вещества и способы лечения рассеянного склероза, опосредованного в клетками

Формула изобретения

1. Полипептид растворимого Fc рецептора человека (Fc-гамма рецептор) для применения при лечении рассеянного склероза, где рассеянный склероз представляет собой форму рассеянного склероза, опосредованную В клетками, и/или запускаемую аутоантителами форму рассеянного склероза, где Fc рецептор выбран из группы, состоящей из Fc RI (CD64), Fc RIIA (CD32), Fc RIIB1 (CD32), Fc RIIB2 (CD32), Fc RIIc (CD32), Fc RIIIA (CD16) и Fc RIIIB (CD16), где рецептор имеет последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6. SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13.

2. Полипептид растворимого Fc рецептора человека по п.1, где опосредование рассеянного склероза и/или запускаемая аутоантителами форма рассеянного склероза характеризуется одним или более из следующих признаков:

a. течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается лечению внутривенным введением иммуноглобулина (IVIG), и/или

b. течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается лечению aнти-CD20 антителом, и/или

c. течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается плазмаферезу, и/или

d. течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается иммуноадсорбции,

e присутствие аутоантител против антигена миелина олигодендроцитов гликопротеина (MOG), и/или

f. присутствие аутоантител против антигена основного белка миелина (МБР), и/или

g. присутствие аутоантител против аквапорина 4.

3. Полипептид растворимого Fc рецептора человека по п.1 или 2, где опосредование рассеянного склероза и/или запускаемая аутоантителами форма рассеянного склероза определяется перед применением Fc рецептора посредством одного или более из следующих тестов:

a. определением того, облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается лечению внутривенным введением иммуноглобулина (IVIG), и/или

b. облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается лечению анти-СD20 антителом,

c. облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается плазмаферезу, и/или

d. облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается иммуноадсорбции,

e. определение, присутствуют ли аутоантитела против антигена миелина олигодендроцитов гликопротеина (MOG) у пациента, и/или

f. определение, присутствуют ли аутоантитела против антигена основного белка миелина (МБР) у пациента, и/или

g. определение, присутствуют ли аутоантитела против аквапорина 4 у пациента.

4. Полипептид растворимого Fc рецептора человека по п.1, где рецептор химически модифицирован пэгилированием и/или подвергнут аффинному модулированию.

5. Полипептид растворимого Fc рецептора человека по п.1, где рецептор не гликозилирован.

6. Полипептид растворимого Fc рецептора человека по п.1, где рецептор представляет собой Fc RIIA/B/C (CD32) или Fc RIIIA/B (CD16b).

7. Полипептид растворимого Fc рецептора человека по п.1 в водном растворе, где количество рецептора, введенное пациенту в одной дозе, ставляет от 1 до 20 мг/кг.

8. Полипептид растворимого Fc рецептора человека по п.1, где Fc R представляет собой рекомбинантный негликозилированный человеческий растворимый Fc RIIb, предпочтительно выбранный из группы SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и терапевтических средств. Изобретение относится к Fc рецептору (Fc-гамма рецептору) для применения при лечении рассеянного склероза, где рассеянный склероз представляет собой форму рассеянного склероза, опосредованную B клетками, и/или запускаемую аутоантителами форму рассеянного склероза.

Предпосылки изобретения

Современные гипотезы поддерживают концепцию о том, что T клетки играют основную роль в патогенезе рассеянного склероза (MS), которая первоначально основывалась на наблюдении, что T клетки представляют собой преобладающий класс лимфоцитов, присутствующих в поражениях при MS (Windhagen, et al., Cytokine, secretion of myelin basic protein reactive T cells in patients with multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology, 91: 1-9, 1998; Hafler, DA, et al., Oral administration of myelin induces antigen-specific TGF-beta 1 secreting cells in patients with multiple sclerosis. Annals of the New York Academy of Science, 835: 120-131, 1997; Lovett-Racke, A.E., et al., Decreased dependence of myelin basic protein-reactive T cells on CD28-mediated costimulation in multiple sclerosis patients, Journal of Clinical Investigation, 101: 725-730, 1998). Это наблюдение продолжает оставаться краеугольным камнем данного заболевания, и оно подтверждается рядом наблюдений. Например, активные CD4+ T хелперные клетки, несущие анти-миелиновые T клеточные рецепторы (TCR), присутствуют в спинномозговой жидкости (CSF) пациентов с MS. Кроме того, повышенные уровни Th1-подобных цитокинов были выявлены в CSF пациентов с MS и коррелировались с усугублением заболевания в некоторых случаях (Calabresi et al, Cytokine expression in cells derived from CSF of multiple sclerosis patients. Journal of Neuroimmunology, 89:198-205, 1998).

