твердые формы n-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил-)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида

Формула изобретения

1. N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамид, характеризуемый как Форма А, где эта Форма А характеризуется пиком при приблизительно 7,9 градуса, пиком при приблизительно 11,9 градуса, пиком при приблизительно 14,4 градуса и пиком при приблизительно 15,8 градуса в порошковой рентгенограмме.

2. Форма А по п.1, где эта Форма А характеризуется следующими пиками в порошковой рентгенограмме: приблизительно 7,9, приблизительно 9,3, приблизительно 11,9, приблизительно 14,4, приблизительно 15,1, приблизительно 15,8, приблизительно 17,0, приблизительно 17,7, приблизительно 19,3, приблизительно 20,1, приблизительно 21,4, приблизительно 21,8, приблизительно 23,4, приблизительно 23,8, приблизительно 25,6, приблизительно 26,8, приблизительно 29,4, приблизительно 29,7, приблизительно 30,1 и приблизительно 31,2 градуса.

3. Форма А по п.1, где эта Форма А характеризуется дифрактограммой, показанной на Фигуре 1.

4. Фармацевтическая композиция для лечения или ослабления тяжести CFTR-опосредованного заболевания, содержащая Форму А по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый адъювант или носитель.

5. Применение Формы А в соответствии с п.1 для получения лекарственного средства для лечения или ослабления тяжести заболевания пациента, где указанное заболевание выбрано из муковисцидоза, индуцированного дымом COPD, панкреатита, недостаточности поджелудочной железы, наследственной эмфиземы, хронического обструктивного заболевания легких (COPD) и болезни сухих глаз.

6. Применение по п.5, где указанным заболеванием является муковисцидоз.

7. Набор для применения в измерении активности CFTR или его фрагмента в биологической пробе in vitro или in vivo, содержащий:

(i) композицию, содержащую Форму А по любому из пп.1-3;

(ii) инструкции для:

a) контактирования этой композиции с этой биологической пробой;

b) измерения активности указанного CFTR или его фрагмента.

8. Набор по п.7, дополнительно содержащий инструкции для:

a) контактирования дополнительного соединения с биологической пробой;

b) измерения активности указанного CFTR или его фрагмента в присутствии указанного дополнительного соединения, и

c) сравнения активности CFTR или его фрагмента в присутствии дополнительного соединения с активностью CFTR или его фрагмента в присутствии Формы А по любому из пп.1-3.

9. Набор по п.8, где стадия сравнения активности указанного CFTR или его фрагмента обеспечивает меру плотности указанного CFTR или его фрагмента.

10. Способ модуляции активности CFTR в биологической пробе, предусматривающий стадию контактирования указанного CFTR с Формой А по любому из пп.1-3.

11. Форма А по п.1, имеющая следующие размеры элементарной ячейки кристалла:

а=19,2 Å (ангстрем);

b=19,2 Å (ангстрем) и

с=33,7 Å (ангстрем).

12. Кристаллическая форма N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, имеющая тригональную сингонию, пространственную группу R-3 и следующие размеры элементарной ячейки:

а=19,2 Å (ангстрем);

b=19,2 Å (ангстрем);

с=33,7 Å (ангстрем);

=90°;

=90° и

=120°.

Описание изобретения к патенту

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Эта заявка испрашивает приоритет Предварительной Заявки US 61/107813, поданной 23 октября 2008 года, озаглавленной "ТВЕРДЫЕ ФОРМЫ N-(4-(7-АЗАБИЦИКЛО[2.2.1]ГЕПТАН-7-ИЛ)-2-(ТРИФТОРМЕТИЛ)ФЕНИЛ)-4-ОКСО-5-(ТРИФТОРМЕТИЛ)-1,4-ДИГИДРОХИНОЛИН-3-КАРБОКСАМИДА , все содержание которой включено сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[002] Данное изобретение относится к формам твердого состояния, например кристаллическим формам N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, который является модулятором регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (фиброзно-кистозной дегенерации (поджелудочной железы) ("CFTR"). Это изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим в себя кристаллические формы N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, и относящимся к ним способам.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Транспортеры АТФ-кассеты являются семейством мембранных транспортерных белков, которые регулируют транспорт большого разнообразия фармакологических агентов, потенциально токсических лекарственных средств и ксенобиотиков, а также анионов. Они являются гомологичными мембранными белками, которые связывают и используют клеточный аденозинтрифосфат (АТФ) для их специфических активностей. Некоторые из этих транспортеров были обнаружены в виде белков устойчивости ко множественным лекарственным средствам (таких как MDR1-P гликопротеин или белок устойчивости ко множественным лекарственным средствам, MRP1), защищающим злокачественные раковые клетки против химиотерапевтических агентов. До настоящего времени 48 таких транспортеров были идентифицированы и сгруппированы в 7 семейств на основе идентичности их последовательностей и функции.

[004] Одним членом семейства транспортеров АТФ-кассеты, обычно ассоциированным с заболеванием, является цАМФ/АТФ-опосредуемый анионный канал, CFTR. CFTR экспрессируется в разнообразных типах клеток, в том числе всасывающих клетках и секреторных эпителиальных клетках, где он регулирует поток анионов через мембрану, а также активность других ионных каналов и белков. В эпителиальных клетках нормальное функционирование CFTR является критическим для поддержания транспорта электролитов через тело, в том числе респираторную и дигестивную ткань. CFTR состоит из приблизительно 1480 аминокислот, которые кодируют белок, образованный из тандемного повтора трансмембранных доменов, каждый из которых содержит шесть трансмембранных спиралей и нуклеотидсвязывающий домен. Эти два трансмембранных домена связаны в большой, полярный, регуляторный (R)-домен со множественными сайтами фосфорилирования, которые регулируют активность канала и клеточную направленную миграцию.

[005] Ген, кодирующий CFTR, был идентифицирован и секвенирован (См. Gregory, R. J. et al. (1990) Nature 347:382-386; Rich, D. P. et al. (1990) Nature 347:358-362), Riordan, J. R. et al. (1989) Science 245:1066-1073). Дефект в этом гене вызывает мутации в CFTR, приводящие к муковисцидозу ("CF"), наиболее жизнеугрожающему генетическому заболеванию у людей. Муковисцидоз поражает приблизительно одного в каждых из 2500 младенцев в Соединенных Штатах. В общей популяции Соединенных Штатов, до 10 миллионов людей несут единственную копию этого дефектного гена без видимых патологических эффектов. В противоположность этому индивидуумы с двумя копиями CF-ассоциированного гена страдают от истощения и жизнеугрожающих действий CF, в том числе хронического заболевания легких.

[006] У пациентов с муковисцидозом мутации в CFTR, эндогенно экспрессируемом в респираторном эпителии, приводят к уменьшенной апикальной секреции анионов, вызывающей дисбаланс в транспорте ионов и жидкостей. Полученное уменьшение в транспорте анионов способствует усиленному накапливанию слизи в легком и сопутствующим микробным инфекциям, которые в конечном счете вызывают смерть у пациентов с CF. Кроме респираторного заболевания пациенты с CF обычно страдают от желудочно-кишечных проблем и недостаточности поджелудочной железы, которая при отсутствии лечения приводит к смерти. Кроме того, большинство мужчин с муковисцидозом являются бесплодными, и фертильность является уменьшенной среди женщин с CF. В отличие от тяжелых действий двух копий CF-ассоциированного гена индивидуумы с единственной копией CF-ассоциированного гена обнаруживают увеличенную устойчивость к холере и дегидратации, происходящей из диареи, что, возможно, объясняется относительно высокой частотой встречаемости гена CF в этой популяции.

[007] Анализ последовательности гена CFTR CF-хромосом выявил разнообразие вызывающих это заболевание мутаций (Cutting, G. R. Et al. (1990) Nature 346:366-369; Dean, M. et al. (1990) Cell 61:863:870; и Kerem, B-S. et al. (1989) Science 245:1073-1080; Kerem, B-S et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8447-8451). К настоящему времени были идентифицированы более 1000 вызывающих заболевание мутаций в гене CF (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/). Наиболее преобладающей мутацией является делеция фенилаланина в положении 508 аминокислотной последовательности CFTR, которую обычно называют F508-CFTR. Эта мутация встречается приблизительно в 70% случаев муковисцидоза и ассоциирована с тяжелым заболеванием.

[008] Делеция остатка 508 в F508-CFTR препятствует точной укладке возникающего белка. Это приводит к неспособности мутантного белка выходить из ER (эндоплазматического ретикулума) и направленно мигрировать к плазматической мембране. В результате, число каналов, присутствующих в этой мембране, является гораздо меньшим, чем число каналов, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих CFTR дикого типа. Кроме нарушенной направленной миграции эта мутация приводит к дефектному воротному механизму ионных каналов. Вместе это уменьшенное число каналов в мембране и дефектный воротный механизм каналов приводят к уменьшенному транспорту через эпителий, приводя к дефектному транспорту ионов и жидкости (Quinton, P. M. (1990), FASEB J. 4: 2709-2727). Исследования показали, что уменьшенные количества F508-CFTR в мембране являются функциональными, хотя в меньшей степени, чем CFTR дикого типа (Dolmans et al. (1991), Nature Lond. 354: 526-528; Denning et at., supra; Pasyk и Foskett (1995), J. Cell. Biochem. 270: 12347-50). Кроме F508-CFTR, R117H-CFTR и G551D-CFTR, другие вызывающие заболевания мутации в CFTR, которые приводят к дефектной направленной миграции, дефектному синтезу и/или воротному механизму ионных каналов, могли бы повышающим или понижающим образом регулироваться для изменения секреции анионов и модификации прогрессирования и/или тяжести заболевания.

[009] Хотя CFTR транспортирует разнообразные молекулы наряду с анионами, ясно, что эта роль (транспорт анионов, хлоридных и бикарбонатных) представляет один элемент в важном механизме транспорта ионов и воды через эпителий. Другие элементы включают в себя эпителиальный Na⁺-канал, ENaC, Na⁺/2Cl^-K⁺-котранспортер, Na⁺-K⁺-АТФ-азный насос и K⁺-каналы базолатеральной мембраны, которые являются ответственными за поглощение хлорида в клетку.

[0010] Эти элементы работают вместе для достижения направленного транспорта через эпителий посредством их селективной экспрессии и локализации в клетке. Абсорбция хлорида происходит в результате координированной активности ENaC и CFTR, присутствующих на апикальной мембране, и Na⁺-K⁺-АТФ-азного насоса и Cl-каналов, экспрессируемых на базолатеральной поверхности клетки. Вторичный активный транспорт хлорида из стороны просвета приводит к накапливанию внутриклеточного хлорида, который может затем пассивно оставлять клетки через Cl^--ионные каналы, приводя к векторному транспорту. Размещение Na⁺/2Cl^-K⁺ ко-транспортера, Na⁺-K⁺-АТФ-азного насоса и К⁺-каналов базолатеральной мембраны на базолатеральной поверхности и CFTR на стороне просвета координируют секрецию хлорида посредством CFTR на стороне просвета. Поскольку вода, возможно, никогда не транспортируется сама, ее протекание через эпителий зависит от очень маленьких трансэпителиальных осмотических градиентов, генерируемых массовым потоком натрия и хлорида.

[0011] Предполагается, что дефектный транспорт бикарбоната вследствие мутаций в CFTR вызывает дефекты в некоторых секреторных функциях. См., например, "Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis," Paul M. Quinton, Lancet 2008; 372: 415-417.

[0012] Мутации в CFTR, которые ассоциированы с умеренной дисфункцией CFTR, являются также очевидными у пациентов с состояниями, которые имеют определенные общие проявления с CF, но не удовлетворяют диагностическим критериям в отношении CF. Они включают в себя врожденное двустороннее отсутствие семявыносящего протока, идиопатический хронический панкреатит, хронический бронхит и хронический риносинусит. Другие заболевания, в которых, как считается, CFTR является фактором риска вместе с генами-модификаторами или факторами окружающей среды, включают в себя первичный склерозирующий холангит, аллергический бронхолегочный аспергиллез и астму.

