способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат для репродукции вирусов

Формула изобретения

Способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат для репродукции вирусов, включающий эвтаназию крольчат путем обезглавливания, удаление лапок, хвостов, снятие шкурок, вскрытие брюшной полости на уровне поясничных позвонков, извлечение почек, снятие капсулы органа, измельчение на кусочки величиной 1-3 мм, отличающийся с тем, что в качестве доноров первичный культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста, кусочки ткани отмывают от остатков крови солевым раствором Хенкса, подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°C в течение 30-40 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с рН 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7·10⁵ клеток/см³, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл, определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии при культивировании клеток животных. Первичные культуры клеток почек кроликов, используемые в качестве культивируемых субстратов, хотя и считаются достаточно эффективными объектами, однако они дорогостоящие, а существующие технологии их получения - несовершенны. Использование первичных культур клеток обусловлено более высокой чувствительностью их к вирусам по сравнению с перевиваемыми линиями клеток.

Известны способы получения первичной культуры клеток из легких (Опарин В.Н., Курносов А.Н. Получения и использование первичных культур клеток из постнатальных легких поросят //Актуальные вопросы вет. вирусологии. - Владимир. - 1976. - 4.1. - С.65-67), надпочечников (Сидоренко О.С., Божок Г.А., Легач Е.И. и др. - Получение первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят // Трансплантология. - 2011. - № 1. - С.248-251) и почек (Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П. Пинаева. - Л., 1988. - 320 с.) поросят.

Общими для этих способов получения первичной культуры клеток являются следующие недостатки:

1. Использование в качестве доноров первичных культур клеток весьма дорогостоящих животных-поросят.

2. Поскольку для получения клеток используются целые органы, изначально первичная культура является неоднородной по своему клеточному составу и содержит клетки коры и мозгового слоя почек. К 3-м суткам культивирования монослой состоит, в основном, из фибробластоподобных клеток, а округлые гранулярные клетки (являющиеся скорее всего гормонопродуцирующими) из первичной культуры исчезают. Это может быть связано с тем, что дифференцированные гормонопродуцирующие клетки не способны к пролиферации и имеют ограниченное время существования. В то же время интенсивно пролиферирующие фибробласты приводят к быстрому истощению среды, конкурируя за питательные вещества с остальными типами клеток.

Наиболее близким по техническому решению и качественным параметрам является «Способ получения первичной культуры клеток почек кроликов 25-35-дневного возраста». Б. Митов, Р. Бостанджиева, и др. Проучване върху получаването на клетъчни култури от заешки бъбреци и чувствителността им към вирусни агенти по някой животни. // Ветеринарна медицина. - 2008. - София. - XII. - № 1-2. - С.15-20, который взят нами в качестве прототипа предлагаемого изобретения.

Хотя данный способ считается самым лучшим для наработки вирусной биомассы, однако ему присущ ряд недостатков:

1. С увеличением возраста кроликов до 35 дней, степень покрытия клетками поверхности стекла или пластика за 14 дней составляет лишь 25-75%.

2. С увеличением пассажа субкультивирования наблюдается понижение чувствительности к вирусам, а к 11-у пассажу культура становится нечувствительной к ним.

3. Культура клеток почек до 6 пассажа более чувствительна к вирусу миксоматоза кроликов, чем культура после 6 пассажа и даже постоянная линия RK-13

4. Выращивание крольчат до 28-35-дневного возраста предполагает дополнительные экономические затраты на уход и содержание животных, что ведет к удорожанию себестоимости продукции.

Цель предлагаемого изобретения - повышение эффективности способа на всех этапах технологической цепи получения первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов, репродукции вирусов и наработки вирусной массы.

Поставленная цель решается за счет существенного снижения возраста новорожденных крольчат, используемых в качестве доноров первичной культуры клеток, что ведет к значительному удешевлению себестоимости продукции с одновременным повышением чувствительности культур клеток к вирусам и выходу вирусной биомассы.

Способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат для репродукции вирусов, включающий эвтаназию крольчат путем обезглавливания, удаление лапок, хвостов, снятие шкурок, вскрытие брюшной полости на уровне поясничных позвонков, извлечение почек, снятие капсулы органа, измельчение на кусочки величиной 1-3 мм, отличающийся с тем, что в качестве доноров первичный культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста, кусочки ткани отмывают от остатков крови солевым раствором Хенкса, подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°С в течение 30-40 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с pH 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7·10 ⁵ клеток/см³, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл. Определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл.

Существенным отличием способа получения первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов для репродукции вирусов является то, что используют унифицированную технологию ее получения, позволяющую не только значительно уменьшить возраст используемых доноров первичной культуры клеток до 1-2 дней жизни, тем самым снизить себестоимость продукции, улучшить биологическую активность культивируемых клеток и повысить выход вирусного материала, используемого для производства лечебно-профилактических вирусных препаратов, что иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Зависимость степени и времени образования монослоя первичной культуры клеток почек кроликов от возраста доноров.

