бактерии, продуцирующие сиаловую кислоту

Формула изобретения

1. Применение бактерий пищевого качества, продуцирующих сиаловую кислоту натурального происхождения, для обогащения продукта питания сиаловой кислотой.

2. Применение по п.1, в котором бактерии пищевого качества, продуцирующие сиаловую кислоту натурального происхождения, являются жизнеспособными, так что они продуцируют сиаловую кислоту в организме после потребления продукта питания.

3. Применение по п.1, в котором бактерии используют в количестве, достаточном для получения в продукте питания повышенного содержания сиаловой кислоты на 0,05-2 масс.% от сухой массы; предпочтительно 0,4-1,5 масс.% от сухой массы; более предпочтительно 0,6-1 масс.% от сухой массы.

4. Применение по пп.1-3, в котором бактерии выбраны из группы лактобацилл, в частности лактобацилл, продуцирующих N-ацетилнейраминат-лиазу и/или N-ацетилнейраминат-альдолазу, еще более предпочтительно Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum и/или Lactobacillus salivarius.

5. Применение по п.4, в котором бактерии выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus sakei NCC 121, Lactobacillus sakei NCC 2935, Lactobacillus sakei NCC 2934, Lactobacillus sakei NCC 166, Lactobacillus sakei NCC 170, Lactobacillus sakei NCC 1393, Lactobacillus sakei NCC 1428, Lactobacillus sakei NCC 1511, Lactobacillus sakei NCC 2937, Lactobacillus plantarum NCC 2936, Lactobacillus plantarum NCC 252 или их смесей.

6. Применение по п.1, в котором сиаловая кислота имеет следующую формулу:



где R1=H, ацетил, лактил, метил, сульфат, фосфат, ангидро, сиаловая кислота, фукоза, глюкоза, или галактоза,

R2=N-ацетил, N-гликолил, амино, гидроксил, N-гликолил-O-ацетил или N-гликолил-O-метил,

R3=H, галактоза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, сиаловая кислота, или N-гликолилнейраминовая кислота,

и предпочтительно является N-ацетилнейраминовой кислотой (R1=H, R2=N-ацетил, R3=H).

7. Применение по любому из пп. 1-3, 5 или 6, где продукт питания выбран из группы, состоящей из продуктов питания на молочной основе, в частности молока, сыворотки, йогурта, сыра, ферментированных продуктов; смесей для младенцев, твердых продуктов детского питания; детских смесей для прикорма; напитков для детей в возрасте 1-3 лет; фруктовых соков, по меньшей мере частично растворимых смесей для напитков в порошковой форме, таких как солодовые напитки, шоколадные напитки, капучино, кофейные напитки; шоколада; зерновых продуктов; сладостей; печенья; желе.

8. Продукт питания, обогащенный сиаловой кислотой, содержащий бактерии пищевого качества, продуцирующие сиаловую кислоту натурального происхождения, как изложено в пп.1-7.

9. Продукт питания, обогащенный сиаловой кислотой, по п.8 для применения в обеспечении питания субъекта.

10. Продукт питания, обогащенный сиаловой кислотой, по п.8 для применения в отношении восстановления баланса при отсутствии выработки эндогенной сиаловой кислоты.

11. Продукт питания, обогащенный сиаловой кислотой, по п.8 для применения в профилактике нейродегенерации, в частности, у взрослых.

12. Продукт питания, обогащенный сиаловой кислотой, по п.8 для применения в поддержке иммунной системы, в частности, для усиления иммунитета и/или для улучшения функции кишечника.

13. Продукт питания, обогащенный сиаловой кислотой, по п.8 для применения в отношении улучшения когнитивной функции и/или поддержки развития головного мозга, в частности, у детей.

14. Сиаловая кислота, полученная из бактерий пищевого качества, которые выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus sakei NCC 121, Lactobacillus sakei NCC 2935, Lactobacillus sakei NCC 2934, Lactobacillus sakei NCC 166, Lactobacillus sakei NCC 170, Lactobacillus sakei NCC 1393, Lactobacillus sakei NCC 1428, Lactobacillus sakei NCC 1511, Lactobacillus sakei NCC 2937, Lactobacillus plantarum NCC 2936 и Lactobacillus plantarum NCC 252.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится в основном к области сиаловых кислот, в частности к области пищевых продуктов, обогащенных сиаловыми кислотами, и к их применению. Одно воплощение настоящего изобретения относится к продукту питания, обогащенному бактериями пищевого качества, продуцирующими сиаловую кислоту, и/или их фракциями.

