применение штамма вifidobacterium для получения композиции, предназначенной для профилактики и/или лечения проявлений аллергического типа

Формула изобретения

1. Способ получения композиции, предназначенной для профилактики аллергии к белкам коровьего молока (СМРА) и повышенной чувствительности к аллергенам у новорожденных и грудных детей, отличающийся тем, что он включает стадию биоконверсии молочного субстрата посредством культуры штамма Bifidobacterium breve BBC50, депонированного 31 мая 1999 года в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) под номером I-2219, путем выдерживания субстрата в контакте с культурой штамма в условиях, являющихся неблагоприятными для продуцирования штаммом кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что за стадией биоконверсии молочного субстрата посредством Bifidobacterium breve следует стадия кислой ферментации композиции, полученной на стадии биоконверсии, в присутствии штамма Bifidobacterium breve.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что, параллельно стадии биоконверсии молочного субстрата посредством Bifidobacterium breve, второй молочный субстрат ферментируется посредством Bifidobacterium breve, причем продукты обеих реакций затем объединяют в композиции.

4. Способ по п.1, 2 или 3, отличающийся тем, что он включает стадию стерилизации и/или отделения бифидобактерий после стадии ферментации или биоконверсии.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что композиция содержит также массу, образующуюся при ферментации молочного субстрата штаммом Streptococcus thermophilus.

6. Способ по п.5, в котором штамм Streptococcus thermophilus представляет собой штамм Streptococcus thermophilus ST065, депонированный 23 августа 1995 года в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) под номером I-1620.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что композиция представляет собой продукт для лечебно-профилактического питания, биологически активную добавку или фармацевтическую композицию.

8. Способ по п.1 получения композиции, предназначенной для детского питания.

9. Способ по п.1 получения композиции, предназначенной лицам, страдающим проявлениями аллергического типа, лицам, предрасположенным к аллергии, или детям, у которых по меньшей мере один из родителей болен аллергией и/или имеет предрасположенность к аллергии.

10. Способ по пп.8 и 9 получения композиции, предназначенной для грудных детей, имеющих кожные проявления аллергического типа.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу получения композиций, в частности композиций для детей, позволяющих уменьшать проявления аллергического типа. Такие композиции получают исходя из культуры Bifidobacterium без гидролиза молочных белков.

В течение нескольких десятилетий в промышленно развитых странах увеличивается частота аллергических заболеваний. Так, например, в настоящее время подсчитано, что 20% населения развитых стран затронуто такими формами аллергии, как астма, атопический дерматит, или другими формами проявлений. Такая значительная частота позиционирует в настоящее время аллергию в качестве проблемы здравоохранения, вследствие чего были осуществлены многочисленные исследовательские работы в попытках найти решения, позволяющие ограничить распространение таких патологий. Эти работы позволили квалифицировать 2 первых года жизни как критический период в развитии заболевания, в частности, вследствие фаз повышенной чувствительности к аллергенам, причем дети с развивающейся повышенной чувствительностью в течение данного периода подвержены большему риску развития аллергии в дальнейшем. В то же время также начинает раскрываться роль кишечной микрофлоры в генезе аллергии. Действительно, формирование кишечной микрофлоры у ребенка обуславливает развитие иммунной системы слизистых оболочек (Prescott et al., 2005), и схемы формирования микрофлоры могли бы оказывать влияние на ориентирование иммунной системы на толерантность или напротив на повышенную чувствительность при пероральном приеме (Kalliomaki et al., 2001; Sudo et al., 1997).

Более точно аллергию определяют как реакцию гиперчувствительности, в которой участвует иммунный механизм (Johansson et al., 2001). Такая гиперчувствительность обуславливает воспроизводимые симптомы, вызываемые действием антигена, и дозу, нормально переносимую субъектами без отклонений. Антигены, вызывающие аллергическую реакцию, т.е. аллергены, имеют очень разную природу: пищевую, воздушную, животную и т.д. Наблюдаемые симптомы также очень различаются и проявляются, главным образом, на коже, при пищеварении или дыхании. Целью предложенных стратегий профилактики аллергии является уменьшение частоты новых случаев аллергии (первичная профилактика) или ограничение длительности и развития проявлений аллергии в случае ее установившейся формы (вторичная профилактика).

