средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием

Формула изобретения

Средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием, представляющее собой сухой экстракт листьев и цветков аврана лекарственного, полученный путем измельчения их, экстракции спиртом 96% на водяной бане до кипения и кипячения в течение 14-15 минут, выпаривания при температуре 55-60°С, разведения выпаренного остатка сначала дистиллированной водой при температуре 40-50°С, затем добавления хлороформа в пропорции 4/5 части воды и 1/5 часть хлороформа, охлаждения до комнатной температуры и центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут с последующим отделением водной фракции и высушиванием ее.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к средствам для профилактики и лечения злокачественных новообразований, и может быть использовано как средство в комплексной терапии злокачественных новообразований.

В настоящее время поиск новых лекарственных препаратов для борьбы со злокачественными новообразованиями является приоритетным направлением современной медицины. Особое значение имеют препараты на основе природного растительного сырья с низким токсическим эффектом. Схема лечения онкологических заболеваний строится по трем основным направлениям: прямое воздействие на опухоль (цитостатическое), иммуномодулирующее и антиоксидантное (неспецифическое усиление иммунных реакций и стимуляция антиоксидантной активности) и протекторное (защитное от токсического действия как самих цитостатиков, так и продуктов распада опухоли). Основными механизмами противоопухолевой цитокинотерапии служат запуск апоптоза раковой клетки - восстановление внутреннего механизма саморазрушения раковой клетки (цитотоксическое действие); арест клеточного цикла - остановка безостановочного деления раковой клетки на определенных стадиях клеточного цикла (цитостатическое действие); ангиогенный эффект - некроз опухолей и угнетение ангиогенеза опухоли (за счет разрушения внутренних кровеносных сосудов опухоли); активация клеток собственного противоопухолевого кластера иммунной системы (Балицкий К.Л. и др. <<Лекарственные растения в терапии злокачественных опухолей>> Киев. 1976: Lang I, Nekam K, Deak G, et al. Immunomodulatory and hepatoprotective effects of in vivo treatment with free radical scavengers. Ital J Gastronterol 22:283-7. 1990; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П. <<Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных новообразований>> Томск, 2000).

Трава аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) в малых дозах в составе сырья других более 30 растений входит в сбор для приготовления микстуры Здренко, используемой ранее для лечения некоторых злокачественных новообразований (<<Библиотека лекарственных растений>>, том 2, составитель Зимин В.Н., Санкт-Петербург, АО <<Дорваль>>, 1992, с.181-182).

Недостатком этого средства является то, что оно не воздействует на опухоли, a только устраняет симптомы. Кроме того, растение ядовито и водное извлечение травы аврана обладает высокой токсичностью, поэтому при внутреннем применении используется вместе со слизистыми отварами с большой осторожностью и под обязательным врачебным контролем (http://www.travolekar.ru/articles.php).

Известна 10%-ная спиртовая настойка листьев аврана лекарственного, которая применяется в крайне малых дозах в связи со значительным количеством побочных эффектов и содержит ядовитые грациозид (грациолин), грациотоксин, кукурбитациновый гликозид - элатерицид, жирное масло, эфирное масло, сапонины, яблочную и бетулиновую кислоты, углеводы (стахиоза), терпеноиды (элатеризид, дезацетилэлатеринид, кукурбитации E и I), карденолиды, сапонины, флавоноиды (лигнозид, изолигнозид, апигенин, космосиин, лигнозид, аврозид, изоаврозид, неоаврозид, изонеоаврозид) и алкалоиды (0.2%) (Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов. Самара: ООО <<Офорт>> СамГМУ, 2004, 1180 с.; Алефиров А.Н. Фитотерапия против онкологии. Издательство: Крылов. Серия: Медицина XXI века. 2010 г. 240 с.; http://www.travolekar.ru/articles.php; http://fitocenter.ru/). В научной медицине спиртовая настойка листьев аврана назначается при асците сердечного происхождения (за счет кукурбитацина элатеризида, кукурбитацинового гликозида). Настойка действует на сердце подобно дигиталису; малые дозы настойки повышают чувствительность зрения к зеленому цвету.

Недостатками 10%-ной спиртовой настойки являются ее высокая токсичность за счет присутствия ядовитых соединений, которые выходят в водную часть настойки, и недостаточное количество выхода целевых продуктов, в частности флавоноидов, а также трудность расчета точной дозировки для дальнейшего использования.

Известно средство на основе полифенольных соединений из корней и корневищ кровохлебки лекарственной, повышающее работоспособность больных раком, обладающее антигипоксическим и стимулирующим эффектом, но не обладающее иммуномодулирующим действием (А.С. СССР 858833, A61K 33/78, 1980).

