способ диагностики атопического дерматита у детей

Формула изобретения

1. Способ диагностики атопического дерматита у детей, включающий перемешивание и охлаждение пробы крови пациента до температуры тающего льда, осаждение и выделение эритроцитов, промывку средой промывки следующего состава (мМ): 75 - MgCl₂; 85 - сахароза; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис при pH, равном 7,4, при температуре тающего льда, прединкубацию упакованных эритроцитов в среде прединкубирования состава (мМ): 150 - LiCl; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис при pH, равном 7,4, при температуре 37°C в течение 3 часов, осаждение полученной суспензии, удаление наружного лития, перенесение упакованных эритроцитов в среду, свободную от натрия, содержащую изоосмотическую смесь хлористого магния MgCl₂ и сахарозы с добавлением 0,1 мМ уабаина, и в среду, богатую натрием, следующего состава (мМ): 150 - NaCl, 10 - глюкоза, 10 - HEPES-трис (pH 7,4), 0,1 - уабаин, в каждой из указанных сред проводят инкубацию в течение периода экспрессии - выхода лития в среды инкубации, его обмена на натрий и магний при температуре 37°C с периодическим встряхиванием, затем проводят отбор равного количества суспензии эритроцитов из обеих сред, их раздельное осаждение, затем набирают надосадочную жидкость из каждой пробы, разбавляют водой, производят измерение содержания лития в обеих средах, по полученной концентрации лития определяют скорость натрий-литиевого противотранспорта V как разность между концентрацией лития в среде, богатой натрием, и в среде, свободной от натрия, по формуле

V=(ANa-AMg)·K мкМ лития/литр клеток/час, где

ANa - концентрация лития в среде, богатой натрием;

AMg - концентрация лития в среде, богатой магнием (свободной от натрия);

K - коэффициент, связанный с разбавлением сред и с отношением количества надосадочной жидкости с эритроцитами к количеству сред прединкубации и инкубации на предыдущих этапах,

при значении скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита, превышающем 258 мкМ лития/литр клеток/час, диагностируют атопический дерматит у детей.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осаждение эритроцитов проводят путем центрифугирования в режиме 3000 g в течение 5 минут.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение эритроцитов и плазмы проводят путем отсасывания.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделенные эритроциты дважды промывают трехкратным объемом холодной среды промывки.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что прединкубирование проводят при температуре 37°C в течение 3 часов с периодическим встряхиванием каждые 15 минут по 15 секунд.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление наружного лития проводят промывкой эритроцитов.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывку эритроцитов проводят 4 раза четырехкратным объемом среды промывки.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерение содержания лития проводят методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в режиме эмиссии.

9. Способ по пп.1, 8, отличающийся тем, что калибровочные растворы для измерения содержания лития готовят на средах инкубации с учетом разведения пробы.

10. Способ по пп.1, 8, отличающийся тем, что измерение содержания лития проводят при следующих параметрах: длина волны 670,6 нм, состав пламени ацетилен-воздух, стехиометрия пламени окисляющая, чувствительность 10-7 моль/литр.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что коэффициент, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах, выбирают равным K=33 при следующих условиях:

проведение прединкубации эритроцитов в среде прединкубации в соотношении 1:5;

помещение эритроцитов в среду, богатую натрием, и среду, свободную от натрия, в соотношении 1:10;

разбавление надосадочной жидкости в 3 раза.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что период экспрессии определяют в течение 60 минут.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и касается способа диагностики атопического дерматита, в частности, у детей.

Известен способ диагностики атопического дерматита у детей, основанный на оценке гиперчувствительности фагоцитов больных к гистамину (см. заявку на изобретение № 94036342, МПК А61В 10/00, опубликовано 10.07.96), связанной с регистрацией хемилюминесценции фагоцитов с разной концентрацией гистамина в организме пациента. Недостатком данного способа является диагностирование атопического дерматита косвенно, который не учитывает процессы, происходящие на клеточном уровне. Учитываются межклеточные взаимодействия, которые опосредуются медиаторами (гистамином), при этом сами клетки не исследуются.

Известно, что структурно-функциональной единицей живого организма является клетка, основу функционирования и жизнедеятельности которой определяет клеточная мембрана. Клеточная мембрана обеспечивает избирательное проникновение в клетку и обратно молекул и ионов, необходимых для выполнения клеткой ее специфических функций, поддерживает трансмембранную разницу электрического потенциала, специфику межклеточных контактов. Перенос ионов через клеточную мембрану с помощью переносчиков белковой структуры, включающий активный транспорт и облегченную диффузию, является неотъемлемой частью жизнедеятельности всех клеток организма человека в норме и при патологии. Патология атопического дерматита у детей связана с изменением ионного транспорта в их организме. Одной из ион-транспортных систем является натрий-литиевый противотранспорт (НЛПТ) через мембрану эритроцита.