У грудных детей более частыми случаями аллергии являются пищевые аллергии, в частности аллергия к белкам коровьего молока (APLV). Поскольку наибольшему риску подвержены лица, предрасположенные к аллергии (дети с повышенным риском аллергии, в частности, в силу доказанной наследственной аллергии), то в отношении таких детей данное обстоятельство обосновывает стратегию диетического вмешательства в раннем возрасте. Исключительно продолжительное (>6 месяцев) грудное вскармливание материнским молоком, сочетаемое с постепенным расширением пищевого ассортимента, является стандартным решением, поскольку грудное вскармливание обладает потенциально защитным действием в отношении появления аллергических заболеваний (Host and Halken, 2005). Для детей с факторами, неблагоприятствующими грудному вскармливанию материнским молоком, рекомендуется другая стратегия, в которой используют денатурацию белков коровьего молока частичным или глубоким гидролизом или их замену другими животными или растительными белками (Host et al., 1999). Тем не менее, профилактическая эффективность таких решений остается спорной (Osborn and Sinn, 2006a; Osborn and Sinn, 2006b), а следствием процесса гидролиза является ухудшение органолептических свойств и питательного качества белков, вызывающее отказ у некоторых детей. К тому же во Франции гидролизованные композиции подлежат особой регламентации, ограничивающей их распределение исключительно фармацевтической сетью, что создает дополнительную трудность для родителей таких детей с факторами риска.

Противоаллергенное действие ферментированных молочных продуктов было описано с механистической позиции Peng et al. Исследованные продукты представляют собой сквашенные пробиотические ферментированные молочные продукты (pH=3,7) типа "йогурта". В представленной модели действие основывается на двух особенностях испытуемого продукта: на ферментации и поддержании жизнеспособности ферментов (> 10⁹ КОЕ/мл). Были испытаны пять видов различных ферментов (3 вида Lactobacilles, 1 вид Streptococcus thermophilus MC и 1 вид Bifidobacterium longum), при этом авторами были замечены сильно различавшиеся эффекты, зависевшие от использованного штамма. На такой модели с животным наиболее заметные эффекты были отмечены для штаммов испытанных лактобактерий. В то же время замеченные эффекты имеют чисто иммунологический тип и не связаны непосредственно с клиническими наблюдениями симптомокомплекса аллергического типа (Peng et al., 2007). Следует также отметить, что не все пробиотические штаммы совместимы с детским питанием, поскольку D-молочная кислота не метаболизируется организмами грудных детей.

Terpend et al. были более специфично изучены свойства молока, ферментированного Bifidobacterium breve и Streptococcus thermophilus . Результаты данного исследования показывают эффект усиления кишечного барьера по отношению к молочным белкам. Тем не менее, данными авторами не было выявлено прямое противоаллергенное действие такого ферментированного молочного продукта (Terpend et al., 1999).

В этом контексте авторами настоящего изобретения были разработаны композиции, адаптированные для детского питания и устраняющие по меньшей мере часть недостатков продуктов, описанных на предшествующем уровне техники, что позволяет предложить иной подход в назначении диеты детям с риском аллергии.

Подход, выбранный для получения положительного эффекта, состоит в том, чтобы непосредственно регулировать формирование микрофлоры и интестинальной иммунной системы ребенка посредством активных иммуномодулирующих соединений, образующихся при биоконверсии или ферментации штаммом Bifidobacterium. Результаты, представленные в приведенной далее экспериментальной части, демонстрируют непосредственное полезное действие на аллергический симптомокомплекс.

Таким образом, настоящее изобретение относится, во-первых, к применению штамма Bifidobacterium, для получения композиции, предназначенной для профилактики и/или лечения проявлений аллергического типа. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используемый штамм Bifidobacterium получают из кишечной микрофлоры человека. Более предпочтительно такой штамм принадлежат к виду Bifidobacterium breve. Штамм, наиболее адаптированный для применения по настоящему изобретению, представляет собой штамм BbC50, депонированный 31 мая 1999 года компанией Gervais Danone в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) под номером I-2219.

Способ получения композиции, предназначенной для профилактики и/или лечения аллергических проявлений, по настоящему изобретению включает в себя предпочтительно стадию ферментации молочного субстрата в присутствии штамма Bifidobacterium. Эта стадия ферментации молочного субстрата в присутствии штамма Bifidobacterium может быть осуществлена в аэробных или анаэробных условиях.

