способ оценки экспрессии генов триптофанил-трнк-синтетазы как маркера перегрузок в ходе тренировки спортсменов - состояния перетренированности

Формула изобретения

1. Способ определения у спортсмена состояния утомления и состояния «перетренированности» по повышенной экспрессии гена триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРСазы), включающий взятие у спортсмена контрольного образца до интенсивной тренировки и опытного образца после интенсивной тренировки, где в качестве образца используется образец крови или соскоба или смыва c ротовой полости, отбор и промывку полученных клеток, выделение из них тотальной РНК, проведение обратной транскрипции, амплификацию полученных кДНК, оценку экспрессии гена ТРСазы в опытном и контрольном образцах, при этом состояние утомления и состояние «перетренированности» определяются в случае значительного увеличения уровня экспрессии гена ТРСазы в опытном образце по сравнению с контрольным образцом, а именно более чем в 1,45 раза.

2. Способ по п.1, где специфическую экспрессию оценивали денситометрически по данным электрофореза ПЦР-фрагментов с маркерными полосами ДНК.

3. Способ по п.1, где специфическую экспрессию мРНК ТРСазы оценивали методикой абсолютной количественной оценки мРНК по данным РТ ПЦР анализа с использованием красителя «Сибр грин» и построения калибровочной кривой.

4. Способ по п.1, где специфическую экспрессию мРНК ТРСазы оценивали методикой относительной количественной оценки мРНК по данным РТ-ПЦР анализа с использованием методики определения значений 2^{- CT} с использованием «референсного» гена -актина.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение позволяет существенно повысить информативность, относительно упростить и ускорить тестирование уровня физической подготовленности и тренированности спортсменов и степени развития чрезмерного утомления и оценки риска дезадаптации с развитием синдрома перетренированности и потери физической формы при одновременном резком снижении иммунитета. При этом возможно осуществлять поиск новых методик тренировок при тактическом и стратегическом планировании в спорте.

Уровень исследований и знаний на настоящее время

Несмотря на длительный период изучения комплекса ферментов внерибосомного биосинтеза белков - аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) остается не до конца понятым. Этот класс ферментов, возникший на заре эволюции живых организмов и появления первых многоклеточных организмов, был «приспособлен» для выполнения большого спектра дополнительных «неканонических», регуляторных функций. Так как важнейшей функцией организма является защитная и регуляторная, эти функции и были «преданы» различным формам АРСаз, среди этих функций можно перечислить регуляцию ангиогенеза, активное участие в реализации комплекса реакций природного иммунитета, аутоиммунные реакции, целый спектр активностей по супрессии развития опухолей, комплекс противоспалительных реакций и подавления развития бактериальных патогенов [1]. АРСазы для оптимизации своих основных функций по обеспечению специфического присоединения аминокислот с соответствующими транспортными РНК образуют в клетке крупные мультиферментные комплексы, в которые входят еще ряд кофакторов с важными регуляторными функциями. Ряд АРСаз не входят в подобные комплексы, могут секретироваться в кровоток и обладают спектром регуляторных цитокинных функций - это, в частности, тирозил-тРНК-синтетаза (ТирРС) и ТРС. Особый интерес в связи с изучаемой функцией маркера физического состояния и состояния перетренированности представляет ТРСаза. Этот фермент мощно индуцируется антипролиферативным цитокином интерфероном , участвует в подавлении роста патогенов, обеспечивает стимуляцию синтеза антител - иммуноглобулинов, при модификации под действием матриксных металлопротеиназ приобретает сильно выраженную антиангиогенную функцию, подавляя процессы развития метастазирования опухолей, участвует в синтезе диаденозинполифосфатов Ар3А, а также обладает в комплексе с рядом факторов антионкогенным действием [2]. Столь большой набор дополнительных регуляторных функций фермента делает его важным объектом для использования в качестве диагностического признака и как объекта корректирующего и терапевтического действия.

Подробные исследования динамики активности иммунной системы спортсменов в ходе интенсивных тренировок показали, что поведение физиологических параметров иммунной системы отличается в зависимости от интенсивности тренировок и индивидуальности тренируемого спортсмена. Состояние перетренированности у элитных спортсменов часто сопровождаются респираторными заболеваниями (РЗ), что губительно сказывается на показателях во время ответственных соревнований и уже привело у ряда сборных команд различных стран к потере значительного количества потенциально возможных золотых медалей в прошлых Олимпийских играх. Поведение иммунной системы при этом описывается «J» формой зависимости интенсивности тренировок с вероятностью РЗ. При этом также состояние иммунной системы описывается наличием «открытого окна» нарушенного иммунитета с высоким риском РЗ, длящегося после интенсивных тренировок до нескольких суток. Следует подчеркнуть большую индивидуальную специфику реакций на интенсивные тренировки и достижение состояния «перетренированности», при этом особенно важно иметь информативный и достоверный маркер указанного состояния организма. В силу ослабления системы специфического иммунитета форменных элементов крови, в организме резко активируются дополнительные защитные механизмы, в частности включающие активацию неканонических защитных механизмов АРСаз. Каскад противовоспалительных и противопролиферативных реакций запускается интерфероном , одним из последствий действия которого является мощная активация секретируемой индоламин 2,3-дезоксигеназы (IDO), катализирующей первые этапы распада аминокислоты триптофана, что приводит к локальному обеднению внеклеточной среды тканей незаменимой аминокислотой триптофаном. При этом возникает конкуренция с патогенными бактериями за аминокислоту триптофан. Параллельно в клетках соответствующих тканей, включая форменные элементы крови, резко стимулируется экспрессия ТРСазы, связывающей внутриклеточный триптофан с соответствующей тРНК и «сохраняющей» АК для нужд клеток организма. Еще одной функцией резкого увеличения экспрессии ТРСазы в клетках крови, отвечающих за иммунитет, является обеспечение синтеза иммуноглобулинов, значительно обогащенных триптофаном. Наш выбор ТРСазы в качестве маркера состояния подавления иммунной системы при перетренировке, основывается не только на уже отмеченных свойствах. Снижение функциональности иммунной системы существенно повышает опасность зарождения и развития онкопроцесса. ТРСаза в процессе повышенной экспрессии в клетке способна секретироваться в межклеточное пространство и кровь, подвергаться активирующей модификации и подавлять существенно процессы патологического ангиогенеза, блокируя тем самым дальнейшее развитие и метастазирование первичных клеток опухолей [1]. Наконец, ТРСаза является одним из важных продуцентов диаденозинполифосфата Ар₃А, обладающего сильным подавляющим развитие опухолей действием [3].

