311V/252Y, 311V/256E, 311V/286D, 311V/308F, 311V/308Y, 311V/380A, 311V/428L, 311V/428F, 311V/434H, 311V/434F, 311V/434Y, 311V/434A, 311V/434M и 311V/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 380A/250Q, 380А/250Е, 380A/252Y, 380А/256Е, 380A/286D, 380A/308F, 380A/308Y, 380А/311А, 380A/311V, 380A/428L, 380A/428F, 380А/434Н, 380A/434F, 380A/434Y, 380А/434А, 380А/434М и 380A/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 428L/250Q, 428L/250E, 428L/252Y, 428L/256E, 428L/286D, 428L/308F, 428L/308Y, 428L/311A, 428L/311V, 428L/380A, 428L/434H, 428L/434F, 428L/434Y, 428L/434A, 428L/434M и 428L/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434H/250Q, 434Н/250Е, 434H/252Y, 434Н/256Е, 434H/286D, 434H/308F, 434H/308Y, 434Н/311А, 434H/311V, 434Н/380А, 434H/428L и 434H/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434F/250Q, 434F/250E, 434F/252Y, 434F/256E, 434F/286D, 434F/308F, 434F/308Y, 434F/311A, 434F/311V, 434F/380A, 434F/428L и 434F/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434Y/250Q, 434Y/250E, 434Y/252Y, 434Y/256E, 434Y/286D, 434Y/308F, 434Y/308Y, 434Y/311A, 434Y/311V, 434Y/380A, 434Y/428L и 434Y/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434A/250Q, 434А/250Е, 434A/252Y, 434А/256Е, 434A/286D, 434A/308F, 434A/308Y, 434А/311А, 434A/311V, 434А/380А, 434A/428L и 434A/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434M/250Q, 434М/250Е, 434M/252Y, 434М/256Е, 434M/286D, 434M/308F, 434M/308Y, 434М/311А, 434M/311V, 434М/380А, 434M/428L и 434M/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434S/250Q, 434S/250E, 434S/252Y, 434S/256E, 434S/286D, 434S/308F, 434S/308Y, 434S/311A, 434S/311V, 434S/380A, 434S/428L и 434S/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, M252Y/S254T/T256E/N434S, M252Y/S254T/T256E/V308F, M252Y/S254T/T256E/M428L, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L и T250Q/V308F/M428L.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L и T250Q/V308F/M428L.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: 250I, 250V, 252Q, 252Y, 254Т, 256V, 259I, 307Р, 307Q, 307S, 308F, 309N, 309Y, 311P, 319F, 319L, 428L и 434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: 250V/308F, 250I/308F, 254T/308F, 256V/308F, 259I/308F, 307P/208F, 307Q/308F, 307S/308F, 308F/309Y, 308F/309Y, V308F/311P, 308F/319L, 308F/319F, 308F/428L, 252Q/308F, M252Y/S254T/T256E, 259I/434S, 428L/434S, 308F/434S, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S, 308F/319L/434S, 259I/308F/428L, 259I/307Q/308F, 250I/259I/308F, 259I/308F/319L, 307Q/308F/309Y, 307Q/308F/319L и 250Q/308F/428L.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение эффективного количества Fc-варианта, указанного в настоящем описании.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ увеличения времени полужизни антитела или иммуноадгезина путем модификации Fc согласно модификациям, указанным в настоящем описании.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Структура и функция антитела. Показана модель полноразмерного антитела IgG1 человека, смоделированная с использованием гуманизированной структуры Fab на основании кода доступа в pdb 1CE1 (James et al., 1999, J Mol Biol 289:293-301, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) и структуры Fc IgG1 человека на основании кода доступа в pdb 1DN2 (DeLano et al., 2000, Science 287:1279-1283, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Гибкий шарнир, связывающий области Fab и Fc, не показан. IgG1 представляет собой гомодимер гетеродимеров, состоящий из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. Домены Ig, содержащие антитело, являются мечеными и содержат V_L and C_L для легкой цепи и V_H , Сгамма1 (С 1), Сгамма2 (С 2) и Сгамма3 (С 3) для тяжелой цепи. Область Fc является меченой. Центры связывания для соответствующих белков являются мечеными, включая антигенсвязывающий центр в вариабельной области и центры связывания для Fc Rs, FcRn, C1q и белков А и G в области Fc.

Фиг.2. Последовательности IgG человека, используемые в соответствии с настоящим изобретением с нумерацией EU согласно Kabat et al.

Фиг.3. Пример последовательностей IgG человека и грызунов, используемых в соответствии с настоящим изобретением с нумерацией EU согласно Kabat.

Фиг.4. Пример последовательностей тяжелых цепей FcRn человека и грызунов, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.5. Пример последовательностей бета-2-микроглобулина человека и грызунов, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.6. Модель комплекса Fc/FcRn человека, созданная на основе структур крысы (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Некоторые остатки гистидина показаны в виде атомов пространственной модели в цепях FcRn (светло-серые) и в полипептиде Fc (темно-серые).

Фиг.7. Иллюстрация некоторых концепций, используемых в создании вариантов, содержащих инсерции или делеции.

Фиг.8. Варианты согласно настоящему изобретению.

Фиг.9. Варианты согласно настоящему изобретению.

Фиг.10. Варианты согласно настоящему изобретению.

Фиг.11. Диаграмма вектора pcDNA3.1 Zeo+, который может быть использован в создании Fc-вариантов.

Фиг.12. Данные конкурентного связывания с FcRn Fc дикого типа и Fc-вариантов согласно настоящему изобретению. На каждом графике Fc-варианты согласно настоящему изобретению показаны в виде левой кривой (красной или темно-серой), а антитело анти- HER2 дикого типа показано в виде правой кривой (синей или светло-серой).

Фиг.13. Вывод относительно способностей Fc-вариантов связывать FcRn. В колонках слева направо показаны модификации связывания FcRn, используемый иммуноглобулин, другие модификации, относительная аффинность к FcRn по данным конкурентных анализов AlphaScreen по сравнению с диким типом (медианное значение) и число выполненных анализов. Значения относительной аффинности к FcRn больше 1,0 демонстрируют увеличенное связывание по сравнению с диким типом. Данные получали при pH 6,0 (0,1М фосфат натрия, 25 мМ хлорид натрия).

Фиг.14. Данные связывания с FcRn Fc-вариантов. Fc-варианты включены в алемтузумаб или антитело анти-HER2. Показаны кратные увеличения в связывании по сравнению с диким типом, т.е. значения больше единицы указывают на более прочное связывание с FcRn, в то время как значения меньше единицы указывают на уменьшенное связывание с FcRn.

Фиг.15. Результаты исследований методом поверхностного плазмонного резонанса Fc-вариантов, обладающих улучшенным связыванием с FcRn. На гистограмме показано кратное увеличение аффинности к связыванию FcRn каждого варианта по сравнению с доменом Fc дикого типа.

Фиг.16. Исследования методом поверхностного плазмонного резонанса антитела дикого типа и вариантов согласно настоящему изобретению. Показанные следы представляют собой ассоциацию и диссоциацию Fc-вариант антитела с FcRn при pH 6,0.

Фиг.17. Анализы связывания Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn. Показаны данные анализов прямого связывания, измеренные с помощью AlphaScreen при pH 6,0 (а и b) и pH 7,0 (с).

Фиг.18. Анализы связывания Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn. Показаны единицы измерения поверхностного плазмонного резонанса, полученные при связывании Fc-варианта с поверхностно-связанным FcRn.

Фиг.19. Измерение поверхностного плазмонного резонанса аффинности к связыванию Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn человека при pH 6,0.

Фиг.20. Результаты измерений поверхностного плазмонного резонанса (ППР) аффинности к связыванию Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn человека, макаки и мыши. Значения больше единицы указывают на увеличенное связывание Fc-варианта с FcRn, как определено путем подгонки кривых ПНР к 1:1 модели связывания Ленгмюра.

Фиг.21. Вывод относительно способностей Fc-вариантов связывать FcRn. В колонках слева направо показаны модификации связывания FcRn, используемый иммуноглобулин, другие модификации, относительная аффинность к FcRn по данным конкурентных анализов AlphaScreen по сравнению с диким типом (среднее значение) и число выполненных анализов. Значения относительной аффинности к FcRn больше 1,0 демонстрируют увеличенное связывание по сравнению с диким типом. Данные получали при pH 6,0 (0,1М фосфат натрия, 125 мМ хлорид натрия).

Фиг.22. Аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей антитела анти-HER2.

Фиг.23. Аминокислотные последовательности константных областей (СН1-СН3) некоторых тяжелых цепей IgG1, используемых в настоящем описании.

Фиг.24. Аминокислотные последовательности константных областей (СН1-СН3) некоторых тяжелых цепей гибридного IgG1/2, используемых в настоящем описании.

Фиг.25. Связывание Fc-вариантов с FсгаммаRIIIA (Аллотип V158) по данным конкурентных анализов AlphaScreen .

Фиг.26. Связывание Fc-вариантов с белком А по данным конкурентных анализов AlphaScreen .

Фиг.27. Сывороточные концентрации дикого типа и вариантов антител у мышей с нокином (knockin) FcRn человека. Используемые антитела анти-VEGF были дикого типа (незакрашенные квадраты), V308F (закрашенные квадраты), P257L (закрашенные треугольники) и P257N (крестики).

Фиг.28. Примеры вариантов связывания FcRn согласно настоящему изобретению. Антитела анти-VEGF перечислены с указанием объема культурных сред и выхода очищенного белка.

Фиг.29. Аффинность к связыванию вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn человека при pH 6,0. Значения приведены в виде кратного увеличения связывающей способности указанного варианта относительно антитела дикого типа. Например, вариант 434S связывается с FcRn в 4,4 раза более прочно, чем антитело дикого типа.

Фиг.30. Связывание антител дикого типа и вариантных антител с FcRn на поверхности клеток 293Т.

Фиг.31. Комбинированные варианты согласно настоящему изобретению, содержащие многочисленные замены.

Фиг.32. Картина взаимодействий вариантного домена CH3 человека, содержащего 434S, меченый Ser434, и FcRn человека.

Осуществление изобретения

Согласно настоящему изобретению описано получение новых вариантов доменов Fc, включая варианты, содержащиеся в антителах, слитых с Fc белках и иммуноадгезинах, которые обладают увеличенным связыванием с рецептором FcRn. Как указано в настоящем описании, связывание с FcRn приводит к более продолжительному удерживанию в сыворотке in vivo.

Для того чтобы увеличить удерживание белков Fc in vivo повышение аффинности к связыванию должно происходить при значении pH около 6, тогда как поддержание более низкой аффинности - при значении pH около 7,4. Несмотря на продолжающиеся исследования, считают, что области Fc обладают более продолжительным временем полужизни in vivo, т.к. связывание с FcRn при pH 6 в эндосоме секвестирует Fc (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12):592-598, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Затем эндосомальный компартмент возвращает Fc на поверхность клетки. Как только компартмент открывает внеклеточное пространство, более высокое значение pH, ~7,4, индуцирует высвобождение Fc обратно в кровь. У мышей Dall' Acqua et al. показали, что мутанты Fc, обладающие увеличенным связыванием FcRn при pH 6 и pH 7,4, в действительности уменьшали сывороточные концентрации и время полужизни, как и Fc дикого типа (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Считают, что повышенная аффинность Fc к FcRn при pH 7,4 не позволяет высвобождать Fc обратно в кровь. Следовательно, мутации Fc, которые увеличат время полужизни Fc in vivo в идеальном случае увеличат связывание FcRn при более низком значении pH, в то же время позволяя высвобождать Fc при более высоком значении pH. Аминокислота гистидин меняет свое заряженное состояние в диапазоне pH 6,0-7,4. Следовательно, неудивительно, что остатки His расположены в комплексе Fc/FcRn (фиг.6) в положениях, имеющих важное значение.

Дополнительный аспект настоящего изобретения представляет собой увеличение связывания FcRn по сравнению с диким типом, в частности при более низком значении pH, pH около 6,0, для облегчения связывания Fc/FcRn в эндосоме. Также описаны Fc-варианты, обладающие измененным связыванием FcRn и измененным связыванием с другим классом рецепторов Fc, Fc R' (иногда пишут FсгаммаR), т.к. было показано, что дифференциальное связывание с Fc R, в частности увеличенное связывание с Fc RIIIb и уменьшенное связывание с Fc RIIb, приводит к повышенной эффективности.

Определения

Для более полного понимания настоящей заявки ниже приведены некоторые определения. Подразумевается, что указанные определения включают грамматические эквиваленты.

В настоящем описании термин «ADCC» или «антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность» означает опосредуемую клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc R, распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис данной клетки-мишени.

В настоящем описании термин «ADCP» или «антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз» означает опосредуемую клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc R, распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают фагоцитоз данной клетки-мишени.

В настоящем описании термин «модификация» означает замену, инсерцию и/или делецию аминокислот в полипептидной последовательности или преобразование во фрагмент, химически связанный с белком. Например, модификация может представлять собой измененную структуру углевода или PEG, присоединенную к белку. В настоящем описании термин «модификация аминокислот» означает замену, инсерцию и/или делецию аминокислот в полипептидной последовательности.

В настоящем описании термин «замена аминокислот», или «замещение» означает замену аминокислоты в конкретном положении в исходном полипептиде на другую аминокислоту. Например, замена E272Y относится к вариантному полипептиду, в данном случае Fc-варианту, в котором глутаминовая кислота в положении 272 заменена на тирозин.

В настоящем описании термин «инсерция аминокислот» или «инсерция» означает добавление аминокислотной последовательности в конкретное положение в исходной полипептидной последовательности. Например -233Е или ^233Е означает инсерция глутаминовой кислоты после положения 233 и перед положением 234. Кроме того, -233ADE или ^233ADE означает инсерция AlaAspGlu после положения 233 и перед положением 234.

В настоящем описании термин «делеция аминокислот» или «деления» означает удаление аминокислотной последовательности в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, Е233- или Е233# означает делецию глутаминовой кислоты в положении 233. Кроме того, EDA233- или EDA233# означает делецию последовательности GluAspAla, начинающуюся в положении 233.

В настоящем описании термин «вариантный белок» или «вариант белка», или «вариант» означает белок, отличающийся от исходного белка наличием по меньшей мере одной модификации аминокислоты. Термин «вариант белка» может относиться к самому белку, композиции, содержащей указанный белок, или аминокислотной последовательности, кодирующей его. Предпочтительно вариант белка содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислот по сравнению с исходным белком, например, от примерно одной до примерно десяти модификаций аминокислот, и предпочтительно от примерно одной до примерно пяти модификаций аминокислот по сравнению с исходным белком. В настоящем описании последовательность варианта белка предпочтительно будет обладать по меньшей мере около 80% гомологии с последовательностью исходного белка и более предпочтительно по меньшей мере около 90% гомологии, наиболее более предпочтительно по меньшей мере около 95% гомологии. Термин «вариантный белок» может относиться к самому вариантному белку, композициям, содержащим указанный вариант белка, или последовательности ДНК, кодирующей его. Соответственно, в настоящем описании термин «вариант антитела» или «вариантное антитело» означает антитело, отличающееся от исходного антитела наличием по меньшей мере одной модификации аминокислоты, термин «вариант IgG» или «вариантный IgG» означает антитело, отличающееся от исходного IgG наличием по меньшей мере одной модификации аминокислоты и термин «вариант иммуноглобулина» или «вариантный иммуноглобулин» означает последовательность иммуноглобулина, отличающуюся от исходной последовательности иммуноглобулина наличием по меньшей мере одной модификации аминокислоты. В настоящем описании термин «Fc-вариант» или «Fc-вариантный» означает белок, содержащий модификацию в домене Fc. Fc-варианты согласно настоящему изобретению определены в соответствии с модификациями аминокислот, которые они содержат. Таким образом, например, I332E представляет собой Fc-вариант, содержащий замену I332E относительно исходного полипептида Fc. Аналогичным образом, S239D/I332E/G236A определяет Fc-вариант, содержащий замены S239D, I332E и G236A относительно исходного полипептида Fc. Идентичность аминокислоты дикого типа может быть не определена и в этом случае вышеуказанный вариант обозначается 239D/332E/236A. Отмечают, что порядок, в котором предложены замены, является произвольным, т.е., например, S239D/I332E/G236A представляет собой тот же Fc-вариант, что и G236A/S239D/I332E и т.д. Для всех положений, описанных согласно настоящему изобретению, нумерация приведена согласно индексу EU или схеме нумерации EU (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, тем самым полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Термин «индекс EU» или «индекс EU согласно Kabat», или «схема нумерации EU» относится к нумерации антитела EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, тем самым полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Модификация может представлять собой добавление, делецию или замену. Замены могут включать встречающиеся в природе аминокислоты и не встречающиеся в природе аминокислоты. Варианты могут содержать неприродные аминокислоты. Примеры включают US 6586207; WO 98/48032; WO 03/073238; US 2004-0214988 A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J.W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J.W. Chin, & P.G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J.W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; and, L. Wang, & P.G. Schultz, (2002), Chem. 1-10, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

В настоящем описании термин «белок» означает по меньшей мере две ковалентно присоединенные аминокислоты, при этом указанный термин включает белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Пептидильная группа может содержать встречающиеся в природе аминокислоты и пептидные связи или синтетические пептидомиметические структуры, т.е. «аналоги», такие как пептоиды (см. Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992), который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки). Аминокислоты могут быть либо встречающимися в природе, либо не встречающимися в природе, что очевидно для специалистов в данной области техники. Например, гомофенилаланин, цитруллин и норлейцин считаются аминокислотами для целей настоящего изобретения и могут быть использованы аминокислоты как D-, так и L- (R или S) конфигураций. Варианты согласно настоящему изобретению могут содержать модификации, включающие использование неприродных аминокислот с использованием, например, технологий, разработанных Schultz и коллегами, включая, без ограничения, способы, описанные Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3 и Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Кроме того, полипептиды могут включать синтетическую дериватизацию одной или нескольких боковых цепей или терминалов, гликозилирование, пегилирование (PEGylation), циклическую перестановку, циклизацию, линкеры для соединения с другими молекулами, гибридизацию в белки или домены белков и добавление пептидных тегов или меток.

В настоящем описании термин «остаток» означает положение в белке и связанную аминокислотную идентичность. Например, Аспарагин 297 (также обозначаемый Asn297, также обозначаемый N297) представляет собой остаток в антителе IgG1 человека.

В настоящем описании термин «Fab» или «область Fab» означает полипептид, содержащий домены VH, CH1, VL и CL иммуноглобулина. Термин «Fab» может относиться к данной области отдельно или в контексте полноразмерного антитела, фрагмента антитела или гибридного белка Fab.

В настоящем описании термин «модификация подкласса IgG» означает модификацию аминокислот, превращающую одну аминокислоту одного изотипа IgG в соответствующую аминокислоту другого, изотипа ряда IgG. Например, т.к. IgG1 содержит тирозин, a IgG2 содержит фенилаланин в положении EU 296, замена F296Y в IgG2 считают модификацией подкласса IgG.

В настоящем описании термин «не встречающаяся в природе модификация» означает модификацию аминокислот, которая не является изотипической. Например, т.к. ни один из IgGs не содержит глутаминовую кислоту в положении 332, замену I332E в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 считают не встречающейся в природе модификацией.

В настоящем описании термины «аминокислота» и «идентичность аминокислоты» означают одну из 20 встречающихся в природе аминокислот или любые неприродные аналоги, которые могут присутствовать в конкретном, определенном положении.