Известно средство на основе ксантоновых соединений и секоиридоидов из травы золототысячника с иммуномодулирующим действием, оказывающим влияние на T- и B-лимфоциты. Но такой фитокомплекс не обладает иммунопотенцирующим действием (Патент № 2007178, A61K 35/78, 1994).

Известно средство для профилактики рака - кламин, снижающее частоту и множественность индуцированных канцерогенами опухолей у лабораторных животных (крыс и мышей). Недостатком служит то, что кламин не обладает иммуномодулирующим действием.

Известно средство на основе липидного комплекса хвои сосны или ели для профилактики и лечения рака. Однако противоопухолевая активность при раке молочной железы, толстой кишки у крыс статистически недостоверны. Кроме того, средство не обладает достаточной активностью для иммунопотенцирования при химиотерапии и облучении больных (Патент № 2082423, A61K 35/78, 1994). К недостаткам этого средства относится то, что оно не обладает иммуномодулирующим действием.

Известно средство для лечения больных раком, представляющее собой водно-спиртовую вытяжку из семян татарника колючего на 40%-ном спирте в соотношении 15:500 (Патент № 2092171, А61К 35/78, 1997).

К недостаткам этого средства относится то, что оно не обладает иммуномодулирующим действием.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала лекарственных средств за счет создания эффективного лекарственного средства, обладающего противоопухолевым и иммуномодулирующим действием.

Преимуществом предлагаемого лекарственного экстракта служит отсутствие токсичности, а также расширение функциональных возможностей средства для одновременного использования средства в онкологии и как самостоятельного иммуномодулятора.

Впервые установлены свойства средства, представляющего собой упаренный экстракт листьев и цветков аврала лекарственного, полученного путем измельчения травы аврана лекарственного, экстракцией спиртом 96%, выпаривания экстракта, добавления хлороформа, удаления хлороформа, причем экстракцию спиртом проводят на водяной бане до кипения и кипятят в течение 14-15 минут, выпаривают при температуре 55-600°С, выпаренный экстракт разводят сначала дистиллированной водой 40-500°С, затем добавляют хлороформ в пропорции 4/5 части воды и 1/5 часть хлороформа, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, далее отделяют водную фракцию и высушивают ее, полученная биологически активная композиция обладает новыми свойствами: противоопухолевым и иммуномодулирующим [Заявка на изобретение № 2012105384/15(008220), решение о выдаче от 7.02.2013 г.].

Средство, полученное данным способом, имеет следующий химический состав полученной композиции из аврана лекарственного: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он: 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил- -d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро-d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин.

По сравнению с получаемыми ранее водными и спиртовыми извлечениями из травы аврана полученный сухой экстракт травы аврана нетоксичен, а также обладает противоопухолевым и иммуномодулирующим действием, что может быть использовано при лечении больных со злокачественными новообразованиями.

Была проведена экспериментальная работа на лабораторных крысах по определению класса токсичности полученного сухого экстракта аврана по установлению LD₅₀. Перед началом эксперимента, который предусматривал введение экстракта лабораторным животным (белым лабораторным крысам), сухой экстракт разводили до концентрации экстракта 45 мг/мл для перорального введения, 90 мг/мл для внутримышечного введения и для внутрибрюшинного введения. Полученный водный раствор сухого экстракта аврана вводили крысам перорально, внутримышечно и внутрибрюшинно. Состояние животных оценивалась по четырехбалльной шкале по таким показателям, как: состояние шерсти, двигательная активность, болевая реакция, изменение мышечного тонуса, почесывания за 1 минуту, температура тела (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Хабриев Р.У., Москва, 2005).

Животным весом 220±12,3 г перорально вводился раствор сухого экстракта в дозировке 205 мг/кг экстракта. После чего в течение суток проводилось наблюдение за состоянием животных. Животным весом 220±12,3 г внутримышечно вводился раствор сухого экстракта в дозировке 1323 мг/кг, после чего в течение суток проводилось наблюдение за состоянием животных. Животным весом 220±12,3 г внутрибрюшинно вводился раствор сухого экстракта в дозировке 1663 мг/кг, после чего в течение суток проводилось наблюдение за состоянием животных.

Через сутки ни одно животное не умерло, а состояние животных изменилось по значению таких показателей, как состояние шерсти (увеличилось на два балла до четырех к экспериментальной группе по сравнению с контрольной), двигательная активность (увеличилось на один балл до четырех в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), болевая реакция (снизилась на один балл до одного в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), мышечный тонус (увеличился на один балл до четырех в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), почесывания за 1 минуту (увеличилось на один балл до двух в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), температура тела (снизилась в среднем с 36,9 до 35,8°C).