Известны биохимические маркеры перетренированности - глютамин плазмы.

Концентрация в плазме крови глутамина была предложена в качестве возможного показателя стресса от перетренировки, так как при этом наблюдаются низкие показатели глютамина плазмы у спортсменов с ОТ. Концентрация в плазме крови глутамина снижается после интенсивных или длительных тренировок, но не после интенсивных и краткосрочных тренировок. Снижение глютамина может произойти после физических травм, ожогов, воспалений и инфекций. Концентрации в плазме крови глутамина временно увеличивается после белкового питания, но оно уменьшается на 25% после нескольких дней низкого потребления углеводов (4).

Оценка ферментов - активность креатинкиназы.

Оценка активности фермента креатинкиназы широко используется, а не совсем как ОТ маркер, а как инструмент для идентификации недавнего повреждения мышц или РОТ (4). Этот факт объясняет то, что хорошо подготовленные спортсмены, выполняющие эксцентричный мышечные упражнения не проявляют значительного увеличения активности креатинкиназы, даже если они ощущают мышечные боли, возможно, связано с тем, что они являются результатом повреждения или воспаления в соединительной мышечной ткань (4). С другой стороны, диагноз на основе определения креатинкиназы кажется разумным и адекватно оценивает увеличение мышечного напряжения или индивидуальной переносимости мышечных нагрузок.

Было высказано предположение, что концентрация остатков азота в плазме крови (мочевина и мочевая кислота) может указывать на снижение мышечного белка и быть, в результате, ОТ маркером из-за очевидной связи с катаболическим состоянии. Самая большая проблема в том, что интенсивные и длительные тренировки, связанные с временным увеличением индексов мочевины и мочевой кислоты, могут зависеть от диет с потреблением белков. По этим причинам, мочевина, мочевая кислота и креатинкиназа не представляют собой заслуживающие доверия параметры для однозначного и точного выявления ОТ.

Контроль биохимических маркеров степени утомления - уровень мочевины и лактата в крови.

Снижение максимальной физической выносливости параллельно со снижением максимальной концентрации лактата были описаны для бегунов, пловцов, велосипедистов и триатлонистов (4). Снижение лактата в крови в ответ на субмаксимальные тесты наблюдались у спортсменов с ОТ, вероятно, в связи с уменьшением индекса гликогена мышц, снижения катехоламинов в ответ на упражнения, или снижения влияния катехоламинов на мышечную ткань. Определение лактата в крови является тренировочной рутиной для спортсменов, так что важно знать, может ли оно быть использовано в качестве инструмента диагноза ОТ. В этом контексте было предложено изучать физиологические реакции на выносливость спортсменов в течение 4 недель с увеличением объема и интенсивности тренировок. Уровень лактата оценивался и делался вывод о том, что спортсмены, которые вошли в состояние ОТ при существенном увеличения рабочей нагрузки, проявляли сниженный уровень лактата во время теста на максимальную нарузку. Таким образом, лактата может быть важным инструментом для предотвращения ОТ, так как он является доступным и широко используемым методом в области спорта.

Оценка состояния гормонального фона. Гормональные маркеры: тест на соотношение тестостерон/кортизола. Баланс между анаболической и катаболической активностями определяется соотношениями тестостерона и кортизола, который известен как тестостерон/кортизол тест или свободный тестостерон/кортизол. Исходя из того что тестостерон имеет анаболический эффект, а кортизол катаболический тестостерон/кортизол коэффициент был предложен в качестве важного маркера ОТ. Предпологают (4), что если снижение этого показателя будет более 30%, то спортсмен окажется в состоянии ОТ. В целой серии экспериментов это положение было подтверждено. Так как анализ осуществлялся путем неинвазивных проб в слюне спортсмена - метод получил широкое распространение.

Раскрытие изобретения

Анализ экспрессии генов мРНК гена ТРСазы в образцах крови и соскобах эпителия ротовой полости позволяет получать достоверную информацию о глубинных молекулярных процессах, которыми сопровождаются мышечные сокращения различной формы и интенсивности и точно регистрировать состояния пренапряжения в мышцах с опасностью дезадаптационных процессов в мышечных тканях и других органах и тканях индивида, резко снижающих его физические параметры и здоровье и, что особенно важно, или регистрировать начало деструктивных разрушительных процессов, сопровождающихся резким падением иммунитета.

Осуществление изобретения

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является существенное увеличение информативности, оперативности и ускорения тестирования физического состояния и уровня опасного состояния перетренированности, а также возможности оперативной коррекции методик тренировки. Процедура тестирования на состояние перетренированности включает взятие у спортсмена контрольного образца крови или соскоба или смыва с ротовой полости до интенсивной тренировки и опытного образца после интенсивной тренировки, отбор и промывку полученных клеток, выделение из них тотальной РНК, проведение обратной транскрипции, амплификацию полученных кДНК, оценку экспрессии гена ТРСазы в опытном и контрольном образцах, при этом состояние утомления и состояние «перетренированности» определяют в случае значительного увеличения уровня экспрессии гена ТРСазы в опытном образце по сравнению с контрольным образцом (более чем в 1,45 раза). Одним из существенных аспектов изобретения является возможность неинвазивного осуществления тестирования.