Однако также имелись доказательства того, что В клетки могут участвовать в развитии и поддержании MS, включая:

(1) повышенные уровни иммуноглобулина в CSF пациентов с MS (Link, H., et al., Immunoglobulins in multiple sclerosis and infections of the nervous system, Archives of Neurology, 25: 326-344, 1971; Link, H., et al., Immunoglobulin class and light chain type of oligoclonal bands in CSF in multiple sclerosis determined by agarose gel electrophoresis and immunofixation. Ann Neurol, 6(2): 107-110, 1979; Perez, L., et al., B cells capable of spontaneous IgG secretion in cerebrospinal fluid from patients with multiple sclerosis: dependancy on local IL-6 production. Clinical Experimental Immunology, 101: 449-452, 1995);

(2) олигоклональный бэндинг в CSF пациентов с MS (Link, H., et al., Immunoglobulin class and light chain type of oligoclonal bands in CSF in multiple sclerosis determined by agarose gel electrophoresis and immunofixation. Ann Neurol, 6(2): 107-110, 1979);

(3) искажение соотношения : в CSF пациентов с MS (Hauser, S.L., et al., Clonally restricted B cells in peripheral blood of multiple sclerosis patients: kappa/lambda staining patterns. Annals of Neurology, 11: 408-412,1982);

(4) присутствие анти-миелиновых антител в CSF пациентов с MS (Sun, J.H., et al., B cell responses to myelin-oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Journal of Immunology, 146: 1490-1495,1991) и

(5) демонстрацию того, что антитела из CSF пациентов с MS могут вносить вклад в общую степень повреждения ткани у этих пациентов (Lassmann, H., et al., Experimental allergic encephalomyelitis: the balance between encephalitogenic T lymphocytes and demyelinating antibodies determines size and structure of demyelinated lesions. Acta Neuropathoiogy, 75: 566-576, 1988).

Ряд публикаций демонстрируют такое опосредование В клетками: Bourquin, et al., The journal of Immunology, 2003, 171: 455-461; Stromnes et al. Nature Protocols, Vol. 1, No. 4, 2006: 1810-1818; Stromnes et al Nature Protocols, Vol. 1, No. 4, 2006: 1952-19160; Oliver, et al., The Journal of Immunology, 2003, 171: 462-468.

Основной ролью В клеток в иммунной системе является опосредование гуморальных иммунных реакций. То есть секреция белков, называемых антителами (или иммуноглобулинами), которые связываются с инородными телами и маркируют их для выведения из организма другими иммунными клетками, такими NK клетки (природные киллеры) и макрофаги.

Во многих клинических испытаниях, описанных в литературе, было продемонстрировано, что внутривенный иммуноглобулин (IVIG) оказывает воздействие на два важных аспекта при рецидивирующем-ремиттирующем рассеянном склерозе. IVIG снижает частоту обострений и уменьшает интенсивность и длительность обострений. По-видимому у подгруппы пациентов имеется выраженное вовлечение В клеток в рассеянный склероз. Следовательно, было бы предпочтительно иметь вещества и способы лечения пациентов с таким опосредованным В клетками рассеянным склерозом.

IVIG представляет совокупный человеческий иммуноглобулин от многих доноров. Точный механизм, которым IVIG облегчает течение опосредованных аутоантителами заболеваний, неизвестен. Однако может быть показано, что a) эффективность IVIG зависит от экспрессии FC-рецепторов, b) отношение аутоантител к нормальному иммуноглобулину (IVIG) сдвинуто, что ведет к усиленному разрушению аутоантител, и c) IVIG содержит полную сеть человеческих антител и анти-идиотипических антител (антител против антител), что ведет к нейтрализации аутоантител.

