способ получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака nicotiana tabacum l., содержащего ген uida

Формула изобретения

Способ получения клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген uidA, включающий получение эксплантов, индукцию каллусогенеза и последующее субкультивирование, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют листовые экспланты, полученные из семян интактных растений N. tabacum L., для чего упомянутые семена стерилизуют, переносят на агаризованную безгормональную питательную среду и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток, полученные листья рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см², переносят их на агаризованную гормональную питательную среду MC со следующими дополнениями (мг/л):

2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты	2
кинетина	0,2

и инкубируют в темноте в течение 3-4 недель с образованием каллуса, после чего каллусную ткань, трансформируют агробактериями A. tumefaciens, содержащими репортерный ген uidA и маркерный ген npt II в плазмиде pBi121, культивируют в темноте в течение 6-8 недель на агаризованной селективной питательной среде MC со следующими дополнениями (мг/л):

2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты	2
кинетина	0,2
цефотаксима	500
канамицина	200

отбирают активнорастущие линии, которые выращивают на жидкой питательной среде MC со следующими дополнениями (мг/л):

2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты	2
кинетина	0,2
цефотаксима	500
канамицина	200
целлюлазы	1000-1500
пектиназы	1000-1500

из которых на стадии выращивания суспензионных культур отбирают перспективные линии, характеризующиеся максимальной скоростью роста и максимальным уровнем экспрессии гена uidA.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, в частности, может быть использовано в исследовательских целях и в фармакологической промышленности, т.к. послужит основой для ускоренного создания высокоэффективной, дешевой, биологически безопасной клеточной системы транзиентной экспрессии целевых генов и выращивания биомассы клеточной культуры трансгенного табака N. tabacum L.

Клеточную суспензионную культуру трансгенного табака N. tabacum L. получают путем агробактериальной трансформации каллусной культуры почвенными бактериями Agrobacterium tumefaciens, содержащими маркерный ген npt II и репортерный ген uidA в плазмиде pBi121, и последующего отбора на селективной питательной среде.

К настоящему времени разработаны технологии получения генетически модифицированных (трансгенных) растений, в геном которых встроены гены, кодирующие различные белки для медицинских целей, в том числе и белки человека. Такие технологии основаны на прямом или векторном переносе целевых генов в ядерный геном растения. За последнее десятилетие получены десятки видов трансгенных растений, в геном которых перенесены гены антигенов различных возбудителей инфекционных заболеваний, разнообразных терапевтических белков, моноклональных антител [1, 4, 10]. Однако относительно невысокий уровень накопления целевых белков (менее 1% от общего растворимого белка - ОРБ) в тканях генетически модифицированных растений требует разработки новых систем экспрессии.

Суспензионные клеточные культуры на основе генетически модифицированных растений привлекают внимание исследователей как перспективные потенциальные системы для наработки фармацевтически ценных белков. Такие культуры могут быть получены из рыхлых каллусных тканей, индуцированных из генетически модифицированных эксплантов, либо на основе кокультивирования клеточной суспензии и A. tumefaciens [2, 3]. После оценки ростовых характеристик и отбора клеточных линий по способности накапливать рекомбинантные белки могут быть отобраны перспективные линии для культивирования в биореакторах.

Клеточные линии для наработки рекомбинантных белков на основе клеточных культур моркови и риса разрабатываются для коммерческих целей (например, компанией «Protalix» Израиль) [4]. Широко используются для этих целей также клеточные культуры табака [3, 5]. В 2006 году в США фирме «Dow AgroSciences» была выдана лицензия на способ получения вакцины против возбудителя болезни Ньюкасла (псевдочума, азиатская чума кур) на основе суспензионной клеточной культуры табака [4]. Привлекательной особенностью клеточных культур как системы экспрессии для наработки рекомбинантных белков по сравнению с использованием для этого целых растений является то, что клеточные культуры можно унифицировать по ростовым характеристикам, размерам и типам клеток. Более того, клетки выращиваются в строго контролируемых условиях, при которых скорость накопления продукта не будет меняться от пассажа к пассажу, что является более технологичным и экологически безопасным процессом. Выращивание in vitro трансгенных клеточных культур также имеет еще ряд преимуществ перед другими способами экспрессии чужеродных генов: для этого не требуется сложного оборудования; отсутствует зависимость от сезонности работ, а масштабы культивирования обеспечивают производство рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и терапевтического использования.