[0013] Было также продемонстрировано, что дым сигарет, гипоксия и факторы окружающей среды, которые индуцируют гипоксическую передачу сигнала, нарушают функцию CFTR и могут способствовать определенным формам респираторного заболевания, такого как хронический бронхит. Заболевания, которые могут быть обусловлены дефектной функцией CFTR, но не удовлетворяют диагностическим критериям для CF, характеризуются как CFTR-родственные заболевания.

[0014] Кроме муковисцидоза модуляция активности CFTR может быть полезной для других заболеваний, не вызываемых непосредственно мутациями в CFTR, таких как секреторные заболевания и заболевания, связанные с фолдингом других белков, опосредуемым CFTR. CFTR регулирует протекание хлорида и бикарбоната через эпителий многих клеток для регуляции движения жидкости, солюбилизации белков, вязкости слизи и активности ферментов. Дефекты в CFTR могут вызывать блокирование дыхательных путей или протоков во многих органах, в том числе печени и поджелудочной железе. Потенциирующие средства (усилители) являются соединениями, которые усиливают активность воротного механизма CFTR, присутствующего в клеточной мембране. Любое заболевание, которое включает в себя загустение слизи, нарушенную регуляцию жидкости, нарушенный клиренс слизи или блокированные протоки, приводящие к воспалению и деструкции ткани, могло бы быть кандидатом для применения потенциаторов.

[0015] Они включают в себя, но не ограничиваются ими, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), астму, индуцированное дымом COPD, хронический бронхит, риносинусит, констипацию, болезнь сухих глаз и синдром Шегрена, гастроэзофагеальный рефлюкс, желчные конкременты, пролапс прямой кишки и воспалительное заболевание пищеварительного тракта. COPD характеризуется недостаточной проходимостью дыхательных путей, которая является прогрессирующей и неполностью обратимой. Эта недостаточная проходимость дыхательных путей обусловлена гиперсекрецией слизи, эмфиземой и бронхиолитом. Активаторы мутантного CFTR или CFTR дикого типа представляют потенциальное лечение гиперсекреции слизи и нарушенного реснитчатого клиренса, который является обычным в COPD. Конкретно, увеличение секреции анионов через CFTR может способствовать транспорту жидкости в жидкость поверхности дыхательных путей для гидратации слизи и оптимизации вязкости перицилиарной жидкости. Это могло бы приводить к увеличенному мукоцилиарному клиренсу и уменьшению симптомов, ассоциированных с COPD. Кроме того, посредством предотвращения возникающих инфекции и воспаления вследствие улучшенного клиренса дыхательных путей модуляторы CFTR могут предотвращать или замедлять паренхимную деструкцию дыхательных путей, которая характеризует эмфизему, и уменьшать или обращать увеличение числа и размера секретирующих слизь клеток, которое лежит в основе гиперсекреции слизи в заболеваниях дыхательных путей. Заболевание сухих глаз характеризуется уменьшением водного продуцирования слез и отклоняющимися от нормы профилями липидов, белка и муцина слезной пленки. Имеются многочисленные причины сухого глаза, некоторые из которых включают в себя возраст, лазерную хирургию глаз, артрит, лекарственные средства, химические/термические ожоги, аллергии и заболевания, такие как муковисцидоз и синдром Шегрена. Увеличение секреции анионов посредством CFTR могло бы усиливать транспорт жидкости из эндотелиальных клеток роговицы и секреторных желез, окружающих глаз, для увеличения гидратации роговицы. Это помогло бы ослабить симптомы, ассоциированные с болезнью сухих глаз. Синдром Шегрена является аутоиммунным заболеванием, в котором иммунная система атакует продуцирующие жидкость железы во всем теле, в том числе в глазу, во рту, в коже, респираторной ткани, печени, вагине и кишечнике. Симптомы включают в себя сухой глаз, сухость рта и вагины, а также заболевание легкого. Это заболевание ассоциировано также с ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системным склерозом и полимиозитом/дерматомиозитом. Считается, что дефектная направленная миграция белков вызывает это заболевание, для которого возможности лечения являются ограниченными. Модуляторы активности CFTR могут гидратировать различные органы, пораженные этим заболеванием, и могут способствовать облегчению ассоциированных симптомов. Индивидуумы с муковисцидозом имеют рецидивирующие приступы кишечной закупорки и более высокие встречаемости ректального полапса, желчных конкрементов, гастроэзофагеального рефлюкса, желудочно-кишечных (GI) злокачественностей и воспалительного заболевания пищеварительного тракта, что указывает на то, что функция CFTR может играть важную роль в предупреждении таких заболеваний.

[0016] Как обсуждалось выше, считается, что делеция остатка 508 в F508-CFTR препятствует точному фолдингу возникающего белка, приводя к неспособности этого мутантного белка выходить из ER (эндоплазматического ретикулума) и направленно мигрировать к плазматической мембране. В результате, в плазматической мембране присутствуют недостаточные количества этого зрелого белка, и транспорт хлорида в эпителиальных тканях является значимо уменьшенным. Действительно, было показано, что клеточный феномен дефектного ER-процессинга CFTR аппаратом ER лежит в основе не только заболевания CF, но и большого диапазона других изолированных и наследственных заболеваний. Двумя путями, которые могут не срабатывать в аппарате ER, являются либо потеря связывания с ER-экспортом белков, приводящая к деградации, либо ER-накапливание этих дефектных/неправильно уложенных белков [Aridor M, et al., Nature Med., 5(7), pp 745-751 (1999); Shastry, B.S., et al, Neurochem. International, 43, pp 1-7 (2003); Rutishauser, J., et al., Swiss Med WkIy, 132, pp 211-222 (2002); Morello, JP et al., TIPS, 21, pp. 466-469 (2000); Bross P., et al., Human Mut, 14, pp. 186-198 (1999)]. Заболеваниями, ассоциированными с первым классом неправильного срабатывания ER, являются муковисцидоз (обусловленный неправильно уложенным F508-CFTR, описанным выше), наследственная эмфизема (обусловленная -1-антитрипсином; не Piz-варианты), наследственный гемохроматоз, недостаточности свертывания-фибринолиза, такие как недостаточность белка С, наследственный ангионевротический отек Типа 1 (болезнь Квинке), недостаточности процессинга липидов, такие как наследственная гиперхолестеринемия, хиломикронемия Типа 1, абеталипопротеинемия, болезни лизосомного накопления, такие как болезнь клеточных включений (муколипидоз)/псевдо-Гурлер-синдром, мукополисахаридозы (обусловленные ферментами лизосомного процессинга), болезнь Сандхоффа/Тэя-Сакса (обусловленная -гексозаминидазой), болезнь Криглера-Найяра типа II (обусловленная УДФ-глюкуронил-сиаликтрансферазой), полиэндокринопатия/гиперинсулемия, сахарный диабет (обусловленный рецептором инсулина), карликовость лароновского типа (обусловленная рецептором гормона роста), недостаточность миелопероксидазы, первичный гипопаратиреоз (обусловленный препропаратиреоидным гормоном), меланома (обусловленная тирозиназой). Заболеваниями, ассоциированными с последним классом нарушенной функции ER, являются гликаноз CDG типа 1, наследственная эмфизема (обусловленная -1-антитрипсином (PiZ-вариант)), врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез (обусловленный проколлагеном Типа I, II, IV), наследственная гипофибриногенемия (обусловленная фибриногеном), ACT-недостаточность (обусловленная -1-антихимотрипсином), несахарный диабет (DI), нейрофизеальный DI (обусловленный гормоном вазопрессином/V2-рецептором), нефрогенный DI (обусловленный аквапорином II), наследственная невральная амиотрофия Шарко-Мари-Тута (обусловленная периферическим белком миелином 22), суданофильная лейкодистрофия (болезнь Перлицеуса-Мерцбахера), нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (обусловленная -АРР и пресенилинами), болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, несколько полиглутаминовых неврологических нарушений, таких как болезнь Хантингтона (Гентингтона), спиноцеребеллярная (относящаяся к спинному мозгу и мозжечку) атаксия типа I, относящаяся к спинному мозгу и продолговатому мозгу мышечная атрофия, дентаторубральная pallidoluysian и миотоническая дистрофия, а также губчатые энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейтцфельдта-Якоба (обусловленная дефектом процессинга прионовых белков), болезнь Фабри (обусловленная дефектом лизосомной -галактозидазы А), синдром Штаусслера-Шейнкера (обусловленный дефектом процессинга Prp), панкреатит бесплодия, недостаточность поджелудочной железы, остеопороз, остеопения, синдром Горхема, хлоридные каналопатии, врожденная миотония (формы Томсона и Беккера), синдром Барттера типа III, болезнь Дента, врожденная патологически усиленная реакция испуга, эпилепсия, болезнь липосомного накопления, синдром Ангельмана, Первичная Цилиарная Дискинезия (PCD), PCD с situs inversus (также известная как синдром Картагенера), PCD без situs inversus и цилиарной аплазии и болезнь печени.

[0017] Другие болезни, предположительно вызываемые мутацией в CFTR, включают в себя мужское бесплодие, вызываемое врожденным билатеральным отсутствием vas deferens (CBAVD), умеренное легочное заболевание, идиопатический панкреатит и аллергический бронхолегочный аспергиллез (ABPA). См., работу "CFTR-opathies: disease phenotypes associated with cystic fibrosis transmembrane regulator gene mutations," Peader G. Noone and Michael R. Knowles, Respir. Res. 2001, 2: 328-332 (включенную здесь посредством ссылки).

[0018] Наряду с повышающей регуляцией активности CFTR уменьшение секреции анионов CFTR-модуляторами может быть полезным для лечения секреторных диарей, в которых эпителиальный транспорт воды разительно повышается в результате активированного усиливающим секрецию агентом (секретагогом) транспорта хлорида. Этот механизм включает в себя повышение цАМФ и стимуляцию CFTR.

[0019] Хотя имеются многочисленные причины диареи, главные последствия диарейных заболеваний, происходящие из избыточного транспорта хлорида, являются общими для всех и включают в себя дегидратацию, ацидоз, нарушенный рост и смерть. Острые и хронические диареи представляют большую проблему в медицине во многих зонах мира. Диарея является как значимым фактором в истощении, так и главной причиной смерти (5000000 смертей в год) у детей с возрастом менее пяти лет.

[0020] Секреторные диареи являются также опасным состоянием у пациентов с приобретенным синдромом иммунодефицита (СПИД) и хроническим воспалительным заболеванием пищеварительного тракта (IBD). Шестнадцать миллионов путешественников, посещающих развивающиеся страны, из индустриализованных наций каждый год развивают диарею, с тяжестью и количеством случаев диареи, варьирующими в зависимости от конкретной страны и зоны путешествия.

[0021] Таким образом, существует потребность в сильнодействующих и селективных CFTR-потенциаторах (CFTR-усилителях) форм дикого типа и мутантных форм CFTR человека. Эти мутантные формы CFTR включают в себя, но не ограничиваются ими, F508del, G551D, R117H, 2789+5G->A.

[0022] Существует также потребность в модуляторах CFTR-активности и их композициях, которые могут быть использованы для модуляции активности CFTR в клеточной мембране млекопитающих.

[0023] Существует потребность в способах лечения заболеваний, вызываемых мутацией в CFTR, с использованием таких модуляторов активности CFTR.

[0024] Существует потребность в способах модуляции активности CFTR в клеточной мембране ex vivo млекопитающих.