Определение терминов

Под уровнем физического состояния понимается измеряемое классическими физическими (степ тест, тест Купера и др.) и физиологическими методами (VO₂max) степень физической формы или тренированности испытуемого [4].

Под состоянием «перетренированности» подразумевается комплекс ответных реакций организма на интенсивные тренировки, превышающие способности организма к нормальному процессу восстановления, включающие резкие изменения обмена веществ и комплекса иммунологических защитных реакций, выражающиеся в существенном изменении в уровне нейрогормонов и их рецепторов в тканях и снижении чувствительности мышечной ткани к катехоламинам, а также резким увеличением уровня лейкоцитов и воспалительных цитокинов в крови, что приводит к существенному падению сопротивляемости к инфекции и к возникновению так называемого «открытого окна» для инфекций.

Под полученной методом магнитных наночастиц препаратов ДНК и РНК из крови понимается методика применения особым образом обработанных частиц силикагеля и их применения для выделения чистых и недеградированных препаратов ДНК и РНК [3].

Под неинвазивной пробой понимается взятие биологичских образцов методом соскобов, специальными стерильными скребками или ушными ватными тампонами с переносом в стерильный изотонический физраствор.

Под методикой определения активности гена экспрессией мРНК гена ТРСазы понимаются процедуры получения препаратов РНК из биологических образцов, перевод ее в стерильных условиях в кДНК, с последующей регистрацией уровня специфической мРНК (кДНК) методом РТ ПЦР с применение флуоресцентно меченых или биотинилированных зондов, или с применением флуоресцирующих красителей и калибровочных кривых, при точной идентификации специфичности получаемого амплификата.

Сравнительный анализ предлагаемого способа оценки состояния «перетренированности» с близкими патентами-аналогами.

Для сравнения предлагаемого способа с имеющимися аналогами (предложенными специалистами ФИПС РФ) (патенты № 891095, 2056860 С1 и 2429836(13) C1) необходимо отметить саму сложность проблемы и ее актуальность, в связи с повышенной подверженностью резким спадам активности иммунной системы и сопротивляемости инфекциям, именно в случае элитных спортсменов.

Система природного неспецифического иммунитета отвечает на хронический стресс интенсивных тренировок резким увеличением активности NK-киллерных клеток и супрессией фагоцитарной противоинфекционной функции нейтрофилов. Несмотря на очевидную связь интенсивных тренировок с функциями нейтрофилов, существуют данные о том, что вырабатываемые нейтрофилами свободнорадикальные формы кислорода (ROS) являются важными модуляторами мышечной активности, антиоксидантной защиты и восстановления при физиологическом ответе. Целый ряд важных факторов биогенеза митохондрий, таких как коактиватор PGC-1 alpha, AMPK киназа и SIRT1, активируются в ответ на вызванный интенсивными упражнениями изменения в редокс потенциале клеток. Активация PGC-1 alpha приводит к снижению повреждающего действия ROS стимуляцией антиоксидантных ферментов и/или увеличением числа митохондрий, что позволяет вырабатывать такое же количество АТФ при более низком уровне ROS. Более того, индуцируемые интенсивными тренировками соединения ROS могут быть важны для метилирования ДНК и пост-трансляционной модификции гистонов, что позволяет достичь состояния наследуемых адаптивных состояний, основанных на эпигенетической модификации хромосом [Radak Z., Zhao Z., Koltai E., Ohno H., Atalay M. Oxygen Consumption and Usage During Physical Exercise: The Balance Between Oxidative Stress. and ROS-Dependent Adaptive Signaling Antioxidants & redox signaling, 2013, v.18 (10), p.1208-1246]. Таким образом, регистрируемые в предлагаемых в качестве аналогов (патенты № 891095 и 2056860 C1), изменения фагоцитарной активности нейтрофилов, скорее всего, являются нормальными физиологическими реакциями, напрямую не связанными с состоянием «перетренированности». Сильно различающаяся реакция на интенсивные тренировки функций нейтрофилов у разных индивидов также снижает диагностическую ценность используемого критерия, делая его малоинформативным.

Одним из недостатков анализа множества параметров иммунной системы является их дороговизна и нацеленность лишь на один аспект сложнейшего комплекса ответных реакций на интенсивные тренировки, которые обладают множеством взаимодополняющих и взаимозаменяемых уровней адаптации. На ряд функций иммунной системы воздействуют как интенсивные, так и умеренные длительные тренировки, повреждения тканей и инфекции. Кроме того, используемые в патенте аналоге № 2056860 C1 технические средства, в качестве усиления диагностической ценности фагоцитарной активности нейтрофилов, заключающиеся в использовании пьезоэлектрических датчиков, радиопередатчиков и приемных отдаленных устройств позволяют регистрировать пульс и технические параметры перемещения спортсмена по трассе и состояние переутомленности, что также не связано напрямую с состоянием «перетренированности».

Сравнение с патентом-аналогом № 2429836(13) C1, лишь подтверждает обоснованность предлагаемых критериев оценки состояний тренированности и перетренированности. Кардинально важным является понимание многофакторности, многокомпонентности, взаимодополняемости ответных реакций организма на интенсивные тренировки, при которых снижение защитного действия форменных элементов крови (нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и др.) осуществляющих фагоцитоз, лизис инфекционных агентов, чужеродных клеток и клеточного дебриса, параллельно запускаются противовоспалительные реакции природного иммунитета осуществляющие реакции иммунной супрессии, важным звеном которых и является экспрессия ТРСазы, причем так как ответные реакции на стресс, связанный с интенсивными тренировками, проходят практически по тому же механизму, как и ответ на инфекционное воздействие, уровень экспрессии данного гена является критерием силы ответа, строго адекватным силе стрессового воздействия, причем превышение определенного «порогового» значения стресса от физической активности в ходе тренировок и запускает комплекс «адаптивных» реакций организма, выражающийся в реакции синдрома «перетренированности». Использование препарата трекрезан для активации защитных реакций организма, видимо, действует комплексно, одновременно активируя пролиферативные защитные реакции, стимуляцию как специфического, так и неспецифического иммунитета, в том числе и через активацию экспрессии ТРСазы и связанных с ним реакций антиангиогенеза и антионкогенеза [Yao P., Fox P.L. Aminoacyl-tRNA synthetases in medicine and disease. EMBO Mol Med. 2013, v.5(3), p.332-343].