Задачей изобретения является достоверное и эффективное диагностирование атопического дерматита у детей с использованием исследований процессов на клеточном уровне путем анализа скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита.

Задача решается и технический результат достигается способом диагностики атопического дерматита у детей, который заключается в следующем:

- утром, натощак производят забор крови пациента в пробирки, смоченные гепарином с фосфатным буфером 20 БД на 1 мл крови;

- содержимое перемешивают и охлаждают до температуры тающего льда 0-2°С;

- после охлаждения проводят осаждение эритроцитов путем центрифугирования в режиме 3000 g в течение 5 минут;

- проводят выделение эритроцитов и плазмы (эритроцитарной массы) путем отсасывания;

- выделенные эритроциты промывают трехкратным объемом холодной среды А промывки при температуре тающего льда, при этом среду А промывки берут следующего состава (мМ): 75 - MgCl₂; 85 - сахароза; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН-7,4);

- далее упакованные (осажденные) эритроциты прединкубируют в среде Г следующего состава (мМ): 150 - LiCl; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН-7,4), при температуре 37°С в течение 3 часов с периодическим встряхиванием;

- далее полученную суспензию осаждают и для удаления наружного лития эритроциты промывают объемом среды А промывки;

- после промывки упакованные эритроциты переносят в среду Б, свободную от натрия и представляющую собой фактически среду А промывки, содержащую изоосмотическую смесь хлористого магния MgCl₂ и сахарозы с добавлением 0,1 мМ уабаина, и в среду В, богатую натрием, содержащую (мМ) : 150 - NaCl, 10 - глюкоза, 10 - HEPES-трис (рН 7,4), 0,1 - уабаин;

- в каждой из указанных сред проводят инкубацию в течение периода экспрессии 60 минут при температуре 37°С с периодическим встряхиванием;

- на шестидесятой минуте инкубации отбирают равное количество суспензии эритроцитов из обеих сред, проводят их раздельное осаждение центрифугированием в течение двух минут, затем осторожно набирают надосадочную жидкость из каждой пробы и разбавляют в 3 раза тридистиллированной водой;

- производят измерение содержания лития в обоих средах методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в режиме эмиссии, при этом калибровочные растворы готовят на средах инкубации с учетом разведения пробы.

- определяют скорость натрий-литиевого противотранспорта V в микромолях лития на 1 литр клеток в час как разность между концентрацией лития в среде, богатой натрием, и в среде, свободной от натрия, по формуле

V=(ANa-AMg)·K,

где ANa - концентрация лития в среде, богатой натрием;

AMg - концентрация лития в среде, богатой магнием (свободной от натрия);

К - коэффициент, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах; коэффициент К, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах, выбирают равным 33 при следующих условиях:

проведение прединкубации эритроцитов в среде прединкубации в соотношении 1:5;

помещение эритроцитов в среду, богатую натрием, и свободную от натрия, в соотношении 1:10;

разбавление надосадочной жидкости в 3 раза.

При значении скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритоцита, превышающем 258 мкM Li/л кл./час, диагностируют атонический дерматит у детей.

Способ диагностики осуществляют следующим образом.

Кровь в количестве 3-х миллилитров забирают утром из вены ребенка в пластиковые пробирки, смоченные гепарином с фосфатным буфером 20 ЕД на 1 мл крови. Содержимое перемешивают и пробирки немедленно помещают в контейнер с тающим льдом. После охлаждения до 0-2 градусов Цельсия пробирки помещают в рефрижираторную центрифугу с вертикальным ротором и эритроциты осаждают при достижении 3000 g в течение 5 минут. Далее плазму и эритроциты удаляют путем отсасывания. Выделенные эритроциты дважды промывают трехкратным объемом холодной среды А промывки при температуре тающего льда. Среда А промывки имеет следующий состав (мМ): 75 - MgCl₂; 85 - сахароза; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН-7,4), при тех же условиях осаждения. Далее 0,25 мл упакованных (осажденных) эритроцитов помещают в 1, 25 мл среды Г следующего состава (мМ): 150 - LiCl; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН-7,4), при температуре 37°С и прединкубируют их при этой температуре в течение 3 часов с периодическим автоматическим встряхиванием каждые 15 минут по 15 секунд. Далее полученную суспензию осаждают и для удаления наружного лития эритроциты промывают 4 раза четырехкратным объемом среды А промывки.