[0025] Кроме того, существует необходимость в стабильных твердых формах указанного соединения, которые могут быть легко использованы в фармацевтических композициях, подходящих для применения в качестве терапевтических веществ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0026] Данное изобретение относится к твердым формам N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (далее называемого здесь "Соединением 1"), которое имеет приведенную ниже структуру:

Соединение 1

[0027] Соединение 1 и его фармацевтически приемлемые композиции применимы для лечения или ослабления тяжести различных заболеваний, нарушений или состояний, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, муковисцидоз, панкреатит, синусит, наследственную эмфизему, наследственный гемохроматоз, недостаточности свертывания-фибринолиза, таких как недостаточность белка С, наследственный ангионевротический отек Типа 1 (болезнь Квинке), недостаточности процессинга липидов, такие как наследственная гиперхолестеринемия, хиломикронемия, абеталипопротеинемия, заболевания лизосомного накопления (или депонирования), такие как болезнь клеточных включений (муколипидоз)/псевдо Гурлер-синдром, мукополисахаридозы, болезнь Сандхоффа/Тэя-Сакса, болезнь Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатию/гиперинсулемию, сахарный диабет, карликовость лароновского типа, недостаточность миелопероксидазы, первичный гипопаратиреоз), меланому, гликаноз CDG типа 1, наследственную эмфизему, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственную гипофибриногенемию, ACT-недостаточность, несахарный диабет (DI), нейрофизеальный DI, нефрогенный DI, наследственную невральную амиотрофию Шарко-Мари-Тута, суданофильную лейкодистрофию (болезнь Перлицеуса-Мерцбахера), нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, несколько полиглутаминовых неврологических нарушений, таких как болезнь Хантингтона (Гентингтона), спиноцеребеллярную (относящуюся к спинному мозгу и мозжечку) атаксию типа I, относящуюся к спинному мозгу и продолговатому мозгу мышечную атрофию, дентаторубральную pallidoluysian и миотоническую дистрофию, а также губчатые энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейтцфельдта-Якоба, болезнь Фабри, синдром Штаусслера-Шейнкера, COPD, болезнь сухих глаз, недостаточность поджелудочной железы, остеопороз, остеопению, синдром Горхема, хлоридные каналопатии, врожденную миотонию (формы Томсона и Беккера), синдром Барттера типа III, болезнь Дента, врожденную патологически усиленную реакция испуга, эпилепсию, заболевание липосомного накопления, синдром Ангельмана, Первичную Цилиарную Дискинезию (PCD), PCD с situs inversus (также известную как синдром Картагенера), PCD без situs inversus и цилиарной аплазии и болезнь Шегрена.

[0028] В одном аспекте, Соединение 1 является по существу кристаллической, беспримесной формой, Формой А.

[0029] Описанные здесь процессы могут быть использованы для приготовления композиций этого изобретения, содержащих Форму А. Количества и признаки компонентов, используемых в этих процессах, являются такими, как описанные здесь.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0030] Фигура 1 является порошковой рентгенограммой Формы А.

[0031] Фигура 2 является конформационным изображением формы А на основе отдельного рентгеноструктурного анализа.

[0032] Фигура 3 обеспечивает FTIR-спектр Формы А.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0033] Определения

[0034] В данном изобретении будут использоваться следующие определения, если нет других указаний.

[0035] Термин "ABC-транспортер" обозначает в данном контексте ABC-транспортерный белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один связывающий домен, где указанный белок или его фрагмент присутствует in vivo или in vitro. Термин "связывающий домен" обозначает в данном контексте домен на ABC-транспортере, который может связываться с модулятором. См., например, Hwang, T. C. et al, J. Gen. Physiol. (1998): 111(3), 477-90.

[0036] Термин "CFTR" обозначает в данном контексте регулятор трансмембранной проводимости муковисцидоза или его мутацию, имеющую регуляторную активность, включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, F508, CFTR, R117H CFTR, и G551D CFTR (см., например, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/, в отношении мутаций CFTR).

[0037] Термин "модулирование" обозначает в данном контексте увеличение или уменьшение измеряемой величины.

[0038] Термин "нормальный CFTR" или "нормальная функция CFTR" обозначает в данном контексте подобный дикому типу CFTR без какого-либо нарушения вследствие факторов окружающей среды, таких как курение, загрязнение или все, что производит воспаление в легких.

[0039] Термин "уменьшенный CFTR" или "уменьшенная функция CFTR" обозначает в данном контексте менее активный CFTR, чем нормальный CFTR, или меньшую функцию, чем нормальная функция CFTR.

[0040] В данном контексте кристаллическими" называют соединения или композиции, в которых структурные звенья расположены в фиксированных геометрических кристаллических структурах или решетках, так что кристаллические твердые вещества имеют жесткий дальний порядок (структуры). Структурные единицы, которые составляют кристаллическую структуру, могут быть атомами, молекулами или ионами. Кристаллические твердые вещества обнаруживают отчетливые точки плавления.

[0041] В данном контексте фраза "по существу кристаллический обозначает твердый материал, который расположен в фиксированных геометрических структурах или решетках, которые имеют жесткий дальний порядок. Например, по существу кристаллические материалы имеют большую, чем приблизительно 85% кристалличность (например, большую чем приблизительно 90% кристалличность или большую, чем приблизительно 95% кристалличность). Следует также отметить, что термин по существу кристаллический включает в себя дескриптор 'кристаллический', который определен в предыдущем абзаце.

[0042] В одном аспекте это изобретение описывает форму N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, характеризующуюся как Форма А.

[0043] В некоторых вариантах осуществления Форма А характеризуется одним или несколькими пиками: от приблизительно 7,7 до приблизительно 8,1 градуса, например, приблизительно 7,9 градуса; от приблизительно 11,7 до приблизительно 12,1 градуса, например, приблизительно 11,9 градуса; от приблизительно 14,2 до приблизительно 14,6 градуса, например, приблизительно 14,4 градуса; и от приблизительно 5,6 до приблизительно 16,0 градуса, например, приблизительно 15,8 градуса; в рентгеновской порошковой дифракции, полученной с использованием альфа-излучения Cu K.

[0044] В некоторых вариантах осуществления Форма А характеризуется одним или несколькими пиками: от приблизительно 7,8 до приблизительно 8,0 градуса, например, приблизительно 7,9 градуса; от приблизительно 11,8 до приблизительно 12,0 градуса, например, приблизительно 11,9 градуса; от приблизительно 14,3 до приблизительно 14,5 градуса, например, приблизительно 14,4 градуса; и от приблизительно 15,7 до приблизительно 15,9 градуса, например, приблизительно 15,8 градуса; в рентгеновской порошковой дифракции, полученной с использованием альфа-излучения Cu K.

[0045] В других вариантах осуществления Форма А характеризуется одним или несколькими пиками: от приблизительно 7,7 до приблизительно 8,1 градуса, например, приблизительно 7,9 градуса; от приблизительно 21,6 до приблизительно 22,0 градуса, например, приблизительно 21,8 градуса; и от приблизительно 23,6 до приблизительно 24,0 градуса, например, приблизительно 23,8 градуса; в рентгеновской порошковой дифракции, полученной с использованием альфа-излучения Cu K.

[0046] В других вариантах осуществления Форма А характеризуется одним или несколькими пиками: от приблизительно 7,8 до приблизительно 8,0 градуса, например, приблизительно 7,9 градуса; от приблизительно 21,7 до приблизительно 21,9 градуса, например, приблизительно 21,8 градуса; и от приблизительно 23,7 до приблизительно 23,9 градуса, например, приблизительно 23,8 градуса; в рентгеновской порошковой дифракции, полученной с использованием альфа-излучения Cu K.

[0047] В некоторых вариантах осуществления Форма А характеризуется одним или несколькими из следующих пиков, измеренных в градусах в порошковой рентгенограмме: пик от приблизительно 7,7 до приблизительно 8,1 градуса (например, приблизительно 7,9 градуса); пик от приблизительно 9,1 до приблизительно 9,5 градуса, (например, приблизительно 9,3 градуса); пик от приблизительно 11,7 до приблизительно 12,1 градуса, (например, приблизительно 11,9 градуса); пик от приблизительно 14,2 до приблизительно 14,6 градуса, (например, приблизительно 14,4 градуса); пик от приблизительно 14,9 до приблизительно 15,3 градуса, (например, приблизительно 15,1 градуса); пик от приблизительно 15,6 до приблизительно 16,0 градуса, (например, приблизительно 15,8 градуса); пик от приблизительно 16,8 до приблизительно 17,2 градуса, (например, приблизительно 17,0 градуса); пик от приблизительно 17,5 до приблизительно 17,9 градуса, (например, приблизительно 17,7 градуса); пик от приблизительно 19,1 до приблизительно 19,5 градуса, (например, приблизительно 19,3 градуса); пик от приблизительно 19,9 до приблизительно 20,3 градуса, (например, приблизительно 20,1 градуса); пик от приблизительно 21,2 до приблизительно 21,6 градуса, (например, приблизительно 21,4 градуса); пик от приблизительно 21,6 до приблизительно 22,0 градуса, (например, приблизительно 21,8 градуса); пик от приблизительно 23,2 до приблизительно 23,6 градуса, (например, приблизительно 23,4 градуса); пик от приблизительно 23,6 до приблизительно 24,0 градуса, (например, приблизительно 23,8 градуса); пик от приблизительно 25,4 до приблизительно 25,8 градуса, (например, приблизительно 25,6 градуса); пик от приблизительно 26,6 до приблизительно 27,0 градуса, (например, приблизительно 26,8 градуса); пик от приблизительно 29,2 до приблизительно 29,6 градуса, (например, приблизительно 29,4 градуса); пик от приблизительно 29,5 до приблизительно 29,9 градуса, (например, приблизительно 29,7 градуса); пик от приблизительно 29,9 до приблизительно 30,3 градуса, (например, приблизительно 30,1 градуса) и пик от приблизительно 31,0 до приблизительно 31,4 градуса, (например, приблизительно 31,2 градуса).

[0048] В некоторых вариантах осуществления Форма А характеризуется одним или несколькими из следующих пиков, измеренных в градусах в порошковой рентгенограмме: пик от приблизительно 7,8 до приблизительно 8,0 градуса (например, приблизительно 7,9 градуса); пик от приблизительно 9,2 до приблизительно 9,4 градуса, (например, приблизительно 9,3 градуса); пик от приблизительно 11,8 до приблизительно 12,0 градуса, (например, приблизительно 11,9 градуса); пик от приблизительно 14,3 до приблизительно 14,5 градуса, (например, приблизительно 14,4 градуса); пик от приблизительно 15,0 до приблизительно 15,2 градуса, (например, приблизительно 15,1 градуса); пик от приблизительно 15,7 до приблизительно 15,9 градуса, (например, приблизительно 15,8 градуса); пик от приблизительно 16,9 до приблизительно 17,1 градуса, (например, приблизительно 17,0 градуса); пик от приблизительно 17,6 до приблизительно 17,8 градуса, (например, приблизительно 17,7 градуса); пик от приблизительно 19,2 до приблизительно 19,4 градуса, (например, приблизительно 19,3 градуса); пик от приблизительно 20,0 до приблизительно 20,2 градуса, (например, приблизительно 20,1 градуса); пик от приблизительно 21,3 до приблизительно 21,5 градуса, (например, приблизительно 21,4 градуса); пик от приблизительно 21,7 до приблизительно 21,9 градуса, (например, приблизительно 21,8 градуса); пик от приблизительно 23,3 до приблизительно 23,5 градуса, (например, приблизительно 23,4 градуса); пик от приблизительно 23,7 до приблизительно 23,9 градуса, (например, приблизительно 23,8 градуса); пик от приблизительно 25,5 до приблизительно 25,7 градуса, (например, приблизительно 25,6 градуса); пик от приблизительно 26,7 до приблизительно 26,9 градуса, (например, приблизительно 26,8 градуса); пик от приблизительно 29,3 до приблизительно 29,5 градуса, (например, приблизительно 29,4 градуса); пик от приблизительно 29,6 до приблизительно 29,8 градуса, (например, приблизительно 29,7 градуса); пик от приблизительно 30,0 до приблизительно 30,2 градуса, (например, приблизительно 30,1 градуса) и пик от приблизительно 31,1 до приблизительно 31,3 градуса, (например, приблизительно 31,2 градуса).

[0049] В некоторых вариантах осуществления Форма А характеризуется дифрактограммой, обеспеченной на Фигуре 1.