В настоящем описании термин «эффекторная функция» означает биохимическую реакцию, являющуюся следствием взаимодействия области Fc антитела с рецептором или лигандом Fc. Эффекторные функции включают без ограничения ADCC, ADCP и CDC.

В настоящем описании термин «эффекторная клетка» означает клетку иммунной системы, экспрессирующую один или несколько рецепторов Fc и опосредующую одну или несколько эффекторных функций. Эффекторные клетки включают без ограничения моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В-клетки, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, естественные киллерные (ЕК) клетки и Т-клетки и могут происходить из любого организма, включая без ограничения, людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян.

В настоящем описании термин «лиганд Fc IgG» означает молекулу, предпочтительно полипептид, происходящую из любого организма, которая связывается с областью Fc антитела IgG с образованием комплекса Fc/лиганд Fc. Лиганды Fc включают без ограничения Fc RI, Fc RII, Fc RIII, FcRn, C1q, С3, маннан-связывающий лектин, маннозный рецептор, стафилококковый белок А, стрептококковый белок G и вирусный Fc R. Лиганды Fc также включают гомологи рецептора Fc (FcRH), которые представляют собой семейство рецепторов Fc, гомологичных Fc R (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Лиганды Fc могут включать неисследованные молекулы, связывающие Fc. Конкретные лиганды Fc IgG представляют собой FcRn и гамма рецепторы Fc. В настоящем описании термин «лиганд Fc» означает молекулу, предпочтительно полипептид, происходящую из любого организма, которая связывается с областью Fc антитела с образованием комплекса Fc/лиганд Fc.

В настоящем описании термин «Fc-рецептор гамма», «Fc R» или «FсгаммаR» означает любой член семейства белков, который связывается с областью Fc антитела IgG и кодируется геном Fc R. У людей данное семейство включает без ограничения Fc RI (CD64), включая изоформы Fc RIa, Fc RIb и Fc RIc; Fc RII (CD32), включая изоформы Fc RIIa (включая аллотипы Н131 и R131), Fc RIIb (включая Fc RIIb-1 и Fc RIIb-2) и Fc RIIc; и Fc RIII (CD 16), включая изоформы Fc RIIIa (включая аллотипы V158 и F158)и Fc RIIIb (включая аллотипы Fc RIIIb-NA1 и Fc RIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), а также любые неисследованные изоформы Fc Rs или Fc R или аллотипы человека. Fc R может происходить из любого организма, включая без ограничения людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. Fc Rs мыши включают без ограничения Fc RI (CD64), Fc RII (CD32), Fc RIII (CD 16) и Fc RIII-2 (CD 16-2), а также любые неисследованные мышиные Fc R или изоформы или аллотипы Fc R.

В настоящем описании термин «FcRn» или «неонатальный рецептор Fc» означает белок, который связывается с областью Fc антитела IgG и по меньшей мере частично кодируется геном FcRn. FcRn может происходить из любого организма, включая без ограничения людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. Как известно в данной области техники, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто называющихся «тяжелой цепью» и «легкой цепью». Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, а тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если в настоящем описании не указано иное, термин «FcRn» или «белок FcRn» относится к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином. Последовательности FcRn, в частности людей, представляющие особый интерес, показаны на фигурах.

В настоящем описании термин «исходный полипептид» означает немодифицированный пептид, который затем модифицируют с получением варианта. Исходный полипептид может представлять собой встречающийся в природе полипептид или вариант, или созданную версию встречающегося в природе полипептида. Термин «исходный полипептид» может относиться к самому полипептиду, композициям, содержащим указанный исходный полипептид, или аминокислотной последовательности, кодирующей его. Соответственно, в настоящем описании термин «исходный иммуноглобулин» означает немодифицированный пептид иммуноглобулина, который модифицируют с получением варианта, а термин «исходное антитело» означает немодифицированное антитело, которое модифицируют с получением вариантного антитела. Следует отметить, что термин «исходное антитело» включает известные коммерчески доступные, полученные рекомбинантными способами антитела, как указано ниже.

В настоящем описании термин «положение» означает место в последовательности белка. Положения могут быть пронумерованы по порядку или в соответствии с установленной схемой, например, индексом EU, как у Kabat. Например, положение 297 представляет собой положение в антителе IgG1 человека.

В настоящем описании термин «антиген-мишень» означает молекулу, специфически связанную вариабельной областью указанного антитела. Антиген-мишень может представлять собой белок, углевод, липид или другое химическое соединение.

В настоящем описании термин «клетка-мишень» означает клетку, экспрессирующую антиген-мишень.

В настоящем описании термин «вариабельная область» означает область иммуноглобулина, которая содержит один или несколько доменов иммуноглобулина, по существу кодируемых любым из генов V , V и/или VH, составляющих каппа, лямбда локусы и генетические локусы тяжелых цепей иммуноглобулина соответственно.

В настоящем описании термин «дикий тип, или WT» означает аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе, включая аллельные вариации. Белок дикого типа содержит аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которую целенаправленно не модифицировали.

Настоящее изобретение относится к антителам, демонстрирующим модулированное связывание с FcRn (модуляция, включающая увеличенное, а также уменьшенное связывание). Например, в ряде случаев увеличенное связывание приводит к клеточной рециркуляции антитела, и, следовательно, к увеличенному времени полужизни, например для терапевтических антител. В качестве альтернативы, уменьшенное связывание FcRn необходимо, например, для диагностических антител или терапевтических антител, содержащих радиоактивные метки. Кроме того, антитела, демонстрирующие увеличенное связывание с FcRn и измененное связывание с другими рецепторами Fc, например Fc R, находят применение согласно настоящему изобретению. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены антитела.

Антитела

Настоящее изобретение относится к антителам, которые содержат модификации аминокислот, модулирующие связывание с FcRn. Особый интерес представляют антитела, минимально содержащие область Fc или ее функциональный вариант, демонстрирующий повышенную аффинность к связыванию с FcRn при пониженном значении pH и по существу не демонстрирующий измененное связывание при более высоком значении pH.

Традиционные структурные единицы антитела, как правило, содержат тетрамер. Каждый тетрамер, как правило, состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара содержит одну «легкую» (как правило, имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (как правило, имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа). Легкие цепи человека делят на каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи делят на мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и они определяют изотип антитела IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включая без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включая без ограничения IgM1 и IgM2. Таким образом, в настоящем описании термин «изотип» означает любой из подклассов иммуноглобулинов, определяемый химическими и антигенными свойствами своих константных областей. Известные изотипы иммуноглобулина человека представляют собой IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD и IgE.

Аминотерминальный участок каждой цепи содержит вариабельную область, состоящую из примерно 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственную за распознавание антигена. В вариабельной области три петли соединены для каждого из V-доменов тяжелой цепи и легкой цепи с образованием антигенсвязывающего центра. Каждая из петель называется гипервариабельным участком (далее обозначаемым как «CDR»), в котором вариация аминокислотной последовательности имеет наибольшее значение.

Карбокситерминальный участок каждой цепи определяет константную область, главным образом ответственную за эффекторную функцию. Kabat et al. получили многочисленные первичные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. Исходя из степени консервативности указанных последовательностей, они классифицировали индивидуальные первичные последовательности на CDR и каркасные области и составили их список (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.A. Kabat et al., который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки).

В подклассе IgG иммуноглобулинов существуют несколько доменов иммуноглобулина в тяжелой цепи. В настоящем описании термин «домен иммуноглобулина (Ig)» означает область иммуноглобулина, имеющую отличающуюся третичную структуру. Согласно настоящему изобретению интерес представляют домены тяжелых цепей, включая константные тяжелые (СН) домены и шарнирные домены. В контексте антител IgG каждый изотип IgG содержит три области СН. Соответственно, домены «СН» в контексте IgG являются следующими: «СН1» относится к положениям 118-220 согласно индексу EU, как у Kabat. «CH2» относится к положениям 237-340 согласно индексу EU, как у Kabat и «СН3» относится к положениям 341-447 согласно индексу EU, как у Kabat.

Другой тип домена Ig тяжелой цепи представляет собой шарнирную область. В настоящем описании термин «шарнир» или «шарнирная область», или «шарнирная область антитела», или «шарнирная область иммуноглобулина» означает гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константным доменом антитела. Структурно, домен СН1 IgG заканчивается в положении EU 220, а домен CH2 IgG начинается положении EU остатка 237. Таким образом, для IgG шарнир антитела в настоящем описании включает положения 221 (D221 в IgG1) - 236 (G236 в IgG1), при этом нумерация приведена согласно индексу EU, как у Kabat. В некоторых вариантах осуществления, например в контексте области Fc, включен нижний шарнир, при этом термин «нижний шарнир» в целом относится к положениям 226 или 230.

Особый интерес согласно настоящему изобретению представляют области Fc. В настоящем описании термин «Fc» или «область Fc» означает полипептид, содержащий константную область антитела за исключением первого иммуноглобулинового домена константной области, и в некоторых случаях часть шарнира. Таким образом, термин «Fc» относится к последним двум иммуноглобулиновым доменам IgA, IgD и IgG константной области, последним трем иммуноглобулиновым доменам IgE и IgM константной области и гибкому шарниру, N-концевому по отношению к указанным доменам. Для IgA и IgM, Fc может содержать цепь J. Для IgG, как изображено на фиг.1, Fc содержит домены иммуноглобулина Сгамма2 и Сгамма3 (Cg2 и Cg3) и низшую шарнирную область между Сгамма1 (Cg1) и Сгамма2 (Cg2). Несмотря на то, что границы области Fc могут варьироваться, область Fc тяжелой цепи IgG человека, как правило, включает остатки С226 или Р230 относительно карбоксильного терминала, при этом нумерация приведена согласно индексу EU, как у Kabat. Термин «Fc» может относиться к данной области отдельно или в контексте полипептида Fc, как описано ниже. В настоящем описании термин «полипептид Fc» означает полипептид, содержащий всю область Fc или ее часть. Полипептиды Fc включают антитела, слитые с Fc белки, выделенные области Fc и фрагменты Fc.

В некоторых вариантах осуществления антитела являются полноразмерными. В настоящем описании термин «полноразмерное антитело» означает структуру, которая формирует природную биологическую форму антитела, включая вариабельные и константные области, содержащие одну или несколько модификаций, как указано в настоящем описании.

В качестве альтернативы, антитела могут представлять собой множество структур, включая без ограничения фрагменты антител, моноклональные антитела, биспецифические антитела, миниантитела, доменные антитела, синтетические антитела (иногда называющиеся в настоящем описании «миметиками антител»), химерные антитела, гуманизированные антитела, гибриды антител (иногда называющиеся в настоящем описании «конъюгатами антител») и фрагменты каждого из указанных соответственно.

Фрагменты антител

В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела. Особый интерес представляют антитела, содержащие области Fc, слитые с Fc белки и константную область тяжелой цепи (СН1-шарнир-СН2-СН3), также включая гибриды константной области тяжелой цепи.

Конкретные фрагменты антитела включают без ограничения (i) фрагмент Fab, содержащий домены VL, VH, CL и СН1, (ii) фрагмент Fd, содержащий домены VH и СН1, (iii) фрагмент Fv, содержащий домены VL и VH одного антитела; (iv) фрагмент dAb (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), содержащий одну вариабельную область, (v) выделенные области CDR, (vi) фрагменты F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два связанных фрагмента Fab (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), в которых домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, позволяющим двум указанным доменам ассоциироваться с образованием антигенсвязывающего центра (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки), (viii) биспецифический одноцепочечный Fv (WO 03/11161, тем самым полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) и (ix) «диатела» или «триатела», поливалентные или полиспецифические фрагменты, полученные путем слияния генов (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO 94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Фрагменты антитела могут быть модифицированы. Например, молекулы могут быть стабилизированы путем введения дисульфидных мостиков, связывающих домены VH и VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых вариантах осуществления каркасные компоненты могут представлять собой смесь разных видов. Поэтому, если белок представляет собой антитело, такое антитело может представлять собой химерное антитело и/или гуманизированное антитело. В целом, термин как «химерные антитела», так и «гуманизированные антитела» относится к антителам, содержащим комбинированные области более чем одного вида. Например, «химерные антитела» традиционно содержат вариабельную область (области) мыши (или крысы в некоторых случаях) и константную область (области) человека. Термин «гуманизированные антитела» в целом относится к антителам нечеловеческого происхождения, содержащим каркасные области вариабельного домена, замененные на последовательности, встречающиеся в антителах человека. В целом, в гуманизированном антителе антитело полностью, за исключением CDR, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или является идентичным такому антителу, за исключением CDR. Области CDR, некоторые или все из которых кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими из нечеловеческого организма, трансплантируют в каркас бета-складчатого слоя вариабельной области антитела человека с получением антитела, специфичность которого определяется внедренными CDR. Получение таких антител описано, например, в WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. «Обратная мутация» выбранных акцепторных остатков каркаса в соответствующие донорные остатки часто необходима для восстановления аффинности, утраченной в исходной трансплантированной конструкции (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). В оптимальном варианте гуманизированное антитело также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, как правило иммуноглобулина человека, и таким образом будет содержать область Fc человека. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием мышей с иммунной системой, созданной методами генной инженерии. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки. Множество технологий и способов гуманизации и реконструирования антител нечеловеческого происхождения хорошо известны в данной области техники (См. Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of В Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) и приведенные там ссылки, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки). Способы гуманизации включают без ограничения способы, описанные в Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей антител нечеловеческого происхождения могут включать способы восстановления поверхности, например, как описано в Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки. В одном из вариантов осуществления исходное антитело подвергали созреванию аффинности, как известно в данной области техники. Способы, основанные на структуре, могут быть использованы для гуманизации и созревания аффинности, например, как описано в USSN 11/004590. Способы, основанные на выборе, могут быть использованы для гуманизации и/или созревания аффинности вариабельных областей антитела, включая без ограничения способы, описанные в Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37):22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Другие способы гуманизации могут включать трансплантацию только частей CDRs, включая без ограничения способы, описанные в USSN 09/810510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

Биспецифические антитела

В одном из вариантов осуществления антитела согласно настоящему изобретению включают полиспецифическое антитело и в частности биспецифическое антитело, также иногда называющееся «диателом». Указанные антитела представляют собой антитела, связывающиеся с двумя (или более) различными антигенами. Диатела могут быть получены множеством способов, известных в данной области техники (Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), например, получены химически или из межвидовых гибридом.

Миниантитела

В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой миниантитело. Миниантитела представляют собой минимизированные подобные антителам белки, содержащие scFv, соединенный с доменом СН3. Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки. В некоторых случаях scFv может быть связан с областью Fc и может включать некоторую часть или всю шарнирную область.

Антитела человека

В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело полностью человеческого происхождения, содержащее по меньшей мере одну модификацию, как указано в настоящем описании. Термин «антитело полностью человеческого происхождения» относится к антителу человека, содержащему последовательность генов антитела, полученную из хромосомы человека с модификациями, указанными в настоящем описании.

Слитые антитела

В одном из вариантов осуществления антитела согласно настоящему изобретению представляют собой слитые с антителом белки (иногда называющиеся в настоящем описании «конъюгатами антител»). Один из видов гибридов антител содержит слитые с Fc белки, которые объединяют область Fc с «партнером» по конъюгации. В настоящем описании термин «слитый с Fc белок» означает белок, в котором один или несколько полипептидов функционально связаны с областью Fc. В настоящем описании термин «слитый с Fc белок» является синонимом терминов «иммуноадгезин», «гибрид Ig», «химера Ig» и «рецепторный глобулин» (иногда через черточку), используемых в известном уровне техники (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Слитый с Fc белок объединяет область Fc иммуноглобулина с «партнером» по слиянию, который в целом может представлять собой любой белок или небольшую молекулу. В действительности любой белок или небольшая молекула может быть связана с Fc с получением слитого с Fc белка. Белковые «партнеры» по слиянию могут включать без ограничения вариабельную область любого антитела, область рецептора для связывания с мишенью, адгезивную молекулу, лиганд, фермент, цитокин, хемокин или некоторый другой белок или домен белка. «Партнеры» по слиянию, представляющие небольшие молекулы, могут включать любой терапевтический агент, который направляет слитый с Fc белок к мишени, для терапевтического воздействия. Такие мишени могут представлять собой любую молекулу, предпочтительно внеклеточный рецептор, которая вовлечена в заболевание. Таким образом, варианты IgG могут быть соединены с одним или несколькими «партнерами» по слиянию. В одном из альтернативных вариантов осуществления вариант IgG конъюгируют или функционально связывают с другим терапевтическим соединением. Терапевтическое соединение может представлять собой цитотоксический агент, химиотерапевтический агент, токсин, радиоизотоп, цитокин или другой терапевтически активный агент. IgG может быть связан с одним из множества небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

Помимо слитых с Fc белков слитые антитела включают константную область тяжелой цепи, слитую с одним или несколькими «партнерами» по слиянию (включая вариабельную область любого антитела), в то время как другие слитые антитела представляют собой по существу или полностью полноразмерные антитела с «партнерами» по слиянию. В одном из вариантов осуществления роль «партнера» по слиянию заключается в опосредовании связывания с мишенью и таким образом он является функционально аналогичным вариабельным областям антитела (и фактически может быть). В действительности любой белок или небольшая молекула может быть соединена с Fc с получением слитого с Fc белка (или слитого антитела). Белковые «партнеры» по слиянию могут включать без ограничения область рецептора для связывания с мишенью, адгезивную молекулу, лиганд, фермент, цитокин, хемокин или некоторый другой белок или домен белка. «Партнеры» по слиянию, представляющие небольшие молекулы, могут включать любой терапевтический агент, который направляет слитый с Fc белок к мишени для терапевтического воздействия. Такие мишени могут представлять собой любую молекулу, предпочтительно внеклеточный рецептор, которая вовлечена в заболевание.

«Партнер» по конъюгации может быть белковым или небелковым; последний обычно получают с использованием функциональных групп антитела и «партнера» по конъюгации. Например, линкеры известны в данной области техники; например, гомо- или гетеробифункциональные линкеры хорошо известны (см. 1994 каталог Pierce Chemical Company, раздел техники, посвященный линкерам, страницы 155-200, который включен в настоящее описание посредством отсылки).

Подходящие конъюгаты включают без ограничения метки, как описано ниже, лекарственные средства и цитотоксические агенты, включая без ограничения цитотоксические лекарственные средства (например, химиотерапевтические агенты) или токсины, или активные фрагменты указанных токсинов. Подходящие токсины и их соответствующие фрагменты включают цепь А дифтерии, цепь А экзотоксина, цепь А рицина, цепь А абрина, курцин, кротин, феномицин, эномицин и т.п. Цитотоксические агенты также включают радиохимические вещества, получаемые путем конъюгирования радиоизотопов с антителами или путем связывания радионуклида с хелатирующим агентом, который был ковалентно присоединен к антителу. В дополнительных вариантах осуществления используют калихимицин, ауристатин, гелданамицин, майтансин и дуокармицин и аналоги; на предмет последнего см. U.S. 2003/0050331 А1, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки.

Ковалентные модификации антител

Ковалентные модификации антител включены в объем настоящего изобретения и обычно, но не всегда их осуществляют посттрансляционно. Например, некоторые виды ковалентных модификаций антитела вводят в молекулу путем осуществления взаимодействия конкретных аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом (используемым для получения производных), который может реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или С-концевыми остатками.

Цистеинильные остатки чаще всего подвергают взаимодействию с -галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Цистеинильные остатки также могут быть дериватизированы посредством реакции с бромтрифторацетоном, -бром- -(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилди сульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлормеркурбензоатом, 2-хлормеркур-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом и т.п.