Примеры собственных экспериментов

Собственными исследованиями было установлено, что определение уровня экспрессии мРНК ТРСазы (патенты РФ RU № 2429836 C1 от 01.04.2010 «Метод контроля физиологического состояния человека») может применяется и для контроля за физическим состоянием индивида на различных этапах тренировочного процесса и достижения опасного состояния перетренированности с целью необходимых корректировок процесса и повышения эффективности адаптационных процессов и увеличения физической формы спортсмена. Актуальность проведенного цикла методических экспериментов, приведенных далее и раскрывающих сущность независимого признака (п.1), связана с практическим отсутствием в настоящее время надежного метода диагностики состояния перетренированности, а также большим потенциалом совершенствования методики, как с точки зрения точной диагностики состояния перетренированности, так и возможности коррекции состояния организма, как в случае здоровых индивидов, так и возможных патологий.

Собственными исследованиями было показано, что уровень экспрессии мРНК гена ТРСазы является высокоэффективным критерием общего состояния различных систем органов спортсмена и позволяет выработать оптимальную тактику тренировок.

Следует подчеркнуть взаимосвязь и взаимозависимость приведенных ниже методик, их связь с независимыми признаками (п.1) с точки зрения раскрытия содержания этих признаков. Предварительную оценку специфичности и уровня экспрессии мРНК ТРСазы определяли комплексом методик, приведенных в примере 1 и заключающихся в сканировании гелей с картиной разделения продуктов специфической ПЦР кДНК на содержание копий мРНК ТРСазы, параллельно с маркерами количеств ДНК для построения калибровочной кривой. Окончательную оценку уровня экспрессии, отобранных на данном этапе анализа, используемую в качестве диагностического признака использовали уже методами ПЦР в реальном времени по построенной калибровочной кривой (пример 2) или с использованием методики относительной количественной оценки мРНК с использованием референсного гена (пример 3). Дается также краткая характеристика преимуществ и недостатков методик в аспекте необходимости полной реализации положений независимых признаков изобретения (п.1).

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1.

Нами был разработан комплекс методик выявления состояния утомления по определению уровня активности гена, кодирующего ТРСазу, по синтезируемой с гена специфической мРНК. Последовательность операций разработанных методик включала отбор соскобов с ротовой полости, отбор и промывку полученных клеток, получение микроколичеств крови из пальца, выделение препаратов РНК и ДНК с помощью наборов с наночастицами фирмы Силекс. РНК также выделяли с помощью набора «Yellow Solve» фирмы Силекс. РНК переводили в форму комплементарной ДНК с помощью обратной РНК-зависимой ДНК полимеразы (MMoLV) с применением вырожденных гексануклеотидных затравок. Образованную специфическую кДНК ТРСазы выявляли с помощью специфической ПЦР и специально подобранными затравками, которые размножали именно нужные виды кДНК, а не возможные примеси геномной ядерной ДНК. Гели прокрашивали бромистым этидием или красителем «Сибр-грин».

Количественный анализ специфической мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы.

Экспрессия гена ТРСазы количественно оценивалась по уровню специфической мРНК. При этом критерием уровня мРНК служил количественный анализ суммарной кДНК определенный методом ПЦР с последующим анализом полученных электрофореграмм денситометрически по яркости свечения продуктов. При проведении реакции ПЦР использовались наборы реактивов фирмы «Силекс-М» (http://sileks.com/ru/), специфические затравки синтезировались на фирме «Синтол». Затравки конструировали по программе рекомендуемой фирмой производителем.

Выделение препаратов РНК. После отбора контрольных и опытных образцов и отмывки клеток (в соответствии с п.1), берут около 100 мкл суспензии клеток эпителия после взятия соскобов с ротовой полости или образца крови в 0,05 М ЭДТА, добавляют а 1 мл YellowSolve, перемешивают. Лизат центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляют 0.1 мл хлороформа, энергично перемешивают смесь на вортексе и инкубируют 20 минут при комнатной температуре, встряхивая пробирку каждые 5 минут. Центрифугируют (ЦФ) пробирку при 10-15 тыс. об./мин в течение 5 мин. Отбирают верхний слой, нижний слой отбрасывают. К отобранному верхнему слою добавьте равный объем депротеинизирующего раствора GreenClean и энергично встряхивайте смесь на вортексе 2-3 минуты, ЦФ 10-15 тыс. об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добаляют 2 объема 96%-ного этанола, инкубируют на -20°C в течение 20-30 мин для формирования осадка РНК. Осаждают РНК ЦФ при 10-15 тыс. об./мин в течение 10-20 мин. Осадок промывают 0,5 мл 80%-ного этанола и центрифугируют при 10-15 тыс. об./мин в течение 15 мин. Растворяют осадок РНК в бидистиллированной стерильной воде и замораживают при -20°C.