На базе института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) методом кокультивации листовых дисков растений табака N. tabacum (линии SRI) с суспензией клеток агробактерий A. tumefaciens (штамм LBA4404), содержащих плазмидную ДНК pBi101-IL18, получены генетически модифицированные растения табака N. tabacum L., включающие гены интерлейкина-18 человека [6]. Созданные трансгенные растения могут служить источником иммуномодулирующего белка медицинского назначения.

Прототипом изобретения выбран способ получения трансгенного растения N. tabacum L., включающего гены интерлейкина-18 человека и продуцирующего белки IL-18 [7]. Синтезируемые белки обладают стабильностью и могут сохраняться длительное время без выделения.

Недостатками известного способа являются длительность процесса получения трансгенных растений, высокая трудоемкость, ограничивающая объем анализируемого материала, длительность контакта растительного материала с антибиотиком в процессе культивирования на канамицинсодержащей среде, в результате чего морфогенетический потенциал клеточной культуры может быть снижен, а также широкая вариабельность по уровню экспрессии целевого гена среди растений-трансформантов, объясняемая случайной природой интеграции трансгена в геном растения-реципиента.

Техническая задача изобретения - создание более быстрого и эффективного способа получения клеточной культуры трансгенных растений N. tabacum L. с высоким уровнем экспрессии репортерного гена uidA (фермента -глюкуронидазы).

Поставленная задача решается тем, что при агробактериальной трансформации вместо использования листовых дисков интактных растений табака используется каллусная ткань. Для этого получают экспланты из стерильных пробирочных растений табака N. tabacum L., выращенных in vitro на свету в течение 28 суток из простерилизованных семян на безгормональной питательной среде Мурасиге и Скуга [8]. Рассеченные листовые сегменты размером 0,2-0,3 см² переносят на агаризованную питательную среду MC с добавлением фитогормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в концентрации 2 мг/л и кинетина в концентрации 0,2 мг/л и инкубируют в темноте в течение 3-4 недель с образованием каллуса табака. После этого проводят агробактериальную трансформацию каллусной ткани бактериями A. tumefaciens, содержащими маркерный ген npt II и репортерный ген uidA в плазмиде pBi121, и последующее субкультивирование на агаризованной питательной среде MC, содержащей фитогормоны 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в концентрации 2 мг/л, кинетин в концентрации 0,2 мг/л и антибиотики цефотаксим в концентрации 500 мг/л и канамицин - 200 мг/л для подавления агробактерий и отбора трансформированных каллусов. Для проверки успешной трансформации каллусной ткани проводят гистохимическое выявление GUS-активности. Затем из наиболее активно растущих каллусных тканей получают суспензионные культуры, состоящие из множества преимущественно одиночных клеток или мелких клеточных агрегатов. Для этого используют жидкую среду МС с добавлением фитогормонов, антибиотиков (как указано выше) и ферментов пектиназы и целлюлазы в равных концентрациях от 1000 до 1500 мг/л. Культивирование суспензий осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин.

Перевод каллусных культур в суспензионные обусловлен тем, что при таком режиме культивирования: 1) происходит интенсификация ростовых процессов (длительность пассажа составляет 15-16 дней); 2) проще выявлять линии клеточных культур, отличающихся разным уровнем экспрессии гена uidA (что может быть связано с различным местом встройки в растительном геноме); 3) быстрое получение биомассы растительных клеток суспензионных культур позволяет использовать крупномасштабное промышленное оборудование (ферментеры) для культивирования.

В условиях ламинар-бокса небольшие аликвоты суспензионных культур (по 2-5 мл) с помощью стерильного шпателя Дригальского высевают в чашки Петри на селективную агаризованную питательную среду МС с добавлением фитогормонов, антибиотиков (как указано выше).

Из активно растущих каллусов через 4-8 недель вновь получают суспензионные культуры, в которых в дальнейшем с помощью гистохимического окрашивания выявляют уровень транзиентной экспрессии гетерологичных генов. На основании результатов полуколичественного анализа GUS-активности проводится отбор клеточных линий по способности к максимальному уровню экспрессии фермента -глюкуронидазы.

Общая схема получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака N. tabacum L., содержащего ген uidA, для создания на ее основе биопродуцентов рекомбинантных белков представлена на фиг.1.

В таблице 1 приведен оптимальный состав агаризованной безгормональной питательной среды MC для получения стерильных растений табака.

В таблице 2 приведен состав агаризованной питательной среды для инкубации подготовленных эксплантов с добавлением фитогормонов: ауксина и цитокинина.