Сиаловые кислоты (SiAc) являются семейством заряженных моносахаридов с девятью атомами углерода, полученных из нейраминовой кислоты (NeuAc). NeuAc является единственной сиаловой кислотой, образуемой в нормальных условиях у человека. У других позвоночных также присутствуют, например, N-гликолилнейраминовые кислоты (NeuGc).

Сиаловые кислоты необходимы для основных клеточных функций у позвоночных. В качестве функционального и структурного компонента ганглиозидов они синтезируются во всех тканях у млекопитающих. Однако быстрорастущие клетки и ткани с высокой скоростью апоптоза и обновления могут нуждаться в дополнительных количествах NeuAc, например, обеспечиваемых с пищей.

Поэтому на сегодняшний день сиаловые кислоты часто применяются, в частности, в области питания грудных детей. Например, возможное участие сиаловых кислот в развитии когнитивных функций у грудных детей было описано Wang (Wang, В. and Brand-Miller, J. (2003) Eur.J.Clin.Nutr. Nov; 57(11):1351-69). Вкратце, исследования по сравнению грудных детей на грудном вскармливании и получавших детскую смесь показали, что более высокое содержание NeuAc в грудном молоке по сравнению с нормальной детской смесью коррелирует с повышением содержания NeuAc в слюне и головном мозге грудных детей. Однако влияние добавок NeuAc на поведение человека не изучено. Тем не менее, предполагается, что добавление NeuAc в коровье молоко придает ему свойства грудного молока человека, что может оказывать влияние на развитие головного мозга у детей.

Природными источниками, богатыми сиаловыми кислотами, например NeuAc, являются, например, молоко человека, молоко слона, молоко индийского буйвола, мясо, яйца и рыба. Однако эти источники являются либо недостаточными, либо не пригодными (и/или очень дорогостоящими), например, для обогащения продуктов питания сиаловыми кислотами в пищевой промышленности в настоящее время.

Таким образом, имеется значительная потребность в альтернативном источнике сиаловых кислот. Авторы настоящего изобретения решают эту проблему.

Соответственно, задачей настоящего изобретения является обеспечение в данной области техники источника сиаловых кислот, который легко применить в промышленных условиях, который является относительно дешевым и позволяет выделить сиаловые кислоты в чистой форме или в виде фракции, которую можно применять в продукте питания.

Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что могут решить эту задачу путем применения в соответствии с первым и вторым объектом изобретения и с помощью обогащенного сиаловой кислотой продукта питания в соответствии с третьим объектом изобретения.

Авторы изобретения установили, что SiAc могут быть легко обеспечены из бактериальных источников в форме, пригодной для продуктов питания.

SiAc являются компонентами поверхности некоторых патогенов, которые действуют как факторы вирулентности. Предполагают, что они функционируют как молекула, препятствующая распознаванию, позволяющая сиалилированному микроорганизму маскироваться, таким образом ускользая от иммунных механизмов организма-носителя. Однако сиаловая кислота, полученная из патогенных организмов, явно является не пригодной для продуктов питания, в частности для продуктов питания, предназначенных для грудных детей.

Неожиданно, авторы настоящего изобретения выявили микроорганизмы пищевого качества, синтезирующие SiAc, например NeuAc, в частности, при выращивании в стандартной среде.

Таким образом, настоящее изобретение относится к сиаловой кислоте, полученной из бактерий пищевого качества.

Соответственно, одно воплощение настоящего изобретения относится к применению природных бактерий пищевого качества, продуцирующих сиаловую кислоту, или по меньшей мере одной их фракции для обогащения продуктов питания сиаловой кислотой.

Изобретение также относится к применению сиаловой кислоты, полученной из бактерий пищевого качества и/или фракции бактерий пищевого качества, содержащей сиаловую кислоту, для обогащения продукта питания сиаловой кислотой.

Продукт питания может быть обогащен бактериями пищевого качества, продуцирующими сиаловую кислоту, инактивированными или живыми и/или фракцией бактерий и/или их растущей культурой.