Для изучения степени и времени образования монослоя клеток почек новорожденных крольчат были использованы первичные культуры клеток, полученные предлагаемым и известным способами на 1, 2, 20, 25, 28, 30 и 35 дни после рождения крольчат.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1
Способы	Первичная культура клеток	Возраст доноров (дни)	Получена первичная культура	Монослой
				степень (%)	время (дни)
Предлагаемый	ПК-1	1	+	97	8
	ПК-1	2	+	97	8
	ПК-2	1	+	100	10
	ПК-2	2	+	100	10
Известный	ЗБ-8	20	-	25	6
	ЗБ-10	25	-	37	8
	ЗБ-5	28	+	75	14
	ЗБ-3	30	+	95	14
	ЗБ-6	35	+	100	14

Из данных таблицы видно, что при использовании доноров предлагаемым способом, первичная культура была получена во всех случаях, в то время как при использовании известного способа она получена только на 28-35 сутки. Степень образования монослоя при предлагаемом способе составляет 97-100% за 8-10 суток, в то время как при использовании известного способа она достигает этого уровня только за 14 сут культивирования.

Пример 2. Определение зависимости эффективности культивирования почечных клеток новорожденных крольчат от числа пассажей.

Для определения зависимости культивирования клеток от числа пассажей, первичные культуры клеток подвергали 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 59-кратному пассированию их на питательных средах с последующим определением времени и степени образования монослоя клеток почек новорожденных крольчат от смены пассажей.

Таблица 2
Результаты субкультивирования первичной культуры клеток, почек кроликов, полученных предлагаемым и известным способами
Способ	Культуры клеток	Возраст доноров (дни)	Пассаж	Время(дни) образования монослоя	Степень(%)образования монослоя
Предлагаемый	ПК-1	1	59	9	100%
	ПК-2	2	30	9	100%
Известный	ЗБ-6	35	52	14	100%
	ЗБ-1	28	5	14	97%
	ЗБ-8	20	3	14	25%

Из данных таблицы видно, что время, затраченное на образование монослоя при культивировании первичных культур в предлагаемом способе, меньше, чем в известном. Также как и степень образовавшегося монослоя значительно выше в предлагаемом способе.

Пример 3. Определение чувствительности первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат к некоторым вирусам.

Для определения чувствительности первичных культур клеток почек новорожденных крольчат к вирусам, ростовые среды с указанными культурами клеток заражали паравирусом крупного рогатого скота, герпесвирусом типа-1 (ИРТ) - вакцинный штамм ТК-А (ВИЭВ)-В2 и вирусом парагриппа-3 («штамм ПТК-43-86»).

Результаты титрования чувствительности первично-трипсинизированный культуры почек новорожденных кроликов к использованным вирусам представлены в таблице 3.

Таблица 3
Чувствительность первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат к некоторым вирусам
Вирус	Первичная культура клеток	Наличие ЦПД			lg ТЦД50/мл
		24 ч	48 ч	72 ч	1 пассаж	2 пассаж	3 пассаж
Герпесвирус типа I (вирус ИРТ)	ПК	+	+	+	1,5	4,0	4,25
ПГ-3	ПК	-	-	-	0,5	0,7	0
Парвовирус КРС типа I	ПК	-	-	-	-	-	-

Из данных таблицы видно, что использованные клетки нечувствительны к парвовирусу, о чем свидетельствовало отсутствие специфического цитопатического действия (ЦПД) в течение трех последовательных пассажей.

Первичная культура клеток почек новорожденных кроликов поддерживала репликацию вируса парагриппа-3 КРС на протяжении двух пассажей. Однако в последующих пассажах на этой системе репродукция вируса ПГ-3 не была регистрирована.

Герпесвирус типа I легко культивировался в монослое, его цитопатогенное действие отмечалось на 48-96 ч после заражения и характеризовалось специфическим ЦПД. С каждым последующим пассажем на клеточном монослое титр вируса возрастал и на третьем пассаже соответствовал lg ТЦД50/мл=4,25±0,1.

Кроме того, при данной плотности посева клеток (5-7·10⁵ клеток см³) образовался монослой через 8-9 дней с сывороткой крови взрослого КРС, а с сывороткой крови плодов коров через 6-7 дней после посева. Клетки, выращенные на среде Игла MEM в присутствии 0,5% раствора лактоальбумина (1:1) с 10% сывороткой крови, полученные по предлагаемому способу, более жизнеспособны; падение индекса пролиферации происходит медленнее, чем при выращивании на среде Игла MEM.

Отличительные признаки и полезной эффективность предлагаемого способа получения первичной культуры клеток новорожденных крольчат для репродукции вирусов сводится к следующему:

а) преимущества предлагаемого способа получения первичной культуры клеток новорожденных крольчат дают возможность ускорить технологической процесс в 17 раз, что ведет к снижению себестоимости продукции;

б) использование комбинированной питательной (ростовой) среды на основе среды Игла и 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) позволяет сэкономить дорогостоящую и труднодоступную фетальную сыворотку и сыворотку крови КРС, что также позволяет значительно снизить себестоимость конечного продукта;

в) существенное увеличение выхода вирусного материала при использовании предлагаемой культуры клеток обеспечивает значительное ускорение технологического процесса производства вирусных биопрепаратов.