Гистидильные остатки дериватизируют посредством реакции с диэтилпирокарбонатом при pH 5,5-7,0, т.к. данный агент обладает относительной специфичностью в отношении боковой цепи гистидила. Также подходит пара-бромфенацилбромид; указанную реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при pH 6,0.

Лизинильные и аминотерминальные остатки подвергают взаимодействию с ангидридами янтарной кислоты или других карбоновых кислот. Дериватизация указанными агентами приводит к изменению заряда лизинильных остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации остатков, содержащих альфа-аминогруппу, включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборгидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; O-метилизомочевина; 2,4-пентандион и реакцию с глиоксилатом, катализируемую трансаминазой.

Аргинильные остатки модифицируют посредством реакции с одним или несколькими стандартными реагентами, среди которых находится фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для дериватизации остатков аргинина необходимо осуществлять реакцию в щелочной среде из-за высокого значения pKa гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, данные реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина.

Специфическая модификация тирозильных остатков может быть с особым интересом осуществлена при введении спектральных меток в тирозильные остатки по реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Чаще всего используют N-ацетилимидазол и тетранитрометан с образованием O-ацетилтирозильных соединений и 3-нитропроизводных соответственно. Тирозильные остатки иодируют с применением 125I или 131I с получением меченых белков для использования в радиоиммуноанализе, при этом вышеописанный хлораминовый метод является подходящим.

Боковые карбоксильные группы (аспартила или глутамила) селективно модифицируют посредством реакции с карбодиимидами (R'-N=C=N--R'), где R и R' возможно представляют собой разные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил) карбодиимид или 1-этил-3-(4-азония-4,4-диметилпентил) карбодиимид. Кроме того, аспартильные и глутамильные остатки превращают в аспарагинильные и глутаминильные остатки посредством реакции с ионами аммония.

Дериватизация с помощью бифункциональных агентов подходит для сшивания антител с водонерастворимой вспомогательной матрицей или поверхностью для применения во множестве способов помимо способов, описанных ниже. Широко применяемые сшивающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидные эфиры, например, эфиры 4-азидосалициловой кислоты, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидильные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, образуют фотоактивируемые интермедиатры, которые могут образовывать поперечные связи в присутствии света. В качестве альтернативы, реакционноспособные водонерастворимые матрицы, такие как бромциан-активированные углеводы и реакционноспособные субстраты, описанные в патентах США 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки, применяют для иммобилизации белков.

Глутаминильные и аспарагинильные остатки многократно дезамидируют с образованием соответствующих глутамильных и аспартильных остатков соответственно. В качестве альтернативы, данные остатки дезамидируют в умеренно кислой среде. Любая форма указанных остатков входит в объем настоящего изобретения. Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование -аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Т.Е. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 [1983], полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), ацетилирование N-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.

Гликозилирование

Другой вид ковалентной модификации представляет собой гликозилирование. В другом варианте осуществления варианты IgG, указанные в настоящем описании, могут быть модифицированы и в результате содержать одну или несколько сконструированных гликоформ. В настоящем описании термин «сконструированная гликоформа» означает углеводную композицию, ковалентно присоединенную к IgG, при этом указанная углеводная композиция химически отличается от композиции исходного IgG. Сконструированные гликоформы могут подходить для решения множества задач, включая без ограничения усиление или ослабление эффекторной функции. Сконструированные гликоформы могут быть получены множеством способов, известных в данной области техники (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6602684; USSN 10/277370; USSN 10/113929; PCT WO 00/61739 A1; PCT WO 01/29246 A1; PCT WO 02/31140 A1; PCT WO 02/30954 A1, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки; (технология Potelligent® [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; инженерная технология гликозилирования GlycoMAb® [Glycart Biotechnology AG, Zurich, Switzerland]). Многие из данных технологий основаны на контроле уровня фукозилированных и/или разветвленных олигосахаридов, ковалентно присоединенных к области Fc, например, путем экспрессии IgG в различных организмах или линиях клеток, созданных или иначе полученных (например, клетки СНО Lec-13 или клетки YB2/0 гибридомы крысы), путем регуляции ферментов, включенных в путь гликозилирования (например, FUT8 [ 1,6-фукозилтрансферазы] и/или 1-4-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III [GnTIII]), или путем модификации углевода (углеводов) после экспрессии IgG. Термин «сконструированная гликоформа» как правило относится к другому углеводу или олигосахариду; таким образом, вариант IgG, например, антитело или слитый с Fc белок, может содержать сконструированную гликоформу. В качестве альтернативы, термин «сконструированная гликоформа» может относиться к варианту IgG, содержащему другой углевод или олигосахарид. Как известно в данной области техники, профили гликозилирования могут зависеть как от последовательности белка (например, присутствия или отсутствия конкретных аминокислотных остатков гликозилирования, указанных ниже), так и от клетки-хозяина или организма, в котором образуется белок. Конкретные системы экспрессии указаны ниже.

Гликозилирование пептидов, как правило, является либо N-связанным, либо O-связанным. «N-связанное» относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина, представляют собой последовательности узнавания ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из данных трипептидных последовательностей в полипептиде создает возможный центр гликозилирования. «O-связанное гликозилирование» относится к присоединению одного из сахаров, N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы, к гидроксиаминоки слоте, наиболее часто серину или треонину, хотя 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин также могут быть использованы.

Добавление центров гликозилирования к антителу удобным способом осуществляют путем изменения аминокислотной последовательности, таким образом чтобы она содержала одну или несколько вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных центров гликозилирования). Указанное изменение также может быть осуществлено путем добавления или замены одного или нескольких остатков серина или треонина к исходной последовательности (для O-связанных центров гликозилирования). Для удобства аминокислотную последовательность антитела предпочтительно изменяют посредством изменений в уровне ДНК, в частности путем мутации ДНК, кодирующей целевой полипептид, в предварительно выбранных основаниях, таким образом чтобы образовывались кодоны, которые будут транслироваться в необходимые аминокислоты.

Другой способ увеличения числа углеводных фрагментов антитела представляет собой химическое или ферментативное соединение гликозидов с белком. Данные процедуры обладают преимуществом в том, что они не требуют образования белка в клетке-хозяине, которая способна к гликозилированию в отношении N- и O-свяанного гликозилирования. В зависимости от используемого способа соединения, сахар (сахара) может быть присоединен к (а) аргинину и гистидину, (b) свободным карбоксильным группам, (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, (d) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина, (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глутамина. Указанные способы описаны в WO 87/05330 и в Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

Удаление углеводных фрагментов, присутствующих в исходном антителе, может быть осуществлено химически или ферментативно. Для химического дегликозилирования необходимо подвергать белок воздействию соединения, трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентного соединения. Данное воздействие приводит к распаду большинства или всех Сахаров за исключением связывающего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), в то время как полипептид остается нетронутым. Химическое дегликозилирование описано Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 и Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Ферментативное расщепление углеводных фрагментов в полипептидах может быть осуществлено путем использования множества эндо- и экзогликозидаз, как описано Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки. Гликозилирование в возможных центрах гликозилирования может быть предотвращено путем использования соединения, туникамицина, как описано Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки. Туникамицин блокирует образование белок-N-гликозидных связей.

Другой вид ковалентной модификации антитела включает связывание антитела с различными небелковыми полимерами, включая без ограничения различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, способом, описанным, например, в 2005-2006 Каталоге PEG Nektar Therapeutics (доступном на web-сайте Nektar), патентах США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Кроме того, как известно в данной области техники, замены аминокислот могут быть осуществлены в различных положениях в пределах антитела для облегчения добавления полимеров, таких как PEG. См., например. Публикацию США 2005/0114037 А1, которая полностью включена в настоящее описание посредством отсылки.

Меченые антитела

В некоторых вариантах осуществления ковалентная модификация антител согласно настоящему изобретению включает добавление одной или нескольких меток. В некоторых случаях они рассматриваются как слитые антитела. Термин «группа для мечения» означает любую детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления группу для мечения соединяют с антителом посредством спейсерных групп различной длины с уменьшением возможного стерического несоответствия. Различные способы мечения белков известны в данной области техники и они могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения.

В целом, метки относятся к множеству классов в зависимости от анализа, в котором они детектируются: а) изотопные метки, которые могут представлять собой радиоактивные или тяжелые изотопы; b) магнитные метки (например, магнитные частицы); с) редокс-активные фрагменты; d) оптические красители; ферментные группы (например, пероксидаза хрена, -галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза); е) биотинилированные группы; и f) заранее определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой «молнии», центры связывания для вторичных антител, домены связывания с металлом, эпитопные метки и т.д.). В некоторых вариантах осуществления группу для мечения соединяют с антителом посредством спейсерных групп различной длины с уменьшением возможного стерического несоответствия. Различные способы мечения белков известны в данной области техники и они могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения.

Специфические метки включают оптические красители, включая без ограничения хромофоры, фосфоры и флуорофоры, при этом последние являются специфическими во многих случаях. Флуорофоры могут представлять собой либо флуоресцирующие агенты, представляющие «небольшие молекулы», либо белковые флуоресцирующие агенты.

Термин «флуоресцентная метка» означает любую молекулу, которая может быть обнаружена посредством присущих ей флуоресцентных свойств. Подходящие флуоресцентные метки включают без ограничения флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стильбен, Люцифер желтый, Cascade Blue, Техасский красный, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5,5, LC Red 705, Oregon green, красители Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow и R-фикоэритрин (РЕ) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Родамин и Техасский красный (Pierce, Rockford, IL), Cy 5, Cy 5,5, Cy 7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Подходящие оптические красители, включая флуорофоры, описаны в Molecular Probes Handbook Richard P. Haugland, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки.

Подходящие белковые флуоресцентные метки также включают без ограничения зеленый флуоресцентный белок, включая разновидности зеленого флуоресцентного белка Renilla, Ptilosarcus или Aequorea (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., номер доступа в Genbank U55762), синий флуоресцентный белок (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), «усиленный» желтый флуоресцентный белок (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), люциферазу (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), -галактозидазу (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) и Renilla (WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, Патенты США 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Все вышеуказанные источники в данном абзаце явным образом включены в настоящее описание посредством отсылки.

Варианты IgG

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложены вариантные белки IgG. Варианты IgG по меньшей мере включают фрагмент антитела, содержащий область СН2-СН3 тяжелой цепи. Кроме того, подходящие варианты IgG включают домены Fc (например, включая низшую шарнирную область), а также варианты IgG, содержащие константную область тяжелой цепи (СН1-шарнир-СН2-СН3), также являющиеся подходящими согласно настоящему изобретению, все из которых могут быть слиты с «партнерами» по слиянию.

Вариант IgG содержит одну или несколько модификаций аминокислот по сравнению с исходным полипептидом IgG, в некоторых случаях по сравнению с IgG дикого типа. Вариант IgG может обладать одним или несколькими оптимизированными свойствами. Вариант IgG отличается по своей аминокислотной последовательности от исходного IgG наличием по меньшей мере одной модификации аминокислот. Таким образом, варианты IgG содержат по меньшей мере одну модификацию аминокислот по сравнению с исходным IgG. В качестве альтернативы, варианты IgG могут содержать несколько модификаций аминокислот по сравнению с исходным IgG, например, от примерно одной до пятидесяти модификаций аминокислот, предпочтительно от примерно одной до десяти модификаций аминокислот и наиболее предпочтительно от примерно одной до примерно пяти модификаций аминокислот по сравнению с исходным IgG.

Таким образом, последовательности вариантов IgG и последовательности исходного полипептида Fc по существу являются гомологичными. Например, вариантные последовательности Fc-варианта в настоящем описании будут обладать примерно 80% гомологии с вариантной последовательностью исходного IgG, предпочтительно по меньшей мере примерно 90% гомологии и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 95% гомологии. Модификации могут быть получены методами генной инженерии с использованием молекулярной биологии или могут быть получены ферментативно или химически.

Антигены-мишени для антител

В действительности, на любой антиген можно прицельно воздействовать вариантами IgG, включая без ограничении белки, субъединицы, домены, мотивы и/или эпитопы, относящиеся к следующему перечню антигенов-мишеней, который включает как растворимые факторы, такие как цитокины, так и мембраносвязанные факторы, включая трансмембранные рецепторы: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PCF2a, 8-оксо-dG, Аденозиновый рецептор А1, А33, АСЕ, АСЕ-2, Активин, Активин А, Активин АВ, Активин В, Активин С, Активин RIA, Активин RIA ALK-2, Активин RIB ALK-4, Активин RIIA, Активин RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Addressins, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, альфа-V/бета-1 антагонист, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, АРР, APRIL, AR, ARC, ART, Артемии, анти-Id, ASPARTIC, предсердный натрийуретический фактор, интегрин av/b3, Ax1, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, стимулятор В-лимфоцитов (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенин BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, BOK, Бомбезин, нейтрофический фактор костей, BPDE, BPDE-ДНК, ВТС, комплементарный фактор 3 (С3), С3а, С4, С5, С5а, С10, СА125, CAD-8, Кальцитонин, цАМФ, карциноэмбриональный антиген (СЕА), карциномный антиген, Катепсин А, Катепсин В, Катепсин C/DPPI, Катепсин D, Катепсин Е, Катепсин Н, Катепсин L, Катепсин О, Катепсин S, Катепсин V, Катепсин X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белки р67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, цГМФ, CINC, токсин Clostridium botulinum, токсин Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, опухолеассоциированный антиген цитокератина, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, фактор ускорения распада, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксин, DNAM-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, эндотелиновый рецептор, Энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин1, ЕрСАМ, Эфрин В2/ EphB4, EPO, ERCC, Е-селектин, ET-1, Фактор IIa, Фактор VII, Фактор VIIIc, Фактор IX, белок-активатор фибробластов (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, Ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, Фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, Фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (Миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа1, GFR-альфа2, GFR-альфа3, GITR, Глюкагон, Глют 4, гликопротеин IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, фактор, высвобождающий гормон роста, Гаптен (NP-cap или NIP-cap), HB-EGF, НСС, гликопротеин gB оболочки HCMV, гликопротеин gH оболочки HCMV, HCMV UL, гемопоэтический фактор роста (HGF), Hep В gp120, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеин gD HSV, HGFA, высокомолекулярный меланома-ассоциированный антиген (HMW-MAA), HIV gp120, V3 петля gp 120 HIV IIIB, HLA, HLA-DR, HM 1,24, HMFG PEM, HRG, Hrk, кардиальный миозин человека, цитомегаловирус человека (HCMV), гормон роста человека (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептор IgA, IgE, IGF, связывающие белки IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, интерферон (INF)-альфа, INF-бета, INF-гамма, Ингибин, iNOS, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин альфа2, интегрин альфа3, интегрин альфа4, интегрин альфа4/бета, интегрин альфа4/бета7, интегрин альфа5 (альфаV), интегрин альфа5/бета1, интегрин альфа5/бета3, интегрин альфа6, интегрин бета1, интегрин бета2, интерферон гамма, IP-10, I-TAC, JE, Калликреин 2, Калликреин 5, Калликреин 6, Калликреин 11, Калликреин 12, Калликреин 14, Калликреин 15, Калликреин L1, Калликреин L2, Калликреин L3, Калликреин L4, KC, KDR, кератиноцитарный фактор роста (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), Латентный TGF-1, Латентный TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антиген Льюиса-Y, родственный антиген Льюиса-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеины, LIX, LKN, Lptn, L-Селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, сурфактант легких, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина-бета, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, МСАМ, МСАМ, MCK-2, МСР, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептор MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, ММАС1, ММР, ММР-1, ММР-10, ММР-11, ММР-12, ММР-13, ММР-14, ММР-15, ММР-2, ММР-24, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцин (Mucl), MUC18, ингибирующее вещество Мюллера, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-Кадгерин, NCA 90, NCAM, NCAM, Неприлизин, Нейротрофин-3, -4 или -6, Нейротурин, фактор роста нервов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, Паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-Кадгерин, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, РЕМ, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, плацентарная щелочная фосфатаза (PLAP), P1GF, PLP, PP14, Проинсулин, Прорелаксин, Белок С, PS, PSA, PSCA, простата-специфический мембранный антиген (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, А-цепь Релаксина, В-цепь Релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Ревматоидные факторы, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, СЕРИН, Сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (опухоль-ассоциированный гликопротеин-72), TARC, TCA-3, рецепторы Т-клеток (например, рецептор альфа/бета Т-клеток), TdT, TECK, ТЕМ1, ТЕМ5, ТЕМ7, ТЕМ8, TERT, тестикулярная PLAP-подобная щелочная фосфатаза, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, полиспецифический TGF-бета, TGF-бета RI (ALK-5), TGF-бета RII, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета, TGF-бета 2, TGF-бета3, ТСР-бета4, ТСР-бета5, Тромбин, Тимусный Ck-1, Тиреостимулирующий гормон, Tie, TIMP, TIQ, Тканевый фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа бета, TNF-бета2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 Лиганд, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK Лиганд ODF, OPG Лиганд), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 Лиганд, DR3 Лиганд), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM Лиганд, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR Лиганд AITR Лиганд, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectin, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 Лиганд gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 Лиганд CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas Лиганд Аро-1 Лиганд, АРТ1 Лиганд), TNFSF7 (CD27 Лиганд CD70), TNFSF8 (CD30 Лиганд CD153), TNFSF9 (4-1BB Лиганд CD137 Лиганд), ТР-1, t-РА, Тро, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, опухолеассоциированный антиген СА 125, опухолеассоциированный антиген, экспрессирующий родственный Льюс-Y углевод, TWEAK, ТХВ2, Ung, uPAR, uPAR-1, Урокиназа, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Кадгерин, VE-кадгерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, Вирусные антигены, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрин VNR, фактор фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD и рецепторы гормонов и факторов роста.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что вышеуказанный перечень мишеней относится не только к конкретным белкам и биомолекулам, но и к биохимическому пути или путям, включающим их. Например, при ссылке на CTLA-4 как на антиген-мишень предполагают, что лиганды и рецепторы, которые составляют костимулирующий путь Т-клеток, включая CTLA-4, В7-1, В7-2, CD28 и любые другие неисследованные лиганды или рецепторы, связывающиеся с данными белками, также представляют собой мишени. Таким образом, в настоящем описании термин «мишень» относится не только к конкретной биомолекуле, но и к набору белков, взаимодействующих с указанной мишенью и к участникам биохимического пути, к которому относится указанная мишень. Для специалиста в данной области техники также очевидно, что любой их вышеуказанных антигенов-мишеней, лигандов или рецепторов, которые с ними связываются, или других участников соответствующего биохимического пути может быть функционально связан с Fc-вариантами согласно настоящему изобретению с образованием слитого с Fc белка. Таким образом, например, слитый с Fc белок, прицельно воздействующий на EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), может быть создан путем функционального связывания Fc-варианта с EGF, TGF-b или любым другим лигандом, исследованным или неисследованным, который связывается с EGFR. Соответственно, Fc-вариант согласно настоящему изобретению может быть функционально связан с EGFR с образованием слитого с Fc белка, связывающегося с EGF, TGF-b или любым другим лигандом, исследованным или неисследованным, который связывается с EGFR. Таким образом, в действительности любой полипептид, как лиганд, рецептор, так и некоторый другой белок или домен белка, включая без ограничения вышеуказанные мишени и белки, составляющие соответствующие биохимические пути, могут быть функционально связаны с Fc-вариантами согласно настоящему изобретению с образованием слитого с Fc белка.