Бактерии «пищевого качества» являются бактериями, пригодными для потребления человеком или животным.

«Фракция» бактерий пищевого качества, продуцирующих сиаловую кислоту, включает любую часть бактерий и/или бактериальной культуры, содержащую сиаловые кислоты. Термин «фракция» бактерий пищевого качества, продуцирующих сиаловую кислоту, также включает среду, где выращивали бактерии пищевого качества или ее части, поскольку эта среда автоматически содержит бактериальные SiAc. Кроме того, термин «фракция» бактерий пищевого качества, продуцирующих сиаловую кислоту, также включает любую фракцию, содержащую SiAc, полученную при очистке SiAc из бактериальной культуры.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения природные бактерии пищевого качества, продуцирующие сиаловую кислоту, являются жизнеспособными в продукте питания. Преимуществом является то, что бактерии могут продолжать продуцировать сиаловую кислоту в организме даже после употребления продукта питания. Кроме того, бактерии остаются жизнеспособными в организме, они продолжают размножаться и, соответственно, количество сиаловой кислоты, производимой бактериями в организме, будет существенно увеличиваться.

Для стерильных продуктов также может быть предпочтительно, чтобы бактерии присутствовали в инактивированной форме или чтобы продукт был обогащен чистой бактериальной SiAc или фракцией культуры бактерий, продуцирующих SiAc, не содержащей живых бактерий.

В частности, если бактерии пищевого качества являются жизнеспособными в продукте, бактерии или по меньшей мере одна их фракция являются эффективными в любом количестве. Если бактерии поступают в кишечник в живом состоянии, одной бактерии может быть достаточно для обеспечения мощного эффекта посредством колонизации и размножения.

Однако для продукта питания в соответствии с настоящим изобретением в целом предпочтительно, чтобы бактерии или по меньшей мере одна их фракция применялись в количестве, достаточном для получения повышения содержания сиаловой кислоты в продукте питания 0,05-2 масс.% от массы сухого вещества, предпочтительно 0,4-1,5 масс.% от массы сухого вещества, более предпочтительно 0,6-1 масс.% от массы сухого вещества.

Продукт питания в соответствии с настоящим изобретением может быть питательной композицией, нутрацевтиком, питьем, пищевой добавкой или медикаментом. Пищевая добавка или медикамент может быть, например, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости.

Продукт питания предпочтительно выбран из группы, состоящей из продуктов питания на молочной основе, в частности молока, сыворотки, йогурта, сыра, ферментированных продуктов; детских смесей, твердых продуктов детского питания; детских смесей для прикорма; напитков для детей в возрасте 1-3 лет; фруктовых соков, по меньшей мере частично растворимых смесей для напитков в порошковой форме, таких как солодовые напитки, шоколадные напитки, капучино, кофейные напитки; шоколада; зерновых продуктов; сладостей; печенья; желе.

Молоко может быть молоком, полученным из животных или растительных источников, и предпочтительно является коровьим молоком, грудным молоком человека, овечьим молоком, козьим молоком, лошадиным молоком, верблюжьим молоком или соевым молоком.

Вместо молока могут применяться также белковые фракции, полученные из молока или молозива.

Продукт питания может дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие, как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие агенты, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы; материалы, образующие стенку/оболочку, матриксные соединения, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные агенты, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т.д.), адсорбенты, носители, наполнители, со-соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, средства обработки (растворители), агенты для текучести, агенты для маскировки вкуса, агенты для обеспечения массы, желирующие агенты, желеобразующие агенты, антиоксиданты и противомикробные средства. Он может также содержать обычные фармацевтические добавки и адъюванты, наполнители и разбавители, включая без ограничения воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, аравийскую камедь, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, любриканты, красители, увлажняющие агенты, наполнители и тому подобное. Кроме того, он может содержать любой органический или неорганический материал, пригодный для перорального или энтерального применения, а также витамины, минералы и микроэлементы и другие микронутриенты в соответствии с рекомендациями правительственных органов, таких как Рекомендуемые суточные нормы для США.

Продукт питания в соответствии с настоящим изобретением может содержать источник белка, источник углеводов и/или источник липидов.