Краткое описание сущности изобретения

Авторы к удивлению обнаружили, что современная гипотеза о том, что Т клетки играют центральную роль в патогенезе рассеянного склероза (MS) по меньшей мере не полностью правильная. Авторы обратились к опосредованной В клетками форме рассеянного склероза и к удивлению обнаружили, что способны обеспечить специфическое лечение.

Изобретение относится к Fc рецептору (Fc-гамма рецептору) для применения при лечении рассеянного склероза, где рассеянный склероз представляет собой форму рассеянного склероза, опосредованную B клетками, и/или запускаемую аутоантителами форму рассеянного склероза. Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим Fc рецептор (Fc-гамма рецептор) для применения при лечении рассеянного склероза, где рассеянный склероз представляет собой форму рассеянного склероза, опосредованную B клетками, и/или запускаемую аутоантителами форму рассеянного склероза.

Fc рецепторы (FcR) играют ключевую роль в защите человеческого организма от инфекций. После того как патогенны получают доступ в циркулирующую кровь, они опсонизируются иммуноглобулинами (Ig). Полученные иммунокомплексы ввиду их многовалентности с высокой авидностью связываются с клетками, несущими FcR, ведущей к образованию кластеров FcR, которые запускают несколько эффекторных функций (Metzger, H., 1992A). В зависимости от типа экспрессированных FcR и ассоциированных белков, эти функции включают эндоцитоз с последующей нейтрализацией патогенов и представлением антигена, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), секрецию медиаторов или регуляцию продукции антител (Fridman, et al., 1992; van der Winkei and Capel, 1993).

Специфические FcR существуют для всех классов Ig, причем FcR для IgG наиболее многочисленны в самом широком разнообразии. Вместе с рецептором, обладающим высокой аффинностью в отношении IgE (Fc RIa), Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) и Fc RIIIa (CD16), встречаются в виде трансмембранных белков I типа или в растворимых формах (sFcR), но также существует закрепленная гликозилфосфатидилинозитолом форма Fc RIII (Fc RIIIb). Кроме того, Fc R встречаются в различных изоформах (Fc RIa, b1, b2, c; Fc RIIa1-2, b1-3, c) и аллелях (Fc RIIa1-HR, -LR, Fc RIIIb-NA1, -NA2) (van der Winkel and Capel, 1993). В отличие от всех гомологичных внеклеточных частей, их расположение на мембране и цитоплазматические домены различаются. Может быть произведена их полня делеция, или они могут иметь размер 8 кДа. Они могут содержать или 26 аминокислотный иммунорецепторный активационный мотив на основе тирозина (ITAM), как в Fc RIIa, или соответствующий 13 аминокислотный ингибиторный мотив (ITIM) в Fc RIIb, участвующем в передаче сигналов (Amigorena, et al., 1992).

В настоящем описании EAE означает экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к Fc рецептору (Fc-гамма рецептору) для применения при лечении рассеянного склероза, где рассеянный склероз представляет собой форму рассеянного склероза, опосредованную B клетками, и/или запускаемую аутоантителами форму рассеянного склероза.

Опосредование B клетками рассеянного склероза и/или запускаемая аутоантителами форма рассеянного склероза характеризуется одним или более из следующих признаков, (a) течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается лечению внутривенным введением иммуноглобулина (IVIG) и/или (b) течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается лечению анти-CD20 антителом, и/или (c) течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается плазмаферезу, и/или (d) течение рассеянного склероза облегчается, если пациент подвергается иммуноадсорбции, (e) присутствие аутоантител против антигена миелина олигодендроцитов гликопротеина (MOG), и/или (f) присутствие аутоантител против антигена основного белка миелина (MBP), и/или (g) присутствие аутоантител против аквапорина 4.

Болезнь Девика аналогична MS тем, что иммунная система организма атакует миелин, окружающий нервные клетки. В отличие от стандартного MS, такие атаки не считаются опосредованными T клетками иммунной системы, а скорее антителами, называемыми NMO-Ig. Эти антитела нацелены на белок, называемый аквапорином 4, в клеточных мембранах астроцитов, который действует в качестве канала для транспорта воды через клеточную мембрану.