В результате для экстракта аврана не были определены LD₅₀, так как при указанных дозировках раствор сухого экстракта не вызвал гибели ни одной из крыс, получавших его перорально внутримышечно и внутрибрюшинно, что свидетельствует о нетоксичности экстракта в дозировках, в два раза превышающих терапевтические.

Была проведена экспериментальная работа с использованием перевиваемой опухоли рака печени РС-1 для определения противоопухолевой активности сухого экстракта из аврана лекарственного.

Исследовался водный раствор сухого экстракта аврана лекарственного. В работе использованы самцы белых лабораторных крыс массой 150±50 г, которым имплантировали подкожно в области лопатки по 0,5 мл 25%-ной опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма альвеолярного рака печени РС-1, развившегося из эпителия желчных ходов печени крыс. Штаммы перевиваемых опухолей получены из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Работа с лабораторными животными осуществлялась согласно протоколу исследований и не противоречила распоряжению Президиума АН СССР № 120002496 от 02.04.1980 г. «Правила проведения научных исследований с использованием экспериментальных животных» и Женевской Конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных». Протоколы экспериментов одобрены этической комиссией ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России (протокол № 13 от 3 мая 2011 г.).

Животные с перевитой опухолью печени методом случайной выборки были разделены на две группы - опытную (10 крыс), получавшую экстракт аврана лекарственного в дозировке 65 мг/кг, и контрольную интактную группу (10 крыс). Опытной группе крыс раствор вводился перорально в объеме 1 мл один раз в двое суток в течение трех недель с момента трансплантации опухоли. Динамика роста опухоли оценивалась по объему опухоли в определенные периоды времени после трансплантации опухолевой взвеси и высчитывалась по формуле V=a×b×c, где а - ширина, в - толщина, с - высота опухоли. Измерения проводились штангенциркулем.

На 26 сутки животных выводили из эксперимента и производили забор образцов ткани органов, опухоли, крови для морфологического и биохимического исследования. Для оценки патоморфоза опухоли были использованы следующие цитоморфологические показатели: диаметр раковой клетки, диаметр ядра раковой клетки, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ) раковой клетки, рассчитываемый как отношение диаметра ядра к диаметру клетки. Анализировалось 100 опухолевых клеток с каждого препарата. Лейкоцитарная формула крови анализировалась по следующим показателям: количеству палочек, сегментов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов, по которым высчитывается индекс эндогенной интоксикации Каль-Калифа и модификации Б.А. Рейса и соавторов (Гриц и др., 2009). Все результаты были обсчитаны в программе Statistika 6,0.

В группе крыс, получавших экстракт аврана, на 26 сутки после трансплантации в структуре опухоли отмечено уменьшение слизистого компонента по сравнению с контрольной группой, a также атрофические и дистрофические изменения опухолевых клеток, о чем свидетельствует появление клеток по типу «клеток теней». Митозы не выявлялись. На фигуре 1 представлены атрофические и дистрофические изменения опухолевых клеток рака печени РС-1, окрашенных гематоксилином и эозином (увеличение 100), уменьшение слизистого компонента и отсутствие фигур митоза в опухоли в группе животных, получавших экстракт аврана. Также в опухолях опытной группы животных было обнаружено появление четких зон некроза, представленное на фигуре 2.

Диаметр ядер опухолевых клеток в группе крыс, получавших авран, составил 3,4±0,15, что на 13,5% меньше диаметра ядер клеток в контроле (4,05±0,15). Диаметр самих клеток в экспериментальной группе (5,025±0,22) был достоверно меньше на 32,7% по сравнению с диаметром клеток в контроле (7,45±0,15) (табл.1). Полученные различия достоверны при р<0,05.

Таблица 1
Изменение метрических показателей клеток опухолей в контроле и под действием экстрактов
		Под действием экстракта аврана
Показатели клеток опухоли	В контроле
разряд ядра (у.е.)	4,05±0,15	3,4±0,15
размер клетки (у.е.)	7,45±0,15	5,025±0,22
ЯЦИ	0,54±0,03	0,68±0,03

Отмеченное значительное уменьшение диаметра клетки и диаметра ядра по сравнению с контрольной группой, наряду с отсутствием митозов в клетках опухоли группы крыс, получавших авран, указывает на низкую митотическую активность опухоли, что в целом свидетельствует о цитостатическом действии биологически активной композиции экстракта аврана лекарственного. Полученные данные об отсутствии фигур митоза в группе крыс, получавших экстракт аврана, позволяют сделать вывод о его цитостатической активности и торможении клеточного цикла в период S и G₂ фазы и задерживанию пролиферации клеток.