Под "молочным субстратом" в настоящем описании понимают водную среду, содержащую по меньшей мере одну фракцию белков молочной сыворотки и лактозу. При необходимости белки молочной сыворотки могут быть гидролизованы и/или обогащены нативным лактальбумином. Пермеат молочной сыворотки также может быть введен в молочный субстрат. В качестве неограничительных примеров молочных субстратов можно упомянуть молоко, концентрат молока, основу для молочного детского питания, основу для йогурта и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения композиции, предназначенной для профилактики и/или лечения аллергических проявлений, по настоящему изобретению включает в себя стадию биоконверсии молочного субстрата штаммом Bifidobacterium , осуществляемую в условиях, являющихся неблагоприятными для продуцирования кислоты упомянутым штаммом, соответственно описанному в заявке WO 2001/001785. Такая биоконверсия, соответствующая ферментации, при которой не повышается или в малой степени повышается кислотность, обеспечивает также продуцирование активных метаболитов. Подробности условий такой специфической ферментации приведены далее.

Под "условиями, неблагоприятными для продуцирования кислоты штаммом Bifidobacterium", понимают условия, в которых повышение кислотности среды за счет Bifidobacterium не превышает 0,5 единицы pH за 8 часов инкубации исходного посева, превышающего 1·10⁷ КОЕ на 1 мл. Они могут быть легко определены специалистами в данной области техники посредством простых опытов путем варьирования, в частности, аэрации культуральной среды, ее осмотического давления и/или температуры культивирования и измерения pH в начале и в конце культивирования.

Для большого числа штаммов Bifidobacterium такие условия предпочтительно могут быть получены:

- использованием бактериальной популяции, получаемой из инокулята на последующей стадии фазы экспоненциального роста;

- выдерживанием в аэробных условиях, например, при перемешивании;

- выдерживанием среды при осмотическом давлении, соответствующем от 0,93 до 0,97 активности воды (AW);

- выдерживанием при температуре от 40 до 48ºC;

а также при комбинировании этих различных условий.

В этом варианте осуществления настоящего изобретения приведение в контакт молочного субстрата и бифидобактерий может быть осуществлено из расчета от 10⁷ до 10⁹ КОЕ на 1 мл молочного субстрата, а конечная популяция бифидобактерий по окончании реакции биоконверсии может составлять от 10 ⁵ до 10⁹ КОЕ в 1 мл продукта.

Значение pH молочного субстрата при приведении в контакт с бактериями предпочтительно составляет от 6,0 до 7, а значение pH продукта по окончании реакции биоконверсии предпочтительно составляет от 5,8 до 7.

В используемых условиях время контакта молочного субстрата с бактериями на стадии биоконверсии может составлять от 4 до 24 часов.

Разумеется, в способе по настоящему изобретению описанные ранее стадии биоконверсии и ферментации не исключают друг друга. Например, такой способ может включать в себя стадию биоконверсии молочного субстрата (в малой степени повышающей кислотность или не повышающей ее) штаммом Bifidobacterium с последующей стадией ферментации, повышающей кислотность, тем же самым штаммом бактерии. Альтернативным образом обе реакции могут быть проведены параллельно на двух различных субстратах, при этом продукты двух реакций могут быть объединены затем в конечную противоаллергическую композицию.

В зависимости от вида противоаллергической композиции, подлежащей получению, могут быть применены различные способы дополнительной обработки продукта биоконверсии и/или ферментации молочного субстрата бифидобактериями. В частности, после стадии ферментации или биоконверсии предпочтительно может быть предусмотрена стадия стерилизации и/или отделения бифидобактерий, в частности, для получения продуктов длительного хранения. В зависимости от вида конечной композиции, подлежащей получению, могут быть осуществлены также различные стадии фильтрования, обезвоживания или хроматографирования.

Примеры продуктов, приемлемых для использования с целью получения композиции по настоящему изобретению, предназначенной для профилактики и/или лечения аллергических проявлений, описаны, в частности, в WO 2001/001785 (продукт, используемый в приведенном далее примере 1), WO 2004/093898 и WO 2004/093899 (пример 2), и WO 2006/040485. Разумеется, по настоящему изобретению могут быть использованы также смеси таких продуктов.