В таблице 3 приведен состав питательной среды для выращивания A. tumefaciens, содержащих репортерный ген uidA и маркерный ген npt II в плазмиде pBi121.

В таблице 4 приведен состав агаризованной питательной среды МС с добавлением фитогормонов и антибиотиков для отбора каллусных культур после агробактериальной трансформации.

В таблице 5 приведен состав жидкой питательной среды МС с добавлением фитогормонов, антибиотиков и ферментов для получения суспензионных трансформированных культур табака.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1 поясняет получение стерильных пробирочных растений. В подготовленные стерильные пробирки (контейнеры для выращивания проростков) разливают стерильную агаризованную безгормональную питательную среду № 1 (табл.1).

В условиях ламинар-бокса стерильные бумажные фильтры помещают в стерильные чашки Петри, с помощью пипетки-дозатора смачивают фильтр 4-5 мл стерилизующего раствора, состоящего из 96%-ного этанола, 37%-ной перекиси водорода и воды в объемном соотношении 7,5:1:1 соответственно. Семена помещают на смоченный фильтр. Открытые чашки Петри оставляют под УФ-излучением на 10 мин, после чего фильтры оставляют в ламинарном шкафу на 40-45 мин до высыхания. Семена с подсохшего фильтра высаживают в подготовленные контейнеры на застывшую питательную среду. Закрывают контейнеры парафильмом и помещают в культуральную комнату на стеллажи с люминесцентными лампами Philips TL-D 36 W/54 - 765 белого света (интенсивность I=5000 лк, фотопериод 16/8 часов) с температурным режимом t=25-27°C и влажностью воздуха 70%. Примерно через 28 дней листья полученных стерильных растений табака сегментируют и используют для получения каллусной культуры.

Пример 2 поясняет индукцию каллусогенеза. В условиях ламинарного бокса стерильные растения табака извлекают пинцетом из контейнеров. С помощью скальпеля рассекают листья на сегменты площадью 0,2-0,3 см². Полученные экспланты помещают на модифицированную гормональную среду MC (табл.2). Пробирки или контейнеры с эксплантами переносят в культуральную комнату, где поддерживают температуру воздуха t=25-27°C при 70%-ной влажности.

Пример 3 поясняет агробактериальную трансформацию A. tumefaciens, содержащими репортерный ген uidA и маркерный ген npt II в плазмиде pBi121. Для выращивания ночной культуры агробактерии A. tumefaciens берут отдельный агробактериальный клон с чашки, добавляют в пробирку с 3 мл жидкой стерильной среды YEP (табл.3), содержащей антибиотики (рифампицин - 500 мг/л, канамицин - 500 мг/л), культивируют в течение ночи в термостатируемом шейкере при 28°C до плотности 1 (измеряется на ФЭК при длине 670 нм). Эту бактериальную суспензию используют для трансформации.

Для этих целей ночную культуру агробактерии A. tumefaciens предварительно центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, к суспензии бактерий добавляют солевой раствор, содержащий макро- и микроэлементы по прописи среды MC (табл.1). Затем бактерии вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость вновь удаляют. К осадку бактерий добавляют жидкую среду MC и доводят до разведения 10 млн бактериальных клеток в 1 мл раствора.

Для кокультивирования используют каллус 2-3-го субкультивирования, предварительно разделенный на небольшие кусочки (около 3-7 мм в диаметре весом 30-70 мг), которые раскладывают их на стерильной фильтровальной бумаге в стерильных чашках Петри. На каждый из кусочков каллуса наносят по 10-20 мкл приготовленной суспензии ночной культуры агробактерии A. tumefaciens. После того, как избыток суспензии впитается фильтровальной бумагой, кусочки каллуса переносят в чашки Петри и помещают на агаризованную среду MC с 2 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л кинетина, в которую добавляют антибиотики цефотаксим в концентрации 500 мг/л и канамицин - 200 мг/л для подавления агробактерии и отбора трансформированных каллусов (табл.4). Чашки Петри помещают в термостат в темноту при температуре 22°C и культивируют на протяжении 2-3 пассажей по 28 суток.

Пример 4. Гистохимическое выявление GUS-активности в каллусной ткани. Гистохимическое определение основано на реакции:

.