После промывки упакованные эритроциты по 0,1 мл переносят в среду Б 1 мл, свободную от натрия и представляющую собой фактически среду А промывки, содержащую изоосмотическую смесь хлористого магния MgCl₂ и сахарозы с добавлением 0,1 мМ уабаина, и в среду В, богатую натрием, содержащую (мМ) : 150 - NaCl, 10 - глюкоза, 10 - HEPES-трис (рН 7,4), 0,1 - уабаин. В указанных средах инкубацию продолжают 60 минут при температуре 37°С с периодическим встряхиванием. В этот период происходит выход лития в натриевую и безнатриевую (магниевую) среды за счет обмена лития на натрий и магний, осуществляемого благодаря работе белка-переносчика в условиях ингибирования натрий-калиевой АТФ-азы уабаином.

На шестидесятой минуте инкубации отбирают по 0,45 мл суспензии эритроцитов из обеих сред, производят их центрифугирование в течение двух минут, затем осторожно набирают 0,3 мл надосадочной жидкости и разбавляют в 3 раза тридистиллированной водой. Далее производят измерение содержания лития в магниевой и натриевой средах методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в режиме эмиссии на спектрофотометре СА-455. Калибровочные растворы готовят на средах инкубации с учетом разведения пробы. Используют следующие параметры аппаратуры: длина волны - 670,6 нм, состав пламени - ацетилен-воздух, стехиометрия пламени - окисляющая, чувствительность - 10-7 моль/литр. Программа измерения концентрации элемента в исследуемом растворе в эмиссионном режиме состоит в сравнении интенсивности светового потока эталонного раствора известной концентрации с интенсивностью потока исследуемого раствора. Информация со спектрофотометра поступает на специализированное вычислительное устройство «Электроника Д3-28», которое вычисляет концентрацию исследуемого элемента, а результаты выдает на цифровое табло. Скорость натрий-литиевого противотранспорта V в микромолях лития на литр клеток в час определяют как разность между концентрацией лития в среде, богатой натрием, и в среде, свободной от натрия, через 60 минут инкубации по формуле

V=(ANa-AMg)·K,

где ANa - концентрация лития в среде, богатой натрием;

AMg - концентрация лития в среде, богатой магнием (свободной от натрия);

К - коэффициент, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах; К=33 при следующих условиях:

- проведение прединкубации эритроцитов в среде прединкубации в соотношении 1:5;

- помещение эритроцитов в среду, богатую натрием, и свободную от натрия, в соотношении 1:10;

- разбавление надосадочной жидкости в 3 раза.

При значении скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритоцита, превышающем 258 мкM Li/л кл./час, диагностируют атонический дерматит у детей.

Пороговое значение скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритоцита, равное 258 мкM Li/л кл./час, было определено на основе сопоставления значений скорости у контрольной группы заведомо здоровых пациентов и заведомо определенных как больных атопическим дерматитом. Для этого было отобрано две группы детей в возрасте от 7 до 15 лет: контрольная, скомплектованная из здоровых детей, в количестве 11 детей, и испытуемая, скомплектованная из детей, заведомо больных атопическим дерматитом, в количестве 14 детей. Для каждого члена групп были проведены указанные выше измерения скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембранах эритоцитов, и было установлено, что у членов контрольной группы указанная скорость была ниже порогового значения, а у членов испытуемой группы в зависимости от тяжести заболевания она была выше.

Ниже приводятся отдельные клинические примеры.

Пример 1. Больной Н. 13 лет обратился с жалобами на высыпания на коже. Диагноз при поступлении в стационар - псевдоаллергическая (неспецифическая) форма аллергии в стадии обострения. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритоцита на второй день госпитализации составила 347 мкМ лития на литр клеток в час. Через 97 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 344 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - атопический дерматит.

Пример 2. Больной Т. 12 лет. Диагноз при поступлении в стационар - неинфекционно-аллергическая форма дерматита, стадия обострения. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритоцита на второй день госпитализации составила 361 мкМ лития на литр клеток в час. Через 102 дня, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 363 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - атопический дерматит.

Таким образом, заболевание атопическим дерматитом у детей диагностировали путем анализа функционального состояния клеточных мембран, которое оценивали по максимальной скорости Na⁺-Li⁺ -противотранспорта в мембране эритроцита по методу М. Canessa (см. Canessa M.L., Adragna N.C., Solomon H.S. et al. //N. Engl. J. Med. - 1980. - Vol.302. - P.772-776), заключающемуся в измерении обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации. Конечный результат представляли в микромолях Li на литр клеток (эритроцитов) в час (мкМ Li). За нормативы определяемых показателей взяты собственные данные, полученные при обследовании детей группы контроля.

Приведенные клинические данные свидетельствуют о достоверности предлагаемого способа диагностики атопического дерматита у детей, о ее эффективности для последующего лечения и послелечебного анализа состояния пациента.

Способ апробирован в стационарном отделении клиники Казанского Государственного Медицинского Университета и может найти широкое клиническое применение в медицинской практике и эффективно использоваться в дерматологии.