В группе крыс, получавших экстракт аврана, отмечалось замедление роста опухоли по сравнению с контрольной группой. На фигуре 3 в см ³ представлена динамика увеличения объема опухоли в контрольной группе крыс и в группе крыс, получавших экстракт аврана. Полученные нами данные о заметном замедлении роста опухоли в группе крыс, получавших экстракт аврана, вполне согласуется с гистологическими изменениями опухоли у крыс этой группы.

Об иммуномодулирующем действии сухого экстракта аврана свидетельствует выявленное нами положительное влияние экстракта аврана на состав лейкоцитарной формулы крови белых лабораторных крыс с перевитым раком печени РС-1. В лейкоцитарной формуле животных под действием экстракта аврана достоверно уменьшалось количество сегментоядерных нейтрофилов на 22,3% и увеличивалось количество лимфоцитов на 55% по сравнению с контролем (табл.2), а также по индексу эндогенной интоксикации Каль-Калифа.

Таблица 2
Изменения лейкоцитарной формулы крови крыс с перевитым раком печени РС-1 в контрольной группе и группе, получавшей экстракты
Показатели лейкоцитарной формулы
	В контроле	Под действием экстракта аврана
палочки	3±0,67	3±0,4
сегменты	60,3±2,89	46,8±4,16
базофилы	1,67±0,89	2,75±0,88
моноциты	10,67±1,56	10,4±3,44
лимфоциты	24,67±1,11	38,2±2,56

Степень интоксикации определяли по лейкоцитарному интоксикационному индексу (ЛИИ) Каль-Калифа в модификации Б.А. Рейса и соавторов (Гриц и др., 2009):

;

В результате было выявлено, что животные в контрольной группе испытывали высокую эндогенную интоксикацию за счет развития опухолевого процесса, а под действием экстракта уровень интоксикации снижался в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой, соответствуя литературным значениям умеренной интоксикации (табл.3).

Таблица 3
Степень интоксикации в контрольной группе крыс и крыс, получавших средство на основе аврана
Группа животных	ЛИИ	Степень интоксикации
Контрольная	2,58	выраженная
Под действием экстракта	1,02	умеренная

Увеличение количества лимфоцитов в лейкоцитарной формуле у животных с перевитым раком печени РС-1 под действием экстракта аврана на фоне развивающейся опухоли свидетельствует о включении иммунных механизмов специфической защиты организма в целом, а также возможной активации естественных NK-киллеров, активирующих апоптоз в атипичных клетках.

Изменения во внутренних органах лабораторных животных под действием экстракта аврана носили слабовыраженный характер. Кроме того, состояние животных изменилось по значению таких показателей, как состояние шерсти (увеличилось на два балла до четырех в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), двигательная активность (увеличилось на один балл до четырех в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), болевая реакция (снизилась на один балл до одного в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), мышечный тонус (увеличился на один балл до четырех в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), почесывания за 1 минуту (увеличилось на один балл до двух в экспериментальной группе по сравнению с контрольной), температура тела (снизилась в среднем с 36,9 до 35,8°C). Все перечисленные изменения с животными, получавшими экстракт аврана, положительные, что указывает на низкую токсичность экстракта и свидетельствует об иммуностимуляции.

Таким образом, полученный экстракт аврана лекарственного обладает одновременно комплексом свойств, необходимых для профилактики и лечения онкологических заболеваний: противоопухолевыми (преимущественно цитостатическими) и иммуномодулируюшими свойствами (возможной активации NK-киллеров, активирующих апоптоз в атипичных клетках), что, наряду с низкой токсичностью, позволяет использовать его как средство в комплексной терапии злокачественных новообразований.

Пример. Траву аврана измельчали и просеивали через сито с размером ячеек не более 3 мм. Взвесили 10 г измельченного сырья, поместили его в колбу объемом 500 мл, добавили 100 мл этилового спирта 96%, на водяной бане довели до кипения и кипятили в течение 14-15 мин. Экстракт из колбы процедили в стеклянную емкость через 4 слоя широкого бинта, остаток растительного материала тщательно отжали, залили еще 100 мл этилового спирта 96%. Довели до кипения и снова профильтровали в ту же стеклянную емкость. Полученный экстракт выпарили досуха в термостате при температуре не выше 55-60°C. В стеклянную емкость с выпаренным экстрактом добавили 8 мл дистиллированной воды, затем с помощью шприца перенесли полученный раствор в пластиковую центрифужную пробирку объемом 11 мл, добавили 2 мл хлороформа, встряхнули несколько раз до однородности, остудили до комнатной температуры и центрифугировали в течение 15 мин (для удаления неполярных примесей (хлорофилла) и др.) при скорости 1500 оборотов в минуту. Водную фракцию собирали с помощью шприца, поместили в заранее взвешенную чашку Петри, высушили и в таком виде хранили до начала эксперимента. Вес сухого экстракта подсчитали как разницу между весом взвешенной чашкой Петри с сухим экстрактом и весом пустой чашки Петри. Получили 225 мг сухого экстракта аврана.

