способ определения токсичности водной среды

Формула изобретения

Способ определения токсичности водной среды с помощью теста, основанного на реакции суспензии клеток губки, включающий помещение суспензии в исследуемый раствор, выдерживание в течение суток с последующим подсчетом пузыревидных клеток под микроскопом, отличающийся тем, что о токсичности судят по достоверному увеличению клеток в исследуемом растворе по сравнению с контролем.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к водной токсикологии и может быть использовано для биоиндикации и биотестирования загрязненных вод и отдельных поллютантов и может быть использовано в качестве дополнительного метода к биотестам обязательного применения при определении качества вод, в которых (представительным) доминирующим видом является Spongia.

При проведении токсикометрии поллютантов в настоящее время рекомендуется использовать не только обязательные биотесты, включенные в Федеральный реестр, но и тесты, разработанные в качестве дополнительных, на представительных для исследуемого водоема организмах. Особенно это касается охраны вод такого уникального озера, как Байкал. Пресноводные байкальские губки (Lubomirskiidae) - эндемичные организмы, преобладающие по биомассе среди бентосных животных литорали, мало изучены в плане экотоксикологии.

Известны способы определения токсичности с использованием бентосных организмов, неспособных передвигаться и уходить из зоны загрязнения, в частности губок.

Известен способ оценки токсичности водных сред / Авт. св. СССР № 1730581, G01N 33/18, А01К 61, 1992/, основанный на обездвиживании личинок байкальской губки Baicalospongia bacillifera в токсичной среде.

Способ достаточно чувствителен, но его недостаток в ограничении периода проведения исследования, так как размножение личинками происходит лишь два раза в год.

Известен способ определения токсичности воды по отталкиванию облака красителя водой, выбрасываемой губкой из оскулюмов / Патент РФ № 2003096 G01N 33/18, А01К 61/00 от 15.11.93 1993/. Предварительно животных экспонируют в испытуемых растворах в аквариумах, затем, с помощью микропипетки, на расстоянии 3-5 см от тела животного вносят раствор красителя в безвредный концентрации, например флюоресцеина. В случае неудовлетворительного физиологического состояния облако медленно опускается на губку, в контрольных аквариумах наблюдается резкое отталкивание облака флюоресцеина струей воды из оскулюмов.

Реакция малочувствительна, недостаточно воспроизводима и требует использования большого количества неповрежденных особей животных, но удобна при мониторинге их состояния непосредственно в нативных условиях, что осуществляется аквалангистами с помощью шприца.

Известен способ биотестирования токсичности водной среды / Патент РФ № 2462707, G01N 33/18, А01К 61/00, 2012 г. / В качестве тест-объекта используют коловратку, вид которой экологически соответствует минеральному составу исследуемой водной среды. Для определения степени токсичности исследуемой водной среды осуществляют серию разведений исследуемой пробы водой, взятой из фонового чистого участка водного объекта. Степень токсичности исследуемой водной среды оценивают по степени разведения пробы чистой водой до снятия абортирования, причем при разведении пробы до 1:1 исследуемую воду относят к нетоксичной; до 1:25 - к слаботоксичной; до 1:50 - к умеренно токсичной; до 1:100 - к остротоксичной; до 1:500 и более - к весьма токсичной.

Известен биологический способ определения степени общей токсичности и основных токсикантов водной среды /Патент РФ № 2110067, G01N 33/18, А01К 61/00, 1998 г./ В качестве тест-организмов однократно используют особей лабораторной культуры тест-организмов, выращенной путем близкородственного скрещивания гидробионтов при постоянном режиме содержания на искусственных чистых эталонной воде и кормах. Определяют и сравнивают между собой возникающие в наборе растворов модельных токсикантов искусственной чистой эталонной воде и тестируемой водной среде спектры поведенческих реакций тест-организмов, их локомоторную активность.