В предпочтительном варианте осуществления опосредование B клетками рассеянного склероза и/или запускаемую аутоантителами форму рассеянного склероза определяют перед использованием Fc рецептора посредством одного или более из следующих тестов, (a) определение того, облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается лечению внутривенным введением иммуноглобулина (IVIG), и/или (b) облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается лечению анти-CD20 антителом, (c) облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается плазмаферезу, (d) облегчается ли течение рассеянного склероза, если пациент подвергается иммуноадсорбции, (e) определение того, присутствуют ли аутоантитела против антигена миелина олигодендроцитов гликопротеина (MOG) у пациента, и/или (f) определение того, присутствуют ли аутоантитела против антигена основного белка миелина (MBP) у пациента, и/или (g) определение того, присутствуют ли аутоантитела против аквапорина 4. Предпочтительно, выбирают два из указанных тестов, предпочтительно, выбирают три из указанных тестов, предпочтительно, выбирают четыре из указанных тестов.

Одним примером средства для лечения анти-CD20 антителом является ритуксимаб. Он представляет собой моноклональное антитело. К сожалению, он обладает тяжелыми побочными эффектами, которые могут быть облегчены, если вместо ритуксимаба используют белок по настоящему изобретению, т.е. полипептиды.

Во время плазмафереза первоначально осуществляют забор крови из организма через иглу или предварительно имплантированный катетер. Затем плазму удаляют из крови клеточным сепаратором. Обычно используют три процедуры для отделения плазмы от крови.

Центрифугирование в прерывистом потоке:

Требуется одна магистраль венозного катетера. Обычно за один раз удаляют партию 300 мл крови и центрифугируют для отделения плазмы от клеток крови.

Центрифугирование в непрерывном потоке:

Используют две венозные магистрали. Этот способ требует удаления из организма несколько меньшего объема крови в любой отрезок времени, так как при таком способе возможно непрерывное центрифугирования для отделения плазмы.

Фильтрация плазмы:

Используют две венозные магистрали. Плазму фильтруют с использованием стандартного оборудования для гемодиализа. Такой непрерывный процесс требует удаления из организма менее чем 100 мл крови в любой отрезок времени.

Во время иммуноадсорбции кровь пациента очищают от иммуноглобулина колоночной экстракорпоральной аффинной хроматографией.

Каждый способ имеет свои преимущества и недостатки. После отделения плазмы клетки крови возвращаются индивиду, подвергаемому лечению, тогда как плазма, которая содержит антитела, сначала обрабатывается, а затем возвращается пациенту традиционным плазмаферезом. (При обмене плазмы, удаленная плазма удаляется, и пациент получает заменяющую донорскую плазму или солевой раствор с добавленными белками.) Для предотвращения свертывания крови пациенту во время процедуры, как правило, вводят медикаментозное средство (антикоагулянт). Плазмаферез используется в качестве лечения при определенных заболеваниях.

Важным применением плазмафереза является его использование при лечении аутоиммунных расстройств. Однако этот способ крайне обременителен для пациента.

В WO 2008/017363 описано средство для тестирования опосредующей роли B клеток. В частности, в нем описано средство для выявления аутоантител против MOG и аквапорина 4. WO 2008/017363 включен в настоящее описание посредством ссылки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения FcR рецептор имеет человеческое происхождение. Fc рецептор согласно настоящему изобретению предпочтительно выбран из группы Fc RI (CD64), Fc RIIA (CD32), Fc RIIB1 (CD32), Fc RIIB2 (CD32), Fc RIIc (CD32), Fc RIIIA (CD16) и Fc RIIIB (CD16).

Fc RIIB1 (CD32) и Fc RIIB2 (CD32) представляют собой так называемые изоформы, т.е. изоформы 1 и 2.