Условия фиксации различны в зависимости от типа ткани и ее проницаемости для фиксатора [9]. Наилучшим субстратом для гистохимического выявления -глюкуронидазы в тканях и клетках служит 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронид (X-GLUC). При реакции с данным субстратом в области локализации фермента образуется голубой осадок. На точность определения GUS влияют многие факторы, и для их нейтрализации необходимо хорошо понимать ход реакций. Соединение, образующееся при взаимодействии глюкуронидазы с X-GLUC, не окрашено. Для образования нерастворимого и ярко окрашенного в голубой цвет конечного продукта индоксильное производное, образующееся в ходе реакции, должно подвергнуться окислительной димеризации. Димеризацию стимулируют атмосферным кислородом, кроме того, она может быть в значительной мере усилена при использовании катализатора окисления, например смеси феррицианида и ферроцианида калия.

Для исследования используют нетрансгенную (в качестве контроля) и трансгенную каллусную ткань. Растительный материал помещают в раствор для фиксации (0,5%-ный раствор тритона Х-100 и фосфатного буфера pH 7,0) и быстро (1 мин) пропитывают им ткани с помощью вакуумной инфильтрации. Инкубируют в фиксаторе при комнатной температуре в течение 45 минут, а затем при 37°C от 20 мин до нескольких часов (в зависимости от интенсивности окрашивания и растительного объекта). После окрашивания растительных объектов проводят визуальное определение GUS-активности.

Пример 5 поясняет получение суспензионных культур. Для получения суспензионной культуры используют трансформированные каллусные ткани табака, имеющую рыхлую структуру, светлую окраску и достаточно высокую интенсивность роста. В жидкую питательную среду МС с добавлением фитогормонов (2 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л кинетина), антибиотиков (цефотаксим в концентрации 500 мг/л и канамицин - 200 мг/л) и ферментов пектиназы и целлюлазы, куда вносят разделенный на небольшие кусочки каллус из расчета 3 г на 50 мл среды. Опыты проведены при добавлении ферментов пектиназы и целлюлазы в равных концентрациях от 1000 мг/л до 2500 мг/л каждого фермента, (табл.5). Культивирование суспензий осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на шейкере Multi PSU-20 BioSan при скорости вращения 100 об/мин. Время субкультивирования - 15-20 дней. При культивировании соблюдаются следующие условия выращивания: температура 26°C, относительная влажность воздуха - 70%.

Как видно из табл.5, увеличение концентрации пектиназы и целлюлазы не приводит к существенному увеличению количества одиночных клеток в суспензии, оптимальным диапазоном является добавление от 1000 до 1500 мг/л каждого фермента в равных концентрациях.

При последующем субкультивировании время субкультивирования сокращают до 16 суток, так как в процессе культивирования происходит постепенное повышение жизнеспособности клеток и увеличение интенсивности их роста.

В экспериментах использовали не менее 10 сосудов для каждого варианта смеси ферментов пектиназы и целлюлазы при одинаковой концентрации каждого фермента. При пересадках постоянно вели поддерживающий отбор по признаку «темп роста», визуально отбирая для дальнейшего культивирования колбы с наилучшим ростом и уровнем транзиентной экспрессии фермента -глюкуронидазы [9]. Исключение из питательной среды МС ионов кальция (CaCl₂) облегчает процесс суспендирования клеточной массы.

Жизнеспособность культуры и размеры клеток определяли по стандартной методике, путем окрашивания клеток метиленовым синим.

Пример 6. Каллусные культуры. В условиях ламинар-бокса из культуральных колб отбирают небольшие объемы суспензионных культур в стерильные емкости-стаканы, а затем автоматической пипеткой аликвоты по 2-5 мл вносят в чашки Петри с агаризованной питательной средой МС с добавлением фитогормонов, антибиотиков (табл.4) и с помощью стерильного шпателя Дригальского рассевают по поверхности среды. Через 3-4 недели наиболее крупные по размеру микрокаллусы (что свидетельствует о более высокой скорости роста) переносят на свежую питательную среду для наращивания биомассы.

Через 2-3 недели культивирования от индивидуально промаркированных микрокаллусов в стерильных условиях отбирают небольшие фрагменты ткани для следующего этапа - оценки GUS-активности. После этого из каллусов с лучшим ростом и максимальным уровнем экспрессии -глюкуронидазы вновь получают суспензионные культуры. В этом случае культуры выращивают на жидкой питательной среде с добавлением фитогормонов и антибиотиков (табл.4).

Полуколичественный анализ уровня транзиентной экспрессии гетерологичных генов (на примере активности фермента -глюкуронидазы) проводится на всех этапах культивирования каллусных и суспензионных культур.