Можно применять любой подходящий диетический белок, например животные белки (такие, как белки молока, белки мяса и яичные белки); растительные белки (такие, как соевый белок, рисовый белок и гороховый белок); смеси свободных аминокислот или их комбинации. Особо предпочтительными являются белки молока, такие как казеин и сыворотка, и белки сои.

Если продукт питания включает источник жира, то источник жира более предпочтительно обеспечивает 5%-40% от калорийности рецептуры; например 20%-30% калорийности. Может быть добавлена ДГК. Подходящий жировой профиль может быть получен с применением смеси масла канолы, кукурузного масла и подсолнечного масла с высоким содержанием олеина.

Источник углеводов может обеспечивать, наиболее предпочтительно, от 40% до 80% энергии композиции. Можно применять любой подходящий источник углеводов, например, сахарозу, лактозу, глюкозу, фруктозу, сухую кукурузную патоку, мальтодекстрины и их смеси.

Бактерии пищевого качества предпочтительно выбирают из группы, состоящей из лактобацилл.

Авторы изобретения установили, что лактобациллы продуцируют, в частности, большие количества SiAc, если эти лактобациллы вырабатывают N-ацетилнейраминат-лиазу и/или N-ацетилнейраминат-альдолазу.

Особо предпочтительными видами лактобацилл, которые можно применять для целей настоящего изобретения, являются Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum и/или Lactobacillus salivarius. Особенно хорошие результаты были получены с бактериями, выбранными из группы, состоящей из Lactobacillus sakei NCC 121, Lactobacillus sakei NCC 2935, Lactobacillus sakei NCC 2934, Lactobacillus sakei NCC 166, Lactobacillus sakei NCC 170, Lactobacillus sakei NCC 1393, Lactobacillus sakei NCC 1428, Lactobacillus sakei NCC 1511, Lactobacillus sakei NCC 2937, Lactobacillus plantarum NCC 2936, Lactobacillus plantarum NCC 252 или их смесей.

Для целей настоящего изобретения можно применять любую бактериальную фракцию. Особо предпочтительными фракциями являются фракции, полученные путем выращивания клеток в питательной среде, сбора клеток, гидролиза клеток в кислых условиях и сбора надосадочной жидкости, содержащей сиаловую кислоту.

Например, можно применять один из следующих способов:

Способ 1. После 16 ч выращивания при 37°С в среде API (пептон 1%, дрожжевой экстракт 0,5%, полисорбат 80 0,1%, аммония цитрат 0,2%, натрия ацетат 0,5%, магния сульфат 0,01%, марганца сульфат 0,005% и калия фосфат двухзамещенный 0,2%, глюкоза 1%) клетки собирали и один раз промывали водой. Сиаловые кислоты высвобождали из клеток путем гидролиза в 2М уксусной кислоте при 80°С в течение 3 часов. Полученную после центрифугирования надосадочную жидкость лиофилизировали.

Способ 2. Клетки выращивали в среде API (см. выше) в течение 16 часов при 37°С в 1 л ферментационной среды, добавляли 250 г трихлоруксусной кислоты и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. После центрифугирования клеток в надосадочную жидкость добавляли 1 л ацетона, инкубировали в течение ночи при 4°С и вновь центрифугировали. Осадок отмывали 50% ацетоном и ресуспендировали в воде. Доводили значение рН до 7 и центрифугировали вновь. Экстракт диализовали против воды и лиофилизировали.

Способ 3: После 16 часов выращивания при 37°С в среде API (см. выше) бактериальные клетки промывали дважды холодным фосфатным солевым буферным раствором (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 8,1 мМ Na₂HPO₄ , 1,5 мМ КН₂РO₄, рН 7,4) и один раз 0,1 М пиридин ацетатом (рН 5). Бактерии ресуспендировали в 0,1 объеме предварительно нагретого пиримидин ацетата (0,1 М, рН 5) и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования, лиофилизировали.

Для целей настоящего изобретения можно применять любую сиаловую кислоту.

Однако предпочтительно сиаловая кислота имеет следующую формулу:

R1=Н, ацетил, лактил, метил, сульфат, фосфат, ангидро, сиаловая кислота, фукоза, глюкоза или галактоза,

R2=N-ацетил, N-гликолил, амино, гидроксил, N-гликолил-О-ацетил или N-гликолил-О-метил,

R3=Н, галактоза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, сиаловая кислота, или N-гликолилнейраминовая кислота.