Выбор подходящего антигена зависит от области применения. Для противоракового лечения необходима мишень, экспрессия которой ограничена раковыми клетками. Некоторые мишени, которые как доказано особенно поддаются терапии антителами, представляют собой мишени, обладающие сигнальными функциями. Другие терапевтические антитела оказывают свое действие путем блокирования передачи сигнала рецептором посредством ингибирования связывания рецептора с родственным ему лигандом. Другой механизм действия терапевтических антител заключается в том, что они вызывают понижающую (отрицательную) регуляцию рецептора. Другие антитела действуют не путем передачи сигнала посредством их антигена-мишени. В некоторых случаях используют антитела, направленные против возбудителей инфекционных заболеваний.

В одном из вариантов осуществления Fc-варианты согласно настоящему изобретению включены в антитело к цитокину. В качестве альтернативы, Fc-варианты подвергают слиянию или конъюгируют с цитокином. В настоящем описании термин «цитокин» представляет собой общий термин для белков, высвобождаемых одной клеточной популяцией, которые действуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов. Например, как описано в Penichet et al., 2001, J Immunol Methods 248:91-101, который явным образом включен в настоящее описание посредством отсылки, цитокины могут быть соединены с антителом с получением ряда необходимых свойств. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные полипептидные гормоны. Цитокины включают гормон роста такой, как гормон роста человека; N-метионил гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин, инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); печеночный фактор роста; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор-альфа и -бета некроза опухолей; ингибирующее вещество Мюллера; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов, такие как NGF-бета; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF) такие, как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальный CSF (GM-CSF) и гранулоцитарный-CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1альфа, IL-2, IL-g, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; фактор некроза опухолей, такой как TNF-альфа или TNF-бета; С5а; и другие полипептидные факторы, включая LIF и kit-лиганд (KL). В настоящем описании термин «цитокин» включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов, содержащих нативные последовательности.

Цитокины и растворимые мишени, такие как члены суперсемейства TNF, представляют собой предпочтительные мишени для использования совместно с вариантами согласно настоящему изобретению. Например, антитела анти-VEGF, анти-CTLA-4 и анти-TNF или фрагменты указанных антител представляют собой антитела, которые особенно подходят для использования Fc-вариантов, увеличивающих связывание FcRn. Лекарственные средства против данных мишеней часто используют в лечении аутоиммунных заболеваний, при этом необходимы многочисленные инъекции в течение длительных периодов времени. Следовательно, более продолжительное время полужизни в сыворотке и менее частые курсы лечения, обусловленные вариантами согласно настоящему изобретению, являются наиболее предпочтительными.

Fc-варианты согласно настоящему изобретению могут быть полезны для ряда антител и слитых с Fc белков, разрешенных для применения, в клинических исследованиях или в разработке. В настоящем описании указанные антитела и слитые с Fc белки называются «клиническими продуктами и кандидатами». Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут найти применение в ряде клинических продуктов и кандидатов. Например, полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут быть полезны для ряда антител, прицельно воздействующих на CD20. Например, полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут найти применение в антителе, которое по существу сходно с ритуксимабом (Ритуксан®, IDEC/Genentech/Roche) (см., например US 5736137), химерном антителом анти-CD20, разрешенным для лечения неходжкинской лимфомы; HuMax-CD20, анти-CD20, разрабатываемом в настоящее время Genmab, антителе анти-CD20, описанным в US 5500362, АМЕ-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) и PRO70769 (PCT/US2003/040426, под названием "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof). Полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут быть полезны для ряда антител, прицельно воздействующих на членов семейства рецепторов эпидермального фактора роста, включая EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4). Например, полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут найти применение в антителе, которое по существу сходно с трастузумабом (trastuzumab) (Герцептин® (Herceptin®), Genentech) (см., например, US 5677171), гуманизированном антителом анти-Her2/neu, разрешенным для лечения рака груди; пертузумабе (pertuzumab) (rhuMab-2C4, Omnitarg ), разрабатываемом в настоящее время Genmab; антителе анти-Her2, описанным в US 4753894; цетуксимабе (cetuximab) (Эрбитукс® (Erbitux®), Imclone) (US 4943533; PCT WO 96/40210), химерном антителе анти-EGFR в клиническим исследованиях для множества раковых опухолей, ABX-EGF (US 6235883), разрабатываемом в настоящее время Abgenix-Immunex-Amgen; HuMax-EGFr (USSN 10/172317), разрабатываемом в настоящее время Genmab; 425, EMD55900, EMD62000 и EMD72000 (Merck KGaA) (US 5558864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3): 129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centre de Immunologia Molecular, Cuba (US 5891996; US 6506883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, (National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); и SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138). В другом предпочтительном варианте осуществления полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут найти применение в алемтузумабе (Кэмпас® (Campath®), Millenium), гуманизированном моноклональном антителе, в настоящее время разрешенном для лечения В-клеточного хронического лимфолейкоза. Полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут найти применение во множестве антител или слитых с Fc белков, которые по существу сходны с другими клиническими продуктами и кандидатами, включая без ограничения муромонаб-CD3 (muromonab-CD3) (Orthoclone OKT3®), антитело анти-CD3, разработанное Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ибритумомаб тиуксетан (Зевалин®) (ibritumomab tiuxetan, Zevalin®), антитело анти-CD20, разработанное IDEC/Schering AG, гемтузумаб озогамицин (Милотарг®) (gemtuzumab ozogamicin, Mylotarg®), антитело анти-CD33 (белок р67), разработанное Celltech/Wyeth, алефацепт (Амевив®) (alefacept, Amevive®), слитый с Fc белок анти-LFA-3, разработанный Biogen, абциксимаб (РеоПро®) (abciximab, ReoPro®), разработанный Centocor/Lilly, базиликсимаб (Симулект®) (basiliximab, Simulect®), разработанный Novartis, паливизумаб (Синагис®) (palivizumab, Synagis®), разработанный MedImmune, инфликсимаб (Ремикейд®) (infliximab, Remicade®), антитело анти-ТNFальфа, разработанное Centocor, адалимумаб (Хумира®) (adalimumab, Humira®), антитело анти-ТNFальфа, разработанное Abbott, Humicade , антитело анти-ТNFальфа, разработанное Celltech, этанерцепт (Энбрел®) (etanercept, Enbrel®), слитый с Fc белок анти-ТNFальфа, разработанный Immunex/Amgen, ABX-CBL, антитело анти-CD147, разрабатываемое Abgenix, ABX-IL8, антитело анти-IL8, разрабатываемое Abgenix, ABX-MA1, антитело анти-MUC18, разрабатываемое Abgenix, Пемтумомаб (Pemtumomab) (R1549, 90Y-muHMFG1), анти-MUC1, разрабатываемое Antisoma, Therex (R1550), антитело анти-MUC1, разрабатываемое Antisoma, AngioMab (AS 1405), разрабатываемый Antisoma, HuBC-1, разрабатываемый Antisoma, Тиоплатин (Thioplatin) (AS1407), разрабатываемый Antisoma, Antegren® (натализумаб) (Антегрен®, natalizumab), антитело анти-альфа-4-бета-1 (VLA-4) и альфа-4-бета-7, разрабатываемое Biogen, VLA-1 mAb, антитело анти-VLA-1 интегрин, разрабатываемое Biogen, LTBR mAb, антитело анти-лимфотоксин бета рецептор (LTBR), разрабатываемое Biogen, CAT-152, антитело анти-TGF- 2, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology, J695, антитело анти-IL-12, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology и Abbott, CAT-192, антитело анти-TGF 1, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology и Genzyme, CAT-213, антитело анти-Eotaxin1, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology, антитело анти-Blys LymphoStat-B , разрабатываемое Cambridge Antibody Technology и Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, антитело анти-TRAIL-R1, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology и Human Genome Sciences, Inc., Авастин (бевацизумаб) (Avastin , bevacizumab, rhuMAb-VEGF), антитело анти-VEGF, разрабатываемое Genentech, антитело семейства анти-HER рецептора, разрабатываемое Genentech, Анти-тканевый фактор (ATF), антитело против тканевого фактора, разрабатываемое Genentech, Ксолар (Омализумаб) (Xolair , Omalizumab), антитело анти-IgE, разрабатываемое Genentech, Раптива (Эфализумаб) (Raptiva , Efalizumab), антитело анти-CD11a, разрабатываемое Genentech и Xoma, антитело MLN-02 (ранее LDP-02), разрабатываемое Genentech and Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, антитело анти-CD4, разрабатываемое Genmab, HuMax-IL15, антитело анти-IL15, разрабатываемое Genmab и Amgen, HuMax-Inflam, разрабатываемый Genmab и Medarex, HuMax-Cancer, антитело анти-гепараназа I, разрабатываемое Genmab и Medarex и Oxford GcoSciences, HuMax-Lymphoma, разрабатываемый Genmab и Amgen, HuMax-TAC, разрабатываемый Genmab, IDEC-131 и антитело анти-CD40L, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Кленоликсимаб (Clenoliximab)), антитело анти-CD4, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, антитело анти-CD80, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, анти-CD23, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, антитела к фактору миграции макрофагов (MIF), разрабатываемые IDEC Pharmaceuticals, BEC2, антиидиотипическое антитело, разрабатываемое Imclone, IMC-1C11, антитело анти-KDR разрабатываемое Imclone, DC101, антитело анти-flk-1, разрабатываемое Imclone, антитела анти-VE кадгерин, разрабатываемые Imclone, CEA-Cide (лабетузумаб (labetuzumab)), антитело к карциноэмбриональному антигену (СЕА), разрабатываемое Immunomedics, LymphoCide (Эпратузумаб (Epratuzumab)), антитело анти-CD22, разрабатываемое Immunomedics, AFP-Cide, разрабатываемый Immunomedics, MyelomaCide, разрабатываемый Immunomedics, LkoCide, разрабатываемый Immunomedics, ProstaCide, разрабатываемый Immunomedics, MDX-010, антитело анти-CTLA4, разрабатываемое Medarex, MDX-060, антитело анти-CD30, разрабатываемое Medarex, MDX-070, разрабатываемый Medarex, MDX-018, разрабатываемый Medarex, Osidem (IDM-1) и антитело анти-Her2, разрабатываемое Medarex и Immuno-Designed Molecules, HuMax -CD4, антитело анти-CD4, разрабатываемое Medarex и Genmab, HuMax-IL15, антитело анти-IL15, разрабатываемое Medarex и Genmab, CNTO 148, антитело анти-TNF , разрабатываемое Medarex и Centocor/J&J, CNTO 1275, антитело анти-цитокин, разрабатываемое Centocor/J&J, MOR101 и MOR102, антитела (CD54) к молекулам межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), разрабатываемые MorphoSys, MOR201, антитело к рецептору фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3), разрабатываемое MorphoSys, Нувион® (визилизумаб) (Nuvion®, visilizumab), антитело анти-CD3, разрабатываемое Protein Design Labs, HuZAF , антитело анти-гамма интерферон, разрабатываемое Protein Design Labs, Анти- 5 1 Интегрин, разрабатываемый Protein Design Labs, анти-IL-12, разрабатываемое Protein Design Labs, ING-1, антитело анти-Ер-САМ, разрабатываемое Xoma, и MLN01, антитело анти-Бета2 интегрин, разрабатываемое Xoma; все вышеуказанные источники в данном абзаце явным образом включены в настоящее описание посредством отсылки.

Полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут быть включены в вышеуказанные клинические кандидаты и продукты или антитела и слитые с Fc белки, по существу сходные с ними. Полипептиды Fc согласно настоящему изобретению могут быть включены в варианты вышеуказанных клинических кандидатов и продуктов, гуманизированные, подвергнутые созреванию аффинности, созданные или модифицированные каким-либо другим способом.

В одном из вариантов осуществления Полипептиды Fc согласно настоящему изобретению используют для лечения аутоиммунных симптомов, симптомов воспаления или трансплантации. Антигены-мишени и клинические продукты, и кандидаты, подходящие для лечения указанных заболеваний, включают без ограничения антитела анти- 4 7 интегрин, такие как LDP-02, антитела анти-бета2 интегрин, такие как LDP-01, антитела анти-комплемент (С5), такие как 5G 1,1, антитела анти-CD2, такие как BTI-322, MEDI-507, антитела анти-CD3, такие как OKT3, SMART анти-CD3, антитела анти-CD4, такие как IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A, антитела анти-CD11a, антитела анти-CD14, такие как IC14, антитела анти-CD18, антитела анти-CD23, такие как IDEC 152, антитела анти-CD25, такие как Zenapax, антитела анти-CD40L, такие как 5с8, Antova, IDEC-131, антитела анти-CD64, такие как MDX-33, антитела анти-CD80, такие как IDEC-114, антитела анти-CD147, такие как ABX-CBL, антитела анти-Е-селектин, такие как CDP850, антитела анти-gpIIb/IIIa, такие как РеоПро/Абциксимаб, антитела анти-ICAM-3, такие как ICM3, антитела анти-ICE, такие как VX-740, антитела анти-FcR1, такие как MDX-33, антитела анти-IgE, такие как rhuMab-E25, антитела анти-IL-4, такие как SB-240683, антитела анти-IL-5, такие как SB-240563, SCH55700, антитела анти-IL-S, такие как АВХ-IL8, антитела анти-интерферон гамма, антитела анти-TNF (TNF, TNFa, TNFa, TNF-альфа), такие как CDP571, CDP870, D2E7, Инфликсимаб, MAK-195F и антитела анти-VLA-4, такие как Антегрен (Antegren).

Fc-варианты согласно настоящему изобретению, такие как варианты, обладающие увеличенным связыванием с FcRn, могут быть использованы в молекулах ингибиторов TNF с получением улучшенных свойств. Подходящие молекулы ингибиторов TNF включают любую молекулу, ингибирующую действие TNF-альфа у млекопитающего. Подходящие варианты включают слитый с Fc белок Энбрел® (этанерцепт) и антитела Хумира® (адалимумаб) и Ремикейд® (инфликсимаб). Моноклональные антитела (такие как Ремикейд и Хумира), созданные с использованием Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с увеличением связывания FcFn, могут приводить к большей эффективности посредством увеличенного времени полужизни.

В некоторых вариантах осуществления используют антитела к инфекционным заболеваниям. Антитела к эукариотическим клеткам включают антитела, прицельно воздействующие на дрожжевые клетки, включая без ограничения Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis и K. lactis, Pichia guillerimondii и P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe, plasmodium falciparium и Yarrowia lipolytica.

Также подходят антитела к клеткам грибков, включая антигены-мишени, связанные со штаммами Candida, включая среди прочих Candida glabrata, Candida albicans, С.krusei, С.lusitaniae и С.maltosa, а также разновидности Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces и Penicillium.

Антитела, направленные против антигенов-мишеней, связанных с простейшими, включают без ограничения антитела, связанные с Trypanosoma, разновидностями Leishmania, включая Leishmania donovanii;, Plasmodium spp., Pneumocystis carinii, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica и Cyclospora cayetanensis.

Также подходят антитела к прокариотическим антигенам, включая антитела к подходящим бактериям, таким как патогенные и непатогенные прокариоты, включая без ограничения Бациллу, включая Bacillus anthracis; Вибрион, например, V. cholerae; Эшерихию, например, Энтеротоксигенная Е. coli, Шигеллы, например, S. dysenteriae; Сальмонеллу, например, S. typhi; Микробактерии, например, М. tuberculosis, M. leprae; Клостридий, например, С. botulinum, С. tetani, С. difficile, C. perfringens; Коринебактерии, например, С. diphtheriae; Стрептококк, S. pyogenes, S. pneumoniae; Стафилококк, например, S. aureus; Гемофильные бактерии, например, Н. influenzae; Нейссерию, например, N. meningitidis, N. gonorrhoeae; Иерсинии, например, Y. lamblia, Y. pestis, палочки Pseudomonas, например, Р. aeruginosa, P. putida; Хламидию, например, С. trachomatis; Бордетеллы, например, В. pertussis; Трепонему, например, Т. palladium; В. anthracis, Y. pestis, Brucella spp., F. tularensis, B. mallei, B. pseudomallei, B. mallei, B. pseudomallei, C. botulinum, Salmonella spp., SEB V. cholerae toxin B, Е. coli O157:H7, Listeria spp., Trichosporon beigelii, Rhodotorula species, Hansenula anomala, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Listeria sp., Mycoplasma sp. и т.п.

Согласно некоторым аспектам, антитела направлены против вирусных инфекций; данные вирусы включают без ограничения ортомиксовирусы (например, вирус гриппа), парамиксовирусы (например, респираторно-синцитиальный вирус, вирус свинки, вирус кори), аденовирусы, риновирусы, коронавирусы, реовирусы, тогавирусы (например, вирус краснухи), парвовирусы, поксвирусы (например, вирус натуральной оспы, вирус осповакцины), энтеровирусы (например, полиовирус, вирус Коксаки), вирусы гепатита (включая А, В и С), герпесвирусы (например, вирус простого герпеса, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр), ротавирусы, норовирусы, хантавирусы, аренавирусы, рабдовирусы (например, вирус бешенства), ретровирусы (включая ВИЧ, HTLV-I и -II), паповавирусы (например, папилломавирусы), полиомавирусы и пикорнавирусы и т.п.

Оптимизированные свойства вариантов IgG

Согласно настоящей заявке также предложены варианты IgG, оптимизированные для множества терапевтически важных свойств. В настоящем описании вариант IgG, который создают или предполагают для демонстрации одного или нескольких оптимизированных свойств, называется «оптимизированным вариантом IgG». Наиболее предпочтительные свойства, которые могут быть оптимизированы, включают без ограничения повышенную или пониженную аффинность к FcRn и увеличенное или уменьшенное время полужизни in vivo. Подходящие варианты осуществления включают антитела, демонстрирующие повышенную аффинность к связыванию с FcRn при пониженном pH, таком как pH, связанный с эндосомами, например, pH 6,0, в то же время поддерживающие пониженную аффинность при более высоком значении pH, таком как 7,4, чтобы допустить увеличенное поглощение эндосомами, но обычные скорости высвобождения. Аналогичным образом данные антитела с модулированным связыванием FcRn могут обладать другими необходимыми свойствами, такими как модулированное связывание Fc R, как например указано в заявках USSN 11/174287, 11/124640, 10/822231, 10/672280, 10/379392 и заявке на патент 11/256060 под названием «Варианты иммуноглобулина IgG, обладающие оптимизированной эффекторной функцией», поданной 21 октября 2005. Т.е. оптимизированные свойства также включают без ограничения повышенную или пониженную аффинность к Fc R. В одном из возможных вариантов осуществления варианты IgG оптимизируют, в результате чего они обладают повышенной аффинностью к активирующему Fc R человека, предпочтительно Fc RIIIa, помимо характеристики связывания FcRn. В еще одном возможном альтернативном варианте осуществления варианты IgG оптимизируют, в результате чего они обладают пониженной аффинностью к ингибирующему рецептору Fc RIIb человека. Т.е. конкретные варианты осуществления включают использование антител, демонстрирующих увеличенное связывание с FcRn и увеличенное связывание с Fc RIIIa. В других вариантах осуществления используют антитела, демонстрирующие увеличенное связывание с FcRn и увеличенное связывание с Fc RIIIa. Предполагают, что согласно указанным вариантам осуществления предложены полипептиды IgG, обладающие улучшенными терапевтическими свойствами у людей, например, усиленной эффекторной функцией и более высокой противораковой активностью. В альтернативном варианте осуществления варианты IgG оптимизируют, в результате чего они обладают повышенной или пониженной аффинностью к FcRn и повышенной или пониженной аффинностью к Fc R человека, включая без ограничения Fc RI, Fc RIIa, Fc RIIb, Fc RIIc, Fc RIIIa и Fc RIIIb, включая их аллельные варианты. Предполагают, что согласно данным вариантам осуществления предложены полипептиды IgG, обладающие улучшенными терапевтическими свойствами у людей, например, увеличенным временем полужизни и пониженной эффекторной функцией. В других вариантах осуществления варианты IgG обеспечивают повышенную аффинностью к FcRn и повышенную аффинностью к одному или нескольким Fc R, но пониженную аффинность к одному или нескольким другим Fc R. Например, вариант IgG может обладать увеличенным связыванием с FcRn и Fc RIIIa, но уменьшенным связыванием с Fc RIIb. В качестве альтернативы, вариант IgG может обладать уменьшенным связыванием с FcRn и Fc R. В другом варианте осуществления вариант IgG может обладать пониженной аффинностью к FcRn и повышенной аффинностью к Fc RIIb, но пониженной аффинностью к одному или нескольким Fc R. В еще одном варианте осуществления вариант IgG может обладать пониженной аффинностью к FcRn и повышенной аффинностью к Fc RIIb, но пониженной аффинностью к одному или нескольким Fc R. В еще одном варианте осуществления вариант IgG может обладать увеличенным временем полужизни и пониженными эффекторными функциями.