Согласно настоящему изобретению получение растворимых Fc рецепторов происходит в прокариотических и эукариотических клетках. Оно может также происходить в эукариотических клетках. Если оно происходит в прокариотических клетках (см. EP-B1 1135486), то образуются нерастворимые тельца включения, содержащие рекомбнантный белок, таким образом облегчая очистку сепарацией телец включения от других клеточных компонентов перед тем как происходит ренатурация белков, содержащихся в них. Ренатурация FcR согласно настоящему изобретению, которые содержатся в тельцах включения, может в основном происходить в соответствии с известными способами. Преимущество получения в прокариотических клетках, продукция телец включения и полученные таким образом рекомбинантные растворимые Fc рецепторы обеспечивают возможность получения очень чистого и, в частности, также очень однородного препарата FcR. Также, ввиду отсутствия гликозилирания полученный продукт имеет большую однородность. Однако в некоторых случаях может быть желательно гликозилирование.

Клетка-хозяин представляет собой полученным генной инженерией полинуклеотидом или вектором, кодирующим или несущим FcR. Клетки-хозяева, которые могут использоваться для целей настоящего изобретения, включают, но без ограничения, прокариотические клетки, такие как бактерии (например, E. Coli и B. Subtilis), которые могут быть трансформированы, например, векторами экспрессии рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими молекулы полинуклеотида, кодирующие FcR; простые эукариотические клетки, подобные дрожжам (например, Saccharomyces и Pichia), которые могут быть трансформированы, например, рекомбинантными дрожжевыми векторами экспрессии, содержащими молекулу полинуклеотида по изобретению, т.е. молекулы полинуклеотидов, кодирующих FcR; системы клеток насекомых, подобные, например, Sf9 клеткам Hi5, которые могут быть инфицированы, например, рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловируса), содержащими молекулы полинуклеотидов по изобретению; ооциты Xenopus, в которые могут инъецироваться, например, плазмиды; системы растительных клеток, в которые могут инъецироваться, например, рекомбинантные вирусные векторы экспрессии (например, вирус мозаики цветной капусты (CaMV) или вирус мозаики табака (TMV), или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, плазмиды Ti), содержащими FcR, или вариантную нуклеотидную последовательность; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, CHO, BHK, HEK293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3 и NIH 3T3), которые могут быть трансформированы рекомбинантными экспрессионными конструктами, содержащими, например, промоторы, полученные, например, из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса, CMV IE и промотор вируса коровьей оспы 7.5K) или из бактериальных клеток (например, tet-репрессор связывания используется в системах tet-включения и tet-выключения). Также используемыми в качестве клеток-хозяев являются первичные или вторичные клетки, полученные непосредственно у млекопитающего и трансфицированные плазмидным вектором или инфицированные вирусным вектором. В зависимости от клетки-хозяина и от соответствующего вектора, используемого для введения полинуклеотида по изобретению, полинуклеотид может интегрироваться, например, в хромосому или митохондриальную ДНКи, или может поддерживаться внехромосомно, как, например, эписомально, или может только транзиторно содержаться в клетках.

В последовательности Fc RIIb обнаружены три потенциальных сайта N-гликозилирования. Все три сайта находятся на поверхности молекулы и являются доступными. Они локализуются в петлях EIF (N61 и N142) обоих доменов и на нити E (N 135) С-концевого домена. FcR, выделенный из клеток млекопитающих, является высоко гликозилированными. Поскольку FcR гликозилирован in vivo, то может быть желательным выбор экспрессионной системы, которая обеспечивает точное гликозилирование белка. Следовательно, предпочтительно введение полинуклеотидов, кодирующих FcR по настоящему изобретению в высшие эукариотические клетки, в частности в клетки млекопитающих, например в клетки COS, CHO, BHK, HEK293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3 и NIH 3T3.

Предпочтительно рецептор согласно изобретению не содержит трансмембранный домен и/или сигнальный пептид и является растворимым. Растворимые формы Fc рецепторов (sFcR), такие как Fc RIII, опосредуют изотип-специфическую регуляцию роста В клеток и продукцию иммуноглобулина. На мышиной модели миеломы sFcR подавляет рост и продукцию иммуноглобулина опухолевых клеток (Muller, et al., 1985; Roman, et al., 1988; Neillaud, et al., 1990). Кроме того, sFcR связывается с поверхностным IgG на культурах клеток миеломы человека, секретирующих IgG, и осуществляет подавление роста опухолевых клеток и секрецию IgG. Продолжительный контакт этих клеток с sFcR приводит к цитолизу опухолевых клеток (Hoover, et al., 1995).