Полученные 225 мг сухого экстракта из травы аврана лекарственного исследовали методом хромато-масс-спектрометром модели Trace (GC-Trace DSQ (фирма ThermoFinnigan , США). В рамках выполненной работы были выделены органические вещества: -4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4H-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил- -d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро-d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин.

В эксперименте использовался самец крысы, массой 160 г, которому подкожно в области лопатки имплантировали опухолевую взвесь штамма альвеолярного рака печени PC-1 по 0,5 мл 25% в растворе Хэнкса. Водный раствор сухого экстракта аврана вводили перорально с помощью шприца в объеме 1 мл один раз в двое суток в течение трех недель с момента трансплантации опухоли. Была использована дозировка 65 мг/кг. Динамику роста опухоли оценивали по увеличению ее объема через 6, 8, 10, 12, 14, 20, 22 и 24 суток. Измерения проводились штангенциркулем. На 26 сутки крысу вывели из эксперимента и произвели забор образцов ткани органов, опухоли, крови для морфологического и биохимического исследования.

В структуре исследуемой опухоли отмечалось заметное уменьшение слизистого компонента; появление клеток по типу <<клеточных теней>> и четких зон некроза, что свидетельствовало об атрофических и дистрофических изменениях опухолевых клеток. Митозы в клетках опухоли не выявлялись. Диаметр ядер опухолевых клеток составил в среднем 3,2±0,10 у.е., диаметр самой клетки - 5,00±0,12 у.е. Отсутствие митозов и уменьшение диаметра клетки и диаметра ядра (по сравнению со средними значениями в контрольной группе крыс) указывают на низкую митотическую активность клеток опухоли.

Изменение объема опухоли крысы, получавшей экстракт аврана, через 6 суток - 0 см³, 8-0 см³, 10-2,89 см³ , 12-4,8 см³, 14-8,91 см³, 20-11,88 см ³, 22-18,24 см³ и 24-18,36 см³, свидетельствует о заметом замедлении роста опухоли (по сравнению со средними значениями объема в контрольной группе крыс).

В лейкоцитарной формуле крысы под действием экстракта аврана: палочек - 3, сегментов - 42, базофилов - 2, моноцитов - 10, лимфоцитов - 38. Отмечается уменьшение количества сегментоядерных нейтрофилов на 22% и увеличение количества лимфоцитов на 54% (по сравнению со средними значениями в контрольной группе крыс), что свидетельствует об иммуномодулирующем действии аврана у крысы с перевитым раком печени РС-1.

Отмечена также умеренная степень интоксикации, рассчитанная по лейкоцитарному интоксикационному индексу (ЛИИ) Каль-Калифа и равная 1,0.

Изменения во внутренних органах крысы под действием экстракта аврана носили слабовыраженный характер. Через сутки состояние крысы изменилось по значению таких показателей, как состояние шерсти (увеличилось на два балла до четырех по сравнению с исходным), двигательная активность (увеличилось на один балл до четырех по сравнению с исходным), болевая реакция (снизилась на один балл до одного по сравнению с исходным), мышечный тонус (увеличился на один балл до четырех по сравнению с исходным), почесывания за 1 минуту (увеличилось на один балл до двух по сравнению с исходным), температура тела (снизилась с 36,9 до 35,7°C). Такие изменения в состоянии крысы косвенно свидетельствуют о повышении иммунитета на фоне раковой опухоли под действием экстракта аврана.

Применение водного раствора сухого экстракта аврана лекарственного у крысы с перевитым раком печени РС-1 показало, что данное средство обладает противоопухолевым и иммуномодулирующем действием.

Как видно из описания и примера, средство представляет собой сухой экстракт травы аврана лекарственного и не содержит токсичные соединения алкалоиды и гликозиды, находящиеся в растении. Средство уникально тем, что не является токсичным и в то же время способствует задержке роста опухоли, вызывает в ней дистрофические изменения и некрозы, а также благоприятно воздействует на организм лабораторного животного с опухолью, значительно снижая эндогенную интоксикацию и повышая иммунитет.