R1 может быть выбран из группы, состоящей из Н, ацетила, лактила, метила, сульфата, фосфата, ангидро, сиаловой кислоты, фукозы, глюкозы и/или галактозы.

R2 может быть выбран из группы, состоящей из N-ацетила, N-гликолила, амино, гидроксила, N-гликолил-О-ацетила и/или N-гликолил-О-метила.

R3 может быть выбран из группы, состоящей из Н, галактозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилгалактозамина, сиаловой кислоты и/или N-гликолилнейраминовой кислоты.

Группы в положении R1 могут быть идентичными или могут отличаться друг от друга. Подобным образом группы в положении R2 могут быть идентичными или могут отличаться друг от друга, как и группы в положении R3.

В особо предпочтительном воплощении настоящего изобретения сиаловая кислота является N-ацетилнейраминовой кислотой с R1=H, R2=М-ацетил и R3=H.

Настоящее изобретение также относится к продукту питания, обогащенному сиаловой кислотой, содержащему природную бактерию пищевого качества, продуцирующую сиаловую кислоту или ее фракцию. Продукт питания, обогащенный сиаловой кислотой, может иметь те же самые характеристики, как описано выше, для применения в настоящем изобретении.

Продукт питания обогащается сиаловой кислотой, если сиаловую кислоту или бактерии, продуцирующие сиаловую кислоту, добавляют в продукт питания. Например, при обогащении количество сиаловой кислоты, которое может естественно присутствовать в продукте питания, повышается по меньшей мере на 10 масс.%, предпочтительно по меньшей мере 50 масс.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 100 масс.%.

Продукт питания в соответствии с настоящим изобретением может применяться для обеспечения питания у субъекта, например, для восстановления баланса при отсутствии продукции эндогенной сиаловой кислоты. В частности, у растущих организмов потребности в сиаловой кислоте часто превышают собственную продукцию эндогенной сиаловой кислоты. Следовательно, добавление в продукты питания сиаловой кислоты позволяет поддерживать развитие субъекта. Отсутствие выработки эндогенной сиаловой кислоты может, однако, также встречаться у субъектов, более не растущих.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к продукту питания в соответствии с настоящим изобретением для применения с целью обеспечения питания субъекта. Продукт питания можно применять для восстановления баланса при отсутствии выработки эндогенной сиаловой кислоты.

Следовательно, предмет обсуждения настоящего изобретения предназначен для людей или животных, в частности для домашних животных, питомцев и/или домашнего скота. Предмет обсуждения из настоящего изобретения в целом не ограничивается какой-либо конкретной возрастной группой. Продукт питания можно применять у матерей во время беременности и лактации, для лечения детей. Его можно применять у грудных детей, детей более старшего возраста, подростков, взрослых или пожилых лиц. Однако продукт питания предпочтительно использовать для грудных детей.

Роль и возможности сиаловой кислоты в питании человека были описаны Wang, В. and Brand-Miller, J. (2003) Eur.J.Clin.Nutr. Nov; 57(11):1351-69.

Авторы настоящего изобретения недавно установили, что применение продукта питания в соответствии с настоящим изобретением у субъекта приводит к повышенному сиалилированию в головном мозге, в частности, у пожилых лиц. Это наблюдается, например, в виде повышения сиалилирования препаратов головного мозга, богатых ганглиозидом (сиалил-лактозилцерамидами). Сиалилирование и особенно ганглиозиды являются важными факторами стабилизации нейрональной целостности и обеспечения нейрональной пластичности в центральной и периферической нервной системе.

Также было установлено, что применение продукта питания в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно у пожилых ведет к повышению сиалилирования в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), в частности в слизистой оболочке проксимального и дистального отдела толстой кишки. Здесь модификация сиалилирования муцина влияет на физико-химические свойства слизистого барьера. Кроме того, было установлено, что сиалилирование гликолипидной связи усиливается, как можно видеть по повышению уровней ганглиозидов в толстой кишке.

Кроме того, наблюдалось, что применение продукта питания в соответствии с настоящим изобретением у субъекта приводит к улучшению клеточно-опосредованного иммунного ответа. Кроме того, уровни ИЛ-2 при стимуляции спленоцитов in vitro лектином конканавалином А усиливается у субъектов, потребляющих продукт питания в соответствии с настоящим изобретением, по сравнению с субъектами контрольной группы. Этот эффект был более отчетливым у грудных детей и детей более старшего возраста, чем у пожилых.