Известен способ с применением активных красителей для определения физиологического состояния животных, основанный на свойстве проционовых красителей образовывать прочные ковалентные связи с веществами скелета губки /Патент РФ № 2003097 G01N 33/18, А01К 61/00, 15.11.93/. По степени окрашивания скелета можно судить о трофической активности животного, причем можно использовать только часть тела губки. В опытную и контрольную водную среды помещают бентосных губок, выдерживают их, регистрируют физиологический параметр губок и судят о токсичности исследуемой среды по полученным опытным данным в сравнении с контролем, причем дополнительно в опытную и контрольную среду вносят проционовый краситель. Выдерживание губок в средах проводят в течение 8 ч, после чего приготавливают срезы отростков губок, а в качестве физиологического параметра регистрируют наличие или отсутствие окраски тела губок, к токсичной относят опытную среду в случае отсутствия окраски на срезе отростка губки, содержащей в опытной среде.

При использовании дорогостоящего красителя чувствительность метода недостаточно высока.

Ближайшим аналогом является способ биоиндикации токсичности сточных вод /А. св. № 1578650 от G01N 33/18, А01К 61/00.1988 г. /. Губке присуща уникальная способность регенерировать из диссоциированных клеток животного, образуя конгломераты различной формы. Данное свойство лежит в основе способа биотестирования. Критерием токсичности служит отсутствие сборки клеток в конгломераты в испытуемых растворах.

Тест прост в осуществлении, экспрессен (время сборки 1 сутки), дает возможность использования небольшого фрагмента тела животного, но недостаточно чувствителен.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа, позволяющего повысить его чувствительность при минимальных сроках проведения эксперимента.

Поставленная задача достигается тем, что в способе биотестирования вод с помощью теста, основанного на реакции суспензии клеток губки, включающий помещение суспензии в исследуемый раствор, выдерживание в течение определенного времени с последующим подсчетом пузыревидных клеток под микроскопом, о токсичности судят по достоверному увеличению клеток в исследуемом растворе по сравнению с контролем.

Способ осуществляется следующим образом.

В чашки Петри с 20 мл байкальской воды или раствора токсиканта добавляют по 1 мл суспензии клеток губки и помещают в холодильные камеры с температурой 8°С. Через сутки из образовавшихся конгломератов с помощью дозатора добавляют 5 мкл суспензии клеток, помещают на предметное стекло и подсчитывают под микроскопом, при увеличении 20×18 количество пузыревидных клеток (диаметром около 16 мк) в камере Горяева или в поле зрения. В контроле, как правило, 3-10 клеток в поле зрения.

Пример 1

Исследовали токсичность пара-безнохинона, поллютанта, образующегося при окислении дифенолов, содержащихся в сточных водах Байкальского целлюлозно-бумажного завода и при распаде лигнина - отхода производства БЦБК. На Фиг.1 показана зависимость количества пузыревидных клеток от концентрации пара-бензохинона и хлорида ртути (II).

На Фиг.1 видно, что исследуемый раствор в концентрации 10^-1 -10^-4 моль/л обладает острой токсичностью и суспензия клеток губки не успевает отреагировать на его присутствие выбросом пузыревидных клеток и погибает, что подтверждается отсутствием конгломератов собравшихся клеток.

Если для перечисленных тест-аналогов токсичными являются концентрации пара-бензохинона 10^-5-10^-6 моль/л, то для теста по появлению пузыревидных клеток 10^-10 моль/л.

Пример 2

Полученную суспензию клеток губки выдерживают в растворах HgCl², через сутки в каждой пробе просчитывают количество пузыревидных клеток под микроскопом.

На Фиг.1 видно, что концентрации 10^-1-10^-6 . моль/л губительны для суспензии и клетки не образуются.

При использовании ближайших аналогов - нетоксичными для губки можно считать концентрации HgCl² до 10 ^-7 моль/л, тогда как по тесту появления пузыревидных клеток таковой является концентрация 10^-12 моль/л, что говорит о ее высокой чувствительности по сравнению с аналогами.

Технический эффект - значительное повышение чувствительности при минимальных сроках проведения эксперимента.