Предпочтительные варианты осуществления включают оптимизацию связывания с FcRn и Fc R человека, однако в альтернативных вариантах осуществления варианты IgG обладают повышенной или пониженной аффинностью к FcRn и Fc R не относящихся к человеку организмов, включая без ограничения грызунов и низших приматов. Варианты IgG, которые оптимизируют для связывания с FcRn не человеческого происхождения, могут найти применение в проведении исследований. Например, доступны модели мышей для множества заболеваний, позволяющие тестировать свойства, такие как эффективность, токсичность и фармакокинетические характеристика для указанного потенциального лекарственного средства. Как известно в данной области техники, раковые клетки могут быть трансплантированы или введены путем инъекции мышам для имитации рака человека, способ под названием «ксенотрансплантация». В результате тестирования вариантов IgG, включающих варианты IgG, оптимизированные в отношении FcRn, можно получить полезную информацию относительно характеристик клиренса белка, его механизма клиренса и т.п. Варианты IgG также могут быть оптимизированы в отношении увеличенной функциональности и/или свойств раствора в гликозилированной форме. Лиганды Fc включают без ограничения FcRn, Fc Rs, C1q и белки А и G, и могут происходить из любого источника, включая без ограничения человека, мышь, крысу, кролика или обезьяну, предпочтительно человека. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления варианты IgG оптимизируют, в результате чего они становятся более стабильными и/или более растворимыми по сравнению с гликозилированной формой исходного варианта IgG.

Варианты IgG могут содержать модификации, модулирующие взаимодействие с лигандами Fc, кроме FcRn и Fc R, включая без ограничения белки комплемента и гомологи рецептора Fc (FcRH). FcRH включают без ограничения FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5 и FcRH6 (Davis et al, 2002, Immunol. Reviews 190:123-136, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Предпочтительно специфичность варианта IgG к лиганду Fc будет определять его терапевтическую полезность. Полезность указанного варианта IgG для терапевтических целей будет зависеть от эпитопа и формы антигена-мишени, и заболевания или симптома, подвергаемого лечению. Для большинства мишеней и симптомов увеличенное связывание FcRn может являться предпочтительным, т.к. увеличенное связывание FcRn может приводить в увеличенному времени полужизни в сыворотке. Более продолжительное время полужизни в сыворотке позволяет менее часто или в более низкой дозе вводить лекарственное средство. Это является наиболее предпочтительным, когда лечебное средство вводят в ответ на симптом, требующий повторного введения. Для некоторых мишеней и симптомов уменьшенное связывание FcRn может являться предпочтительным. Это может являться наиболее предпочтительным, когда необходим Fc-вариант с увеличенным клиренсом и уменьшенным временем полужизни в сыворотке, например, в полипептидах Fc, используемых в качестве радиофармацевтических средств или радиотерапевтических средств.

Могут быть использованы варианты IgG, включающие варианты IgG, обеспечивающие повышенную аффинность к FcRn с активирующим Fc R, и/или пониженную аффинность к ингибиторным Fc Rs. Для некоторых мишеней и симптомов также может являться полезным использование вариантов IgG, обеспечивающих дифференцированную селективность в отношении различных активирующих Fc R; например, в некоторых случаях может быть необходимо увеличенное связывание с Fc RIIa и Fc RIIIa, но не с Fc RI, тогда как в других случаях увеличенное связывание только с Fc RIIa может являться предпочтительным. Для некоторых мишеней и симптомов может быть предпочтительным использование вариантов IgG, изменяющих связывание FcRn и усиливающих как Fc R-опосредуемые, так и комплемент-опосредуемые эффекторные функции, тогда как в других случаях может являться полезным использование вариантов IgG, увеличивающих связывание FcRn или время полужизни в сыворотке и либо Fc R-опосредуемые, либо комплемент-опосредуемые эффекторные функции. Для некоторых мишеней или симптомов рака может являться полезным ослабление или удаление одной или нескольких эффекторных функций, например путем выключения связывания с C1q, одним или несколькими Fc R, FcRn или одни или несколькими другими лигандами Fc. Для других мишеней и симптомов может быть предпочтительным использование вариантов IgG, обеспечивающих увеличенное связывание с ингибирующим Fc RIIb, но уровня дикого типа, уменьшенное или удаленное связывание с активирующим Fc R. В частности, это может являться подходящим, например, в случае когда задача варианта IgG заключается в ингибировании воспаления или аутоиммунного заболевания или модулировании иммунной системы некоторым образом. Т.к. аутоиммунные заболевания в целом являются продолжительными и лечение осуществляют с повторными введениями доз, их лечение Fc-вариантами, обладающими увеличенным временем полужизни благодаря увеличенному FcRn является наиболее предпочтительным.

Может быть осуществлена модификация для улучшения стабильности, растворимости, функции или клинического применения IgG. В предпочтительном варианте осуществления варианты IgG могут содержать модификации для снижения иммуногенности у людей. В наиболее предпочтительном варианте осуществления иммуногенность варианта IgG снижают с применением способа, описанного в USSN 11/004590, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки. В альтернативных вариантах осуществления варианты IgG гуманизируют (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки.

Варианты IgG могут содержать модификации, снижающие иммуногенность. Модификации для снижения иммуногенности могут включать модификации, уменьшающие связывание обработанных полипептидов, полученных из исходной последовательности, с белками МНС. Например, модификации аминокислот могут быть осуществлены таким образом, чтобы не было или было минимальное количество иммунных эпитопов, которые как предполагают, связываются с высокой аффинностью с любыми преобладающими аллелями МНС. Некоторые способы идентификации связывающихся с МНС эпитопов в последовательностях белков известны в данной области техники и могут быть использованы для подсчета эпитопов в варианте IgG. См., например, WO 98/52976; WO 02/079232; WO 00/3317; USSN 09/903,378; USSN 10/039,170; USSN 60/222,697; USSN 10/754,296; PCT WO 01/21823; и РСТ WO 02/00165; Mallios, 1999, Bioinformatics 15:432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17:942-948; Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561; WO 98/59244; WO 02/069232; WO 02/77187; Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154:5927-5933; и Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180:2353-2358, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Основанная на последовательностях информация может быть использована для определения результата связывания для взаимодействия указанный пептид-МНС (см., например, Mallios, 1999, Bioinformatics 15:432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942-948; Sturniolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17:555-561, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки).

Создание вариантов IgG

Варианты согласно настоящему изобретению могут быть получены различными способами. Варианты, указанные в настоящем описании, могут представлять собой инсерции, делеции, замены, другие модификации или комбинации этих и других изменений. В частности, новым вариантом осуществления настоящего изобретения является создание инсерций и делеций, которые либо увеличивают, либо уменьшают связывание полипептида Fc с лигандом Fc. Как указано в настоящем описании, могут быть осуществлены инсерции или делеции, которые повышают или понижают аффинность полипептида Fc к FcRn. Инсерции и делеции могут быть получены с помощью рациональных подходов или подходов, включающих использование случайных компонентов, например произвольное и полупроизвольное создание библиотек или скрининг. В альтернативном варианте осуществления описаны замены, повышающие или понижающие аффинность полипептида Fc к FcRn.

Модификации остова: инсерции и делеции

Вариантные полипептиды Fc могут быть получены путем замены вариантной аминокислоты в месте исходной аминокислоты в положении в полипептиде Fc. Путем замены одной или нескольких аминокислот на вариантные аминокислоты в полипептиде Fc изменяют боковые цепи в этих положениях. Наиболее подходящие замены модифицируют свойства Fc путем изменения боковых цепей Fc. Замененные боковые цепи могут взаимодействовать напрямую или опосредованно с партнером по связыванию Fc, который связан с функцией или свойством Fc. По меньшей мере одна замена изменяет ковалентную структуру одной или нескольких боковых цепей исходного полипептида Fc.

В качестве альтернативы, могут быть получены вариантные полипептиды Fc, меняющие ковалентную структуру остова исходного полипептида Fc. В белках атомы остова представляют собой пептидный азот, альфа-углерод, карбонильный или пептидный углерод и карбонильный кислород. Изменение ковалентной структуры остова предоставляет дополнительные способы изменения свойств полипептидов Fc. Ковалентная структура остова Fc может быть изменена путем добавления атомов в остов, например, путем инсерции одной или нескольких аминокислот, или путем удаления атомов из остова, например путем делеции одной или нескольких аминокислот. Ковалентная структура остова также может быть изменена путем замены индивидуальных атомов остова на другие атомы (Deechongkit et al., J Am Chem Soc. 2004. 126(51):16762-71, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Как известно в данной области техники и проиллюстрировано в настоящем описании, инсерции или делеции аминокислот в полипептидах Fc могут быть осуществлены путем инсерции или делеции соответствующих нуклеотидов в ДНК, кодирующей указанный полипептид Fc. В качестве альтернативы, как известно в данной области техники, инсерции или делеции аминокислот могут быть осуществлены в ходе синтеза полипептидов Fc.

Создание инсерций или делеций аминокислот, которые изменяют взаимодействие полипептида Fc с одним или несколькими партнерами по связыванию (например, FсгаммаR, FcRn, C1q), могут быть осуществлены путем рассмотрения структуры комплекса полипептида Fc и его партнера по связыванию. В менее предпочтительном варианте осуществления создание может быть осуществлено путем рассмотрения структуры полипептида Fc и информации об области Fc, участвующей в связывании с партнером по связыванию. Указанная информация может быть получена путем проведения экспериментов по мутагенезу, экспериментов по фаговому дисплею, путем сравнения гомологии, компьютерного моделирования или другими способами.

Предпочтительными положениями в аминокислотной последовательности для инсерций или делеций, влияющих на связывающие взаимодействия Fc, но не влияющих на общую структуру, стабильность, экспрессию или применение полипептида Fc, являются петли, участвующие во взаимодействиях Fc/партнер по связыванию Fc. Для изменения связывания FcRn с полипептидом Fc положения 244-257, 279-284, 307-317, 383-390 и 428-435 представляют собой предпочтительные расположения петель для инсерций или делеций (нумерация согласно индексу EU Kabat et al., Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Для изменения связывания Fc-гамма рецептора с полипептидом Fc положения 229-239, 266-273, 294-299 и 324-331 представляют собой предпочтительные расположения петель для инсерций или делеций (нумерация согласно индексу EU Kabat et al., код в PDB 1E4K. pdb Sondermann et al. Nature. 2000 406:267, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки). Петли представляют собой области полипептида, не включенные в альфа-спиральную структуру или структуру бета-складчатого слоя. Положения петель представляют собой положения, не включенные ни в альфа-спиральную структуру, ни в структуру бета-складчатого слоя (van Holde, Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, Chapter 1 pp 2-67, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Положения петель являются предпочтительными, т.к. атомы остова, как правило, являются более гибкими и с меньшей вероятностью вовлечены в образование водородных связей по сравнению с атомами остова альфа-спиралей и бета-складчатых слоев. Следовательно, удлинение или укорочение петли за счет инсерции или делеции одной или нескольких аминокислот с меньшей вероятностью приводит к значительным, разрушительным изменениям полипептида Fc, включая стабильность, экспрессию или другие трудности.

Инсерции и делеции могут быть использованы для изменения длины полипептида. Например, в областях петли изменение длины петли приводит к измененной гибкости и конформационной энтропии указанной петли. Инсерции в петле в целом увеличат конформационную энтропию петли, которая может быть определена как константа Больцмана, умноженная на натуральный логарифм числа возможных конформаций (van Holde, Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, pp 78, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Путем инсерции по меньшей мере одной аминокислоты в полипептид увеличивается общее число конформаций полипептида. Указанные дополнительные конформаций могут быть полезны для образования подходящих взаимодействий Fc/партнер по связыванию Fc, т.к. в связывании Fc-связывающего белка может быть использована одна из дополнительных конформаций полипептида Fc. В данном случае инсерция может привести к более сильным взаимодействиям Fc/партнер по связыванию Fc. В случае, если дополнительные конформаций не используются в области связывания, указанное инсерция может привести к более слабым взаимодействиям Fc/партнер по связыванию Fc, т.к. дополнительные конформаций будут конкурировать с конформацией, способной к связыванию. Аналогичным образом делеция полипептидного сегмента может также привести либо к более сильным, либо к более слабым взаимодействиям Fc/партнер по связыванию Fc. В случае если делеция сегмента, уменьшающая возможное число конформаций остова, исключает конформацию, способную к связыванию, указанная делеция может привести к более слабым взаимодействиям Fc/партнер по связыванию Fc. В случае если делеция не исключает конформацию, способную к связыванию, делеция может привести к более сильным взаимодействиям Fc/партнер по связыванию Fc, т.к. указанная делеция может исключить конформаций, конкурирующие с конформацией, способной к связыванию.

Инсерции и делеции могут быть использованы для изменения положений и ориентации аминокислот в полипептиде Fc. Т.к. инсерции и делеции вызывают изменение ковалентной структуры остова, они неизбежно вызывают изменение положений атомов остова. На фиг.7 сравнены положения остова в некоторых сегментах петли, обозначенных L1-L4, в трех различных остовах. Эталонная структура остова содержит четыре сегмента петли, тогда как в остов с делецией не содержит сегмент L1, а сегмент инсерции содержит дополнительный сегмент перед (т.е. N-концевой), сегментом L1. Делеции и инсерции вызывают наибольшее изменение в структуре остова рядом с участком инсерции или делеции. Путем делеции сегмента, расположенного рядом с N-концевой областью петли, например сегмента L1, петля укорачивается, и оставшиеся сегменты перемещают свое положение ближе к N-концу петли. Это вызывает смещение сегмента L2 к прежнему расположению сегмента L1 и к N-концу петли. Данное изменение в положении сегмента L2 по направлению к сегменту L1 может усилить связывание комплекса Fc/партнер по связыванию Fc и является предпочтительным в случае, когда есть предварительная информация о том, что аминокислота или аминокислоты, расположенные в L2, осуществляют подходящие взаимодействия с партнером по связыванию Fc, при расположении в L1. Например, если L2 содержит аланин и тирозин, и замена двух аминокислот сегмента L1 на аланин и тирозин уже приводит к Fc-варианту, обладающему увеличенным связыванием, то в результате делеции L1 можно получить Fc-вариант, обладающий повышенной аффинностью к партнеру по связыванию Fc.

Аналогичным образом инсерция полипептидного сегмента в полипептид Fc в N-концевой области петли вызывает смещение положений сегментов петли к С-концевому участку петли. На фиг.7 инсерция одной или нескольких аминокислот перед (т.е. с N-конца) сегментом L1 изменяет конформацию остова, включая смещение сегмента L1 к С-концевой области петли. Данный вид инсерции является предпочтительным когда известно, что расположенные в сегменте L1 аминокислоты осуществляют подходящие взаимодействия при расположении в положениях L2, т.к. указанное инсерция может привести к более сильным взаимодействиям Fc/партнер по связыванию Fc. В случае, если необходимы более слабые взаимодействия Fc/партнер по связыванию Fc, может быть использовано инсерция для смещения неподходящей аминокислоты в другое положение. Встроенные, удаленные и эталонные сегменты (L1-L4 на фиг.7) могут представлять собой одну или несколько аминокислот в полипептиде Fc.

В качестве альтернативы инсерции или делеции могут быть использованы в С-концевой области петель способом, аналогичным инсерциим или делециям в N-концевой области петель. Инсерции в С-конце петли могут приводить к смещению положений, N-концевых по отношению к инсерции, к N-концу петли. Делеции в С-конце петли могут приводить к смещению положений, N-концевых по отношению к делеции, к С-концу петли. Выбор использования инсерции или делеции в N-концевой или С-концевой области петли осуществляют исходя из аминокислот, расположенных в петле, необходимости повышенной или пониженной аффинности Fc/партнер по связыванию Fc и необходимого смещения положений.

Инсерции или делеции могут быть использованы в любой области полипептида Fc, включая петли, альфа-спиральные области и области бета-складчатых слоев. Предпочтительные участки для инсерции и делеции включают области петель, которые представляют собой области, которые не являются альфа-спиральными или областями бета-складчатых слоев. Петли являются предпочтительными, т.к. они в целом принимают изменения остова лучше, чем альфа-спирали или бета-складчатые слои. Наиболее предпочтительные участки для инсерции или делеции, приводящих к более сильным взаимодействиям белок/белок, расположены на N-концевых или С-концевых участках петли. Если боковые цепи петли вовлечены во взаимодействия Fc/партнер по связыванию Fc, инсерции или делеции на указанных участках с меньшей вероятностью приведут к сильно разрушительным изменениям в связывающих взаимодействиях. В результате делеции в пределах точного центра петли более вероятно удаление важных остатков на границе Fc/партнер по связыванию Fc, а в результате инсерции в пределах точного центра петли более вероятно появление неподходящих взаимодействий на границе Fc/партнер по связыванию Fc. Количество удаляемых или встраиваемых остатков может быть определено объемом необходимого изменения остова, при этом предпочтительными являются инсерции или делеции 15 или менее остатков, более предпочтительными являются инсерции или делеции 10 или менее остатков и наиболее предпочтительными являются инсерции или делеции 5 или менее остатков.

После того, как сконструировано положение и размер делеционного Fc-варианта, определяют всю полипептидную последовательность, и полипептид может быть получен способами, известными в данной области техники.

Однако инсерционные Fc-варианты включают дополнительный этап конструирования последовательности содержащей, по меньшей мере, одну аминокислоту, подлежащую инсерции. Инсерции полярных остатков, включая Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Gly, His являются предпочтительными в положениях, которые как предполагается, будут подвержены воздействию в полипептиде Fc. Малые аминокислоты, включая Ser, Thr и Ala, являются наиболее предпочтительными, т.к. небольшой размер с меньшей вероятностью стерически препятствует взаимодействиям Fc/партнер по связыванию Fc. Ser и Thr также могут образовывать водородные связи с атомами партнера по связыванию Fc.