Обратная транскрипция. В пробирке, помещенной в лед, смешивают следующие компоненты: Раствор РНК 2 мкл (0.1-5 мкг) или поли(А) «плюс» РНК 10-0.5 нг, затравки - 1 мкл «рэндом» гексапраймера 0.5 мкг (или олиго(дТ)15 0.5 мкг) воду, свободную от РНКаз до 18 мкл. Перемешивают, осаждают капли кратковременным центрифугированием. Инкубируют смесь 5 мин при +70°C, переносят пробирку в лед и собирают капли кратковременным центрифугированием. Затем добавляют следующие компоненты: 10-кратный ОТ буфер 2.5 мкл, 4 мкл 2.5 мМ смеси dNTP, M-MLV обратная транскриптаза 0.5 мкл (100 ед. акт). Затем смесь инкубируют в течение 60 мин при +37°C (при использовании случайных гексапраймеров перед инкубацией при +37°C проинкубируйте смесь в течение 10 мин при +25°C и затем инкубируйте смесь в течение 60 мин при +37°C). Останавливают реакцию прогреванием смеси в течение 10 мин при +70°C. Переносят смесь в лед. Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же использована для ПЦР или синтеза второй цепи и последующего клонирования. Храните синтезированную кДНК при -20°C или при -70°C для долгосрочного хранения.

Полимеразная цепная реакция. Полимеразной цепной реакция проводится в объеме 50-мкл реакционной смеси, содержащей 80 пмоль каждого из двух праймеров (1 мкл раствора в 1 ое/мл), 5 мкл 10 мМ раствора dNTP, 5 мкл 10-х буфера (100 мМ Трис рН 8,5 при 25°C, 500 мМ KCl, 1% Тритон Х-100), и 2 единицы Taq ДНК-полимеразы. Смеси для серии ПЦР реакций смешивают как суммарный «мастер микс», который затем разделяют на запланированные реакции, в которые добавляли по 1 мкл кДНК из контрольных и опытных образцов (базовое состояние отдыха индивида или после интенсивных тренировок). ПЦР проводили в следующем режиме - 94°C в течение 15 с, от 58°C до 62°C в течение 15 с и 72°C в течение 30 с. Аликвоты по 7 мкл реакции отбирали для контроля хода реакции.

Использованные затравки для получения специфического ПЦР фрагмента мРНК ТРСазы из суммарной кДНК копии суммарной РНК из биологических образцов:

- прямая=5'-GAAAGGCATTTTCGGCTTCA-3'

- обратная=5'-CAGCCTGGATGGCAGGAA-3'.

В сериях все реакции двухкратно повторялись. Стандартные образцы для сравнения получены амплификацией контрольных образцов биологического материала спортсменов до начала интенсивных тренировок. Значения относительной экспрессии оценивались путем денситометрического анализа продуктов ПЦР анализа образцов РНК, после их перевода в кДНК и амплификации с применением специфических затравок как указано ниже. В качестве контрольных значений, взятых за 100%, служили образцы биологического материала до начала тренировок.

В соответствии с положением п.1 о том, что «состояние «перетренированности» определяют в случае значительного (более чем в 1,45 раза) увеличения уровня экспрессии в опытном образце по сравнению с контрольным», основным диагностическим признаком является именно уровень экспрессии ТРСазы. И этого следует большая значимость точности, воспроизводимости и взаимной дополняемости приведенных методик количественной оценки копий мРНК ТРСазы в препаратах РНК и кДНК.

Приведенные методики отражают существующие в настоящее время стратегии количественной оценки образовавшихся специфических видов кДНК, отражающих исходное содержание специфических мРНК ТРСазы.

Адаптированная и оптимизированная методика количественной оценки специфических видов кДНК (видов мРНК ТРСазы) методом гель-электрофореза.

Сравнительный анализ преимуществ и недостатков данного подхода в «иерархии» приведенных методик позволяет позиционировать его как зависимый, позволяющий вычленить группу испытуемых с высоким риском «перетренированности».

Электрофорез проводили в 7%-ном полиакриламидном геле в трис-боратном буфере рН 8,3 (89 мМ трис, 8,9 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА). В карманы геля наносили аликвоты из реакционной смеси в объеме 7-10 мкл. Электрофорез проводили при напряжении 10 в/см в течение 1,5-2,0 час. Гель окрашивали раствором бромистого этидия 1 мкг/мл в течение 15 мин. Изображения гель-электрофореза были сфотографированы с использованием комплекта оборудования, включая трансиллюминатор УВТ-1, цифровой камеры Kodak DC120, системой для наблюдения гелей и регистрации гелей "ViTran Photo", системой обработки изображений "ViTran Photo". Цифровые копии гелей анализировали с использованием пакета программ EDAS 120 (Electrophoresis Documentation and Analysis System 120) фирмы Eastman Kodak. Программа Kodak Digital Science 1D версии 2.0.3 использовалась для измерения интенсивности полос. Количественная оценка содержания специфических видов кДНК (и соответствующего содержания видов мРНК ТРСазы) в нанесенных на гель образцах рассчитывали по интенсивности полос ДНК маркера молекулярной массы, точно известной концентрации, соответствующей подвижности в геле.

На рис.1 приведены результаты цикла исследований относительной экспрессии гена ТРСазы спортсменов мужской сборной России по водному поло. Значения относительной экспрессии оценивались путем денситометрического анализа картины электрофоретического разделения продуктов ПЦР амплификации образцов суммарных препаратов РНК, после их перевода в кДНК и амплификации с применением специфических затравок. В качестве контрольных значений, взятых за 100%, служили образцы биологического материала до начала тренировок. Приведенные данные представляют собой усредненные данные 2-х параллельных экспериментов. В следующих примерах отдельные образцы от данной панели исследовали с помощью альтернативных подходов включая РТ ПЦР и абсолютными и относительными методиками оценки количества специфических мРНК гена ТРСазы в биологических образцах.

Видно, что в образцах № 2, 9, 12, 13 идет интенсификации экспрессии, существенно превышающие базовый уровень, свидетельствующий об активизации восстановительных процессов, наступающих в ответ на чрезмерные нагрузки и требующие применения индивидуальных восстановительных программ.