Полипептиды Fc рецептора могут представлять собой любые из полипептидов, описанных выше, но не более чем с десятью (например, не более чем: с десятью, с девятью, с восемью, с семью, с шестью, с пятью, с четырьмя, с двумя или с одним) консервативными заменами. Консервативные замены известны в данной области и обычно включают замену, например, одной полярной аминокислоты другой полярной аминокислотой и одной кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой. Соответственно, консервативные замены предпочтительно включают замены в пределах следующих групп аминокислот: глицин, аланин, валин, пролин, изолейцин и лейцин (неполярная, алифатическая боковая цепь); аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота (отрицательно заряженная боковая цепь); аспарагин, глутамин, метионин, цистеин, серин и треонин (полярные, незаряженная боковая цепь); лизин, гистидин и аргинин; и фенилаланин, триптофан и тирозин (ароматическая боковая цепь); и лизин, аргинин и гистидин (положительно заряженная боковая цепь). В данной области хорошо известно, как определить эффект данной замены, например, на pKI и т.д. Все, что требуется от полипептида, имеющего одну или более консервативных замен, наличие у него по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5% или 100%, или более) активности неизмененного Fc рецептора согласно изобретению.

Как полипептиды, так и пептиды могут быть получены стандартными методиками рекомбинантной ДНК in vitro и трансгенезом in vivo с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих соответствующие полипептиды или пептиды. Способы, хорошо известные специалистам в данной области, могут применяться для конструкции векторов экспрессии, содержащих релевантные кодирующие последовательности и соответствующие транскрипционные/трансляционные контролирующие сигналы. См., например, методики, описанные Sambrook, et al., в Molecular Cloning: A Laboratory Manual {2nd Ed.) [Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989], и Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology [Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989].

Полипептиды и фрагменты по изобретению, т.е. выделенные полипептиды, также включают такие, как описано выше, но модифицированные для применения in vivo добавлением на амино- и/или карбоксильные концы блокирующих агентов, чтобы содействовать выживанию релевантного полипептида in vivo. Это может полезно в тех ситуациях, когда пептидные концы имеют тенденцию к разрушению протеазами перед клеточным захватом. Такие блокирующие агенты могут включать, но без ограничения, дополнительные связанные или несвязанные пептидные последовательности, которые могут быть присоединены к амино- и/или карбоксильным концевым остаткам пептида, подлежащего введению. Это может быть сделано или химически во время синтеза пептида, или способами технологии рекомбинантной ДНК, известными специалистам в данной области.

Альтернативно, блокирующие агенты, такие как пироглутаминовая кислота или другие молекулы, известные в данной области, могут быть присоединены к амино- и/или карбоксильным концевым остаткам, или аминогруппа на амино-конце или карбоксильная группа на карбоксильном конце может быть заменена другой частью. Аналогичным образом, пептиды могут быть ковалентно или нековалентно связаны с фармацевтически приемлемыми белками-«носителями» перед введением.

Термин «выделенный» полипептид или фрагмент пептида, используемый в настоящем описании, относится к полипептиду или фрагменту пептида, который или не имеет естественно встречающейся копии, или был выделен или очищен от компонентов, которые естественно сопровождают его, например, в тканях, таких как язык, поджелудочная железа, печень, селезенка, яичники, семенники, мышцы, суставная ткань, нервная ткань, желудочно-кишечная ткань или опухолевая ткань, или биологические жидкости, такие как кровь, сыворотка или моча. Обычно полипептид или пептидный фрагмент считается «выделенным», когда он составляет по меньшей мере 70% на сухую массу, свободной от белков и других встречающихся в природе молекул, с которыми он природно ассоциирован. Предпочтительно препарат полипептида (или его пептидного фрагмента) по изобретению составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% на сухую массу полипептида (или его пептидного фрагмента) по изобретению, соответственно. Так, например, препарат полипептида «x» составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% на сухую массу полипептида «x». Поскольку полипептид, который химически синтезирован, по своей природе отделен от компонентов, которые в природе сопровождают его, то синтетический полипептид является «выделенным».