Инсерции также обладают дополнительной гибкостью, в результате чего встроенный полипептид может быть получен таким образом, чтобы образовывать подходящие взаимодействия с партнером по связыванию Fc, что необходимо в случае, когда требуется более сильное связывание Fc/партнер по связыванию Fc. Длина инсерции в остове может быть определена путем моделирования вариантного остова со встроенной простой типичной последовательностью. Например, инсерции полисерина, полиглицина или полиаланина различной длины могут быть «сконструированы» и смоделированы. Моделирование может быть осуществлено множеством способов, включая гомологичное моделирование на основе известных трехмерных структур гомологов, содержащих указанное инсерция, и путем компьютерного моделирования, включая MODELLER (M.A. Marti-Renom et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 291-325, 2000) и ROSETTA (Kuhlman et al. (2003). Science 302, 1364-8), оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки. Как правило, сначала получают различные конформации остова, и конечная структура остова может быть определена после установления идентичности боковой цепи. Боковые цепи могут быть созданы с помощью алгоритмов PDA® (US 6188965; 6269312; 6403312; 6801861; 6804611; 6792356, 6950754 и USSN 09/782004; 09/927790; 10/101499; 10/666307; 10/666311; 10/218102, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки).

Могут быть произведены инсерции или делеции для изменения связывания полипептидов Fc с FсгаммаR аналогично описанному способу изменения свойств связывания FcRn. Домены Fc связываются с FсгаммаR в положении, указанном на фиг.1. Структуры комплекса Fc/FсгаммаR, включая коды в PDB 1T89 и 1IIS (Radaev S et al. J. Biol. Chem. v276, p.16469-16477, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), демонстрируют взаимодействующие остатки и петли между двумя структурами. Все результаты мутагенеза, такие как приведены в US 11/124620 и US 6737056 (оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки) полезны в определенных подходящих смещениях в положениях в остове.

Инсерции или делеции могут быть произведены в любом полипептиде, помимо полипептидов Fc, способами, указанными в настоящем описании. Например, инсерции или делеции в члене суперсемейства TNF, APRIL, могут быть произведены с помощью трехмерной структуры (код в PDB 1XU1.pdb, Hymowitz, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:7218, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Инсерции или делеции могут быть произведены для увеличения связывания APRIL со своим рецептором TACI. Остатки петель, предпочтительные в качестве сайтов инсерции или делеции, представляют собой остатки Ser118-Val124, Asp164-Phe167, Pro192-Ala198, Pro221-Lys226. Данные петли взаимодействуют с TACI в комплексе APRIL/TACI и опосредуют связывание.

Полипептиды, включающие варианты.

Варианты IgG могут быть основаны на последовательностях IgG человека и таким образом последовательности IgG человека используют в качестве «базовых» последовательностей, с которыми сравнивают другие последовательности, включая без ограничения последовательности других организмов, например, последовательности грызунов и приматов. Варианты также IgG могут содержать последовательности других классов иммуноглобулина, таких как IgA, IgE, IgD, IgM и т.п. Предполагается, что несмотря на то, что варианты IgG создают в контексте одного исходного IgG, варианты могут быть созданы в контексте другого, второго исходного IgG или «перенесены» к нему. Это осуществляют путем определения «эквивалентных» или «соответствующих» остатков и замен между первым и вторым IgG, как правило исходя из гомологии последовательности или структурной гомологии между последовательностями IgG. Для установления гомологии аминокислотную последовательность первого указанного IgG напрямую сравнивают с последовательностью второго IgG. После выравнивания последовательностей с использованием одной или нескольких программ выравнивания гомологии, известных в данной области техники (например, с использованием консервативных остатков в качестве промежуточных видов), предусматривая необходимые инсерции и делеции для поддержания выравнивания (т.е. избегая удаления консервативных остатков путем произвольной делеции и инсерции), определяют остатки, эквивалентные конкретным аминокислотам в первичной последовательности первого варианта IgG. Выравнивание консервативных остатков предпочтительно должно сохранять 100% таких остатков. Однако выравнивание более 75% или до 50% консервативных остатков также подходит для определения эквивалентных остатков. Эквивалентные остатки также могут быть определены путем установления структурной гомологии между первым и вторым IgG, т.е. на уровне третичной структуры для IgGs, структуры которых были определены. В данном случае эквивалентные остатки определяют как остатки, для которых атомные координаты двух или более атомов основной цепи конкретного аминокислотного остатка родоначальника или предшественника (N на N, СА на СА, С на С и О на О) находятся в пределах 0,13 нм и предпочтительно 0,1 нм после выравнивания. Выравнивание осуществляют после ориентации и расположения лучшей модели с получением максимального совпадения атомных координат неводородных белковых атомов белков. Независимо от того, как определяют эквивалентные или соответствующие остатки и независимо от идентичности исходного IgG, в котором создают IgGs, неизменным остается то, что исследованные варианты IgG могут быть созданы во втором исходном IgG, обладающим значительной гомологией последовательностей или структурной гомологией с вариантом IgG. Таким образом, например, если получают вариантное антитело, в котором исходное антитело представляет собой IgG1 человека, путем использования вышеописанных способов или других способов определения эквивалентных остатков вариантное антитело может быть создано в другом исходном антителе IgG1, которое связывается с другим антигеном, исходном антителе IgG2 человека, исходном антителе IgA человека, исходном антителе IgG2a или IgG2b мыши и т.п. Снова, как описано выше, контекст исходного варианта IgG не влияет на способность переносить варианты IgG в другие исходные IgGs.

Предложены способы создания, получения и скрининга вариантов IgG. Описанные способы не ограничивают любое конкретное применение или методику применения. Предпочтительно предложенные способы в целом иллюстрируют, что один или несколько вариантов IgG могут быть созданы, получены и экспериментально подвергнуты скринингу для получения вариантов IgG, обладающих оптимизированной эффекторной функцией. Описано множество способов создания, получения и тестирования вариантов антитела и белка в in USSN 10/754296 и USSN 10/672280, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

Множество способов создания белка может быть использовано для создания вариантов IgG, обладающих оптимизированной эффекторной функцией. В одном из вариантов осуществления может быть использован основанный на структуре способ создания, в котором имеющуюся структурную информацию используют для управления заменами, инсерциями или делениями. В предпочтительном варианте осуществления может быть использован компьютерный способ скрининга, в котором замены производят на основе их энергетического соответствия в компьютерных расчетах. См., например, USSN 10/754296 и USSN 10/672280 и указанные в них источники, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

Выравнивание последовательностей может быть использовано для управления заменами в идентифицированных положениях. Для специалиста в данной области техники очевидно, что использование информации о последовательностях может ограничивать введение замен, которые являются потенциально разрушительными для структуры белка. Источник последовательностей может широко варьироваться и включать одну или несколько известных баз данных, включая без ограничения базу данных Kabat (Северо-Западный Университет (Northwestern University)); Johnson & Wu, 2001, Nucleic Acids Res. 29:205-206; Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res. 28:214-218), базу данных IMGT (IMGT, the international ImMunoGeneTics information system®; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28:219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:307-310) и VBASE, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Информация о последовательностях антитела может быть приобретена, скомпилирована и/или получена в результате выравниваний гаметических последовательностей или последовательностей встречающихся в природе антител любого организма, включая без ограничения млекопитающих. Для специалиста в данной области техники очевидно, что использование последовательностей человеческого или по существу человеческого происхождения также может обладать преимуществом, которое заключается в том, что они менее иммуногенные при введение человеку. Другие базы данных, которые представляют собой более общие базы данных нуклеиновых кислот или белков, т.е. не конкретно антител, включают без ограничения SwissProt, GenBank Entrez и базу данных нуклеотидных последовательностей EMBL. Выровненные последовательности могут включать последовательности VH, VL, СН и/или CL. Существуют многочисленные основанные на последовательности программы выравнивания и способы, известные в данной области техники, и все они находят применение в получении выравниваний последовательностей.

В качестве альтернативы способы случайного или полуслучайного мутагенеза могут быть использованы для создания аминокислотных модификаций в необходимых положениях. В данных случаях положения выбирают произвольно или аминокислотные изменения осуществляют по упрощенным правилам. Например, все остатки могут быть подвергнуты мутации с получением аланина, мутагенез под названием «аланиновое сканирование». Указанные способы могут быть комбинированы с более сложными инженерными подходами, в которых применяют способы отбора для скрининга более высоких уровней отличия последовательностей. Как хорошо известно в данной области техники, существует множество технологий отбора, которые могут быть использованы для указанных подходов, включая, например, технологии дисплея, такие как фаговый дисплей, рибосомный дисплей, дисплей на клеточной поверхности и т.п., как описано ниже.

Способы получения и скрининга вариантов IgG хорошо известны в данной области техники. Общие способы молекулярной биологии антитела, экспрессии, очистки и скрининга описаны в Antibody Engineering, под редакцией Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; и Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76. Также см. способы, описанные в USSN 10/754296; USSN 10/672280; и USSN 10/822231; и 11/124620, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

Предпочтительные варианты согласно настоящему изобретению включают варианты, приведенные на фиг.8. В качестве альтернативы, предпочтительные варианты согласно настоящему изобретению включают варианты, приведенные на фиг.9. Дополнительно в качестве альтернативы, предпочтительные варианты согласно настоящему изобретению включают варианты, приведенные на фиг.10. Данные варианты продемонстрировали увеличенное связывание с рецептором Fc, FcRn, как проиллюстрировано в примерах.

Создание вариантов IgG

Варианты IgG могут быть созданы любым способом, известным в данной области техники. В одном из вариантов осуществления последовательности вариантов IgG используют для получения нуклеиновых кислот, которые кодируют последовательности членов и которые затем могут быть клонированы в клетках-хозяевах, экспрессированы и анализированы при необходимости. Данные технологии осуществляют с использованием хорошо известных процедур и множество способов, которые могут найти в них применение, описаны в Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3^rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001) и Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты IgG, могут быть включены в вектор экспрессии для экспрессии белка. Векторы экспрессии, как правило, содержат белок, функционально связанный, т.е. находящийся в функциональной зависимости, с контрольными или регуляторными последовательностями, селектируемыми маркерами, любыми партнерами по слиянию и/или дополнительными элементами. Варианты IgG могут быть получены путем выращивания клетки-хозяина, трансформированной нуклеиновой кислотой, предпочтительно вектором экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую варианты IgG, в подходящих условиях для индуцирования или вызова экспрессии белка. Может быть использован широкий спектр подходящих клеток-хозяев, включая без ограничения клетки млекопитающих, бактерии, клетки насекомых и дрожжи. Например, множество линий клеток, которые могут найти применение, описаны в каталоге линий клеток АТСС, доступном из американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection), полностью включенном в настоящее описание посредством отсылки. Способы введения экзогенной нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева хорошо известны в данной области техники и будут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина.

В предпочтительном варианте осуществления варианты IgG очищают или выделяют после экспрессии. Антитела могут быть выделены или очищены множеством способов, известных специалистам в данной области техники. Стандартные способы очистки включают методы хроматографии, методы электрофореза, иммунологические методы, методы осаждения, диализа, фильтрации, концентрирования и методы хроматофокусирования. Как хорошо известно в данной области техники, множество природных белков связывают антитела, например бактериальные белки A, G и L, и данные белки могут найти применение в очистке. Часто очистке может способствовать конкретный партнер по слиянию. Например, белки могут быть очищены с использованием глутатионовой смолы в случае, если используют слияние с GST, Ni⁺²-аффинной хроматографии в случае, если используют His-метку, или иммобилизированного антитела анти-flag в случае, если используют flag-метку. Для общего руководства относительно подходящих способов очистки см. Antibody Purification: Principles and Practice, 3^rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки.

Скрининг вариантов IgG

Fc-варианты могут быть подвергнуты скринингу с использованием множества способов, включая без ограничения способы, в которых используют анализы in vitro, анализы in vivo и анализы на основе клеток и технологии селекции. Технологии автоматического скрининга и скрининга высокой производительности могут быть использованы в процедурах скрининга. В скрининге могут использовать партнера по слиянию или метку, например, иммунную метку, изотопную метку или обладающую небольшой молекулой метку, такую как флуоресцентный или колориметрический краситель.

В предпочтительном варианте осуществления функциональные и/или биофизические свойства Fc-вариантов подвергают скринингу в анализе in vitro. В предпочтительном варианте осуществления белок подвергают скринингу на предмет функциональности, например, его способности катализировать реакцию или его аффинности к связыванию в отношении мишени.

Как известно в данной области техники, подгруппами способов скрининга являются те, которые отбирают подходящих членов библиотеки. В настоящем описании указанные способы называются «способами отбора» и данные способы находят применение в настоящем изобретении в скрининге Fc-вариантов. Когда белковые библиотеки подвергают скринингу с использованием способа отбора, только те члены библиотеки, которые подходят, т.е. которые отвечают критериям отбора, пропускают, выделяют и/или наблюдают. Множество способов отбора известны в данной области техники, и они могут найти применение в настоящем изобретении для скрининга белковых библиотек. Другие способы отбора, которые могут найти применение в настоящем изобретении, включают способы, которые не основываются на отображении, такие как способы in vivo. Подгруппа способов отбора, называющихся способами «направленной эволюции», представляет собой способы, включающие спаривание или «скрещивание» подходящих последовательностей в ходе отбора, иногда с включением новых мутаций.

В предпочтительном варианте осуществления Fc-варианты подвергают скринингу с использованием одного или нескольких основанных на клетках анализов или анализов in vivo. Для указанных анализов очищенные и неочищенные белки, как правило, добавляют извне таким образом, что клетки подвергают воздействию индивидуальных вариантов или пулов вариантов, относящихся к библиотеке. Данные анализы как правило, но не всегда основаны на функции полипептида Fc; т.е. способности полипептида Fc связываться с мишенью и опосредовать некоторую биохимическую реакцию, например, эффекторную функцию, ингибирование связывания лиганд/рецептор, апоптоз и т.п. Указанные анализы часто включают мониторинг реакции клеток на IgG, например, выживания клеток, гибели клеток, изменения клеточной морфологии или транскрипционной активации, такой как клеточная экспрессия природного гена или гена-репортера. Например, указанные анализы могут измерять способность Ре-вариантов вызывать ADCC, ADCP или CDC. Для некоторых анализов может быть необходимо добавление дополнительных клеток или компонентов, т.е. в дополнение к клеткам-мишеням, например, сывороточного комплемента или эффекторных клеток, таких как моноциты периферической крови (РВМС), макрофаги, естественные киллерные клетки и т.п. Указанные дополнительные клетки могут происходить из любого организма, предпочтительно людей, мышей, крысы, кролика и обезьяны. Антитела могут вызывать апоптоз некоторых линий клеток, экспрессирующих мишень, или могут опосредовать атаку клеток-мишеней иммунными клетками, добавленными к анализу. Способы мониторинга гибели или жизнеспособности клеток известны в данной области техники и включают применение красителей, иммунохимических, цитохимических и радиоактивных реагентов. Транскрипционная активация может служить в качестве способа анализа функции в анализах на основе клеток. В качестве альтернативы, скрининги на основе клеток осуществляют с использованием клеток, трансформированных или трансфицированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими варианты. Т.е. Fc-варианты не добавляют извне к клеткам.

Биологические свойства вариантов IgG могут быть охарактеризованы исходя из данных экспериментов с участием клеток, тканей и всего организма. Как известно в данной области техники, лекарственные средства часто тестируют на животных, включая без ограничения, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и обезьян, для того, чтобы измерить эффективность лекарственного средства в отношении лечения заболевания или модели заболевания или для измерения фармакокинетических характеристик, токсичности и других свойств лекарственного средства. Указанные животные могут рассматриваться как модели заболеваний. Лекарственные средства часто тестируют на мышах, включая без ограничения мышей линии nude, мышей SCID, мышей с ксенотрансплантатами и трансгенных мышей (включая нокины и нокауты). В результате проведения указанных исследований можно получить важные данные для определения потенциала белка, который будет использоваться в качестве лекарственно средства. Для тестирования может быть использован любой организм, предпочтительно млекопитающие. Например, обезьяны из-за их генетического сходства с людьми могут представлять собой подходящие модели для лечения и, таким образом, могут быть использованы для тестирования эффективности, токсичности, фармакокинетических характеристик или другого свойства IgGs. В конечном счете, необходимо проведение тестов на людях для разрешения использования в качестве лекарственных средств и, следовательно, данные эксперименты обязательно предполагаются. Таким образом, IgGs могут быть протестированы на людях для определения их терапевтической эффективности, токсичности, иммуногенности, фармакокинетических характеристик и/или других клинических свойств.

Способы использования вариантов IgG

Варианты IgG могут найти применение в широком диапазоне продуктов. В одном из вариантов осуществления вариант IgG представляет собой терапевтический, диагностический или экспериментальный реагент, предпочтительно терапевтический. Вариант IgG может найти применение в композиции антител, являющейся моноклональной или поликлональной. В предпочтительном варианте осуществления варианты IgG используют для разрушения клеток-мишеней, которые порождают антиген-мишень, например, раковых клеток. В альтернативном варианте осуществления варианты IgG используют для блокирования, вызова антагонизма или агонизма к антигену-мишени, например для вызова антагонизма к цитокину или рецептору цитокина. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления варианты IgG используют для блокирования, вызова антагонизма или агонизма к антигену-мишени и разрушения клеток-мишеней, порождающих антиген-мишень.

Варианты IgG могут быть использованы для различных терапевтических целей. В предпочтительном варианте осуществления антитело, содержащее вариант IgG, вводят пациенту для лечения расстройства, связанного с антителом. Для данных целей термин «пациент» включает людей и других животных, предпочтительно млекопитающих и наиболее предпочтительно людей. В настоящем описании термин «расстройство, связанное с антителом» или «расстройство, восприимчивое к антителу», или «состояние», или «заболевание» означает расстройство, которое можно облегчить путем введения фармацевтической композиции, содержащей вариант IgG. Расстройства, связанные с антителом, включают без ограничения аутоиммунные заболевания, иммунологические заболевания, инфекционные заболевания, воспалительные заболевания, неврологические заболевания и онкологические, и неопластические заболевания, включая рак. В настоящем описании термины «рак» и «раковый» описывают или относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому (включая липосаркому), нейроэндокринные опухоли, мезотелиому, шванному, менингиому, аденокарциному, меланому, лейкоз и лимфолейкозы.

В одном из вариантов осуществления вариант IgG представляет собой единственный терапевтически активный агент, вводимый пациенту. В качестве альтернативы, вариант IgG вводят в комбинации с одним или несколькими терапевтическими агентами, включая без ограничения цитотоксические агенты, химиотерапевтические агенты, цитокины, ингибиторы роста, антигормональные агенты, ингибиторы киназы, антиангиогенные агенты, кардиопротекторы или другие терапевтические агенты. Варианты IgG могут быть введены одновременно с использованием одной или нескольких схем лечения. Например, вариант IgG может быть введен пациенту наряду с химеотерапией, лучевой терапией или как химиотерапией, так и лучевой терапией. В одном из вариантов осуществления вариант IgG может быть введен совместно с одним или несколькими антителами, которые могут или не могут представлять собой вариант IgG. Согласно другому варианту осуществления, вариант IgG и один или несколько других видов противораковой терапии используют для лечения раковых клеток ex vivo. Предполагается, что указанное лечение ex vivo может быть подходящим в трансплантации костного мозга и в частности аутогенной трансплантации костного мозга. Обязательно предполагается, что варианты IgG могут быть использованы в комбинации еще с другими терапевтическими методами, такими как хирургия.