Сравнительная характеристика метода. Преимуществом метода является его относительная простота, менее строгие требования к специфичности ПЦР затравок, относительная дешевизна, вследствие неприменения флуоресцентных зондов и дорогого оборудования для проведения ПЦР в реальном времени (стоимость прибора для РТ ПЦР от 1,5 до 5 млн. руб.). Основными недостатками являются невысокая точность методики, сложность осуществления массовых анализов (сотен образцов в день) в связи с процедурами электрофореза и сканирования гелей. Однако он позволяет вычленить «группу риска» спортсменов для дальнейшего более точного анализа, что удешевляет суммарную процедуру тестирования (особенно при необходимости анализа по нескольким генным биомаркерам).

Пример 2.

Сравнительная характеристика метода. Приведенный пример представляет собой дальнейшее методическое развитие методик количественной оценки популяций нуклеиновых кислот в смесях в общем, и в применении к оценке «перетренированности» в частности. Метод позволяет регистрировать уровень экспрессии специфических мРНК «в контрольных и опытных образцах» в режиме реального времени, что позволяет делать окончательный вывод о состоянии претренированности. Метод содержит все основные этапы и процедуры предыдущих методик, отраженных в формуле изобретения, включая «сбор образцов, отмывку клеток, выделение РНК, получение кДНК» и проведение специфической ПЦР в реальном времени с определением абсолютных количеств кДНК копий транскриптов мРНК ТРСазы. В данном методе не используются дорогие флуоресцентные зонды.

Процедуры проведения анализа. Существует два подхода к количественной оценке экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени (РТ ПЦР): относительная и абсолютная количественная оценка экспрессии генов. Относительный метод количественного сравнения экспрессии генов основывается на сравнении уровня экспрессии гена в одном образце с экспрессией другого стандартного рефлексного гена, используемого для нормализации. Абсолютная количественная оценка основана на применении стандартной калибровочной кривой, которая получается из образцов матриц с точно известной концентрацией. Концентрация любого неизвестного препарата ДНК или РНК может быть определена путем простого сравнения значений его ПЦР сигнала (Cq) с данными стандартной кривой.

Последовательность процедур при количественном определении уровня экспрессии гена ТРСазы (или другого гена) с использованием подхода абсолютной количественной оценки в системе РТ ПЦР включают в себя: экстракцию РНК, синтез кДНК, подготовку последовательных серийных разведений, РТ ПЦР амплификацию и анализ данных.

1. Экстракция РНК и оценка количества и качества препарата.

Особенностью использованного в данном примере подхода является обязательное требование высокого качества и целостности препаратов РНК. Для этого необходимо соблюдать повышенные предосторожности (максимальную быстроту сбора и хранение образцов в специальных растворах) при сборе и транспортировке образцов, а также при выделении и хранении суммарных препаратов РНК. Проверку качества и количества полученных препаратов тотальной РНК осуществляли методом УФ-спектроскопии.

Для экономии полученных препаратов суммарной РНК образцы разбавляли в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и измеряли его оптическую плотность при 260, 280 и 320 нм. Для учета фонового поглощения при рассеянии света вызванных загрязнениями кювет и частицами пыли данные по оптической плотности при 320 нм вычитают из данных при 260 и 280 нм. Чистоту полученных препаратов РНК определяли по соотношению А260/А280. Значения между 1,8 и 2,1 являются показателями высокой степени очистки препаратов РНК. Концентрацию препарата РНК оценивали по формуле: Концентрация РНК (мкг/мкл)=(А260×40×D)/1000, где D - коэффициент разбавления. Например, мы разбавляли 2 мкл препарата РНК в 498 мкл ТЕ, рН 8,0, до получения А₂₆₀ =1,0, то концентрация препарата РНК составила 10 мкг/мкл. Препараты РНК после выделения в ходе дальнейших процедур анализа хранили во льду. Для длительного хранения препарат замораживали при -80°C, однако предпочтительнее сразу перевести ее в форму кДНК.

2. Синтез кДНК. Синтез кДНК осуществляли, в основном, как и в предыдущем примере. Специфика заключается в повышенных требованиях к качеству препарата и требовании полноты и тщательности подбора условий реакций. Для реакции брали от 0,1 пкг (пикограмм) до 1 мкг суммарного препарата РНК (спРНК). В конечном объеме реакционной смеси 10-20 мкл объединяли до 5 мкг спРНК, 1 мкл затравок (50 нг/мкл гексануклеотидных затравок), буфер для отжига затравок (1-2 мкл) и ddH₂O (бидистиллированной воды) до соответствующего объема общей смеси. Инкубировали 5 мин при 65°C и сразу помещали в лед на 1 мин. Короткое центрифугирование (ЦФ).

Затем добавляют 2Х буфера для синтеза первой цепи кДНК (10 мМ MgCl2, 1 мМ каждого dNTP) и 2 мкл обратной транскриптазы, перемешивают, кратко ЦФ и инкубируют 10 минут при 25°C, затем 50 минут при 50°C. Останавливают реакцию инкубацией при 85°C в течение 5 минут. Быстро охлаждали во льду. Сразу переходили к следующему этапу. В противном случае хранили препараты кДНК при -20°C.

3. Подготовка последовательных серийных разведений полученных препаратов кДНК. Для того чтобы обеспечить тщательное и равномерное покрытие необходимого количественного диапазона кДНК должна быть подготовлена достаточная степень разведения образцов, чтобы покрыть ожидаемый диапазон экспрессии гена в изучаемых образцах. Нами были подготовлены, по крайней мере, 5-точек 10-кратных серийных разведений для стандартной кривой, которая может быть использована программным обеспечением РТ ПЦР прибора для определения концентрации полученных опытных образцов кДНК. Для построения калибровочной кривой, вносили 18 мкл безнуклеазной воды в 4 пробирки, кратко ЦФ и маркировали их номерами с 2 по 5. Полученный ранее препарат кДНК оттаивали (пробирка 1), хорошо перемешивали и переносили 2 мкл в пробирку 2. Перемешивали пипетированием. И так далее до пробирки 5.