Следовательно, продукт питания в соответствии с настоящим изобретением и/или сиаловую кислоту, полученную из бактерий пищевого качества, можно применять для лечения или профилактики нейродегенерации, в частности, у взрослых. Их также можно применять для улучшения когнитивной функции и/или для поддержки развития головного мозга, в частности, у детей.

Дополнительными приложениями продуктов питания в соответствии с настоящим изобретением и/или сиаловой кислоты, полученной из бактерий пищевого качества, являются поддержка иммунной системы, в частности усиление иммунитета и/или улучшение функции кишечника.

Частные патологические состояния, лечение и профилактику которых можно проводить с помощью продукта питания в соответствии с настоящим изобретением и/или сиаловой кислоты, полученной из бактерий пищевого качества, включают, например, воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженного кишечника, дегенеративные заболевания нервной системы, такие как деменция или болезнь Альцгеймера, постинфекционные аутодеструктивные иммунные заболевания, и/или деградацию нейронов ЖКТ.

Соответственно, продукт питания в соответствии с настоящим изобретением и/или сиаловая кислота, полученная из бактерий пищевого качества, могут, например, стимулировать здоровый рост и здоровое созревание; поддерживать развитие головного мозга у грудных детей и детей более старшего возраста; улучшать когнитивную функцию; предотвращать или противодействовать когнитивному ухудшению и/или нейродегенерации, например, обусловленной старением, заболеванием или стрессом; поддерживать созревание и гомеостаз иммунной системы; повышать сиалилирование, например, у пожилых людей, например, путем обеспечения диетической NeuAc для иммунной защиты; для снижения неспецифичных воспалений, для улучшения кишечного барьера и/или для подавления системного воспаления.

Продукт питания с добавлением сиаловой кислоты в соответствии с настоящим изобретением может вносить вклад в оптимальное снабжение SiAc новорожденных, например, в материнском молоке или детской смеси; в оптимальное развитие ЦНС; в восстановление побочного дефицита SiAc, например, во время беременности, лактации и/или в случае нарушения питания.

Специалисту в данной области техники понятно, что можно свободно комбинировать все признаки настоящего изобретения, описанные здесь, без отделения от раскрытого объема изобретения. В частности, характеристики, описанные для применения настоящего изобретения, можно применять к продукту питания в соответствии с настоящим изобретением и наоборот.

Дополнительные преимущества и характеристики в соответствии с настоящим изобретением станут явными из следующих примеров и фигуры 1.

На фигуре 1 показаны хроматограммы с детекцией 1,2-диамино-4,5-метилендиоксибензол дигидрохлорида (ДМБ): L. plantarum NCC2936 (A); NCC2936 с добавлением стандартов NeuAC и NeuGc (В) и стандарты NeuAC и NeuGc (С).

Примеры

Способы

Бактериальные штаммы и их получение

Бактериальные штаммы получали из коллекции культур Нестле (NCC) и выращивали на среде API (пептон 1%, дрожжевой экстракт 0,5%, полисорбат 80 0,1%, аммония цитрат 0,2%, натрия ацетат 0,5%, магния сульфат 0,01%, марганца сульфат 0,005% и калия фосфат двухзамещенный 0,2%, глюкоза 1%). После 16 ч выращивания при 30°С бактерии собирали и лиофилизировали.

Определение SiAc

SiAc определяли с помощью модифицированного способа Jowdian et al. (1971) JBiol Chem 246:430-435. Вкратце, 10 мкл 0,04 М йодной кислоты смешивали с 50 мкл образца или 50 мкл стандарта NeuAc (0, 20, 40, 60 и 100 мкг/мл) и инкубировали в течение 35 минут на ледяной бане. Добавляли 25 мкл свежей смеси, состоящей из 0,04 мг CuSO ₄ в 6 мл 28% НСl+1 мл 6% резорцинола +3 ml H₂ O и инкубировали в течение 5 минут при 4°С. Образцы кипятили в течение 15 минут и охлаждали. Добавляли 125 мкл 95% трет-бутанола и инкубировали в течение 3 минут при 37°С для стабилизации окраски. Подсчет проводили визуально путем сравнения интенсивности синей окраски образцов со стандартами различных концентраций.