Множество других терапевтических агентов может быть введено с вариантами IgG. В одном из вариантов осуществления IgG вводят совместно с антиангиогенным агентом. В настоящем описании термин «антиангиогенный агент» означает соединение, блокирующее или в некоторой степени препятствующее росту кровеносных сосудов. Антиангиогенный фактор может, например, представлять собой небольшую молекулу или белок, например, антитело, слитый с Fc белок или цитокин, связывающийся с фактором роста или рецептором фактора роста, вовлеченным в стимулирование ангиогенеза. В настоящем описании предпочтительный антиангиогенный фактор представляет собой антитело, связывающееся с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF). В альтернативном варианте осуществления IgG вводят совместно с терапевтическим агентом, индуцирующим или усиливающим адаптивный иммунный ответ, например, антителом, которое прицельно воздействует на CTLA-4. В альтернативном варианте осуществления IgG вводят совместно с ингибитором тирозинкиназы. В настоящем описании термин «ингибитор тирозинкиназы» означает молекулу, в некоторой степени ингибирующую тирозинкиназную активность тирозинкиназы. В альтернативном варианте осуществления варианты IgG вводят совместно с цитокином.

Фармацевтические композиции предполагаются в случае, когда получают вариант IgG и один или несколько терапевтически активных агентов. Составы вариантов IgG получают для хранения путем смешивания IgG необходимой степени чистоты с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Указанные составы для применения для введения in vivo, предпочтительно являются стерильными. Это легко осуществляют путем фильтрации через мембраны для стерилизующей фильтрации или другими способами. Варианты IgG и другие терапевтически активные агенты, указанные в настоящем описании, также могут быть получены в виде иммунолипосом и/или заключены в микрокапсулы.

Концентрация терапевтически активного варианта IgG в составе может варьироваться от примерно 0,1 до 100% масс. В предпочтительном варианте осуществления концентрация IgG находится в диапазоне 0,003-1,0 моль. Для лечения пациента может быть введена терапевтически эффективная доза варианта IgG. В настоящем описании термин «терапевтически эффективная доза» означает дозу, обеспечивающую необходимые эффекты. Точная доза будет зависеть от цели лечения и будет определена специалистом в данной области техники с использованием известных способов. Дозы могут находиться в диапазоне от 0,01 до 100 мг/кг массы тела или выше, например 0,01, 0,1, 1,0, 10 или 50 мг/кг массы тела, при этом доза 1-10 мг/кг является предпочтительной. Как известно в данной области техники, могут быть необходимы поправки на разрушение белков, системную или локализованную доставку, и скорость синтеза новых протеаз, а также возраст, массу тела, общее состояния здоровья, пол, диету, продолжительность введения, взаимодействие лекарственных средств и тяжесть состояния, которые могут быть определены специалистом в данной области техники с помощью стандартного исследования.

Введение фармацевтической композиции, содержащей вариант IgG, предпочтительно в форме стерильного водного раствора может быть осуществлено множеством способов, например, без ограничения перорально, подкожно, внутривенно, парентерально, интраназально, в ухо, внутрь глаза, ректально, вагинально, трансдермально, местно (например, гели, мази, лосьоны, кремы и т.д.), интраперитонеально, внутримышечно, внутрилегочно (например, система для ингаляции AERx® выпускаемая Aradigm, или система доставки в легкие Inhance® выпускаемая Nektar Therapeutics, и т.д.). Лекарственное средство, указанное в настоящем описании, может быть введено одновременно с другими лекарственными средствами, т.е. лекарственные средства, указанные в настоящем описании, могут быть назначены совместно с другими видами терапии или лекарственными средствами, включая например, малые молекулы, другие биологические препараты, лучевую терапию, хирургию и т.д.

Примеры

Ниже приведены примеры для иллюстрации настоящего изобретения. Данные примеры не ограничивают настоящее изобретению каким-либо конкретным применением или методикой применения. Для всех положений, описанных согласно настоящему изобретению, нумерация приведена согласно индексу EU, как у Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Для специалистов в области техники, касающейся антител, очевидно, что данное соглашение состоит из непоследовательной нумерации в конкретных областях последовательности иммуноглобулина, предоставляя стандартизированную ссылку на консервативные положения в семействах иммуноглобулина. Соответственно, положения любого указанного иммуноглобулина, определенные индексом EU, не будут обязательно соответствовать его порядковой последовательности.

Пример 1. Создание ДНК, экспрессия и очистка Fc-вариантов

Fc-варианты создавали с использованием домена Fc IgG1 человека и вариабельного домена трастузумаба (Герцептин®, Genentech). Полипептиды Fc представляли собой часть алемтузумаба, антитела анти-HER2 или АС10. Алемтузумаб (Кэмпас®, зарегистрированная торговая марка Millenium) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, в настоящее время разрешенное для лечения В-клеточного хронического лимфолейкоза (Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35:118-127, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Трастузумаб (Герцептин® зарегистрированная торговая марка Genentech) представляет собой антитело анти-HER2/neu для лечения метастатического рака молочной железы. Последовательности тяжелых и легких цепей антитела анти-HER2 показаны на фиг.22. АС10 представляет собой моноклональное антитело анти-CD30. Вариабельную область Герцептина собирали с помощью рекурсивной ПЦР. Затем данную вариабельную область клонировали с IgG1 человека в векторе pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen), показанном на фиг.11. Плазмиды размножали в клетках Е. coli One Shot ТОР10 (Invitrogen) и очищали с использованием набора Hi-Speed Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Определяли последовательность плазмид и в результате подтверждали наличие клонированных вставок.

Осуществляли сайт-направленный мутагенез с использованием способа Quikchange (Stratagene). Плазмиды, содержащие необходимые замены, инсерции и делеции, репродуцировали в клетках Е. coli One Shot ТОР10 (Invitrogen) и очищали с использованием набора Hi-Speed Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Секвенировали ДНК и в результате подтверждали правильность последовательностей.

Плазмиды, содержащие ген тяжелой цепи (VH-C 1-C 2-C 3) (дикий тип или варианты), совместно трансфицировали с плазмидой, содержащей ген легкой цепи (VL-С ), в клетки 293Т. Среды собирали через 5 дней после трансфекции и антитела очищали от надосадочной жидкости с использованием аффинной хроматографии с белком А (Pierce). Характеристики связывания с белком А некоторых модифицированных Fc показаны на фиг.26. Концентрации антител определяли путем анализа с использованием бицинхониновой кислоты (ВСА) (Pierce).

Пример 2. Измерения аффинности связывания

Связывание полипептидов Fc с лигандами Fc анализировали путем измерений поверхностного плазменного резонанса. Измерения поверхностного плазменного резонанса (ППР) осуществляли с использованием прибора BIAcore 3000 (BIAcore AB). Антитело дикого типа или вариантное антитело фиксировали с использованием иммобилизованного белка L (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) и измеряли связывание с рецепторным аналитом. Белок L ковалентно соединяли с сенсорным чипом СМ5 при концентрации 1 мкМ в 10 мМ ацетате натрия, pH 4,5 на сенсорном чипе СМ5 с использованием N-гидроксисукцинимид/N-этил-N'-(-3-диметиламинопропил) карбодиимида (NHS/EDC) при скорости потока 5 мкл/мин. Проточную кювету 1 каждого сенсорного чипа обрабатывали NHS/EDC в качестве отрицательного контроля связывания. Подвижный буфер представлял собой 01 М HEPES pH 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества Р20 (HBS-EP, Biacore, Uppsala, Sweden), а буфер регенерации чипа представлял собой 10 мМ глицин-HCl pH 1,5. 125 нМ антитело анти-HER2 дикого типа или вариантное антитело анти-HER2 связывали с белковым L чипом СМ5 в HBS-EP при скорости 1 мкл/мин в течение 5 минут. Аналит FcRn-His-GST, FcRn, соединенный с His-меткой, и глутатион-S-трансферазу в серийных разведенениях 1 - 250 нМ вводили для 20 минутной ассоциации, 10 минутной диссоциации в HBS-EP при скорости 10 мкл/мин. Реакцию, измеряемую в единицах резонанса (RU), получали через 1200 секунд после введения рецептора, отражая околостационарное связывание. Цикл только с антителом и буфером обеспечивал базовую линию анализа. Строили графики зависимости RU от 1/log концентрации и подгоняли к сигмоидальной дозовой зависимости с использованием криволинейной регрессии с помощью GraphPad Prism.

Связывание полипептидов Fc с лигандами Fc также осуществляли с помощью технологии AlphaScreen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay). AlphaScreen представляет собой нерадиоактивный люминесцентный анализ близости на основе бусин. Возбуждение лазером донорной бусины приводит к возбуждению кислорода, который в случае достаточно близкого расположения к акцепторной бусине, будет вызывать каскад хемилюминесцентных событий, в конечном счете, приводя к испусканию флуоресценции при 520-620 нм. Главным преимуществом AlphaScreen является его чувствительность. Т.к. одна донорная бусина испускает до 60000 возбужденных молекул кислорода в секунду, усиление сигнала чрезвычайно велико, что позволяет обнаруживать вплоть до аттомолярных (10^-18) уровней. Антитело дикого типа биотинилировали стандартными способами для присоединения к покрытым стрептавидином донорным бусинам, а меченый лиганд Fc, например, FcRn, РсгаммаК или Белок А, связывали с покрытыми хелатом глутатиона акцепторными бусинами. AlphaScreen применяли в качестве анализа прямого связывания, в котором взаимодействия Fc/лиганд Fc сближают донорные и акцепторные бусины с получением измеряемого сигнала. Кроме того, AlphaScreen применяли в качестве конкурентного анализа для скрининга полученных полипептидов Fc. В отсутствии конкурирующих полипептидов Fc антитело дикого типа и FcRn взаимодействуют и дают сигнал при 520-620 нм. Немеченые домены Fc конкурируют с взаимодействием Fc дикого типа/FcRn, количественно уменьшая флуоресценцию, что облегчает определение значений относительной аффинности к связыванию.

Пример 3. Способности к связыванию FcRn Fc-вариантов.

Аффинность к связыванию Fc IgG1 с FcRn измеряли с помощью вариантных антител с использованием технологии AlphaScreen . Полипептиды Fc представляли собой часть Алемтузумаба или Трастузумаба. Алемтузумаб (Кэмпас®, Ilex) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, в настоящее время разрешенное для лечения В-клеточного хронического лимфолейкоза (Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35:118-127, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Трастузумаб (Герцептин®, Genentech) представляет собой антитело анти-HER2/neu для лечения метастатического рака молочной железы.

Получали данные конкурирующего AlphaScreen и в результате измеряли относительное связывание Fc-вариантов по сравнению с антителом дикого типа в 0,1 М фосфате натрия pH 6,0 м с 25 мМ хлоридом натрия. Примеры сигнала AlphaScreen как функции конкурирующего антитела показаны на фиг.12. Показаны кривые 12 для вариантов, кривые P257L, P257N, V279E, V279Q, V279Y, ^281S, E283F, V284E, L306Y, T307V, V308F и Q311V демонстрируют повышенную аффинность, т.к. кривая каждого варианта смещена в левую сторону относительно кривой дикого типа. Данные конкурентного AlphaScreen для Fc-вариантов согласно настоящему изобретению суммированы на фиг.13 и 14. Дополнительные данные конкурентного AlphaScreen в 0,1М фосфате натрия pH 6,0 с 125 мМ хлоридом натрия суммированы на фиг.21. Приведены данные относительного связывания с FcRn варианта по сравнению с диким типом. Значения больше единицы демонстрируют улучшенное связывание Fc-варианта с FcRn по сравнению с диким типом. Например, варианты E283L и V284E обладают в 9,5 и 26 раз более сильным связыванием, чем дикий тип соответственно. Измерения поверхностного плазмонного резонанса многих вариантов также показывают увеличенное связывание с FcRn, как показано на фиг.15 и 16.

В положении 257 все варианты, у которых отсутствует аминокислота, пролин, и заменена аминокислота без N остова на ковалентную связь боковой цепи, придают остову больше гибкости, предоставляющей больше свободного пространства для домена Fc для лучшего связывания FcRn. В частности, варианты в положении 257 с L и N обладают сильным связыванием FcRn при pH 6, демонстрируя, что четырехатомная боковая цепь и паттерн гамма-разветвления боковой цепи помогает домену Fc осуществлять продуктивные, т.е. сильные взаимодействия с FcRn. Положение 308 взаимодействует с положением 257. Оба этих положения в свою очередь взаимодействуют с Н310, который напрямую включен во взаимодействия Fc/FcRn (Таблица 2, Burmeister et al (1994) Nature 372:379-383, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Fc-варианты V308F и V08Y демонстрируют 2,9-кратное и 4,3-кратное повышение аффинности к FcRn по сравнению с диким типом (фиг.13). Положения 279 и 385 взаимодействуют с FcRn, т.к. варианты V279E, V279Q и V279Y, и G385H, и G385N все обладают более сильными взаимодействиями с FcRn. Данные варианты все представлены по отношению к аминокислотам, которые могут образовывать водородные связи. Последовательности областей Fc IgG1 человека, содержащие различные модификации согласно настоящему изобретению, показаны на фиг.23.

Fc-вариант N434Y обладает наиболее сильным связыванием с FcRn при pH 6,0, как показано на фиг.13. Один вариант N434Y обладает 16-кратно увеличенным связыванием. Комбинации данного варианта с другими модификациями приводили к еще более сильному связыванию. Например, P257L/N434Y, ^281S/N434Y и V308F/N434Y демонстрируют 830-кратное, 180-кратное и 350-кратное увеличение в связывании с FcRn.

Пример 4. Варианты, содержащие инсерции и делеции.

Осуществляли инсерции и делеции, изменяющие силу взаимодействий Fc/FcRn, и измеряли их способности к связыванию с различными лигандами Fc. Создавали Fc-вариант, содержащий встроенный остаток Ser между остатками 281 и 282 с использованием нумерации EU Kabat et al, с увеличением способностей к связыванию с FcRn домена Fc. Данный вариант обозначается как ^281S, при этом "^" означает инсерцию после указанного положения. Данные AlphaScreen , демонстрирующие улучшенное связывание ^281S, показаны на фиг.12b и 21а. Встроенная последовательность, которая может представлять собой несколько остатков, указана после номера положения. Fc-вариант создавали в каппа, антителе анти-HER2 IgG1 трастузумабе (Герцептин®, Genentech) с использованием способов, указанных в настоящем описании. Инсерция на участке между остатками 281 и 282 приводит к смещению остатков петли Fc, С-концевых к остатку 281, к С-концу петли и изменению положения боковой цепи. Fc-варианты, содержащие замены в положениях 282, 283 и 284 показывали, что С-концевое смещение данной петли являлось подходящим (см. фиг.14). Также создавали другой вариант, делецию N286, иногда обозначаемую N286#, в результате чего происходило смещение положения данной петли, связывающей FcRn. Указанный вариант демонстрирует увеличенное связывание с FcRn при pH 6,0 (фиг.14b).

Данные AlphaScreen демонстрируют связывание варианта ^281S и других вариантов с FcRn. Указанные данные AlphaScreen получали в результате анализа прямого связывания. Более высокие уровни хемилюминесцентных сигналов демонстрируют более сильное связывание. Т.к. концентрации вариантов повышают в данном анализе, получают более сильные сигналы. Указанные данные при pH 6,0, на фиг.17а и 17b демонстрируют повышенную аффинность ^281S, P257L, P257L/^281S (комбинированный вариант с заменой/инсерцией) и других вариантов по сравнению с Fc дикого типа. Также представлена двойная замена T250Q/M428L, ранее показанная, как обладающая увеличенным временем полужизни у обезьян (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Одна инсерция ^281S приводит к увеличению связывания Fc/FcRn. Кроме того, ^281S также приводит к увеличению связывания P257L, когда эти две модификации комбинируют в варианте P257L/^281S, как показано на данных ~40 нМ. Данные на фиг.17 с показывают, что данные варианты не демонстрируют увеличенное связывание FcRn при at pH 7,0. Пониженная аффинность при pH 7,0 необходима для увеличенного времени полужизни in vivo, т.к. позволяет высвобождать полипептиды Fc из FcRn во внеклеточное пространство, важный этап в рециркуляции Fc.

Эксперименты методом поверхностного плазмонного резонанса также демонстрируют улучшенное связывание ^281S с FcRn. На фиг.18 показаны единицы отклика, полученные в результате связывания различных Fc-вариантов с FcRn на поверхности чипа. После полного связывания варианта с чипом единицы отклика регистрируют и отмечают на ординате. Инсерция ^281S демонстрирует способности к связыванию, сопоставимые с другими вариантами, которые указаны в настоящем описании как обладающие повышенной аффинностью к FcRn по сравнению с диким типом (в качестве примеров, см. фиг.13, 14 и 15).

Вариант делеции, содержащий делецию N286, N286#, также демонстрирует повышенную аффинность к FcRn по сравнению с диким типом. Данный вариант обладает 2,0-кратным увеличением аффинности к FcRn, как показано на фиг.13. Указанные данные также представляют собой данные AlphaScreen , полученные в результате конкурентного эксперимента при pH 6,0. Данные варианты используют для ингибирования связывания Fc дикого типа, соединенного с донорной бусиной, с FcRn, соединенным с акцепторными бусинами. Было необходимо в два раза меньшее количество свободного N286#, по сравнению с Fc дикого типа, для ингибирования связывания донорных/акцепторных бусин посредством комплекса Fc/FcRn. Это демонстрирует в два раза более прочное связывание N286# по сравнению с диким типом.

Другие Fc-варианты, содержащие инсерции или делеции, обладают пониженной аффинностью к FcRn. Вариант инсерции ^254N обладает значительно уменьшенным связыванием с FcRn, относительно ожидаемого, исходя из природы и положений указанного варианта. В данном варианте инсерция, Asn, расположена в середине петли, связывающей FcRn. Данная инсерция обладает только 1,1% аффинности от аффинности связывания дикого типа (фиг.13).

Пример 5. Комбинированные варианты с измененными характеристиками в отношении FcRn и FсгаммаR

Как показано на фиг.13b, для антитела анти-HER2 Fc-вариант P257L обладает повышенной аффинностью к FcRn по сравнению с WT. P257L давал среднее значение 2,6-кратного повышения аффинности к FcRn в отношении FcRn человека, pH 6,0 в фосфатном буфере с добавленным 25 мМ NaCl. В результате добавления I332E или S239D/I332E к варианту P257L получали двойные и тройные варианты, P257L/I332E и S239D/P257L/I332E, сохраняющие повышенную аффинность к FcRn. Вариант S239D/I332E обладает по существу неизмененным связыванием с FcRn по сравнению с диким типом, как показано в анализах AlphaScreen на фиг.14b. Данные двойные и тройные варианты обладали 5- и 4-кратно повышенной аффинностью. Варианты I332E и S239D/I332E обладают улучшенным связыванием с FсгаммаR, в частности с FсгаммаRIIIа (См. US 11/124620, который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки). Способности к связыванию FсгаммаR некоторых вариантов согласно настоящему изобретению показаны на фиг.25. Способности к связыванию белка А некоторых вариантов согласно настоящему изобретению показаны на фиг.26. Связыванием с белком А часто используют во время очистки белков, содержащих Fc. Замена V308F также улучшает связывание FcRn при pH 6,0 (фиг.13е). V308F обладает 3-кратно повышенной аффинностью как одна замена в антителе анти-HER2, трастузумабе (Герцептин , Genentech), и также обладает повышенной аффинностью при комбинировании с заменами, увеличивающими связывание FсгаммаR, такими как I332E, S239D/I332E и S298A/E333A/K334A (Lazar et al. 2006 Proc. Nat. Acad. Sci USA. 103(111):4005-4010, Shields et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Увеличенное связывание G385H с FcRn также сохраняется при комбинировании с улучшающими связывание FсгаммаR заменами, особенно в варианте с тройной заменой S239D/I332E/G385H.