При необходимости композиция, получаемая способом по настоящему изобретению, может содержать помимо продукта ферментации или биоконверсии молочного субстрата штаммом Bifidobacterium массу, образующуюся при ферментации молочного субстрата штаммом Streptococcus thermophilus, например штаммом ST065, депонированным 23 августа 1995 года компанией Gervais Danone в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) под номером I-1620. Композиция, получаемая по настоящему изобретению, предпочтительно может содержать фракцию, полученную способом, описанным в WO 96/06924.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получаемая композиция представляет собой продукт для лечебно-профилактического питания (или функциональный пищевой продукт), т.е. пищевой продукт или пищевой ингредиент, оказывающий полезное действие в отношении здоровья, в данном случае в отношении профилактики или лечения аллергических проявлений. Например, композиция может представлять собой свежий молочный продукт типа йогурта, приготовленное блюдо, соус и т.п. Композиция может представлять собой также стерилизованный и/или обезвоженный продукт длительного хранения.

Композиция, получаемая в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, предназначена для детского питания. Например, она может представлять собой молоко для детей (в обезвоженном или в необезвоженном виде). Неограничительный пример молока для детей, получаемого по настоящему изобретению, представляет собой молоко, реализуемое группой Danone под названием Gallia Calisma (для 1-й или 2-й возрастной группы).

Важно отметить, что композиция, получаемая одним из ранее описанных способов или способом, приведенным далее в примере 2, может быть введена в качестве ингредиента в пищевую композицию любого типа. Таким образом, пищевая композиция, получаемая по настоящему изобретению, может отличаться тем, что она содержит в качестве ингредиента по меньшей мере одну композицию, полученную одним из ранее описанных способов или способом, приведенным далее в примере 2. Такие пищевые композиции могут предназначаться для питания людей или животных и могут, в частности, представлять собой ферментированную или неферментированную, молочную или иную композицию животного или растительного происхождения, включая, в частности, композиции для детей или взрослых и пожилых людей и, в частности, молочные смеси для детей, питьевое или сухое молоко, свежие продукты, злаковые смеси, бисквиты (корм), смеси в мелкой фасовке, десерты и т.п., или также продукты питания или диетические продукты для взрослых, в том числе продукты лечебного назначения.

Альтернативно композиция, получаемая по настоящему изобретению, может представлять собой пищевую добавку.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, предназначенной для профилактики и/или лечения аллергических проявлений. Фармацевтическая композиция, получаемая по настоящему изобретению, отличается тем, что она содержит в качестве активного вещества по меньшей мере одну композицию, полученную одним из ранее описанных способов или способом, приведенным далее в примере 2, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Под "фармацевтически приемлемым" понимают любой носитель, который при сохранении свойств композиции, полученной одним из ранее описанных способов или способом, приведенным далее в примере 2, позволяет транспортировать указанную композицию.

Пищевая добавка или фармацевтическая композиция, получаемая по настоящему изобретению, может находиться в любой галеновой форме, требуемой для введения пероральным путем человеку или животному, такой как, например, жидкая форма для сиропа, раствора или спрея или твердая форма, такая как, например, порошок, таблетка, желатиновая капсула, средство в облатке, порошковый спрей, жевательная резинка, паста, гранулы, в иной форме для непосредственного или программируемого высвобождения или в любой другой форме, адаптированной для введения пероральным путем. Кроме того, фармацевтические композиции, получаемые по настоящему изобретению, могут быть получены в форме для наружного введения человеку или животному, такой как, например, крем, лосьон, мыло, раствор, гель, молочко, масло, или для введения человеку или животному анальным путем, например, в форме суппозитория.

Композиции, получаемые способом по настоящему изобретению, предпочтительно предназначены для питания людей и могут быть полезны для любых людей, имеющих предрасположенность к аллергии. Лица, страдающие проявлениями аллергического типа, а также новорожденные, грудные дети или дети младшего возраста (до 5 лет), у которых по меньшей мере один из родителей болен аллергией и/или имеет предрасположенность к аллергии, представляют собой группу пациентов, которым такие композиции могут быть очень полезны. Лица, больные пищевыми, респираторными или контактными аллергиями, а также лица, предрасположенные к аллергии, также могут ощутить улучшение состояния, обусловленное регулярным употреблением композиции, получаемой способом по настоящему изобретению.