4. Проведение процедуры РТ ПЦР. Стандартный ПЦР в реальном времени занимает от 30 до 120 минут. Использованный протокол применим к стандартной и быстрой ПЦР в реальном времени. Для проведения специфичной ПЦР, в соответствии с приводимым примером, использовали следующий протокол: 1. Добавляли 2 мкл от каждого разведения и отдельно по 2 мкл воды (контроль минус матрица, или -ММ), в двойных повторах в 48-луночный планшет; 2. При использовании неизвестных образцов, добавляют по 2 мкл каждого, желательно в двух повторах в оставшиеся свободные лунки на плашке. При этом программное обеспечение будет автоматически использовать стандартную кривую (лунки от А1 до Е2 на схеме опыта) для определения концентрации неизвестных образцов; 3. Подготавливают РТ ПЦР «мастер микс» (6 мкл безнуклеазной воды, 10 мкл 2Х «мастер микса», 2 мкл 10Х затравки до концентрации 100-900 нМ) в объеме на 10-20% больше, чем необходимо, для учета ошибок дозирования при разнесении реакционных смесей по лункам плашки; 4. Добавить по 18 мкл «мастер микса» во все лунки, содержащих разведения, контрольные пробы, или изучаемые образцы. Осторожно перемешивают пипетированием, избегая пузырьков; 5. Запечатывают плашку, кратко ЦФ, и помещают в РТ ПЦР прибор; 6. Выбирают (вводят) подходящую (заранее оптимизированную) программу для эксперимента из предлагаемых протоколов; 7. В окне установки параметров программы прибора указывают лунки 10-кратных серийных разведений (А1-Е2), как предварительно расписано в схеме эксперимента, указывают контроли и опытные лунки (A3-F8) плашки; 8. Запускают прибор и в ходе процесса можно визуализировать амплификацию в режиме реального времени в окне Run Monitor. Амплификация занимает около 40 минут (быстрый протокол) или до 90 минут (стандартный протокол).

5. Анализ данных. После окончания процедуры программа автоматически открывает окно «анализ данных» и выполняет базовые процедуры анализа, определяя автоматически базовую линию и пороговые значения. Далее выбирают функцию «график амплификации». Для извлечения количественных данных из кривых ПЦР-амплификации в реальном времени, результаты должны быть нанесены в виде линейной регрессии значений Cq против логарифма соотношений количеств РНК/ДНК (то есть стандартной калибровочной кривой). Программное обеспечение прибора автоматически генерирует стандартную кривую. Для просмотра кривой, выбирают вкладку «результаты» в окне «анализ данных».

Данные о ПЦР извлекаемые из стандартных кривых. Наклон линии кривой графика является мерой эффективности ПЦР анализа. Значения наклона в интервале между -3,1 и -3,6 считаются приемлемыми (90% и 110% эффективности, соответственно), в то время как наклон -3,32 свидетельствует о 100% эффективности. R2 является мерой производительности анализа и является коэффициентом корреляции между полученными в опыте результатами и данными ожидаемыми в идеальных условиях. Значения R2 должны быть больше 0,99. Это означает, что >99% от общей вариации в образцах ДНК, составляющих калибровочную кривую, можно объяснить связью между полученными значениями Cq и соответствующими им концентрациями ДНК. Для извлечения количественных данных из любого значения Cq, используется следующее уравнение: Количество = 10^(Cq-b)/m, где b это y-пересечение на оси у, a m - наклон линейной регрессии.

Количественные данные отображаются либо как весовые количества исходной специфической матрицы (например, пикограмм), ее концентрации (например, пикограмм/мкл), или как "копии" исследуемого гена. В используемом подходе абсолютных количественных ПЦР экспериментов единицы измерения опытных образцов должны соответствовать единицам, используемым при построении калибровочной кривой. Дополнительная информация на сайте: http://www.illumina.com/support.

На Рис.2 приведен результат конечной серии экспериментов (с использованием параллельно взятых биологических образцов в экспериментах, описанных на Рис.1 в примере 1 на основе описанного в примере 2 абсолютного количественного подхода к определению количеств экспрессирующихся мРНК ТРСазы, путем построения калибровочной кривой.

Сравнительный анализ методов ПЦР в реальном времени. Метод требует высокой специфичности затравок, так как оценивается суммарное количество амплифицируемого материала, включая возможное неспецифическое копирование, самокопирование затравок и др. Метод чувствителен к ошибкам копирования, необходимость построения калибровочных кривых усложняет процедуры, требует много дополнительно проводимых реакций ПЦР в каждом опыте. Преимуществом является высокая точность метода и получение данных об абсолютных количествах видов кДНК, что в некоторых случаях бывает важным.

Пример 3.

Сравнительная характеристика метода. Приведенный метод оценки относительных количеств видов мРНК обратно транскрибированных в кДНК является наиболее эффективным точным и быстрым методом. Применение флуоресцентных зондов, еще больше повышает специфичность методики, позволяя регистрировать только определенные размножаемые виды кДНК, гибридизующиеся с зондом, позволяющим реализовать основной независимый признак (п.1) - превышение уровня экспрессии мРНК ТРСазы более чем в 1,45 раза. Основным недостатком методики является относительная дороговизна реактивов. Метод является практически незаменимым при необходимости оценки относительной экспрессии нескольких генов в одной пробе.

Относительный количественный метод основывается на использовании «референсного» гена, то есть гена, чья экспрессия постоянна в испытуемых пробах. Основным преимуществом используемого в данном примере методы является возможность нивелировать ошибки в нанесении реагентов в реакционные смеси (в основном РНК/ДНК матриц). Для определения относительной экспрессии изучаемого гена в пробе с использованием гена нормализатора, требуется установить уровень экспрессии обоих генов с использованием РТ ПЦР. К примеру, следует установить четыре значения C_T как указано в таблице 1.

Затем мы воспользовались широко известным методом .

метод.