[0050] В одном аспекте это изобретение описывает фармацевтическую композицию, содержащую Форму А и фармацевтически приемлемый адъювант или носитель.

[0051] В одном аспекте данное изобретение описывает способ лечения CFTR-опосредованного заболевания человека, предусматривающий введение этому человеку эффективного количества Формы А.

[0052] В некоторых вариантах осуществления этот способ предусматривает введение дополнительного терапевтического агента.

[0053] В некоторых вариантах осуществления это заболевание выбрано из муковисцидоза, панкреатита, синусита, наследственной эмфиземы, наследственного гемохроматоза, недостаточностей свертывания-фибринолиза, таких как недостаточность белка С, наследственного ангиневротического отека Типа 1 (болезни Квинке), недостаточностей процессинга липидов, таких как наследственная гиперхолестеринемия, хиломикронемия Типа 1, абеталипопротеинемия, заболеваний лизосомного накопления (или депонирования), таких как болезнь клеточных включений (муколипидоз)/псевдо-Гурлер-синдром, мукополисахаридозов, болезни Сандхоффа/Тэя-Сакса, болезни Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатии/гиперинсулемии, сахарного диабета, карликовости лароновского типа, недостаточности миелопероксидазы, первичного гипопаратиреоза, меланомы, гликаноза CDG типа 1, наследственной эмфиземы, врожденного гипертиреоза, несовершенного остеогенеза, наследственной гипофибриногенемии, ACT-недостаточности, несахарного диабета (DI), нейрофизеального DI, нефрогенного DI, наследственной невральной амиотрофии Шарко-Мари-Тута, суданофильной лейкодистрофии (болезни Перлицеуса-Мерцбахера), нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, нескольких полиглутаминовых неврологических нарушений, таких как болезнь Хантингтона (Гентингтона), спиноцеребеллярной (относящейся к спинному мозгу и мозжечку) атаксии типа I, относящейся к спинному мозгу и продолговатому мозгу мышечной атрофии, дентаторубральной pallidoluysian и миотонической дистрофии, а также губчатых энцефалопатий, таких как наследственная болезнь Крейтцфельдта-Якоба, болезни Фабри, синдрома Штаусслера-Шейнкера, COPD, болезни сухих глаз, недостаточности поджелудочной железы, остеопороза, остеопении, синдрома Горхема, хлоридных каналопатий, врожденной миотонии (форм Томсона и Беккера), синдрома Барттера типа III, болезни Дента, врожденной патологически усиленной реакции испуга, эпилепсии, заболевания липосомного накопления, синдрома Ангельмана, Первичной Цилиарной Дискинезии (PCD), PCD с situs inversus (также известной как синдром Картагенера), PCD без situs inversus и цилиарной аплазии и болезни Шегрена.

[0054] В одном варианте осуществления данное изобретение описывает способ лечения муковисцидоза в человеке, предусматривающий введение указанному человеку эффективного количества Формы А.

[0055] В одном аспекте данное изобретение описывает фармацевтическую упаковку или набор, содержащие Форму А и фармацевтически приемлемый носитель.

[0056] В одном аспекте это изобретение описывает кристаллографическую форму N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, имеющую тригональную кристаллографическую сингонию, пространственную группу R-3, и следующие размеры элементарной ячейки кристалла: a=19,1670(4) Å (ангстрем), b=19,1670(4) Å(ангстрем), c=33,6572(12) Å (ангстрем), =90°, =90° и =120°.

[0057] В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает кристаллографическую форму N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида, имеющую размеры элементарной ячейки кристалла: a=19,1670(4) Å (ангстрем), b=19,1670(4) Å (ангстрем), c=33,6572(12) Å (ангстрем).

[0058] Применения, приготовление и введение

[0059] Фармацевтически приемлемые композиции

[0060] В одном аспекте данного изобретения обеспечены фармацевтически приемлемые композиции, где эти композиции содержат Форму А, описанную выше, и необязательно содержат фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления эти композиции необязательно содержат дополнительно один или несколько дополнительных фармацевтических агентов.

[0061] Как описано выше, фармацевтически приемлемые композиции данного изобретения дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель, которые, в данном контексте, включают в себя любые и все растворители, разбавители или другой жидкий наполнитель, диспергирующие или суспендирующие агенты, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загущающие или эмульгирующие агенты, консерванты, твердые связывающие агенты, смазывающие вещества и т.п., подходящие для конкретной желаемой лекарственной формы. Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) описывает различные носители, используемые в приготовлении фармацевтически приемлемых композиций, и известные способы для их приготовления. За исключением случаев, когда любая общепринятая среда-носитель является несовместимой с соединениями этого изобретения, например, посредством продуцирования какого-либо нежелательного биологического действия или другим образом взаимодействуя вредным образом с любым другим компонентом (любыми другими компонентами) этой фармацевтически приемлемой композиции, считается, что эта среда-носитель находится в рамках этого изобретения. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают в себя, но не ограничиваются ими, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, или сорбат калия, смеси неполного глицерида насыщенных растительных жирных кислот, воды, солей или электролитов, таких как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, калийгидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, магнийтрисиликат, поливинилпирролидон, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, шерстный жир, сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воски для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло; сафлоровое масло; кунжутное масло; оливковое масло; кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферящие агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновую кислоту; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и растворы фосфатного буфера, а также в этой композиции могут присутствовать другие нетоксичные совместимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красящие агенты, усиливающие высвобождение агенты, агенты для покрытия, подслащивающие вещества, вкусовые добавки и ароматизирующие агенты, консерванты и антиоксиданты, в соответствии с мнением изготовителя.

[0062] Применения соединений и фармацевтически приемлемых композиций

[0063] Еще в одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения или ослабления тяжести состояния, заболевания или нарушения, вызываемого предположительно мутацией CFTR. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ лечения состояния, заболевания или нарушения, вызываемого предположительно активностью CFTR, предусматривающий введение композиции, содержащей Форму А Соединения 1, субъекту, предпочтительно млекопитающему, нуждающемуся в этом.

[0064] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ лечения заболеваний, ассоциированных с уменьшенной функцией CFTR вследствие мутаций в гене, кодирующем CFTR, или факторов окружающей среды (например, дыма). Эти заболевания включают в себя муковисцидоз, хронический бронхит, рецидивирующий бронхит, острый бронхит, мужское бесплодие, вызываемое врожденным билатеральным отсутствием vas deferens (CBAVD), женское бесплодие, вызываемое врожденным отсутствием матки и вагины (CAUV), идиопатический хронический панкреатит (ICP), идиопатический рецидивирующий панкреатит, идиопатический острый панкреатит, хронический риносинусит, первичный склерозирующий холангит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, диабет, сухой глаз, констипацию, аллергический бронхолегочный аспергиллез (ABPA), костные заболевания (например, остеопороз) и астму.

[0065] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ лечения заболеваний, ассоциированных с нормальной функцией CFTR. Эти заболевания включают в себя хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), хронический бронхит, рецидивирующий бронхит, острый бронхит, риносинусит, констипацию, панкреатит, в том числе хронический панкреатит, рецидивирующий панкреатит и острый панкреатит, недостаточность поджелудочной железы, мужское бесплодие, вызываемое врожденным билатеральным отсутствием vas deferens (CBAVD), умеренное легочное заболевание, идиопатический панкреатит, заболевание печени, наследственную эмфизему, желчные конкременты, гастроэзофагеальный рефлюкс, желудочно-кишечные злокачественности, воспалительное заболевание пищеварительного тракта, констипацию, диабет, артрит, остеопороз и остеопению.

[0066] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ лечения заболеваний, ассоциированных с нормальной функцией CFTR, включающих в себя наследственный гемохроматоз, недостаточности свертывания/фибринолиза, такие как недостаточность белка С, наследственный ангионевротический отек Типа 1 (болезнь Квинке), недостаточности процессинга липидов, такие как наследственная гиперхолестеринемия, хиломикронемия Типа 1, абеталипопротеинемия, болезни лизосомного накопления, такие как болезнь клеточных включений (муколипидоз)/псевдо-Гурлер-синдром, мукополисахаридозы, болезнь Сандхоффа/Тэя-Сакса, болезнь Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатию/гиперинсулемию, сахарный диабет, карликовость лароновского типа, недостаточность миелопероксидазы, первичный гипопаратиреоз, меланому, гликаноз CDG типа 1, врожденный гипертиреоз, несовершенный остеогенез, наследственную гипофибриногенемию, ACT-недостаточность, несахарный диабет (DI), нейрофизеальный DI, нефрогенный DI, наследственную невральную амиотрофию Шарко-Мари-Тута, суданофильную лейкодистрофию (болезнь Перлицеуса-Мерцбахера), нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, несколько полиглутаминовых неврологических нарушений, таких как болезнь Хантингтона (Гентингтона), спиноцеребеллярную (относящуюся к спинному мозгу и мозжечку) атаксию типа I, относящуюся к спинному мозгу и продолговатому мозгу мышечную атрофию, дентаторубральную pallidoluysian и миотоническую дистрофию, а также губчатые энцефалопатии, такие как наследственная болезнь Крейтцфельдта-Якоба (обусловленная дефектом процессинга прионовых белков), болезнь Фабри, синдром Штаусслера-Шейнкера, синдром Горхема, хлоридные каналопатии, врожденную миотонию (формы Томсона и Беккера), синдром Барттера типа III, болезнь Дента, врожденную патологически усиленную реакцию испуга, эпилепсию, заболевание липосомного накопления, синдром Ангельмана, Первичную Цилиарную Дискинезию (PCD), PCD с situs inversus (также известную как синдром Картагенера), PCD без situs inversus и цилиарной аплазии или болезнь Шегрена, предусматривающий стадию введения указанному млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей Форму А, описанной здесь.

[0067] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления данное изобретение обеспечивает способ лечения муковисцидоза, предусматривающий стадию введения указанному млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей Форму А, описанную здесь.

[0068] Согласно этому изобретению "эффективным количеством" Формы А или ее фармацевтически приемлемой композиции является количество, эффективное для лечения или ослабления тяжести одного или нескольких из заболеваний, нарушений или состояний, приведенных выше.

[0069] Форма А или ее фармацевтически приемлемая композиция могут вводиться с использованием любого количества и любого способа введения, эффективных для лечения или ослабления тяжести одного или нескольких из заболеваний, нарушений или состояний, приведенных выше.

[0070] В некоторых вариантах осуществления Форма А или ее фармацевтически приемлемая композиция применима для лечения или ослабления тяжести муковисцидоза у пациентов, которые проявляют остаточную CFTR-активность в апикальной мембране респираторного и нереспираторного эпителия. Присутствие остаточной CFTR-активности в эпителиальной поверхности может быть легко детектировано с использованием способов, известных в данной области, например стандартных электрофизиологических, биохимических или гистохимических способов. Такие способы идентифицируют CFTR-активность с использованием in vivo или ex vivo электрофизиологических способов, измерения Cl^--концентраций пота или слюны или ex vivo биохимических или гистохимических способов для мониторинга плотности клеточной поверхности. С использованием таких способов остаточная CFTR-активность может быть легко детектирована у пациентов, гетерозиготных или гомозиготных в отношении многих различных мутаций, в том числе пациентах, гомозиготных или гетерозиготных в отношении наиболее обычной мутации, F508.

[0071] В другом варианте осуществления Форма А, описанная здесь, или ее фармацевтически приемлемая композиция применима для лечения или ослабления тяжести муковисцидоза у пациентов, которые имеют остаточную CFTR-активность, индуцированную или увеличенную, с использованием фармакологических способов или генной терапии. Такие способы увеличивают количество CFTR, присутствующего в клеточной поверхности, индуцируя до сих пор отсутствующую CFTR-активность у пациента или увеличивая существующий уровень остаточной CFTR-активности у пациента.