Результаты исследования, представленные в приведенных далее примерах, показывают, в частности, что смеси для детей, полученные по настоящему изобретению, позволяют, с одной стороны, предупреждать появление аллергии к белкам коровьего молока (APLV) у некоторого числа детей с повышенным риском аллергии, а с другой стороны, позволяют лечить кожные проявления аллергического типа у грудных детей. Таким образом, применение штамма Bifidobacterium для получения композиции, предназначенной для профилактики аллергии к белкам коровьего молока, и/или для получения композиции, предназначенной для профилактики и лечения кожных проявлений аллергического типа (экзема, десквамация, ретроаурикулярные трещины, эритема, зуд и т.д.) у грудных детей, составляет часть настоящего изобретения.

Настоящее изобретение может быть лучше понято при чтении следующего далее описания, в котором представлено противоаллергическое действие молока для детей Gallia Calisma в отношении грудных детей, имеющих предрасположенность к аллергии. Также описаны другие композиции, приемлемые для использования по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Противоаллергическое действие молока для детей Gallia Calisma

Смесь для грудных детей (типа Calisma для 1-й возрастной группы) и молочная смесь для последующего вскармливания (типа Calisma для 2-й возрастной группы) были объектами перспективного лонгитюдного многоцентрового рандомизированного двойного слепого исследования с 2 параллельными группами. Способ получения этих композиций представлен в виде схемы на фиг. 1.

Целью исследования было определение эффективности биоконвертированного молока для детей (FF) в отношении профилактики аллергии к белкам коровьего молока (APLV) и появление повышенной чувствительности к аллергенам у новорожденных и грудных детей по сравнению с небиоконвертированной композицией (SF).

Для участия в этом исследовании были отобраны дети с высоким риском аллергии. Были отобраны женщины до 5-го месяца беременности для последующего наблюдения детей до 12 месяцев. Композиции FF или SF давали с момента рождения до 1 года или до момента отнятия от груди в случае детей, которых кормили грудью. Диетический контроль осуществляли с 5-го месяца беременности и до 12-месячного возраста детей с последующим расширением ассортимента согласно фактическим рекомендациям. В ходе наблюдения детей в течение первого года жизни фиксировали проявления, соответствующие пищевой аллергии.

Также осуществляли систематический клинический осмотр в возрасте от 4 до 12 месяцев, а также проводили прик-тесты (накожные испытания, выявляющие чувствительность к заданному аллергену) на аллергию к коровьему молоку (LV), сое, яйцам, злакам, треске, арахису, D. pteronyssinus, Alternaria , кошкам, собакам, пыльце злаков и березы. В случае подозрений на APLV прекращали любое поступление белков коровьего молока и проводили испытание на оральную провокацию (TPO) посредством LV.

В число участников было включено 129 детей, среди которых было 115 детей, наблюдавшихся до 12 месяцев, из которых 59 употребляли FF, а 56 употребляли SF. Из 115 участников 83 ребенка имели симптомы, соответствующие пищевой аллергии (72,2%). В группе FF процентная доля проявлений пищеварительного и респираторного типов была статистически меньше, чем доля в группе SF (p<0,05). Данные результаты представлены на фигурах 2 и 3.

К тому же, из 115 детей 7% имели повышенную чувствительность к молоку (положительный прик-тест) со значительной разницей (p<0,05) между группами FF и SF (1,7 и 12,5% соответственно) (фиг. 4).

В этом исследовании впервые была доказана полезность использования биоконвертированной композиции для профилактики появления проявлений пищевой аллергии и повышенной чувствительности к белкам коровьего молока.

Композиция FF была испытана также в ходе перспективного лонгитюдного многоцентрового открытого исследования с целью оценки полезности использования такой композиции в отношении второстепенного кожного симптомокомплекса.

В этом исследовании было оценено специфическое действие биоконвертированной композиции (Calisma) по сравнению со стандартным молоком посредством измерения развития второстепенных кожных проявлений у грудных детей после замены стандартного молока ферментированной композицией.