Поскольку выделенный полипептид (или пептидные фрагменты) по изобретению могут быть получены, например, экстракцией из природного источника (например, из тканей или биологических жидкостей); экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид; или химическим синтезом. Полипептид, который получен в клеточной системе, отличной от источника, из которого он природно происходит, является «выделенным», потому что он будет обязательно лишен компонентов, которые сопровождают его в природе. Степень выделения или чистоты может быть измерена соответствующим способом, например колоночной хроматографией, электрофорезом на акриламидном геле или анализом с использованием ВЭЖХ.

Fc рецептор согласно изобретению может быть химически модифицирован (усовершенствован) пэгилированием и/или генной инженерией.

Известные подходы включают обеспечение дополнительных сайтов гликозилирования (см., например, WO 91/05867, WO 94/09257 и WO 01/81405). Такие модифицированные аналоги могут иметь по меньшей мере одну дополнительную связанную с N-концом и/или с O-концом углеводородную цепь. Другие попытки увеличить период полувыведения может включать добавление остатков полиэтиленгликоля (PEG) изменяемой длины к основной цепи аминокислоты (см., например, WO 00/32772, WO 01/02017, WO 03/029291). Молекулы могут быть модифицированы по меньшей мере одним олигосахаридом, связанным с N-концом и/или с O-концом; затем молекулы модифицируются окислением, сульфатированием, фосфорилированием, пэгилированием или их комбинацией (см. WO 2005/025606). Все такие подходы могут быть в равной мере использованы для удлинения периода полувыведения вариантов по настоящему изобретению и, соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления Fc рецептора согласно изобретению, при этом модификация выбрана из группы, состоящей из окисления, сульфатирования, фосфорилирования, добавления олигосахаридов или их комбинаций. Если желательно добавление дополнительных олигонуклеотидов, связанных с N-концом или O-концом, то их можно ввести путем введения дополнительных сайтов гликозилирования. Предпочтительно также, чтобы белок был аффинно модулирован.

При осуществлении одного аспекта настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая рецептор по изобретению, может вводиться млекопитающему любым путем, который обеспечивает достаточный уровень активности. Он может вводиться системно или местно. Такое введение может осуществляться парентерально, через слизистые оболочки, например перерально, интраназально, ректально, интравагинально, под язык, под слизистые оболочки или трансдермально. Предпочтительно, введение осуществляют парентерально, например, посредством внутривенной или внутрибрюшинной инъекции, а также включая, но без ограничения, внутриартериальное, внутримышечное, интрадермальное и подкожное введение. Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению вводится местно, ее можно инъецировать непосредственно в орган или ткань, подвергаемую лечению. В случаях лечения нервной системы этот путь введения включает, но без ограничения, интрацеребральный, интравентрикулярный, интрацеребовентрикулярный, подоболочечный, интрацистернальнный, интраспинальный и/или периспинальный пути введения, при которых могут использоваться внутричерепные и внутрипозвоночные иглы и катетеры с насосными устройствами и без них.

Рецептор может также быть гликозилированным.

Наиболее предпочтительно рецептор выбран из группы Fc RIIA/B/C (CD32) и Fc RIIIA/B (CD16b). Изобретение также относится к их изоформам и изоформам рецепторов FcR, в целом заявляемых в настоящем изобретении.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит полипептид FcR в единичной дозированной форме для лечения рассеянного склероза, где рассеянный склероз представляет собой опосредованную B клетками форму рассеянного склероза и/или запускаемую антителами форму рассеянного склероза, и количество, вводимое пациенту в одной дозе, составляет от 1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 2 до 10 мг/кг, более предпочтительно от 25 до 5 мг/кг, еще более предпочтительно от 2,5 до 5 мг/кг.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать одно или более из следующим веществ: детергент и/или сахар. Предпочтительными детергентом является Tween 20. Предпочтительным сахаром является маннит.

Fc рецептор согласно изобретению предпочтительно имеет последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6. SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13. Они представлены в таблице 1.

Fc рецептор согласно изобретению предпочтительно содержит только внеклеточный домен указанных последовательностей (растворимую форму рецептора). Указанный домен известен по совмещениям последовательностей, и он характеризуется рентгеновской кристаллографией и содержит первые два (CD16, CD32) или первые три (CD64) подобные IgG домена зрелого рецептора (Sondermann P., Kaiser J., Jacob U., Molecular basis for immune complex recognition: a comparison of Fc-receptor structures. J. Mol. Biol. 2001, 309, 737-749).