[0072] В одном варианте осуществления, Форма А, описанная здесь, или ее фармацевтически приемлемая композиция, применима для лечения или ослабления тяжести муковисцидоза у пациентов в определенных генотипах, проявляющих остаточную CFTR-активность, например мутациях класса III (нарушенная регуляция или нарушенный воротный механизм каналов), мутациях класса IV (измененная проводимость) или мутаций класса V (уменьшенный синтез) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cystic fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapy; Current Opinion in Pulmonary Medicine 6:521-529, 2000). Другие генотипы пациентов, которые обнаруживают остаточную CFTR-активность, включают в себя пациентов, гомозиготных в отношении одного из этих классов или гетерозиготных с любым другим классом мутаций, в том числе мутаций класса I, мутаций класса II или мутации, которая лишена классификации.

[0073] В одном варианте осуществления Форма А, описанная здесь, или ее фармацевтически приемлемая композиция применима для лечения или ослабления тяжести муковисцидоза у пациентов в определенных клинических фенотипах, например в умеренном - легком клиническом фенотипе, который обычно коррелирует с количеством остаточной CFTR-активности в апикальной мембране эпителия. Такие фенотипы включают в себя пациентов, проявляющих панкреатическую недостаточность, или пациентов, диагностированных как имеющие идиопатический панкреатит и врожденное билатеральное отсутствие vas deferens или умеренное (стертое) заболевание легких.

[0074] Точное необходимое количество будет варьироваться от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести инфекции, конкретного агента, его способа введения и т.п. Соединения этого изобретения предпочтительно готовят в стандартной форме дозы для облегчения введения и однородности дозы. Выражение "стандартная форма дозы" относится в данном контексте к физически дискретной единице агента, подходящей для подлежащего лечению пациента. Однако будет понятно, что прием общей суточной дозы соединений и композиций данного изобретения будет определяться лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения. Уровень конкретной эффективной дозы для любого конкретного пациента или организма будет зависеть от различных факторов, включающих в себя подлежащее лечению нарушение и тяжесть этого нарушения; активность конкретного используемого соединения; конкретной используемой композиции; возраста, массы тела, общего здоровья, пола и диеты пациента; времени введения, способа введения и скорости экскреции этого конкретного используемого соединения; продолжительности лечения; лекарственных средств, используемых в комбинации или совпадающих с конкретным используемым соединением, и подобных факторов, хорошо известных в областях медицины. Термин "пациент" обозначает, в данном контексте, животного, предпочтительно млекопитающего, и наиболее предпочтительно человека.

[0075] Фармацевтически приемлемые композиции этого изобретения могут вводиться людям и другим животным перорально, ректально, парентерально, интрацистернально (внутрь полости), интравагинально, внутрибрюшинно, местно, (в виде порошков, мазей, капель или пластыря), буккально, например в виде перорального или назального спрея, или т.п., в зависимости от тяжести подлежащей лечению инфекции. В некоторых вариантах осуществления соединения этого изобретения могут вводиться перорально или парентерально при уровнях доз приблизительно 0,01 мг/кг - приблизительно 50 мг/кг и предпочтительно от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг массы тела субъекта в день, один или несколько раз в день, для получения желаемого терапевтического эффекта.

[0076] Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают в себя, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных соединений жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и эфиры сорбитана и жирных кислот и их смеси. Наряду с инертными разбавителями пероральные композиции могут также включать в себя адъюванты, такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подслащивающие вещества, вкусовые и ароматизирующие агенты.

[0077] Инъекционные препараты, например стерильные инъекционные водные или масляные суспензии, могут быть приготовлены в соответствии с известным уровнем техники с применением подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъекционный препарат может быть также стерильными инъекционными раствором, суспензией или эмульсией в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, находятся вода, раствор Рингера, U.S.P., и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные, нелетучие масла удобным образом используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может быть использовано легкое нелетучее масло, включающее в себя моно- или диглицериды. Кроме того, в приготовлении инъекционных растворов используют жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

[0078] Эти инъекционные формы могут быть стерилизованы, например, фильтрованием через удерживающий бактерии фильтр или включением стерилизующих агентов в форме стерильных композиций твердых веществ, которые могут растворяться или диспергироваться в стерильной воде или другой стерильной инъекционной среде перед применением.

[0079] Для пролонгирования действия соединения данного изобретения часто желательно замедлить абсорбцию этого соединения из подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть выполнено с использованием жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала со слабой растворимостью в воде. После этого скорость абсорбции этого соединения зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристалла и кристаллической формы. Альтернативно, задержанная абсорбция парентерально введенного соединения осуществляется растворением или суспендированием этого соединения в масляном носителе. Инъекционные депо-формы готовят образованием микроинкапсулирующих матриксов этого соединения в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от отношения соединения к полимеру и природы конкретного используемого полимера может регулироваться скорость высвобождаемого соединения. Примеры других биодеградируемых полимеров включают в себя поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Инъекционные депо-препараты готовят также заключением этого соединения в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями тела.

[0080] Композициями для ректального или вагинального введения являются предпочтительно суппозитории, которые могут быть приготовлены смешиванием соединений этого изобретения с подходящими нераздражающими эксципиентами или носителями, такими как какао-масло, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, которые являются твердыми при комнатной температуре, но жидкими при температуре тела и, следовательно, плавятся в прямой кишке или вагинальной полости и высвобождают активное соединение.

[0081] Твердые лекарственные формы для перорального введения включают в себя капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешано по меньшей мере с одним инертным, фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или а) наполнителями или разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, b) связывающими агентами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидинон, сахароза и аравийская камедь, с) увлажнителями, такими как глицерин, d) дезинтегрирующими агентами, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия, е) задерживающими растворение агентами, такими как парафин, f) увлажняющими агентами, такими как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина, h) абсорбентами, такими как каолиновая и бентонитная глины, и i) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия, и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма может также содержать буферящие агенты.

[0082] Твердые композиции сходного типа могут быть также использованы в виде заполнителей в мягких и твердых заполняемых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т.п. Твердые лекарственные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут быть приготовлены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные оболочки и другие оболочки, хорошо известные в области фармацевтического приготовления. Они могут необязательно содержать делающие их непрозрачными агенты и могут также быть композицией, которая высвобождает активный ингредиент (активные ингредиенты) только, или предпочтительно, в определенной части кишечного тракта, необязательно задержанным образом. Примеры заделанных композиций, которые могут быть использованы, включают в себя полимерные вещества и воски. Твердые композиции сходного типа могут быть также использованы в виде заполнителей в мягких и твердых заполняемых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.

[0083] Эти активные соединения могут быть также в микроинкапсулированной форме с одним или несколькими эксципиентами, как отмечалось выше. Твердые лекарственные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут быть приготовлены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия, регулирующие высвобождение покрытиями и другими покрытиями, хорошо известными в области фармацевтического приготовления. В таких твердых лекарственных формах активное соединение может быть смешано по меньшей мере с одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы могут также содержать, как и в обычной практике, дополнительные вещества, другие, чем инертные разбавители, например таблетирующие смазывающие вещества и другие таблетирующие добавки, такие как стеарат магния и микрокристаллическая целлюлоза. В случае капсул, таблеток и пилюль эти лекарственные формы могут также содержать буферящие агенты. Они могут необязательно содержать глушители (вещества, делающие материал непрозрачным) и могут также иметь такой состав, что они высвобождают активный ингредиент (активные ингредиенты) только или преимущественно в определенной части кишечного тракта, необязательно задержанным образом. Примеры заделанных композиций, которые могут быть использованы, включают в себя полимерные вещества и воски.

[0084] Лекарственные формы для местного или чрескожного введения соединения этого изобретения включают в себя мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, порошки, растворы, спреи, ингаланты (ингаляционные вещества) или пластыри. Активный компонент смешивают при стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и любыми необходимыми консервантами или буферами, которые могут требоваться. Офтальмическая форма, капли для ушей также считаются находящимися в рамках этого изобретения. Кроме того, данное изобретение рассматривает применение трансдермальных пластырей, которые имеют дополнительное преимущество обеспечения регулируемой доставки соединения в тело. Такие лекарственные формы готовят растворением или распределением этого соединения в подходящей среде. Усилители абсорбции могут быть также использованы для увеличения прохождения этого соединения через кожу. Эта скорость может регулироваться либо обеспечением регулирующей скорость мембраны, либо диспергированием этого соединения в полимерном матриксе или геле.

[0085] Должно быть также понятно, что Форма А, описанная здесь, или ее фармацевтически приемлемая композиция может использоваться в комбинированных терапиях, т.е. Форма А, описанная здесь, или ее фармацевтически приемлемая композиция может вводиться одновременно с одним или несколькими другими желаемыми терапевтическими веществами или медицинскими процедурами или до, или после них. Конкретная комбинация терапий (терапевтических веществ или процедур) для использования в комбинированном режиме будет учитывать совместимость желаемых терапевтических веществ и/или процедур и желаемого терапевтического действия, которое должно быть достигнуто. Должно быть также понятно, что эти используемые терапии могут обеспечивать желаемый эффект для одного и того же нарушения (например, соединение этого изобретения может вводиться одновременно с другим агентом, используемым для лечения того же самого нарушения), или они могут обеспечивать другие эффекты (например, контролировать любые вредные побочные эффекты). В данном контексте дополнительные терапевтические агенты, которые вводят обычно для лечения или предупреждения конкретного заболевания или состояния, известны как "подходящие для подлежащего лечению заболевания или состояния".

[0086] В одном варианте осуществления этот дополнительный агент выбран из муколитического агента, бронходилататора, антибиотика, противоинфекционного агента, противовоспалительного агента, CFTR-модулятора, другого, чем соединение данного изобретения, или алиментарного (связанного с питанием) агента.

[0087] В одном варианте осуществления этим дополнительным агентом является антибиотик. Примеры антибиотиков, применимых здесь, включают в себя тобрамицин, в том числе ингалируемый порошок тобрамицина (TIP), азитромицин, азтреонам, в том числе аэрозолированная форма азтреонама, амикацин, в том числе его липосомные формы, циппрофлоксацин, в том числе его формы, подходящие для введения ингаляцией, левофлаксацин, в том числе его аэрозолированные формы, и комбинации двух антибиотиков, например фосфомицина и тобрамицина.

[0088] В другом варианте осуществления дополнительным агентом является муколитический агент. Примерные муколиты, применимые здесь, включают в себя Pulmozyme®.

[0089] В другом варианте осуществления этим дополнительным агентом является бронходилататор. Примеры бронходилататоров включают в себя албутерол, сульфат метапротенерола, ацетат пирбутерола, салметерол или сульфат тетрабулина.

[0090] В другом варианте осуществления этот дополнительный агент является эффективным в восстановлении жидкости поверхности легочных дыхательных путей. Такие агенты улучшают перемещение соли в клетки и из клеток, позволяя слизи в легочных дыхательных путях быть более гидратированной и, следовательно, более легко очищаемой. Примеры таких агентов включают в себя гипертонический солевой раствор, денуфазол-тетранатрий ([[(3S,5R)-5-(4-амино-2-оксипиримидин-1-ил)-3-гидроксиоксалан-2-ил]метоксигидроксифосфорил][[[(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-диоксипиримидин-1-ил)-3,4-дигидрооксиоксолан-2-ил]метоксигидроксифосфорил]оксигидроксифосфорил]гидрофосфат), или бронхитол (ингалируемая форма маннита).

[0091] В другом варианте осуществления этим дополнительным агентом является противовоспалительный агент, т.е. агент, который может уменьшать воспаление в легких. Применимые здесь примеры таких агентов включают в себя ибупрофен, докозагексановую кислоту (DHA), силденафил, ингалируемый глутатион, пиоглитазон, гидроксихлорохин или симвастатин.

[0092] В другом варианте осуществления этот дополнительный агент уменьшает активность блокатора эпителиальных натриевых каналов (ENaC) либо непосредственно блокированием этого канала, либо опосредованно модуляцией протеаз, которые приводят к увеличению активности ENaC (например, сериновых протеаз, активирующих каналы протеаз). Примеры таких агентов включают в себя камостат (ингибитор трипсин-подобной протеазы), QAU145, 552-02, GS-9411, INQ-4995, Аэролитик и амилорид. Дополнительные агенты, которые уменьшают активность блокатора эпителиальных натриевых каналов (ENaC), могут быть найдены, например, в Публикации PCT № WO2009/074575, все содержание которой включено здесь в полном объеме.