Технический результат - возможность получать трансформированный клеточный материал (клеточную суспензионную культуру трансгенного табака, содержащего ген uidA) со значительным уменьшением трудоемкости и с упрощением технологии (процедур обработки, инкубирования, проверки на вставку Т-ДНК).

Библиография

1 Rybiski E.P. Plant-produced vaccines: promise and reality // Drug Discovery Today. 2008. V.13. P.894-901.

2 Hellwig S., Drossard J., Fisher R. Plant cell culture for the production of recombinant proteins // Nat. Biotechnol. 2004. V.22. PP.1415-1422.

3 Martinez C.A., Guilietti A.M., Talou R. Research advances in plant-made flavi-virus antigens. // Biotechnology Advances. 2012. Doi:10.1016/j.biotechadv. 2012.03.004.

4 Yusibov V., Rabindran S. Resent progress in the development of plant-derived vaccines // Expert Reviews of Vaccines. 2008. V.7. P.1173-1183

5 Lienard D., Tran Ding O., van Oort M. Suspension-culture BY-2 tobacco cells produce and mature immunologically active house dust mite allergens // Plant Biotechnol. J. 2007. V.5. PP.93-108.

6 Патент РФ 2302460, C12N 15/09, опубл. 2007. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBi101-IL18, кодирующая синтез интерлейкина-18 человека в трансгенных растениях.

7 Турчинович А.А., Дейнеко Е.В., Филипенко М.Л. и др. Получение трансгенных растений табака - продуцентов интерлейкина-18 человека // Доклады АН. 2004. Т.395(5), С.704-707.

8 Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassay with Tobacco Tissue Culture // Physiol. Plant. - 1962. - Vol.15, № 13. - P.473-497

9 Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. Gus fusions в-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. 1987. - V.6. - P.3301-3307.

10 Sourrouille С., Marshall В., Lienard D., Faye L. From Neanderthal to Nanobiotech: From Plant Potions to Pharming with Plant Factories. In Book: Methods in Molecular Biology: Recombinant Proteins From Plants / Ed. by Faye L. and Gomord V. Humana Press, a part of Springer Science + Buisness Media. 2009. P.1-23.

Таблица 1
Среда № 1 для получения стерильных растений - безгормональная питательная среда MC (pH 5,8)
Компоненты	Содержание, мг/л
неорганические
KNO3	1900
KH2PO4	170
NH4NO3	1650
MgSO4×7H2O	370
CaCl2×2H 2O	440
FeSO4×7H2O	37,3
Na2EDTA×2H 2O	27,8
KI	0,83
H3BO3	6,2
MnSO4×4H 2O	22,3
CoCl2×6H2O	0,025
CuSO4×5H 2O	0,025
ZnSO4×7H2O	8,6
Na2MoO4 ×2H2O	0,25
органические
сахароза	30000
агар	7500-8500
тиамин-HCl	0,5-1,5
пиридоксин-HCl	0,4-0,6
никотиновая кислота	0,4-0,6
вода дистиллированная	до 1 л
Таблица 2
Среда № 2 для индукции и поддержания каллусогенеза растений - агаризованная питательная среда MC (pH 5,8) с добавлением фитогормонов
Компоненты		Содержание, мг/л
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота		2
кинетин		0,2

Таблица 3
Среда № 3 для выращивания A. tumefaciens, содержащих репортерный ген uidA и маркерный ген npt II в плазмиде pBi121 - агаризованная питательная среда YEP
Компоненты	Содержание, г
триптон	1
дрожжевой экстракт	1
NaCl	0,5
агар	1,5
рифампицин	0,05
канамицин	0,05
H2O	100 мл
Таблица 4
Среда № 4 для отбора каллусных культур после агробактериальной трансформации и подавления роста A. tumefaciens - агаризованная питательная среда MC (pH 5,8) с добавлением фитогормонов и антибиотиков
Компоненты		Содержание, мг/л
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота		2
кинетин		0,2
цефотаксим		500
канамицин		200
Таблица 5
Среда № 5 для получения суспензионных трансформированных культур табака - жидкая питательная среда MC (pH 5,8) с добавлением фитогормонов, антибиотиков и ферментов
Компоненты	Содержание, мг/л
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	2		2	2
кинетин	0,2		0,2	0,2
цефотаксим	500		500	500
канамицин	200		200	200
целлюлаза	1000		1500	2500
пектиназа	1000		1500	2500
суспензия из одиночных и мелкоагрегированных клеток	+++		+++	++
++ среднее количество одиночных клеток в суспензии
+++ большое количество одиночных клеток в суспензии