Таблица 1

Предпочтительные FcR кодируются следующими нуклеиновыми кислотами:

Человеческий FCгаммаRIA (SEQ ID NO:1) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:14.

Человеческий FCгаммаRIB (SEQ ID NO:2) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:15.

Человеческий FCгаммаRIB (SEQ ID NO:3) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:16.

Человеческий FCгаммаRIIa (SEQ ID NO:4) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:17.

Человеческий FCгаммаARIIB изоформа 1 (SEQ ID NO:5) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:18.

Человеческий FCгаммаRIIB изоформа 2 (SEQ ID NO:6) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:19.

Человеческий FCгаммаRIIB изоформа 3 (SEQ ID NO:7) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:20.

Человеческий FCгаммаRIIb изоформа 4 (SEQ ID NO:8) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:21.

Человеческий FCгаммаRIIс изоформа 1 (SEQ ID NO:9) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:22.

Человеческий FCгаммаRIIС изоформа 2 (SEQ ID NO:10) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:23.

Человеческий FCгаммаRIIС изоформа 3 (SEQ ID NO:11) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:24.

Человеческий FCгаммаRIIIA (SEQ ID NO:12) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:25.

Человеческий FCгаммаRIIIB (SEQ ID NO:13) кодируется последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:26.

Предпочтительно Fc R представляет собой рекомбинантный негликозилированный человеческий растворимый Fc RIIb, предпочтительно выбранный из группы SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.

Примеры

Биологически активное соединение, молекула рекомбинантного человеческого растворимого Fc RIIb, продуцировали в тельцах включения ферментацией генетически сконструированной E. Coli.

Fc RIIb продуцировали ферментацией в штамме BL21 (DE3) E. Coli, который был трансформирован оптимизированной последовательностью кДНК для экспрессии sFc RIIb.

Fc RIIb содержит 4 цистеина для образования 2 внутримолекулярных дисульфидных мостиковых связей между положениями Cys26-Cys68 и Cys107-Cys151. N-концевая последовательность соответствует консенсусной последовательности эукариотической сигнальной пептидазы. C-конец генерировали введением терминирующего кодона после мотиваSER-SER-PRO. Другие модификации не вводили.

Fc RIIb имеет молекулярную массу 19688,9 в нативном и 19692,9 в восстанавливающем состояниях.

Обзор способа получения лекарственного вещества представлен в таблице 2:

Таблица 2
Один флакон WCB
Ферментация клеточного субстрата E. coli
Сбор клеточного субстрата E. Coli
Выделение телец включения
Повторная укладка Fc RIIb из телец включения
Очистка Fc RIIb для выхода сырого вещества
Хранение сырого Fc RIIb при -80°С

Описание чертежей

Фиг.1

EAE индуцировали в нулевой день у самок 6-8 недельных мышей C57/BI6j подкожной инъекцией 100 мкг крысиного MOG в полном адъюванте Фрейнда (CFA). 250 мг коклюшного токсина вводили внутрибрюшинно в 0 и 2-й день. Мышей обрабатывали внутрибрюшинным введением 200 мкг sEcR после первых симптомов, появившихся на 8, 11 и 14 день. Схема балльной оценки соответствовала степени паралича: 0 = нет паралича, 1 = паралич хвоста, 2 = паралич задних лап, 3 = паралич передних лап, 4 = полный паралич, 5 = смерть.

Фиг.2

EAE индуцировали в нулевой день у самок 6-8-недельных мышей SJL подкожной инъекцией 100 мкг крысиного MOG в полном адъюванте Фрейнда (CFA). 250 мг коклюшного токсина вводили внутрибрюшинно в 0 и 2-й день. Мышей обрабатывали внутрибрюшинным введением 200 мкг sEcR после первых симптомов, появившихся на 9, 12 и 15 день. Схема балльной оценки соответствовала степенью паралича: 0 = нет паралича, 1 = паралич хвоста, 2 = паралич задних лап, 3 = паралич передних лап, 4 = полный паралич, 5 = смерть.