Были отобраны здоровые грудные дети в возрасте меньше 4 месяцев, имевшие кожные проявления аллергического типа, соответствующие 1-му симптоматологическому эпизоду. В числе соответствующих кожных проявлений были следующие: десквамация, ретроаурикулярные трещины, эритема, зуд.

После употребления биоконвертированной композиции в течение месяца развитие таких второстепенных кожных проявлений (природа, местоположение и интенсивность) оценивали педиатр и родители.

В исследование было включено 35 детей. После употребления биоконвертированной композиции в течение 1 месяца благоприятное развитие проявлений было отмечено у 94% детей, из которых у 71% было отмечено полное исчезновение симптомов (фиг. 5).

Данные результаты показывают эффективность продукта в отношении проявлений аллергической природы.

Пример 2. Получение других противоаллергических композиций

Другие противоаллергические композиции могут быть получены способом, включающим в себя следующие стадии:

а - посев и инкубация в аэробных или анаэробных условиях при температуре в интервале приблизительно от 30 до 40ºC материала Bifidobacterium, содержащего по меньшей мере один штамм Bifidobacterium breve I-2219, в водном субстрате, имеющем значение pH в интервале приблизительно от 6 до 8 и содержащем по меньшей мере следующие ингредиенты:

i) пермеат молочной сыворотки;

ii) гидролизат белков молочной сыворотки;

iii) лактозу;

b - удаление Bifidobacterium из водного субстрата;

c - ультрафильтрация водного субстрата через фильтрующие мембраны с пределом разделения в интервале от 100 до 300 кД с получением концентрированного ретентата;

при необходимости осуществляют стадии d- и e-, описанные далее:

d - обезвоживание концентрированного ретентата;

e - растворение обезвоженного ретентата в буферном растворе.

В заключение могут быть осуществлены стадии f- и g- для получения активных фракций ретентата:

f - обработка раствора ретентата способом эксклюзионной гель-хроматографии на колонке с пределом разделения 600 кД;

g - выделение отделенной фракции и/или отфильтрованной фракции после хроматографирования.

Более точно продукты могут быть получены по методике, описанной далее.

Готовят культуральную среду, содержащую следующие ингредиенты:

- 50 г/л пермеата молочной сыворотки;

- 10 г/л гидролизата белков молочной сыворотки;

- 20 г/л лактозы;

- 2 г/л экстракта дрожжей;

- 2,5 г/л дигидрофосфата калия;

- 0,3 г/л гидрохлорида цистеина;

- 0,3 г/л NaOH.

Культуральную среду подвергают ультрафильтрации через кассеты Centramate^®, выпускаемые компанией PALL и оснащенные мембранами из полиэфирсульфона с пределом разделения 300 кД, и пермеат автоклавируют в течение 30 мин при 120ºC. При этом значение pH культуральной среды устанавливают равным 6,5 раствором аммиака, разбавленным в два раза.

Затем культуральную среду засевают бифидобактериями из расчета 6% (об./об.) замороженного концентрата штамма Bifidobacterium breve CNCM I-2219, содержащего 1,1·10¹¹ КОЕ бифидобактерий в 1 мл замороженного концентрата. Исходная концентрация бактерий составляет 3·10⁸ КОЕ бифидобактерий в 1 мл культуральной среды. Бифидобактерии культивируют в анаэробных условиях при температуре в интервале от 35 до 40ºC. Во время культивирования значение pH культуральной среды устанавливают равным 6,5 раствором аммиака, разбавленным в два раза. Время культивирования составляет 15 часов, а концентрация Bifidobacterium в конце культивирования равняется приблизительно 2·10 ⁷ КОЕ в 1 мл культуральной среды.

В конце культивирования бактерии удаляют из ферментированной культуральной среды центрифугированием в течение 1 часа при 3000 g. Остаточную ферментативную активность супернатанта после центрифугирования устраняют термической обработкой в течение 3 минут при 75ºC.

Супернатант подвергают ультрафильтрации через кассеты Centramate^®, выпускаемые компанией PALL и оснащенные мембранами из полиэфирсульфона с пределом разделения 300 кД приблизительно при 40ºC. Таким образом осуществляют 3-кратное концентрирование и затем 3 раза промывают деминерализованной водой. Во время последней промывки в части, задержанной мембраной, достигается 7-кратная концентрация. Таким образом, получают концентрат, называемый ретентатом. Ретентат обезвоживают лиофилизацией и затем растворяют в буферном растворе Tris-NaCl с pH=8.