Количественное определение SiAc

Способ с 1,2-диамино-4,5-метилендиоксибензол дигидрохлоридом (ДМБ): Бактериальный образец растворяли в воде до получения ожидаемой общей концентрации сиаловой кислоты примерно 2 мкг/мл. Аликвоту 200 мкл этого раствора гидролизовали путем добавления 200 мкл муравьиной кислоты (1,0 М) и нагревания при 80°С в течение 2 часов для высвобождения всех связанных сиаловых кислот. Затем проводили дериватизацию сиаловых кислот с 1,2-диамино-4,5-метилендиоксибензол дигидрохлоридом (ДМБ), флюоресцентной меткой, специфичной к альфа-кето-кислотам. Дериватизацию проводили путем добавления 200 мкл раствора ДМБ (7,0 мМ в 1,4 М уксусной кислоте, содержащей 0,75 М 2-меркаптоэтанола и 18 мМ натрия гидросульфита) к 200 мкл аликвоте гидролизованного образца, затем смесь нагревали при 80°С в течение 50 минут. Образцы, подвергнутые дериватизации (5 мкл), вводили на обращенно-фазовую ВЭЖХ колонку (Zorbax SB-Aq, 3,5 мкм, 4,6х50 мм) и элюировали с применением мобильной фазы вода/метанол/уксусная кислота (75/25/0,05 (о/о/о)) со скоростью потока 2,0 мл/мин. Элюант с колонки контролировали с применением флюоресцентной детекции ( _вoзб=373 нм, _эм=448 нм). Расчет проводили путем построения калибровочной кривой с сиаловой кислотой известной концентрации и сравнения площадей пиков образца и стандартов.

Идентификация NeuAc (TX-MC анализ)

Метилгликозиды готовили из отмеренного количества образца путем обработки 1 М НСl в метаноле (25 капель) при 80°С в течение 15 ч с последующим pe-N-ацетилированием с пиридином (5 капель) и уксусным ангидридом (5 капель) в метаноле (20 капель) при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем образцы подвергали пер-O-триметилсилилированию путем обработки Tri-Sil (10 капель, Pierce) при 80°С (15 минут). Эти процедуры проводили, как описано ранее (Merkle, R. К. and I. Poppe (1994) Methods Enzymol. 230:1-15; York, W.A. at al. (1986) Methods Enzymol 118:3-40). ГХ-МС анализ ТМС метилгликозидов проводили на HP 5890 GC, подключенном с 5970 MSD, с помощью колонки DB-1 (30 м×0,25 мм внутр.диам.).

Результаты

Определение бактерий, продуцирующих SiAc

Проводили скрининг бактерий из коллекции культур Нестле на продукцию SiAc с применением йодного способа. Были выявлены следующие штаммы, как особо эффективные в продукции SiAc, и депонированы по Будапештскому договору.

Lactobacillus sakei NCC 121 (регистрационный номер CNCM 1-4020)

Lactobacillus sakei NCC 2935 (регистрационный номер CNCM 1-4064)

Lactobacillus sakei NCC 2934 (регистрационный номер CNCM 1-4025)

Lactobacillus sakei NCC 166 (регистрационный номер CNCM 1-4066)

Lactobacillus sakei NCC 170 (регистрационный номер CNCM 1-4067)

Lactobacillus sakei NCC 1393 (регистрационный номер CNCM 1-4022)

Lactobacillus sakei NCC 1428 (регистрационный номер CNCM 1-4023)

Lactobacillus sakei NCC 1511 (регистрационный номер CNCM 1-4024)

Lactobacillus sakei NCC 2937 (регистрационный номер CNCM 1-4065)

Lactobacillus plantarum NCC 2936 (регистрационный номер CNCM 1-4026)

Lactobacillus plantarum NCC 252 (регистрационный номер CNCM 1-4021)

Идентификация типа SiAc

Высушенные порошки штаммов, продуцирующих SiAc, готовили так, как описано в разделе Материалы и методы. Одни и те же порошки анализировали с помощью двух различных способов: ДМБ и ГХ-МС:

а) На фигуре 1 представлена типичная хроматограмма анализируемых штаммов (NCC 2936), полученная с помощью ДМБ метода. С помощью этого способа мы выявили пик почти с тем же самым временем удерживания, как у N-ацетил-нейраминовой кислоты (NeuAc), но демонстрирующий легкий сдвиг времени удерживания. Не отмечалось пика, подобного N-гликолил-нейраминовой кислоте (NeuGc). Taкой сдвиг может наблюдаться, если образец содержит что-либо, связывающееся со стационарной фазой колонки. Такое связывание снижает взаимодействие анализируемого образца со стационарной фазой и таким образом сдвигает время удерживания. Альтернативно, SiAc может быть модифицирована дополнительно химической группой и таким образом демонстрирует измененное время удерживания.

Чтобы проверить, вызван ли сдвиг пиков интерферирующими соединениями в образце, мы проводили эксперимент с добавлением в образец стандартов. Определенное количество стандарта NeuAc добавляли в препарат образца и образец вновь анализировали с помощью ВЭЖХ. Время удерживания пика, наблюдаемое в образце с добавлением, было гораздо ближе к пику NeuAc стандарта, вероятно, из-за эффекта разбавления. Только один пик обнаруживался в образце с добавлением NeuAc, что указывало, что стандарт, добавленный к образцу, давал пик в том же положении, что и пик исходного образца. Таким образом, мы пришли к выводу, что этот пик наиболее вероятно представлен NeuAc и что исходно наблюдаемый сдвиг времени удерживания был, вероятно, обусловлен интерферирующими соединениями в образце, а не модификацией NeuAc.

b) Дополнительное доказательство того, что бактерии продуцируют NeuAc, было получено с помощью ГХ-МС анализа. С помощью этого метода анализировали гликозильный состав бактериальных образцов (Таблица 1). В результате было подтверждено, что SiAc, присутствующая в бактериальных образцах, является NeuAc.

Таблица 1
Анализ гликозильного состава бактериальных образцов
Образец	Гликозильный остаток	Масса (мкг)	Мол.%1
L. sakei NCC 2934	Рибоза(Rib)	4,0	4,3
	Галактоза (Gal)	23,2	20,7
	Глюкоза (Glc)	42,8	38,3
	N-ацетил-глюкозамин (GlcNAc)	40,2	36,0
	N-ацетил-нейраминовая кислота (NANA)	1,5	0,7
			=111,7
L. sakei NCC 2935	Рибоза(Rib)	1,8	6,4
	Галактоза (Gal)	1,7	4,9
	Глюкоза (Glc)	16,9	49,8
	N-ацетил-глюкозамин (GlcNAc)	12,8	37,8
	N-ацетил-нейраминовая кислота (NANA)	0,6	1,1
			=33,8
L. sakei NCC 2937	Рибоза(Rib)	1,8	6,2
	Рамноза (Rha)	4,7	14,6
	Галактоза (Gal)	1,4	4,1
	Глюкоза (Glc)	9,7	27,3
	N-ацетил-глюкозамин (GlcNAc)	16,4	46,4
	N-ацетил-нейраминовая кислота (NANA)	0,6	1,4
			=34,6
L. plantarum NCC 2936	Рибоза(Rib)	3,9	5,3
	Галактоза (Gal)	5,9	6,8
	Глюкоза (Glc)	56,4	64,8
	N-ацетил-глюкозамин (GlcNAc)	18,2	21,0
	N-ацетил-нейраминовая кислота (NANA)	2,3	2,1
			=86,7
1Значения выражены в мол.% от общего содержания углеводов.

Количественное определение SiAc

Количественное определение SiAc проводили с ДМБ методом и йодным методом. ДМБ является количественным методом, в то время как йодный метод является полуколичественным методом анализа образцов. Точное количественное определение с помощью йодного анализа невозможно из-за высокой фоновой окраски, мешающей спектрофотометрическому определению результатов. Результаты количественного анализа тех же самых партий бактерий представлены в Таблице 2.

Таблица 2
Содержание NeuAc в бактериальных образцах
Штамм	ДМБ метод	Йодный метод
L. sakei NCC2934	0,16	0,27
L. sakei NCС2935	0,13	0,21
L. sakei NСС2937	0,14	0,21

Содержание SiAc выражено в % от сухого вещества бактерий.