Варианты, обладающие увеличенным связыванием с FcRn, могут быть комбинированы с вариантами, уменьшающими или исключающим связывание с FсгаммаR и белком комплемента C1q. Улучшенное связывание с FcRn усиливает эффект от защищающего рецептора, приводя к увеличенному времени полужизни. Белки, содержащие Fc, также могут быть введены в клетки и метаболизированы посредством их взаимодействия с FсгаммаR и белком C1q. В случае если взаимодействия Fc/FcгаммаR и F с/белок C1q не являются необходимыми для эффективности антитела, могут быть осуществлены делеции данных взаимодействий. Делеции данных взаимодействий также могут уменьшать эффект разрушающего рецептора, тем самым также приводя к увеличенному времени полужизни. В частности, варианты 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325А, 325L и 328R (US 11/396495, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) могут быть комбинированы с вариантами, улучшающими связывание FcRn с получением вариантов, обладающих повышенной аффинностью к FcRn и пониженной аффинностью к FсгаммаR или C1q. Данные варианты включают 235G/257C, 325А/385Н, 325A/257L, 234G/308F, 234G/434Y и 269R/308F/311V. Указанные варианты могут быть получены в доменах Fc IgG1, несмотря на то, что уменьшенные взаимодействия с FсгаммаR или C1q могут быть также получены путем введения данных мутаций в белки, содержащие домены Fc IgG2, IgG4 или IgG3. Внесение модификаций FcRn, таких как 257N, 257L, 257М, 308F, 311V, в IgG2 приводит к уменьшению связывания с FсгаммаR и увеличенным взаимодействиям с FcRn.

Варианты, обладающие уменьшенным связыванием с FcRn, могут быть комбинированы с вариантами, обладающими увеличенным связыванием с FсгаммаR или C1q. Уменьшенное связывание с FcRn, комбинированное с увеличенным связыванием с FсгаммаR, может быть полезным для увеличения количества содержащего Fc белка, доступного для вызова эффекторных функций. Уменьшение связывания с FcRn может приводить к уменьшению количества содержащего Fc белка, секвестрированного FcRn, и таким образом влиять, на биодоступность. Модификации, такие как I253V, S254N, S254# (делеция 254), Т255Н и H435N, уменьшают связывание Fc/FcRn (фиг.13) и могут быть комбинированы с вариантами, обладающими улучшенным связыванием с FсгаммаR, такими как S239D, I332E, Н268Е, G236A. Полученные домены Fc, такие как домены, содержащие I253V/S239D/I332E, I332E/H435N или S254N/H268E, обладают уменьшенным связыванием FcRn и увеличенным связыванием FсгаммаR.

Варианты, обладающие уменьшенным связыванием FcRn, могут быть комбинированы с вариантами, обладающими уменьшенным связыванием FсгаммаR. Данная комбинация уменьшенного связывания с FcRn и FсгаммаR является полезной в областях применения, таких как визиография, при которой содержащий Fc белок подвергают мечению радиоактивной или токсичной меткой. В идеальном случае время полужизни белка, содержащего радиоактивную метку, сходно со временем полужизни радионуклида самого по себе. Это обеспечивает выведение метки из организма в то же самое время, что и распад радионуклида. Уменьшенные взаимодействия FсгаммаR также обеспечивают оптимальную доступность содержащего Fc белка для мишени. Например, в случае, если содержащий Fc белок представляет собой антитело, уменьшение связывания FcгаммаR позволяет большему числу антител быть доступными для антигена. Комбинации вариантов, влияющих на FcRn и FсгаммаR, таких как 235G/254N, 236R/435N, 269R/I253V подходят для данного применения.

Пример 6. Fc-варианты в связывании антитела OST577 с FcRn человека.

OST577 представляет собой антитело к поверхностному антигену вируса гепатита В (Ehrlich et al. (1992) Hum. Antibodies Hybridomas 3:2-7, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Последовательности тяжелых и легких цепей были взяты из базы данных Kabat с KADBID 000653 (тяжелая) и KADBID 007557 (легкая) (Martin AC, Proteins. 1996 Мау; 25(1):130-3, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). ДНК, кодирующие указанные тяжелые и легкие цепи, были синтезированы Blue Heron Biolotechnology, Bothell, WA. Антитела OST577 дикого типа и вариантные антитела OST577 экспрессировали и очищали, как и в случае вариантов анти-HER2 (трастузумаб) в ПРИМЕРЕ 1. Анализы связывания Biacore осуществляли, как описано в ПРИМЕРЕ 2, с гибридным белком FcRn человека/глутатион-D-трансфераза (GST), присоединенным к поверхности чипа. Как показано на фиг.19, Fc-варианты согласно настоящему изобретению обладают измененным связыванием с FcRn человека. Варианты, обладающие увеличенным связыванием, легче присоединяются к FcRn на поверхности и вызывают большее увеличение единиц отклика (RU's). Все варианты, показанные с модификацией в области связывания с FcRn, обладают повышенной аффинностью к FcRn, по сравнению с белком дикого типа. Данные варианты включают P257L, P257N, V308F, N434Y, P257L/N434Y и P257L/V308F. Было показано, что вариант с третьими наибольшими RU при 975 секундах, T250Q/M428L, увеличивает время полужизни антител OST577 у макак (Hinton et al. 2004 Journal of Biological Chemistry 279(8):6213-6216, Hinton et al. 2006 Jounal of Immunology 176:346-356, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). В указанный набор данных включено антитело, содержащее константную область тяжелой цепи гибрида IgG1/IgG2, содержащую замены S239D/I332E. Как описано в примере. 5, данные замены повышают аффинность указанного антитела к FсгаммаR. Как показано на фиг.19, данные замены не изменяют способности к связыванию FcRn, т.к. Biacore следы гибрида S239D/I332E перекрываются со следами дикого типа, содержащими каппа и лямбда домены CL1.

Пример 7. Аффинность Fc-вариантов к FcRn человека, обезьяны и мыши.

Fc-варианты в антителе анти-HER2, трастузумабе, получали как описано в примере 1. Следы поверхностного плазменного резонанса (SPR) получали как описано в примере 2, за исключением того, что FcRn человека, макаки или мыши присоединяли к поверхности чипа. Составляли две кривые ППР для каждого Fc-варианта с различными количествами GST-FcRn, присоединенного к поверхности. Каждую кривую подгоняли к модели связывания Ленгмюра и два полученных значения Kd усредняли с получением характерного значения для каждой пары вариант-рецептор. Результаты представлены на фиг.20 в виде кратного увеличения Kd по сравнению с трастузумабом дикого типа. Например, вариант V308F/Q311V обладает в 3,4 раза более прочным связыванием с FcRn человека, по сравнению с диким типом. V308F/Q311V также обладает в 3,7 и 5,1 раза более прочным связыванием с FcRn обезьяны и мыши соответственно. Было показано, что вариант M428L увеличивает время полужизни антитела (Hinton et al. 2004 Journal of Biological Chemistry 279(8):6213-6216, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) и обладает 2,4-, 2,0 и 2,1-кратно увеличенным связыванием с FcRn человека, обезьяны и мыши соответственно. Другие варианты, включая P257L, P257N, N434Y, Q311V, V308F, V308F/N434Y, P257L/V308F и P257L/N434Y, также демонстрируют увеличенное связывание при pH 6,0.

Пример 8. Fc-варианты Rn в различных доменах Ас.

Варианты согласно настоящему изобретению могут быть включены в любой константный домен с использованием технологий молекулярной биологии и очистки, указанных в настоящем описании, включая описанные в примере 1. Аминокислотные последовательности константных доменов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 могут быть использованы, как приведено на фиг.2. Кроме того, могут быть использованы комбинации двух или более различных константных доменов. Например, на фиг.24 перечислены некоторые из модификаций, включенных согласно настоящему изобретению в гибрид IgG1 и IgG2. Данный гибрид содержит домен СН1 IgG2 и домены СН2 и СН3 IgG1. IgG3 обладает более коротким временем полужизни у людей, по сравнению с IgG1, IgG2 и IgG4 (7 дней, по сравнению с ~21 днем, Janeway, Travers, Walport, Shiomchik. Immunology, 5^th ed. Garland Publishing c2001, фиг.4-16, полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки) и следовательно необходим в некоторых областях применения.

Пример 9. Получение варианта в антителе анти-VEGF.

Антитела анти-VEGF, обладающие измененным связыванием, получали с использованием способов, указанных в настоящем описании, включая пример 1. Тяжелая цепь анти-VEGF дикого типа содержит следующую последовательность аминокислот:

Легкая цепь анти-VEGF дикого типа содержит следующую последовательность аминокислот:

Отдельные и комбинированные варианты, обладающие измененным связыванием, включают варианты, показанные на фиг.28, которая демонстрирует полученные варианты, объем используемых культурных сред и полученный выход вариантов антител. Нумерация указанных вариантов приведена согласно индексу EU, как у Kabat et al. Варианты, перечисленные на фиг.28, получали либо в IgG1, либо в гибридной VH, содержащей последовательности как IgG1, так и IgG2. Данные варианты содержат вариабельную область, связывающую антиген VEGF. Оценка всех белков путем эксклюзионной хроматографии и электрофореза в геле в присутствии додецилсульфата натрия показала чистоту >90%.

Пример 10. Время полужизни вариантов антител in vivo

Исследовали на мышах фармакокинетические характеристики антител дикого типа и вариантных антител. Используемые мыши не экспрессировали FcRn мыши (мыши В6-Fcgrt^Tm1Dcr ) и были гетерозиготными в отношении «нокина FcRn человека (hFcRn Tg - трансген), как описано в Petkova et al. International Immunology 2006 Dec; 18(12):1759-69. Petkova et al показали, что вариант N434A обладает увеличенным временем полужизни у данных мышей с «нокином FcRn человека, которое соответствует более ранним результатам, демонстрирующим, что вариант N434A обладает увеличенным временем полужизни у обезьян (заявка США No.11/208422, номер публикации US 26067930 A1). 9-12 недельным самкам мышей вводили внутривенно путем инъекции 2 мг/кг антитела в группах по 6 мышей на одно антитело. Образцы крови собирали через один час и 1, 4, 8, 11, 15, 18, 21, 25 и 28 дней из орбитального изгиба. Концентрацию каждого антитела в сыворотке измеряли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) «сэндвич»-типа с использованием античеловеческих антител Fc и детекции с использованием европия.

На фиг.27 показаны результаты исследования, которые представляют собой репрезентативные данные двух отдельных исследований. Показано среднее и стандартное отклонение среднего значения для четырех образцов. Очевидно, что вариант V308F обладает более продолжительным временем полужизни, оставаясь при измеримых концентрациях до 25 дней. Дикий тип и варианты P257L и P257N выводятся быстрее, обладая измеримыми концентрациями до 15, 8 и 4 дней соответственно. Концентрации в сыворотке в виде функции времени подгоняли к некомпартментной модели с использованием пакета программ WinNonLin (Pharsight Inc). Конечное время полужизни варианта V308F составляло 4,9 дней, в то время как конечное время полужизни дикого типа и вариантов P257L и P257N составляло 3,0, 1,9 и 0,9 дней соответственно. Площадь под кривыми (ППК) варианта V308F составляла 129 день*мкг/мл, в то время как площади под кривыми дикого типа и вариантов P257L и P257N составляли 70, 38 и 38 день*мкг/мл соответственно.

Пример 11. Эксперименты по связыванию FcRn при pH 6,0.

Варианты анти-VEGF согласно настоящему изобретению тестировали на предмет их способности связываться с FcRn человека с помощью анализов Biacore, как описано в примере 2 с некоторыми модификациями. FcRn человека ковалентно присоединяли к чипу СМ5 в 10 мМ ацетате натрия, pH 4,5 с использованием N-гидроксисукцинимид/N-этил-N'-(-3-диметиламинопропил)карбодиимида (NHS/EDC) при скорости потока 5 мкл/мин. Используемый FcRn человека содержал GST и HIS-меченый вариант для облегчения очистки и других анализов. Приблизительно 3300 RU FcRn присоединяли к чипу. Проточную кювету 1 обрабатывали NHS/EDC в качестве отрицательного контроля связывания. Подвижный буфер представлял собой 25 мМ фосфатный буфер pH 6,0, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества Р20. Антитела смывали с чипа FcRn тем же буфером при pH 7,4, который быстро удалял все тестируемые варианты. Следы ассоциации и диссоциации biacore подгоняли к конформационной модели обмена для расчета кажущейся константы равновесного связывания, Kd.

Указанные результаты демонстрируют, что вариант V308F и многие другие варианты обладают улучшенным связыванием с FcRn. Для антитела анти-VEGF дикого типа Kd составляла 18 нМ, что значительно отличается от значения по данным Dall' Acqua et al (Dall' Acqua et al Journal of Immunology 2002, 169:5171-5180) из-за отличий в проведении анализа и согласовании данных. Представленный формат анализа приводил к воспроизводимым результатам в случае, если чип FcRn использовали вскоре после получения. Однако чип FcRn распадался при использовании, возможно, из-за диссоциации одной из двух цепей FcRn с поверхности. Результаты демонстрируют измененное связывание указанных вариантов по сравнению с анти-VEGF дикого типа. На фиг.29 показано кратное увеличение силы связывания по сравнению с контролем дикого типа. Значения больше единицы показывают, что вариантное антитело обладает более высокой аффинностью к FcRn, чем белок дикого типа. Вариант V308F, например, связывает FcRn в 4,5 раза более прочно, чем антитело дикого типа. Вариант V308F/M428L связывает FcRn в 12,3 раза более прочно, а вариант T307P/V308F связывает FcRn в 3,16 раза более прочно, чем белок дикого типа. Варианты, показанные на фиг.29, не обладают пониженной аффинностью к FcRn по сравнению с диким типом (значения были бы меньше 1,0). Вариант N434S обладает аффинностью к связыванию с FcRn в 4,4 раза более сильной, чем дикий тип, сопоставимой с V308F.

Пример 12. Эксперименты по связыванию с трансмембранным FcRn.

Альфа-цепь FcRn и кДНК бета-2-микроглобулина заказывали у OriGene Technologies Inc (Rockville, MD) и трансфицировали в клетки 293Т и в результате происходила экспрессия функционального FcRn на поверхности клетки. 20 мкг Fcgrt и 40 мкг ДНК бета-2-микроглобулина трансфицировали при помощи липофектамина (Invitrogen Inc.) и клетки оставляли для роста в течение трех дней в средах DMEM с 10% сывороткой со сверхнизким содержанием IgG. Также выращивали контрольные клетки, не трансфицированные двумя цепями FcRn. Различные количества антител анти-VEGF (дикий тип и варианты) связывали с клетками на 30 минут в 25 мМ фосфатном буфере pH 6,0, 150 мМ NaCl, 0,5% BSA, а затем 6-9 раз промывали в 25 мМ фосфатном буфере pH 6,0, 150 мМ NaCl, 0,5% BSA плюс 0,003% игепал. После промывки антитела фиксировали на поверхности путем обработки со связыванием 1% PFA. Затем связанные антитела обнаруживали с использованием Fab'₂, меченых РЕ, к доменами Fab человека и измеряли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с использованием BD FACS Canto II. Средние значения двух образцов для каждого антитела представлены на фиг.30. Совпадения кривых данным на фиг.30 не предоставляют интерпретируемых значений ЕС50, т.к. многие кривые не образуют верхнюю базовую линию при насыщении клеток. Однако антитела могут быть ранжированы в порядке их аффинности к связыванию путем представления log[вариант], при котором MFI равна 3000, EC(MFI=3000). С использованием данного показателя антитела могут быть перечислены в порядке от самой сильной аффинности к FcRn до самой слабой аффинности к FcRn следующим образом: V308F/M428L, V259I/V308F, T250I/V308F, T250Q/M428L, N434S, T307Q/V308F, P257L, T307S/V308F, V308F, T256V/V308F, V308F/L309Y и дикий тип.

Пример 13. Характеристики варианта, 434S.

Антитела, содержащие модификацию 434S, обладают наиболее подходящими свойствами, которые делают их предпочтительными вариантами согласно настоящему изобретению. В IgG1 человека остаток дикого типа представляет собой аспарагин, Asn, в положении 434 таким образом, что данный вариант может быть обозначен N434S в контексте IgG1 или других доменов Fc, содержащих Asn, N, в положении 434. В общем, данный вариант может быть обозначен просто 434S. В настоящем описании вариант 434S был успешно получен как в антителе анти-HER2, трастузумабе, так и в антителе анти-VEGF.

Ser в положении 434 обладает способностью образовывать водородные связи с FcRn либо напрямую, либо опосредованно, т.е. опосредовано водой или молекулами растворенного вещества. Гамма-кислород Ser в положении 434 находится поблизости от карбонильных атомов кислорода Gly131 и Pro134 молекулы FcRn, как показано на фиг.32. На фиг.32 показана модель домена Fc человека в комплексе с FcRn человека. Домен Fc в указанной модели содержит замену 434S, следовательно остаток 434 в Ser на фиг.32. Указанная модель создана с помощью технологий PDA® (Dahiyat and Mayo Protein Sci. 1996 May; 5(5):895-903), кристаллической структуры домена Fc крысы, связанного с FcRn крысы (Martin et al. Mol Cell. 2001 Apr; 7(4):867-77), и Pymol (Delano Scientific). Небольшого размера Ser легко размещается между двумя белками.

Вариант антитела N434S обладает 4,4-кратно повышенной аффинностью к связыванию по отношению к FcRn по сравнению с антителом дикого типа, как показано путем измерений системной Biacore (фиг.29). Указанный вариант также демонстрирует увеличенное связывание с FcRn, связанным с поверхностью клетки, как показано путем измерений подсчета клеток (фиг.30).

Исходя из результатов, показанных на фиг.29 и 30, предполагают, что предпочтительные варианты, содержащие 434S и другие модификации, включают V308F/434S, 428L/434S, 252Y/434S, 259I/308F/434S, 250I/308F/434S и 307Q/308F/434S.

Пример 14. Дополнительные варианты

Дополнительные варианты могут быть основаны на данных, содержащихся в настоящем описании и литературе (Dall' Acqua et al Journal of Biological Chemistry 2006 Aug 18; 281(33):23514-24; Petkova et al. International Immunity 2006 Dec; 18(12):1759-69; Dall' Acqua et al Journal of Immunology 2002, 169:5171-5180; Hinton et al, Journal of Biological Chemistry 2004 279(8):6213-6216; Shields et al. Journal of Biological Chemistry 2001 276(9):6591-6604; Hinton et al. Journal of Immunology 2006, 176:346-356, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Данные варианты включают варианты, приведенные на фиг.31.

Исходя из результатов, приведенных на фиг.29 и 30, и результатов Dall' Acqua et al (Journal of Biological Chemistry 2006 Aug 18; 281(33):23514-24, включенный в настоящее описание посредством отсылки), предпочтительные варианты включают Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, M252Y/S254T/T256E/N434S, M252Y/S254T/T256E/V308F, M252Y/S254T/T256E/M428L, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L и T250Q/V308F/M428L.

Исходя из результатов, приведенных на фиг.29 и 30, более предпочтительные варианты включают Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S. T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L и T250Q/V308F/M428L.

В то время как конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше для иллюстрации, для специалистов в данной области техники очевидно, что могут быть осуществлены многочисленные вариации деталей в объеме настоящего изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения. Содержание всех указанных источников полностью включено в настоящее описание.