Метод предполагает что оба гена (опытный и референсный) имеют эффективность амплификации равной около 100% (Hallmarks of an Optimized qPCR Assay). Затем проводят следующие манипуляции:

1. Нормализуют значения C_T исследуемого гена с значениями референсного (ref) гена, как для изучаемой пробы так и для калибровочной:

C_T(тест)=C_{T(иссл, тест)}-C_{T(реф, тест)}

C_T(кал)=C_{T(иссл, кал)}-C_{T(реф, кал)}

2. Нормализуют C_T исследуемого образца с C_T калибратора:

C_T= C_T(тест)- C_T(кал)

3. Оценивали уровень экспрессии по формуле:

2^{- CT} = Нормализованная степень экспрессии

Результатом является соотношения исследуемого гена в пробе со значением в образце калибратора, нормализованного по экспрессии референсного гена. Процесс нормализации экспрессии исследуемого гена с референсным геном компенсирует любые различия в количествах взятых на анализ образцов биологического материала.

Пример расчета: кДНК в количестве 50 ng от РНК выделенных из двух сравниваемых образцах (больной и здоровой, тренированной и не тренированной) анализировали по исследуемому гену и гену актина (референсный ген). C_T значения для каждого образца показаны ниже:

C_T(норм)=15.0-16.5=-1.5

C_{T(патол)}=12.0-15.9=-3.9

Затем C_T, исследуемого образца нормализуют с C_T калибратора:

C_T= C_{T(патол)}- C_T(норм)

=-3.9-(-1.5)=-2.4

Окончательный расчет следующий:

Вывод: Исследуемые образцы имеют в 5.3-раз более высокую экспрессию нежели в контроле.

Непосредственные работы по данному примеру включали.

Экспресс выделение суммарных препаратов РНК (осуществляли как в примере 1). Для выделения суммарных препаратов РНК из неинвазивно полученных образцов соскобов и/или смывов и образцов крови использовали набор фирмы «Силекс-М» «Yellow Solve». Процедуру выделения осуществляли по протоколу фирмы с учетом специфики эксперимента. Препарат РНК хранили в спирте при минус 20°C или ниже.

Синтез на матрице РНК кДНК. Для синтеза кДНК из полученных препаратов суммарной РНК использовались реактивы фирмы Силекс М и прилагающиеся протоколы (см. пример № 1). Полученную кДНК использовали для проведения РТ ПЦР или для синтеза второй цепи. Полученную кДНК хранили при -20°C.

Количественный анализ специфической мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы.

Экспрессия гена ТРСазы количественно оценивалась по уровню специфической мРНК. При этом критерием уровня мРНК служил количественный анализ суммарной кДНК определенный методом РТ-ПЦР. При проведении реакции РТ ПЦР использовались наборы реактивов фирмы «Синтол» (Комплект реагентов R-402) в соответствии с прописью фирмы. Уровень специфических кДНК для ТРСазы количественно определяли на приборе РТ-ПЦР. Затравки конструировали по программе «Праймер Экспресс Версия 2.0», с проверкой степени специфичности к искомым последовательностям по базе данных Nucleotide BLAST:

для -актина:

- прямая=5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3'

- обратная=5'-CGGCCACATTGTGAACTTTG-3';

для кДНК копии мРНК ТРСазы:

- прямая=5'-GAAAGGCATTTTCGGCTTCA-3'

- обратная=5'-CAGCCTGGATGGCAGGAA-3'.

В сериях все реакции трехкратно повторялись. Для анализов результатов использовался пакет программ (RealTime_PCR v 7.3), прилагающийся к прибору. Уровень отклонений рассчитывали с учетом оптимизации. Стандарты получены амплификацией контрольных образцов в ПЦР реакции в условиях, оптимизированных для РТ-ПЦР. Измерения основывались на стандартных величинах, получаемых при 4-кратных последовательных разбавлениях и огибаниях стандартной кривой (8 точек).

Результаты представленные на рис.3 представляют собой сравнительный анализ образцов полученных до серии тренировок и после. Данные для сравнения представляли собой соотношения между изучаемым геном - мишенью ТРСазы и мРНК -актина. Рисунок свидетельствует, что при сравнении экспрессии в индивидов «до» и «после» интенсивных тренировок, в ряде случаев достоверно повышается экспрессия мРНК ТРСазы - в 1,2-1,6 раза. Также как и в примерах с использованием альтернативных методических подходов, видно, что в образцах № 2, 9, 12, 13 идет интенсификации экспрессии, существенно превышающие базовый уровень, свидетельствующий об активизации восстановительных процессов, наступающих в ответ на чрезмерные нагрузки и требующие применения индивидуальных восстановительных программ.

Повышенная экспрессия отражает функцию фермента по поддержанию уровня триптофана для синтеза богатых остатками триптофана иммунокомпетентных белков. При правильном режиме тренировочного цикла наблюдается снижение экспрессии мРНК ТРСазы, что согласуется с данными о снижении уровня экспрессии комплекса цитокинов, которые образуются в ответ на действие различных стимуляторов неспецифического иммунитета [11].

Литература

1. Guo M., Schimmel P., Xiang-Lei Yang X-L. Functional expansion of human tRNA synthetases achieved by structural inventions. 2010, FEBS Letters, V.584, N.2, p.434-442.

2. Merkulova Т., Kovaleva G., Kisselev L. P1, p3-bis(5'-adenosyl)triphosphate (Ap3A) as a substrate and a product of mammalian tryptophanyl-tRNA synthetase. 1994, FEBS Letters, V.350, p.287-290.

3. Park S.G., Schimmel P., Kim S. Aminoacyl tRNA synthetases and their connections to disease. PNAS, 2008, V.105, N.32, p.11043-11049.

4. Gleeson M. Biochemical and immunological markers of overtraining. Journal of Sports Science and Medicine, 2002, V.2, p.31-41.

Таблица 1
	Тест	Калибраторный (кал)
Ислледуемый ген	CТ(иссл, тест)	CТ(иссл, кал)
Референсный ген	CТ(реф, тест)	CТ(реф, кал)