Концентрированный ретентат, предварительно растворенный в буферном растворе Tris-NaCl с pH=8, обрабатывают способом препаративной хроматографии. Разделение осуществляют гель-хроматографированием на колонке Superdex ^® 200, выпускаемой компанией Amersham Biosciences, имеющей диаметр 50 мм и высоту 100 см, эксплуатируемой при скорости подачи 5 мл в минуту и имеющей предел разделения 600 кД. Собирают фракции объемом по 10 мл и измеряют их поглощение при 280 нм.

Таким образом, выделяют две фракции:

- фракцию, полученную эксклюзионной гель-хроматографией, с молекулярной массой больше 600 кД (время удерживания от 130 до 180 мин, +/-10%);

- фракцию, полученную фильтрованием, с молекулярной массой в интервале от 200 до 600 кД (время удерживания от 187 до 370 мин, +/- 10%).

Фракцию, полученную эксклюзионной гель-хроматографией, подвергают диализу с дистиллированной водой и затем разбавляют так, чтобы получить концентрацию ретентата. Затем эту фракцию можно хранить в замороженном или лиофилизованном виде. Фракцию, полученную фильтрованием, также можно хранить таким же образом.

Ретентат или любая из фракций, отделенных хроматографированием, а также их смеси могут быть использованы для профилактики, ослабления или лечения проявлений аллергического типа.

БИБЛИОГРАФИЯ

Host, A., and Halken, S. (2005). Primary prevention of food allergy in infants who are at risk. Curr Opin Allergy Clin Immunol 5, 255-259.

Host, A., Koletzko, B., Dreborg, S., Muraro, A., Wahn, U., Aggett, P., Bresson, J. L., Hernell, O., Lafeber, H., Michaelsen, K. F., et al. (1999). Dietary products used in infants for treatment and prevention of food allergy. Joint Statement of the European Society for Paediatric Allergology and Clinical Immunology (ESPACI) Committee on Hypoallergenic Formulas and the European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) Committee on Nutrition. Arch Dis Child 81, 80-84.

Johansson, S. G., Hourihane, J. O., Bousquet, J., Bruijnzeel-Koomen, C, Dreborg, S., Haahtela, T., Kowalski, M. L., Mygind, N., Ring, J., van Cauwenberge, P., et al. (2001). A revised nomenclature for allergy. An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy 56, 813-824.

Kalliomaki, M., Kirjavainen, P., Eerola, E., Kero, P., Salminen, S., and Isolauri, E. (2001). Distinct patterns of neonatal gut microflora in infants in whom atopy was and was not developing. J Allergy Clin Immunol 107, 129-134.

Osborn, D. A., and Sinn, J. (2006a). Formulas containing hydrolysed protein for prevention of allergy and food intolerance in infants. Cochrane Database Syst Rev, CD003664.

Osborn, D. A., and Sinn, J. (2006b). Soy formula for prevention of allergy and food intolerance in infants. Cochrane Database Syst Rev, CD003741.

Peng, S., Lin, J. Y., and Lin, M. Y. (2007). Antiallergic effect of milk fermented with lactic acid bacteria in a murine animal model. J Agric Food Chem 55, 5092-5096.

Prescott, S. L., Dunstan, J. A., Haie, J., Breckler, L., Lehmann, H., Weston, S., and Richmond, P. (2005). Clinical effects of probiotics are associated with increased interferon-gamma responses in very young children with atopic dermatitis. Clin Exp Allergy 35, 1557-1564.

Sudo, N., Sawamura, S., Tanaka, K., Aiba, Y., Kubo, C, and Koga, Y. (1997). The requirement of intestinal bacterial flora for the development of an IgE production System fully susceptible to oral tolerance induction. J Immunol 159, 1739-1745.

Terpend, K., Blaton, M. A., Candalh, C, Wal, J. M., Pochart, P., and Heyman, M. (1999). Intestinal barrier function and cow's milk sensitization in guinea pigs fed milk or fermented milk. J Pediatr Gastroenterol Nutr 28, 191-198.