[0093] Среди других описанных здесь заболеваний, комбинации модуляторов CFTR, такие как Форма А, и агенты, которые уменьшают активность ENaC, используются для лечения синдрома Лиддла, воспалительного или аллергического состояния, включающего в себя муковисцидоз, первичную цилиарную дискинезию, хронический бронхит, хроническое обструктивное заболевание легких, астму, инфекции дыхательных путей, рак легких, ксеростомию и сухой кератоконъюнктивит, инфекции дыхательных путей (острые и хронические; вирусные и бактериальные) и рак легких.

[0094] Комбинации модуляторов CFTR, таких как Форма А, и агентов, которые уменьшают активность ENaC, также применимы для лечения заболеваний, опосредуемых блокадой эпителиального натриевого канала, а также заболеваний, других, чем респираторные заболевания, которые ассоциированы с отклоняющейся от нормы регуляцией прохождения жидкости через эпителий, возможно, включающей в себя отклоняющуюся от нормы физиологию защищающих поверхности жидкостей на их поверхности, например, в случае ксеротомии (сухого рта) и сухого кератоконъюнктивита (сухого глаза). Кроме того, блокада эпителиальных натриевых каналов в почке могла бы использоваться для стимуляции диуреза и посредством этого индуцировать гипотензивное действие.

[0095] Астма включает в себя как врожденную (неаллергическую), так и наружную (вызываемую наружными факторами) (аллергическую) астму, легкую астму, умеренную астму, тяжелую астму, бронхиальную астму, астму напряжения, профессиональную астму и астму, индуцированную после бактериальной инфекции. Лечение астмы также должно пониматься как лечение, охватывающее субъектов, например, с возрастом, меньшим 4 или 5 лет, обнаруживающих симптомы свистящего дыхания и диагностированных или могущих быть диагностированными как "младенцы со свистящими хрипами", установленную категорию пациентов главной медицинской озабоченности и теперь часто идентифицируемую как астматики начальной или ранней фазы. (Для удобства это конкретное астматическое состояние называют "синдромом младенцев со свистящим (стридорозным) дыханием"). Профилактическая эффективность в лечении астмы будет доказываться уменьшенной частотой или тяжестью симптоматической атаки, например острой астматической или бронхоконстрикторной атаки, улучшением функции легких или улучшенной гиперреактивностью дыхательных путей. Она может дополнительно доказываться пониженной потребностью другой, симптоматической терапии, т.е. терапии для ограничения или прекращения или предназначенной для ограничения или прекращения симптоматической атаки при ее появлении, например противовоспалительной (например, кортикостероидной) или бронхосужающей. Профилактическая польза в случае астмы может быть, в частности, явной в субъектах, склонных к утреннему снижению (максимального потока выдоха). "Утреннее снижение" является признанным астматическим синдромом, общим для существенного процента астматиков и характеризующимся приступом астмы, например, между приблизительно 4-6 ч до полудня, т.е. во время, обычно существенно отдаленное от любой вводимой ранее терапии симптоматической астмы.

[0096] Хроническое обструктивное заболевание легких включает в себя хронический бронхит или одышку, ассоциированные с ним, эмфизему, а также экзацербацию (обострение) гиперреактивности дыхательных путей, после другой лекарственной терапии, в частности другой терапии с ингалируемым лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления комбинации модуляторов CFTR, таких как Форма А, и агентов, которые уменьшают активность ENaC, применимы для лечения бронхита любого типа и происхождения, в том числе, например, острого, арахидного, катарального, крупозного, хронического или гнойного туберкулезного бронхита.

[0097] В другом варианте осуществления дополнительным агентом является модулятор CFTR, другой, чем Форма А соединения 1, т.е агент, который имеет эффект модуляции активности CFTR. Примеры таких агентов включают в себя аталурен ("PTC124®"; 3-[5-(2-фторфенил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]бензойную кислоту), синапультид, ланковутид, депелестат (рекомбинантный ингредиент эластазы нейтрофилов человека), кобипростон (7-{(2R, 4aR, 5R, 7aR)-2-[(3S)-1,1-дифтор-3-метилпентил]-2-гидрокси-6-оксооктагидроциклопента[b]пиран-5-ил}гептановую кислоту) или (3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойную кислоту.

[0098] В другом варианте осуществления этим дополнительным агентом является алиментарный (питательный) агент. Примеры таких агентов включают в себя панкрелипазу (заменитель панкреатического фермента), включающую в себя Панкреазу®, Панкреакарб®, Ультразу® или Креон®, Липротомазу® (ранее Трицитек®), Аквадекс® или ингаляцию глутатиона. В одном варианте осуществления дополнительным алиментарным агентом является панкрелипаза.

[0099] В одном варианте осуществления этим дополнительным агентом является модулятор CFTR, другой, чем соединение данного изобретения.

[00100] Количество дополнительного терапевтического агента, присутствующего в композициях этого изобретения, будет не более чем количество, которое вводилось бы обычно в композицию, содержащую этот терапевтический агент в качестве единственного активного агента. Предпочтительно количество дополнительного терапевтического агента в описанных здесь композициях будет находиться в диапазоне приблизительно 50-100% количества, обычно присутствующего в композиции, содержащей этот агент в качестве единственного терапевтически активного агента.

[00101] Форма A, описанная здесь, или ее фармацевтически приемлемая композиция может быть также включена в композиции для покрытия имплантируемого медицинского устройства, такого как протезы, искусственные клапаны, сосудистые трансплантаты, стенты и катетеры. Таким образом, данное изобретение, в другом аспекте, включает в себя композицию для покрытия имплантируемого устройства, содержащую соединение данного изобретения, описанное в общих чертах выше, и в классах и подклассах здесь, и носитель, подходящий для покрытия указанного имплантируемого устройства. Еще в одном аспекте данное изобретение включает в себя имплантируемое устройство, покрытое композицией, содержащей соединение данного изобретения, описанное в общих чертах выше, и в классах и подклассах здесь, и носитель, подходящий для покрытия указанного имплантируемого устройства. Подходящие покрытия и общее приготовление покрытых имплантируемых устройств описаны в Патентах США с номерами 6099562; 5886026 и 5304121. Эти покрытия являются обычно биосовместимыми полимерными материалами, такими как полимер-гидрогель, полиметилдисилоксан, поликапролактон, полиэтиленгликоль, полимолочная кислота, этиленвинилацетат и их смеси. Эти покрытия могут быть необязательно покрыты подходящим верхним покрытием фторсиликона, полиэтиленгликоля, фосфолипидов или их комбинаций для придания свойств регулируемого высвобождения этой композиции.

[00102] Другой аспект этого изобретения относится к модуляции активности CFTR в биологической пробе или у пациента (например, in vitro или in vivo), причем способ предусматривает введение этому пациенту Формы А, описанной здесь, или контактирование указанной биологической пробы с Формой A, описанной здесь, или ее фармацевтически приемлемой композицией. Термин "биологическая проба" включает в себя, в данном контексте, без ограничения, культуры клеток или их экстракты; материал биопсии, полученный из млекопитающего, или его экстракты; и кровь, слюну, мочу, фекалии, сперму, слезы или другие биологические жидкости и их экстракты.

[00103] Модуляция CFTR в биологической пробе применима для различных целей, которые известны квалифицированному в данной области специалисту. Примеры таких целей включают в себя, но не ограничиваются ими, исследование CFTR в биологических и патологических феноменах; и сравнительное оценивание новых модуляторов CFTR.

[00104] Еще в одном варианте осуществления обеспечен способ модуляции активности анионного канала in vitro или in vivo, предусматривающий стадию контактирования указанного канала с Формой А, описанной здесь, или ее фармацевтически приемлемой композицией. В предпочтительных вариантах осуществления этим анионным каналом является хлоридный канал или бикарбонатный канал. В других предпочтительных вариантах осуществления этим анионным каналом является хлоридный канал.

[00105] Согласно альтернативному варианту осуществления данное изобретение обеспечивает способ увеличения количества функционального CFTR в мембране клетки, предусматривающий стадию контактирования указанной клетки с Формой А, описанной здесь, или ее фармацевтически приемлемой композицией.

[00106] Согласно другому предпочтительному варианту осуществления активность CFTR измеряют измерением трансмембранного потенциала напряжения. Способы для измерения потенциала напряжения в биологической пробе могут быть любыми из известных в данной области способов, такими как оптический анализ мембранного потенциала или другие электрофизиологические способы.

[00107] Оптический анализ мембранного потенциала использует потенциалочувствительные FRET-сенсоры, описанные Gonzalez and Tsien (См. Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1995) "Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells." Biophys J 69(4): 1272-80, и Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1997); "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer" Chem Biol 4(4): 269-77), в комбинации с оборудованием (приборами) для измерения изменений флуоресценции, таким как Voltage/Ion Probe Reader (VIPR) (См. Gonzalez, J. E., K. Oades, et al. (1999) "Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets" Drug Discov Today 4(9): 431-439).

[00108] Эти потенциалочувствительные анализы основаны на изменении переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET) между мембрано-растворимым, потенциалочувствительным красителем, DiSBAC₂(3), и флуоресцентным фосфолипидом, CC2-DMPE, который присоединен к наружному листочку плазматической мембраны и действует в качестве донора FRET. Изменения в мембранном потенциале (V_m) заставляют отрицательно заряженный DiSBAC ₂(S) перераспределяться через плазматическую мембрану, и количество переноса энергии из CC2-DMPE изменяется соответственно. Изменения в испускании флуоресценции могут подвергаться мониторингу с использованием VIPR II, который является интегрированным жидкостным манипулятором и флуоресцентным детектором, сконструированным для проведения сканирований на основе клеток в 96-384 микротитрационных планшетах.

[00109] В другом аспекте данное изобретение обеспечивает набор для применения в измерении активности CFTR или его фрагмента в биологической пробе in vitro или in vivo, содержащий (i) композицию, содержащую Форму А или любой из приведенных выше вариантов; и (ii) инструкции для a) контактирования этой композиции с этой биологической пробой и b) измерения активности указанного CFTR или его фрагмента. В одном варианте осуществления этот набор дополнительно содержит инструкции для а) контактирования дополнительной композиции с биологической пробой; и с) сравнения активности CFTR в присутствии дополнительного соединения с плотностью CFTR в присутствии описанной здесь Формы А. В предпочтительных вариантах осуществления этот набор используют для измерения плотности CFTR.

[00110] Для более полного понимания описанного здесь изобретения представлены следующие примеры. Должно быть понятно, что эти примеры приведены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом это изобретение.

ПРИМЕРЫ

[00111] Способы и материалы

[00112] Рентгеновская порошковая дифракция (XRPD)

[00113] Данные рентгеновской порошковой дифракции (XRPD) регистрировали при комнатной температуре с использованием рентгеновского порошкового дифрактометра Rigaku/MSC MiniFlex Desktop (Rigaku, The Woodlands, TX). Рентгеновское излучение генерировали с использованием Cu-трубки, оперируемой при 30 кВ и 15 мА с запирающим фильтром (фильтром-пробкой) К . Щель дивергенции была вариабельной со щелями рассеяния и приема при 4,2 градуса и щелью 0,3 мм соответственно. Режимом сканирования было фиксированное время (FT) с шириной стадии 0,02 градуса и временем счета 2,0 секунд. Этот порошковый рентгеновский дифрактометр калибровали с использованием ссылочного стандарта: 75% Содалит (Na₃Al₄Si₄O ₁₂Cl) и 25% кремний (Rigaku, Cat# 2100/ALS). Использовали платформу с шестью пробами с держателями проб с 0-фоном (SH-LBSI511-RNDB). Порошковую пробу помещали на вдавленную зону и выравнивали предметным стеклом.

[00114] FTIR (инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием)

[00115] FTIR-спектры собирали из спектрофотометра Thermo Scientific, Nicolet 6700 FT-IR, с компартментом для взятия проб с резкой орбитой (траекторией), ромбовидным окном, с использованием Программы: Omnic, 7.4. Порошковую пробу помещали непосредственно на ромбовидный кристалл и добавляли давление для конформации поверхности этой пробы относительно поверхности ромбовидного кристалла. Собирали спектр фона и затем собирали спектр пробы. Установки сбора были следующими:

Детектор: DTGS KBr;

Расщепитель пучка: KBr;

Источник: IR;

Диапазон сканирования: 4000-400 см^-1;

Усиление: 8,0;

Оптическая скорость: 0,6329 см/сек;

Апертура: 100;

Число сканов: 32; и

Разрешение: 4 см^-1.

[00116] Пример 1: Получение 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (7).

[00117] 2-хлор-5-(трифторметил)анилин 2 (200 г, 1,023 моль), диэтил-2-(этоксиметилен)малонат 3 (276 г, 1,3 моль) и толуол (100 мл) объединяли в атмосфере азота в трехгорлой круглодонной колбе на 1 л, снабженной ловушкой (конденсатором) Дина-Старка. Этот раствор нагревали при перемешивании до 140°С и эту температуру поддерживали в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждали до 70°C и медленно добавляли гексан (600 мл). Полученную суспензию перемешивали и давали ей нагреться до комнатной температуры. Твердое вещество собирали фильтрованием, промывали 10% этилацетатом в гексане (2×400 мл) и затем сушили в вакууме с получением белого твердого вещества (350 г, выход 94%) в виде желаемого продукта конденсации диэтил-2-((2-хлор-5-(трифторметил)фениламино)метилен)малоната 4. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 11,28 (д, J=13,0 Гц, 1Н), 8,63 (д, J=13,0 Гц 1Н), 8,10 (с, 1Н), 7,80 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 7,50 (дд, J=1,5, 8,4 Гц, 1Н), 4,24 (кв, J=7,1 Гц, 2Н), 4,17 (кв, J=7,1 Гц, 2Н), 1,27 (м, 6Н).

[00118] Получение этил-8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилата (5). 3-горлую колбу на 1 л загружали Dowtherm® (200 мл, 8 мл/г), который дегазировали при 200°C в течение 1 ч. Растворитель нагревали до 260°C и загружали в виде порций на протяжении 10 минут диэтил-2-((2-хлор-5-(трифторметил)фениламино)метилен)малонатом 4 (25 г, 0,07 моль). Полученную смесь перемешивали при 260°C в течение 6,5 часов (ч) и полученный этанольный побочный продукт удаляли дистилляцией. Этой смеси давали медленно остывать до 80°C. Медленно добавляли гексан (150 мл) на протяжении 30 минут (мин) с последующим добавлением дополнительных 200 мл гексана в виде одной порции. Эту суспензию перемешивали до достижения комнатной температуры. Твердое вещество фильтровали, промывали гексаном (3×150 мл) и затем сушили в вакууме с получением этил-8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилата 5 в виде желтовато-коричневого твердого вещества (13,9 г, выход 65%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 11,91 (с, 1Н), 8,39 (с, 1Н), 8,06 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 7,81 (д, J=8,4 Гц, 1Н), 4,24 (кв, J=7,1 Гц, 2Н), 1,29 (т, J=7,1 Гц, 3Н).

[00119] Получение этил-4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоксилата (6). 3-горлую колбу на 5 л загружали этил-8-хлор-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксилатом 5 (100 г, 0,3 моль), этанолом (1250 мл, 12,5 мл/г) и триэтиламином (220 мл, 1,6 моль). Затем этот сосуд загружали 10 г 10% Pd/C (50% влажным) при 5°C. Эту реакцию сильно перемешивали в атмосфере водорода в течение 20 ч при 5°C, после чего эту реакционную смесь концентрировали до объема приблизительно 150 мл. Этот продукт, этил-4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоксилат 6, в виде суспензии с Pd/C, брали непосредственно в следующую стадию.

[00120] Получение 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (7). Этил-4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоксилат 6 (58 г, 0,2 моль, неочищенную реакционную суспензию, содержащую Pd/C) суспендировали в NaOH (814 мл 5 M, 4,1 моль) в колбе на 1 л с парциальным конденсатором горячего орошения и нагревали при 80°C в течение 18 часов, с последующим дополнительным нагреванием при 100°C в течение 5 ч. Эту реакцию фильтровали в теплом виде через упакованный Целит для удаления Pd/C и этот Целит промывали 2 н. NaOH. Фильтрат подкисляли до приблизительно рН 1 с получением густого, белого осадка. Этот осадок фильтровали, затем промывали водой и холодным ацетонитрилом. Затем это твердое вещество сушили в вакууме с получением 4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохолин-3-карбоновую кислоту 7 в виде белого твердого вещества (48 г, выход 92%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 15,26 (с, 1Н), 13,66 (с, 1Н), 8,98 (с, 1Н), 8,13 (дд, J=1,6 7,8 Гц, 1Н), 8,06-7,99 (м, 2Н).

[00121] Пример 2: Получение 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина

[00122] Получение 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептана (20). В колбу, содержащую гидрохлорид 7-азабицикло[2.2.1]гептана 9 (4,6 г, 34,43 ммоль), полученный в атмосфере азота, добавляли раствор 4-фтор-1-нитро-2-(трифторметил)бензол 8 (6,0 г, 28,69 ммоль и триэтиламин (8,7 г, 12,00 мл, 86,07 ммоль) в ацетонитриле (50 мл). Реакционную колбу нагревали при 80°C в атмосфере азота в течение 16 часов. Реакционной смеси давали остыть и затем распределяли между водой и дихлорметаном. Органический слой промывали 1 М HCl, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали досуха. Очистка хроматографией на силикагеле (0-10% этилацетат в гексане) давала 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептан 10 (7,2 г, выход 88%) в виде желтого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 8,03 (д, J=9,1 Гц, 1Н), 7,31 (д, J=2,4 Гц, 1Н), 7,25 (дд, J=2,6, 9,1 Гц, 1Н), 4,59 (с, 2Н), 1,69-1,67 (м, 4Н), 1,50 (д, J=7,0 Гц, 4Н).

[00123] Получение 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина (11). В колбе, загруженной 7-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил]-7-азабицикло[2.2.1]гептаном 10 (7,07 г, 24,70 ммоль) и 10% Pd/C (0,71 г, 6,64 ммоль), создавали вакуум и затем колбу продували азотом. Добавляли этанол (22 мл) и эту реакционную колбу подключали к баллону с водородом. После сильного перемешивания в течение 12 часов эту реакционную смесь продували азотом и Pd/C удаляли фильтрованием. Фильтрат концентрировали до темного масла при пониженном давлении и остаток очищали хроматографией на силикагеле (0-15% этилацетат в гексане) с получением 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина 11 в виде пурпурного твердого вещества (5,76 г, выход 91%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 6,95 (дд, J=2,3 8,8 Гц, 1Н), 6,79 (д, J=2,6 Гц, 1Н), 6,72 ( д, J=8,8 Гц, 1Н), 4,89 (с, 1Н), 4,09 (с, 2Н), 1,61-1,59 (м, 4Н) и 1,35 (д, J=6,8 Гц, 4Н).

[00124] Пример 3: Получение N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамида (Соединение 1).

[00125] К раствору 4-оксо-5-(трифторметил)-1H-хинолин-3-карбоновой кислоты 7 (9,1 г, 35,39 ммоль) и 4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)анилина 11 (9,2 г, 35,74 ммоль) в 2-метилтетрагидрофуране (91,00 мл) добавляли циклический ангидрид пропилфосфоновой кислоты (50% раствор в этилацетате, 52,68 мл, 88,48 ммоль) и пиридин (5,6 г, 5,73 мл, 70,78 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную колбу нагревали при 65°C в течение 10 ч в атмосфере азота. Затем после охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляли этилацетатом и гасили насыщенным раствором Na ₂CO₃ (50 мл). Слои разделяли и водный слой экстрагировали дважды дополнительно этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой, сушили над Na₂SO₄ и концентрировали до желтовато-коричневого твердого вещества. Этот неочищенный твердый продукт суспендировали в смеси этилацетат/диэтиловый эфир (2:1), собирали фильтрованием в вакууме и промывали дважды дополнительно смесью этилацетат/диэтиловый эфир (2:1) с получением продукта в виде светло-желтого кристаллического порошка. Этот порошок растворяли в теплом этилацетате и абсорбировали на Целит. Очистка хроматографией на силикагеле (0-50% этилацетат в дихлорметане) давала N-(4-(7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ил)-2-(трифторметил)фенил)-4-оксо-5-(трифторметил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоксамид (Соединение 1) в виде белого кристаллического твердого вещества (Форму А) (13,5 г, выход 76%). LC/MS m/z 496,0 [M+H]⁺ , время удерживания 1,48 мин (RP-C_18, 10-99% CH ₃CN/0,05% ТФУ на протяжении 3 мин). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 13,08 (с, 1Н), 12,16 (с, 1Н), 8,88 (с, 1Н), 8,04 (дд, J=2,1, 7,4 Гц, 1Н), 7,95-7,88 (м, 3Н), 7,22 (дд, 2,5, 8,9 Гц, 1Н), 7,16 (д, J=2,5 Гц, 1Н), 4,33 (с, 2Н), 1,67 (д, J=6,9 Гц, 4Н), 1,44 (д, J=6,9 Гц, 4Н).

[00126] Порошковая дифрактограмма Формы А показана на Фигуре 1.

[00127] Таблица 1 ниже обеспечивает репрезентативные XRPD-пики Формы А.

Таблица 1 XRPD-пики Формы А
2-тета (градусы)	Интенсивность (%)
7,90	100,0
9,28	10,8
11,90	12,8
14,38	35,2
15,08	12,6
15,80	34,1
16,96	25,2
17,66	13,8
19,28	39,4
20,06	20,2
21,36	14,5
21,80	94,2
23,40	30,0
23,80	92,0
25,64	8,9
26,82	6,4
29,36	8,1
29,72	18,1
30,14	14,2
31,20	9,9

[00128] Конформационные изображения Формы А на основе рентгеноструктурного анализа отдельного кристалла показаны на Фигуре 2. Данные дифракции получали на дифрактометре Broker Apex II, снабженном заделанной трубкой-источником CuK-альфа и детектором Apex II CCD. Структуру определяли и уточняли с использованием программы SHELX (Sheldrick, G.M., Acta Cryst. A64, pp.112-122 (2008)). На основе интенсивностей, статистики и симметрии эту структуру определяли и уточняли в системе тригонального кристалла и пространственной группы R-3. Форма А имеет следующие размеры элементарной ячейки кристалла: a=19,1670(4) Å (ангстрем), b=19,1670(4) Å (ангстрем), c=33,6572(12) Å (ангстрем), =90°, =90° и =120°.

[00129] FTIR-спектр Формы А показан на Фигуре 3.

[00130] Таблица 2 ниже обеспечивает репрезентативные FTIR-пики Формы А.

Таблица 2 FTIR-пики Формы А
Положение (см-1 )	Интенсивность
407,4	46,07
436,7	72,55
471,5	61,17
497,8	63,61
505,7	60,34
532,9	61,14
567,8	54,31
590,7	55,23
614,4	64,01
649,7	50,74
661,0	49,82
686,8	51,43
726,1	53,80
751,4	35,60
798,1	48,21
808,8	48,47
824,8	42,25
875,5	52,89
898,6	71,77
918,7	68,93
977,7	42,31
1008,1	64,09
1047,3	35,70
1072,5	53,76
1091,2	43,79
1113,4	28,46
1131,4	30,00
1153,0	34,61
1168,3	40,13
1199,3	74,26
1221,8	48,07
1253,1	47,84
1277,6	36,67
1291,7	48,07
1310,8	55,99
1329,1	63,21
1352,8	42,30
1433,2	42,45
1463,0	63,68
1526,0	35,86
1574,0	60,60
1607,5	60,30
1662,6	55,12
1740,9	86,74
2870,0	81,63
2947,7	75,12
2963,8	75,30
3092,7	84,58

[00131] Анализы для детектирования и измерения свойств потенциирования F508-CFTR соединений

[00132] Оптические способы измерения мембранного потенциала для анализа модулирующих F508-CFTR свойств соединений

[00133] Этот анализ использует флуоресцентные потенциалочувствительные красители для измерения изменений в мембранном потенциале с использованием флуоресцентного планшет-ридера (например, FLIPR III, Molecular Devices, Inc.) в виде считываний показаний увеличения функционального F508-CFTR в клетках NIH 3T3. Движущей силой для этой реакции является создание градиента хлоридных ионов вместе с активацией каналов посредством единственной стадии добавления жидкости, после того как эти клетки были предварительно обработаны соединениями и затем нагружены потенциалочувствительным красителем.

[00134] Идентификация потенциаторных соединений

[00135] Для идентификации потенциаторов F508-CFTR разрабатывали формат HTS-анализа двойного добавления. Этот HTS-анализ использует флуоресцентные потенциалочувствительные красители для измерения изменений в мембранном потенциале на FLBPR DI в качестве измерения на увеличение в воротном механизме (проводимости) F508 CFTR в температурно-корректированных F508 CFTR-клетках NIH 3T3. Движущей силой для этой реакции является градиент Cl^--ионов вместе с активацией каналов форсколином в единственной стадии добавления жидкости с использованием флуоресцентного планшет-ридера, такого как FLIPR III, после того как эти клетки были предварительно обработаны потенциаторными соединениями и затем нагружены перераспределяющим красителем.

[00136] Растворы

Раствор бани № 1: (в мМ) NaCl 160, KCl 4,5, CaCl₂ 2, MgCl ₂ 1, HEPES 10, pH 7,4 с NaOH.

Не содержащий хлорида раствор бани: хлоридные соли в растворе бани № 1 заменены глюконатными солями.

[00137] Культура клеток

[00138] Для оптических измерений мембранного потенциала использовали мышиные фибробласты NIH3T3, стабильно экспрессирующие F508-CFTR. Эти клетки поддерживали при 37°С в 5% CO ₂ и 90% влажности в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 2 мМ глутамином, 10% фетальной телячьей сывороткой, 1 X NEAA, -меркаптоэтанолом, 1 X пен/стреп (пенициллин/стрептомицин) и 25 мМ HEPES в культуральных колбах 175 см². Для всех оптических анализов, эти клетки высевали при ~20000 клетках на лунку в 384-луночных покрытых матригелем планшетах и культивировали в течение 2 часов при 37°С перед культивированием при 27°C в течение 24 часов для анализа потенциатора. Для корректирующих анализов эти клетки культивировали при 27°С или 37°С с соединениями или без соединений в течение 16-24 часов.

[00139] Электрофизиологические анализы для анализа модулирующих F508-CFTR свойств соединений.

[00140] Анализ с камерой Ussing

[00141] Эксперименты с камерой Ussing выполняли на поляризованных эпителиальных клетках дыхательных путей, экспрессирующих F508-CFTR, для дополнительной характеристики модуляторов F508-CFTR, идентифицированных в оптических анализах. Эпителии дыхательных путей не-CF (без муковисцидоза) и CF (с муковисцидозом) выделяли из бронхиальной ткани, культивируемой, как описано ранее (Galietta, L.J.V., Lantero, S., Gazzolo, A., Sacco, O., Romano, L., Rossi, G.A., & Zegarra-Moran, O. (1998) In Vitro Cell. Dev. Biol. 34, 478-481), и высевали на фильтры Costar® Snapwell , которые предварительно покрывали NIH3T3-кондиционированной средой. Спустя четыре дня, эту апикальную среду удаляли и эти клетки выращивали при поверхности раздела воздух-жидкость в течение >14 дней перед использованием. Это приводило к монослою полностью дифференцированных цилиндрических призматических клеток, которые были реснитчатыми, т.е. имели признаки, характерные для эпителия дыхательных путей. Не-CF HBE выделяли из не-курильщиков, которые не имели никакого известного заболевания легких. CF-HBE выделяли из пациентов, гомозиготных в отношении F508-CFTR.

[00142] HBE, выращенные на инсертах культуры клеток Costar® Snapwell , помещали в камеру Ussing (Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA) и трансэпителиальную устойчивость и ток короткого замыкания в присутствии базолатерального - апикального CF ^--градиента (I_sc) измеряли с использованием системы фиксации потенциалов (Department of Bioengineering, University of Iowa, IA). Вкратце, HBE испытывали при регистрирующих условиях фиксации потенциала (V_hold=0 мВ) при 37°C. Базолатеральный раствор содержал (в мМ) 145 NaCl, 0,83 K₂HPO₄ , 3,3 KH₂PO₄, 1,2 MgCl₂, 1,2 CaCl₂, 10 глюкозу, 10 HEPES (pH доводили до 7,35 с использованием NaOH) и апикальный раствор содержал (в мМ) 145 Na-глюконат, 1,2 MgCl₂, 1,2 CaCl₂, 10 глюкозу, 10 HEPES (pH доводили до 7,35 с использованием NaOH).

[00143] Идентификация соединений-потенциаторов

[00144] Типичный протокол использовал базолатеральный - апикальный мембранный градиент Cl^-градиент. Для установки этого градиента использовали обычные кольцеобразователи на базолатеральной мембране, тогда как апикальный NaCl заменяли эквимолярным глюконатом натрия (титрованного до рН 7,4 с использованием NaOH) с получением большого градиента концентрации Cl^- поперек эпителия. Форсколин (10 мкМ) и все тестируемые соединения добавляли на апикальную сторону этих инсертов культур клеток. Эффективность предположительных потенциаторов F508-CFTR сравнивали с эффективностью известного потенциатора, генистеина (ингибитора протеингистидинкиназ).

[00145] Регистрации пэтч-клампов

[00146] Общий ток Cl^- в клетках F508-NIH3T3 подвергали мониторингу с использованием регистрации перфорированной-пэтч конфигурации, описанной ранее (Rae, J., Cooper, K., Gates, P., & Watsky, M. (1991) J. Neurosci. Methods 37, 15-26). Регистрации фиксации потенциала выполняли при 22°C с использованием усилителя пэтч-клампа Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, CA). Раствор пипетки содержал (в мМ) 150 N-метил-D-глюкамин (NMDG)-Cl, 2MgCl₂, 2CaCl₂, 10 ЭГТА, 10 HEPES и 240 мкг/мл амфотерицина-B (pH доводили до 7,35 с использованием HCl). Внеклеточная среда содержала (в мМ) 150 NMDG-Cl, 2MgCl ₂, 2CaCl₂, 10 HEPES (pH доводили до 7,35 с использованием HCl). Генерирование импульсов, получение данных и анализ выполняли с использованием PC, снабженного поверхностью раздела Digidata 1320 A/D вместе с Clampex 8 (Axon Instruments Inc.). Для активации F508-CFTR в баню добавляли 10 мкМ форсколин и 20 мкМ генистеин и реакцию ток - потенциал подвергали мониторингу каждые 30 секунд.

[00147] Идентификация соединений-потенциаторов

[00148] Способность потенциаторов F508-CFTR увеличивать макроскопический ток F508-CFTR Cl^- (I _F508) в клетках NIH3T3, стабильно экспрессирующих F508-CFTR, исследовали также с использованием регистрирующих перфорированные-пэтчи (очажки) способов. Потенциаторы, идентифицированные из оптических анализов, индуцировали зависимое от дозы увеличение I _F508 с силой и эффективностью, сходной с силой и эффективностью в оптических анализах. Во всех испытанных клетках обращенный потенциал до и во время нанесения потенциатора был равен приблизительно -30 мВ, который равен рассчитанному E _Cl (-28 мВ).

[00149] Культура клеток

[00150] Для регистраций цельных клеток использовали мышиные фибробласты NIH3T3, стабильно экспрессирующие F508-CFTR. Эти клетки поддерживали при 37°С в 5% CO ₂ и 90% влажности в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 2 мМ глутамином, 10% фетальной телячьей сывороткой, 1 X NEAA, -меркаптоэтанолом, 1 X пен/стреп (пенициллин/стрептомицин) и 25 мМ HEPES в культуральных колбах 175 см². Для регистрации цельных клеток 2500-5000 клеток высевали на покрытые поли-L-лизином стеклянные покровные стекла и культивировали в течение 24-48 часов при 27°C перед использованием для тестирования активности потенциаторов; и инкубировали с корректирующим соединением или без корректирующего соединения при 37°С для измерения активности корректоров.

[00151] Регистрации отдельных каналов

[00152] Активность воротного механизма wt-CFTR и корректируемого температурой F508-CFTR, экспрессируемого в клетках NIH3T3, наблюдали с использованием регистраций вырезанных пэтчей (очажков) вывернутой наизнанку мембраны, как описано ранее (Dalemans, W., Barbry, P., Champigny, G., Jallat, S., Dott, K., Dreyer, D., Crystal, R.G., Pavirani, A., Lecocq, J-P., Lazdunski, M. (1991) Nature 354, 526-528) с использованием усилителя пэтч-клампа Axopatch 200B (Axon Instruments Inc.). Пипетка содержала (в мМ): 150 NMDG, 150 аспарагиновой кислоты, 5CaCl₂, 2MgCl₂ и 10 HEPES (pH доводили до 7,35 Трис-основанием). Баня содержала (в мМ): 150 NMDG-Cl, 2MgCl₂, 5 ЭГТА, 10 TES и 14 Трис-основания (pH доводили до 7,35 с использованием HCl). После вырезания, как wt-CFTR, так и F508-CFTR активировались добавлением 1 мМ Mg-ATP, 75 нМ каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы (PKA; Promega Corp. Madison, WI) и 10 мМ NaF для ингибирования протеинфосфатаз, которые предотвращали уменьшение тока. Потенциал пипетки поддерживали при 80 мВ. Активность канала анализировали из мембранных пэтчей (очажков), содержащих < 2 активных каналов. Максимальное количество одновременных открываний определяло количество активных каналов во время хода эксперимента. Для определения амплитуды одноканального тока эти данные, зарегистрированные из 120-секундной активности F508-CFTR, фильтровали "автономно" при 100 Гц и затем использовали для построения гистограмм амплитуд для всех точек, которые подгоняли с использованием мультигауссовых функций при помощи программы Bio-Patch Analysis (Bio-Logic Comp. France). Общий микроскопический ток и открытую вероятность (P_o ) определяли из 120 секунд активности каналов. Эту P_o определяли с использованием программы Bio-Patch или из взаимоотношения P₀=I/i(N), где I=средний ток, i=амплитуда тока единственного канала и N=число активных каналов в пэтче (очажке).

[00153] Культура клеток

[00154] Для регистраций вырезанных мембранных пэтч-клампов использовали мышиные фибробласты NIH3T3, стабильно экспрессирующие F508-CFTR. Эти клетки поддерживали при 37°С в 5% CO ₂ и 90% влажности в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 2 мМ глутамином, 10% фетальной телячьей сывороткой, 1 X NEAA, -меркаптоэтанолом, 1 X пен/стреп (пенициллин/стрептомицин) и 25 мМ HEPES в культуральных колбах 175 см². Для регистрации отдельных каналов 2500-5000 клеток высевали на покрытые поли-L-лизином стеклянные покровные стекла и культивировали в течение 24-48 часов при 27°C перед использованием.

[00155] Форма А Соединения 1 применима в качестве модулятора транспортеров АТФ-связывающей кассеты. Было измерено, что EC ₅₀ (мкм) Формы А Соединения 1 равна менее 2,0 мкм. Было рассчитано, что эффективность Формы А Соединения 1 равна 100%-25%. Следует отметить, что 100% эффективность является максимальной реакцией, полученной с 4-метил-2-(5-фенил-1Н-пиразол-3-ил)фенолом.